INGENIERÍA METABÓLICA DE ESCHERICHIA COLI PARA LA ...
51
INGENIERÍA METABÓLICA DE ESCHERICHIA COLI PARA LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDO SUCCÍNICO MEDIANTE FERMENTACIÓN ANAERÓBICA DEL GLICEROL ADRIANA MELISSA TÉLLEZ RUEDA Trabajo de Grado Asesor ÁNDRES FERNANDO GONZÁLEZ BARRIOS UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERÍA DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA BOGOTÁ D.C JUNIO 2012
Transcript of INGENIERÍA METABÓLICA DE ESCHERICHIA COLI PARA LA ...
INGENIERÍA METABÓLICA DE ESCHERICHIA COLI PARA LA PRODUCCIÓN
DE ÁCIDO SUCCÍNICO MEDIANTE FERMENTACIÓN ANAERÓBICA DEL
GLICEROL
ADRIANA MELISSA TÉLLEZ RUEDA
Trabajo de Grado
Asesor
ÁNDRES FERNANDO GONZÁLEZ BARRIOS
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
BOGOTÁ D.C
JUNIO 2012
2
CONTENIDO
INDICE DE TABLAS ........................................................................................................................ 4
INDICE DE FIGURAS ...................................................................................................................... 5
INDICE DE ANEXOS ....................................................................................................................... 6
RESUMEN ......................................................................................................................................... 7
INTRODUCCIÓN .............................................................................................................................. 8
1. OBJETIVOS ............................................................................................................................. 10
1.1 OBJETIVO GENERAL.............................................................................................................. 10
1.2 OBJETIVOS ESPECIFÍCOS ....................................................................................................... 10
2. ESTADO DEL ARTE .............................................................................................................. 11
2.1 BIOSÍNTESIS DE COMBUSTIBLES Y QUÍMICOS ........................................................................ 11
2.1.1 Producción de ácidos orgánicos mediante microorganismos ......................................... 11
2.2 ÁCIDO SUCCÍNICO ................................................................................................................... 12
2.2.1 Producción actual de ácido succínico .............................................................................. 13
2.2.2 Microorganismos productores de ácido succínico .......................................................... 14
2.2.3 Limitaciones de la fermentación ..................................................................................... 16
2.3 GLICEROL ................................................................................................................................ 16
2.4 ESCHERICHIA COLI .................................................................................................................. 18
2.4.1 Metabolismo de glicerol por E. coli .............................................................................. 18
2.4.2 Ingeniería metabólica en E. coli para producción de ácido succínico .......................... 20
2.5 LIBRERÍA ASKA...................................................................................................................... 21
2.5.1 Sobreexpresión de genes en E. coli ............................................................................... 21
3. METODOLOGÍA ..................................................................................................................... 24
3.1 SELECCIÓN DE CLON DE E. COLI ........................................................................................... 24
3.2 MEDIOS DE CULTIVO ............................................................................................................ 25
3.3 RECUPERACIÓN Y CRECIMIENTO DE E. Coli K-12 W3110/pCA24N pcc+ .............................. 26
3.4 FERMENTACIÓN ................................................................................................................... 26
3.4.1 Proceso fermentativo ................................................................................................... 26
3.4.2 Diseño experimental ..................................................................................................... 27
3.5 CURVA DE CRECIMIENTO ..................................................................................................... 28
3.6 CUANTIFICACIÓN DEL GLICEROL .......................................................................................... 28
3.7 CUANTIFICACIÓN DEL ÁCIDO SUCCÍNICO ............................................................................ 29
4. RESULTADOS Y ANÁLISIS ................................................................................................. 30
4.1 CURVAS DE CRECIMIENTO CELULAR .................................................................................... 30
4.1.1 Velocidad de crecimiento celular ................................................................................. 32
3
4.2 CONSUMO DE GLICEROL ...................................................................................................... 33
4.3 PRODUCCIÓN DE ÁCIDO SUCCÍNICO .................................................................................... 34
4.4 ANÁLISIS DE LA INTERACCIÓN ENTRE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO, LA CONCENTRACIÓN
DE GLICEROL Y LACTOSA Y LOS RENDIMIENTOS ........................................................................... 35
CONCLUSIONES ........................................................................................................................... 38
RECOMENDACIONES.................................................................................................................. 39
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................................... 40
ANEXOS .......................................................................................................................................... 44
4
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Trabajos realizados en la producción de succinato ………………………………..15
Tabla 2. Combinaciones de variables a manipular……………………………………………27
Tabla 3. Parámetros encontrados para cada fermentación realizada……………………...36
5
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Ruta metabólica de la producción de acido succínico de una microorganismo
típico………………………………………………………………………………………………..14
Figura 2. Ruta metabólica de la glucosa por E. coli…………………………………………..18
Figura 3. .Ruta metabólica del glicerol por E. coli…………………………………………….19
Figura 4. Construcción del plásmido vector……………………………………………………22
Figura 5. Plásmido pCA24N de E. coli…………………………………………………………24
Figura 6. Crecimiento celular de E. coli K-12 W3110/pCA24N pcc+ en 20 gr/L de glicerol
con diferentes concentraciones de lactosa: 1 gr/L () y 2 gr/L ()………………………..31
Figura 7. Crecimiento celular de E. coli K-12 W3110/pCA24N pcc+ en 15 gr/L de glicerol
con diferentes concentraciones de lactosa: 1 gr/L (), 2 gr/L () y 0 gr/L ()…………..31
Figura 8. Crecimiento celular de E. coli K-12 W3110/pCA24N pcc+ en 10 gr/L de glicerol
con diferentes concentraciones de lactosa: 1 gr/L () y 2 gr/L ()………………………..31
Figura 9. Velocidad máxima de crecimiento de E. coli K-12 W3110/ pCA24N pcc+ en
diferentes concentraciones de glicerol y lactosa………………………………………….…..32
Figura 10. Velocidad de consumo del glicerol por E. coli K-12 W3110/pCA24N pcc+ en
diferentes concentraciones de glicerol y lactosa………………………………………………33
Figura 11. Producción de ácido succínico por E. coli K-12 W3110/pCA24N pcc+…….…..34
6
INDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Curva de calibración del glicerol……………………………………………………..43
Anexo 2. Curvas de consumo del glicerol……………………….……………………………..44
Anexo 3. Curvas de producción del ácido succínico………………………………………….46
7
RESUMEN
El ácido succínico actualmente es producido mundialmente a partir de
hidrocarburos, sin embargo en los últimos años se han realizado trabajos de
investigación para producir este ácido por medio de bacterias utilizando glicerol
como sustrato, para encontrarle un nuevo uso a este subproducto de la industria
del biodiesel que actualmente se encuentra con sobreoferta. En este trabajo se
evaluó la producción de ácido succínico con la cepa Escherichia coli K-12
W3110/pCA24N pcc+ con diferentes concentraciones de glicerol (20, 15 y 10 gr/L)
como fuente de carbono, y lactosa (1 y 2 gr/L) como inductor del plásmido, bajo
condiciones anaerobias. Para tal fin se usó nitrógeno como gas inerte para
reemplazar el oxígeno presente en los medios. Se encontró que la cantidad
adecuada de sustrato es 15 gr/L ya que cantidades mayores o menores a estas no
brindan un diferencia significativa en la velocidad máxima de crecimiento, pero si
disminuyen la velocidad de consumo del glicerol, aumentando así el tiempo de
crecimiento celular. De igual forma, se evidenció un efecto significativo en la
inducción de la ruta metabólica del glicerol hacia el ácido succínico por el gen
sobreexpresado ppc cuando se agrega 1 gr/L de lactosa, debido a que las otras
concentraciones experimentadas para el éste no indujeron la expresión de ppc. Al
finalizar la experimentación se obtuvo un producción máxima de 4.84 gr/L de ácido
succino con 15 gr/L de glicerol inicial y 1 gr/L de lactosa. Estos resultados prueban
que la ruta de glicerol hacia el producto deseado sí es inducible al agregarle las
cantidades adecuadas de inductor del plásmido, pero aun así las concentraciones
de ácido son bajas al compararlas con otros estudios realizados anteriormente.
8
INTRODUCCIÓN
El ácido succínico o butanodioico hace parte del grupo ácido dicarboxílico C4 en el
ciclo de Krebbs, donde la hidrólisis de succinil CoA mediante la enzima succinil
CoA sintetasa libera la coenzima A y un residuo de 4 carbonos o succinato. Este
ácido junto con sus derivados es un intermediario de productos químicos básicos
en diferentes áreas como: cosméticos, conservación de alimentos, fármacos,
síntesis bioquímica, elaboración de plásticos biodegradables, entre otros [1].
Además de ser utilizado en bioremediación de suelos, síntesis de biopolímeros,
regulador de crecimiento de plantas y animales, etc. [2].
Actualmente, el ácido succínico es producido a partir de derivados de
hidrocarburos, mas exactamente a partir del anhidro maleico derivado del butano
por síntesis química. Durante su producción química se obtienen otros productos
no deseables que restringen su aplicación para el ser humano.
Lo anterior junto con la continua alza de los precios de petróleo han despertado el
interés en la industria química por encontrar fuentes alternas para la síntesis de
varios químicos derivados del petróleo y otros recursos fósiles. Entre los cuales se
encuentra el ácido succínico del cual se producen mundialmente 30,000 ton
anuales, creando un mercado mundial de US $225 millones [3]. A pesar del
amplio rango de usos del ácido butanodioico, no es utilizado en gran potencia
dado su alto costo debido a que el precio por kilogramo esta entre US $ 3-5,
mientras que el precio de otros derivados como el ácido maleico es de US $1,5
por kilo [3].
Por consiguiente se necesitan estrategias para producir ácido succínico de forma
más económica, como la fermentación mediante Escherichia coli usando como
sustrato el glicerol, con el fin de darle un valor agregado a éste. Puesto que con el
auge de la industria del biodiesel se ha generado una sobreproducción de
subproductos del proceso como el glicerol, ocasionando una sobreoferta del
compuesto al generarse 10 kg de glicerol por cada 100 kg de biodiesel [4].
Generando el desecho de este residuo, pues es mayor el costo que implica su
separación, que el precio del mismo en el mercado [5].
9
Se han realizado estudios empleando E. coli con varias modificaciones genéticas,
usando glicerol como sustrato en condiciones aerobias y anaerobias. Se han
alcanzado rendimientos entre 5 - 550 gr/L de ácido succínico durante 144 hrs
aeróbicamente [6]. Mientras en condiciones anaeróbicas durante 110 hrs se han
encontrado producciones entre 5 – 112 gr/L de ácido succínico [7].
De acuerdo a lo anterior, este estudio busca producir ácido succínico en
condiciones anaerobias, empleando la bacteria E. coli K-12 W3110 con el gen ppc
sobre-expresado, probando diferentes concentraciones de glicerol y de lactosa,
para determinar si existe alguna relación entre la cantidad inicial de glicerol y
lactosa con la velocidad de crecimiento y la producción de ácido succínico.
10
1. OBJETIVOS
1.1 OBJETIVO GENERAL
Evaluar la producción de ácido succínico a partir de glicerol por medio de
ingeniería metabólica usando Escherichia coli.
1.2 OBJETIVOS ESPECIFÍCOS
Seleccionar un gen involucrado en el metabolismo de la fermentación del glicerol
para la producción de ácido succínico en Escherichia coli
Determinar la curva de crecimiento del clon seleccionado de E. coli a partir de la
cuantificación de la biomasa y de la tasa de consumo del glicerol.
Emplear diferentes concentraciones del inductor del gen y del sustrato, lactosa y
glicerol respectivamente, para establecer su influencia en la síntesis de ácido
succínico.
Comparar los resultados obtenidos con los presentes en literatura sobre la
producción del ácido succínico por E. coli u otra bacteria a partir de glicerol
11
2. ESTADO DEL ARTE
2.1 BIOSÍNTESIS DE COMBUSTIBLES Y QUÍMICOS
El desarrollo de la industria global ha llevado al agotamiento de las reservas de
petróleo y carbón, y el aumento de las emisiones de gases efecto invernadero.
Cambiando el interés de tecnologías basadas en combustibles fósiles a
tecnologías bioalternativas, usando biomasa como materia prima [8].
Por el momento, la eficiencia de estas no es comparable con las de la industria
basada en petróleo por varias razones: Falta de avances científicos para aumentar
el costo-eficiencia de la producción, ausencia de integración del proceso y altos
costos de capital [8].
Aun así, existe una gran cantidad de químicos que pueden ser producidos a partir
de fuentes renovables como biocombustibles diesel, hidrocarburos, alcoholes
(butanol y derivados, pentanoles, hexanol, propanodil, butanodioles), ácidos
carboxílicos (succinato, butirato, acetato), aldehídos y cetonas. De igual forma la
cantidad de sustratos de carbonos es amplia y contiene 5-6-carbonos y azúcares,
acetato, propionato, celulosas y xilanos, almidones y carbohidratos de refinerías
de caña de azúcar o maíz [9].
Los organismos empleados para la transformación de la materia prima varían
entre bacterias, hongos y levaduras
2.1.1 Producción de ácidos orgánicos mediante microorganismos
Los ácidos orgánicos, son aquellos que contienen uno o mas carboxilos y se
caracterizan por ser intermediarios o productos de rutas metabólicas. Entre los
ácidos orgánicos producidos industrialmente por microorganismo están el cítrico,
fumárico, málico y tartárico son sintetizados en su mayoría en fermentaciones
aerobias en cultivo sumergido por los hongos filamentosos Aspergillus nIger,
12
Penicillium, Rhizopus y por la bacteria Acetobacter. El ácido láctico es producido
mediante un metabolismo anaeróbico por Lactobacillus [10].
Por otra parte, en estudios recientes se ha encontrado que Clostridium
thermobutyricum y Actinobacillus succinogenes son los principales productores de
butirato y succínico [9] [11].
2.2 ÁCIDO SUCCÍNICO
Conocido también como ácido butanodioico, es un ácido dicarboxílico de cuatro
carbonos. En el ciclo del acido cítrico de Krebbs desempeña un papel metabólico
fundamental, al ser producido por la hidrólisis de succinil CoA mediante la enzima
succinil CoA sintetasa, generando ATP. Y luego ser oxidado a fumarato mediante
la enzima succinato deshidrogenasa [12]. Sin estas dos reacciones el ciclo de
Krebbs no podría completarse y síntesis de ATP (energía) no seria posible.
El ácido succinato o succínico se encuentra en los tejidos de plantas y animales
(músculos) por su intervención en el ciclo del ácido cítrico. Éste acido es un sólido
cristalino transparente, soluble en agua y con un punto de fusión en 185-187 ºC
[13].
Se emplea en varias industrias de polímeros (fibras de ropa, biopolímeros),
alimentos (acidulante, modificador de pH, agente antimicrobiano), surfactantes,
detergentes y farmacéutica (antibióticos, vitaminas, amino ácidos, farmacéuticos)
[14]. Además de ser empleado en bioremediación de suelos, regulador de
crecimiento de plantas y animales, etc. [2]. Dada su estructura lineal de acido
dicarboxílico saturado puede ser usado como intermediario en la producción de
1,4-butanodiol, tetrahidrofurano, butirolactona y otros químicos de 4 carbonos de
amplio uso industrial a nivel mundial [14].
13
2.2.1 Producción actual de ácido succínico
Tradicionalmente es obtenido por síntesis química a partir de derivados del
petróleo como el anhidro maleico, el cual es producido a partir del n-butano.
Donde se lleva a cabo una oxidación sobre catalizadores de óxido de vanadio-
fósforo.
Hoy en día las nuevas tecnologías le apuntan a reducir la polución causada por los
procesos petroquímicos y encontrar nuevas fuentes de carbohidratos renovables y
amigables con el medio ambiente. Por esto, se ha venido investigando la
producción ácido succínico a partir de la fermentación empleando desechos
industriales como sustrato. Ya que disminuiría la producción de CO2 al ser una
fermentación fijadora de CO2 y podría reemplazar varias materias primas basadas
en benceno e intermediarios petroquímicos [14].
En la producción de succinato por medio de una fermentación (Figura 1), primero
se convierte la glucosa a glucosa-6-fosfato mediante la hexoquinasa, luego 3
enzimas dirigen la producción de fosfoenolpiruvato (PEP). A partir de PEP la ruta
metabólica puede tomar 2 caminos según el nivel de dióxido de carbono presente
en el sistema. Si hay poco CO2 se va a generar formiato, etanol y acetato. En
cambio, para la generación acido succínico es necesario que haya una alta
disponibilidad de CO2. Por esta ruta, el PEP se convierte a oxoloacetato mediante
PEP-carboxiquinasa con adición de CO2, después se agrega hidrógeno para
producir malato, el cual es convertido a fumarato por la enzima fumarasa. Y
finalmente, se produce el succinato con la adición de hidrógeno.
Por otro lado, los costos de proceso de producción del ácido succínico son
afectados pro la productividad y rendimiento de ácido, costo de materias primas y
métodos de recuperación. Por ende para desarrollar una producción a nivel
industrial factible se necesita una productividad volumétrica superior a 2.5 g/Lh [8].
14
Figura 1. Ruta metabólica de la producción de acido succínico de una microorganismo
típico [11]
2.2.2 Microorganismos productores de ácido succínico
El acido butanodioico al encontrarse en la vía metabólica de varios
microorganismos facultativos o anaerobios puede ser formado por bacterias
gastrointestinales y del rumen, a partir de glucosa, como
avefaciens, Actinobacillus
succinogenes, Bacteroides amylophilus, Prevotella ruminicola, Succcinimonas
amylolytica, Succinivibrio dextrinisolvens, Wolinella succinogenes, y Cytophaga
succinicans [14].
15
Tabla 1. Trabajos realizados en la producción de succinato [14], [15], [16], [17], [18], [19],
[20].
Organismo Fermentación Tiempo
(hr) Sustrato
Ácido
succínico
(AS)
Rendimiento
(%)
Actinobacillus
succinogenes
Anaeróbica 60 Melaza
de caña 50.6 g/L 79.5
Anaeróbica 48 Azúcar 55.2 g/L 95
38.5 Glucosa 33.9 g/L 88
84 Glucosa 66.4 g/L 79
Escherichia coli
Anaeróbica -- Glucosa
12 mol
as/mol
glucosa
--
Anaeróbica 144 Glicerol
1.7 mol
as/mol
glucosa
80
Anaeróbica 76 Glucosa 99.2 g/L 110
Anaeróbica 59 Glucosa 58.3 g/L 55
Aeróbica 50 Glucosa 13.5 g/L 95
Anaerobiospirillum
succiniciproducens
Anaeróbica Glicerol 3.54 g/L 167
Anaeróbica 22 Glucosa
+glicerol 29.6 g/L 97
Anaeróbica 30 Glucosa 33 g/L 93
Mannheimia
succiniciproducens
Anaeróbica 50 Glucosa 13.4 g/L 97
Anaeróbica 7.5 Glucosa 14 g/L 187
16
En la tabla 1 se muestran las concentraciones de succinato alcanzadas con
diferentes microorganismos, sustratos y tipos de fermentaciones. Claramente las
fermentaciones anaeróbicas presentas un mayor concentración de ácido respecto
a la aeróbica, y el microorganismo que genera la mayor concentración es
Escherichia coli (99.2g/L) con un rendimiento del 110%.
2.2.3 Limitaciones de la fermentación
La fermentación de carbohidratos presenta una seria de limitaciones, entre las que
se encuentran [11]:
El rango de pH para la fermentación según el tipo de bacteria empleada. Si
el pH sobrepasa el rango, habrá un mayor crecimiento celular pero
aumentando la cantidad de subproductos. Si el pH disminuye, va a
disminuir el crecimiento celular por la alta demanda para el mantenimiento
celular.
La generación de subproductos como acido acético y el fórmico, implican la
necesidad de agregar constantemente una base para mantener la
operación cerca de su pH óptimo. El hidróxido de sodio usado como base
en grandes cantidades causa la floculación de células, disminuyendo su
productividad.
Las bacterias pueden ser inhibidas por altas concentraciones su propio
producto.
La concentración adecuada de sustrato, pues cantidades erróneas pueden
causar inhibición de crecimiento celular o baja síntesis de producto.
2.3 GLICEROL
El glicerol o glicerina es un ácido graso con tres grupos hidroxilos y 3 carbonos,
con características higroscópicas. Se caracteriza por ser un líquido soluble en
agua, viscoso, sin color ni olor característico. Esta presente en los aceites y grasas
vegetales y animales asociadas a otros ácidos grasos [12].
17
Anteriormente su producción se basaba principalmente en la industria de los
glicéridos y del propileno como subproducto. Pero actualmente la industria del
biodiesel representa una fuente de glicerol como subproducto (10%wt) en grandes
cantidades [4], con características como: alto punto de ebullición, gran estabilidad
y poca solubilidad en agua, hidrocarburos y éteres [18].
Aunque posee diferentes usos en cosméticos, fármacos, lubricantes,
anticongelantes, bebidas, resinas, barnices, pinturas, etc., el aumento en su
producción ha ocasionado la búsqueda de nuevos usos relacionados con la
microbiología como fuente de carbono en fermentaciones [18]. Puesto que su
conversión química presenta un elevado costo al necesitar de presiones y
temperaturas altas [5].
Por tal razón, se han realizados diferentes estudios con el fin de darle un valor
agregado al glicerol entre estos:
La optimización in sílico de la producción de etanol en E. coli en un medio
de glicerol implementando análisis de flux metabólico dinámico y validez
experimental [21]. Al sobre al sobre-expresar diferentes genes como pflB,
adhE, gldA, gapA e Ipd, logrando incrementar la producción de etanol [22],
[23], [24].
Generación energía a partir de glicerol en celdas de combustible de
Pseudomonas aeruginosa [25]. Proceso al cual se le realizó un
modelamiento dinámico en COMSOL [26].
Uso del glicerol como sustrato para la producción de ácido succínico
mediante diferentes bacterias [16]
Síntesis de proteína celular a partir de Candida utilis o Torolopsis utilis
usando glicerol como fuente de carbono [27].
Producción de tensoactivos de origen microbiano a partir de P. aeruginosa
o Rodococcus erithopolys en medio salino con glicerol como fuente de
carbono [27].
Producción de hidrogeno, dihidroxiacetona, acido propiónico, acido cítrico,
1,3-propanodiol y 2,3-butanodiol mediante la fermentación de glicerol a
partir de diferentes microorganismos como E. coli, Enterobacter aerogenes,
G. oxydans, Propionibacterium acidipropionici, Yarrowia lipolytica y
Lactobacillus brevis entre otros [27].
18
2.4 ESCHERICHIA COLI
Son bacterias gram negativas, anaerobias facultativas, de rápido crecimiento
pertenecientes a la familia Enterobacteriacae. Existe un amplio numero de cepas
benéficas y dañinas para los animales y el ser humano. Normalmente se
encuentran en tractos intestinales y por ende en heces y aguas negras [28].
Este procariota ha sido uno de los mas estudiados genéticamente al tener un
genoma sencillo completamente secuenciado (3’200.000 pares de bases). Lo cual
ha permitido realizar gran cantidad de experimentos obteniendo diferentes
variantes de cepas con distintos fines [28].
E. coli es utilizada en la reducción de glucosa por vía fermentativa a acido
pirúvico, formando entre otros productos el acido succínico (Figura 2) como
subproducto en bajas cantidades de 12 mol/100 mol de glucosa [14].
Figura 2. Ruta metabólica de la glucosa por E. coli [29]
2.4.1 Metabolismo de glicerol por E. coli
Según estudios realizados la fermentación anaeróbica de glicerol con E. coli
produce acido acético, acido succínico, dióxido de carbono, hidrógeno y etanol
[30]. La adición de fosfatos de sodio y potasio al medio causan inhibición de este
proceso al igual que altas cantidades de hidrógeno y dióxido de carbono. El pH
optimo de la fermentación de glicerol es 6.3 [30], [31].
19
En la figura 3 se presenta la ruta metabólica de E.coli para fermentar glicerol y a
partir de este producir acido succínico, etanol y acetato.
Donde el glicerol es absorbido por la célula por medio de la enzima glpF, luego el
glicerol es transformado a glicerol 3-fosfato (G3P). El G3P por medio de las
enzimas glpABCD y tpiA se convierte a DHAP y a gliceraldehido 3-fosfato (GA3P).
El GA3P por medio de ADP y NAD se convierte a fosfoenolpiruvato (PEP), el cual
es crucial para la producción de ácido succínico, pues a partir de este compuesto
se puede producir succinato o etanol y acetato.
Figura 3. Ruta metabólica del glicerol por E. coli [16]
20
En la ruta para la producción del succinato, la enzima fosfoenolpiruvato
carboxilasa (ppc) es la encargada convertir PEP a oxoloacetato (OAA). El OAA
lleva a cabo una serie de conversiones pasando a malato, fumarato y finalmente a
succinato.
2.4.2 Ingeniería metabólica en E. coli para producción de ácido succínico
En estudios anteriores de acuerdo con Xueli, Shanmugam y Lonie [16] inactivar el
pflB elimina la producción de etanol y formato, y reduce la producción de acetato.
Pero disminuye el crecimiento y el rendimiento, por lo que proponen impedir la
reacción de oxoloacetato a PEP para conservar el ATP y aumentar la reserva de
aceptores de electrones, mediante pck*. Además, también encontraron que la
inactivación de cualquier gen esencial en el sistema de fosfotransferasa como el
pstI aumenta la producción de ácido succínico.
Así mismo, Lin, Bennet y Ka-Yiu [17] en 2004 realizaron un sistema de producción
con 4 mutaciones ∆sdh AB, ∆icl R, ∆pox B y ∆(ack A-pta). El cual tenía dos rutas
en el metabolismo central aeróbico del acido succínico: el ciclo glioxilato y el ciclo
TCA. Y al inactivar el ptsG y sobreexpresar el pepc obtuvieron un rendimiento de 1
mol de acido por mol de glucosa consumida.
De igual forma, en estudios realizados in sílico se encontró que al inactivar 3
genes involucrados en la formación de enzimas de piruvato (ptsG, pykF y pykA) la
producción de succinato incrementa más de 7 veces. Por lo que reducir el flux
metabólico a piruvato es crucial para alcanzar una eficiencia en la síntesis de
succinato mediante E. coli [32].
Por otra parte, se ha propuesto la sobreexpresión de PEP-carboxikinasa (pck) y
PEP-carboxilasa (ppc), donde solo la sobreexpresión de ppc tuvo un efecto en el
aumento de la producción de succinato 3.5 veces. Al igual se ha encontrado que la
inactivación de los genes pfl y Idh aumentan el rendimiento del acido a expensas
de la producción de etanol y acetato pero causan una disminución del crecimiento
microbiano [20].
Así mismo, se han introducido los genes Sorghum vulgare ppc y Lactococcus
lactis pyc en las cepas mutantes de E. coli que tienen inactivados los genes Idh-pfl
21
y Idh-pta-ack respectivamente para redireccionar el piruvato acumulado a acido
oxaloacético. Finalmente, para tratar de producir acido succínico aeróbicamente
se inactivó el succinato deshigrogenasa (sdh), el piruvato oxidasa (poxB), el pta-
ack, el operón aceBAK y los genes ptsG logrando un rendimiento del 85%
respecto a la glucosa [20].
2.5 LIBRERÍA ASKA
La librería genética ASKA del Instituto Nacional de Genética del Japón, es una
colección de clones de E. coli, que contiene los plásmidos portadores de genes
metabólicos individuales de la cepa E. coli K-12 W3110. Donde cada clon codifica
para una proteína de marcos de lectura abierta (ORFs) predictivo marcado con
histidina, 7 espaciadores en el extremo N.-terminal, 5 espaciadores amino ácidos y
una proteína fluorescente (GFP) en el extremo C-terminal [35].
2.5.1 Sobreexpresión de genes en E. coli
Escherichia coli ha sido ampliamente utilizado como organismo modelo debido a
la disponibilidad de la secuencia completa de su genoma. Sin embargo, sólo
alrededor del 50% de sus genes han sido caracterizados [35]. Dado que no se
conoce la función de varios genes, técnicas de genes individualmente clonados o
mutantes con supresiones serían útiles para descubrir su función [35].
Kitagwa et al, [35] realizó una librería genómica con todos los genes de función
conocida o desconocida de E. coli. Para esto, cada ORF fue amplificado por PCR
y clonado en un vector plásmido multicopia. En la construcción del plásmido
vector, cada plásmido fue marcado con histidina en N-terminal y GFP en C-
terminal del ORF, donde la proteína GFP es empleada para la detectar la
localización del producto proteico en la célula huésped y para indicar si clonación
de la amplificación del ORF fue exitosa.
22
Figura 4. Construcción del plásmido vector [35]
23
En la figura 4 se muestra como el extremo romo BamHI y el fragmento SacI de
pQB2 fueron ligados con el fragmento de resistencia a la kanamicina (kan)
amplificado de pHSG299 creando el plásmido pQA2-Km. Después se extrajeron
los fragmentos lacI y BamHI (otorga resistencia al cloranfenicol) por medio de
enzimas de restricción de los plásmidos pGeX-2TK y pNK2884 respectivamente
para formar el plásmido pCX2TK1. Luego se obtuvieron los fragmentos romo Aatll
y Nhel de pQA2-Km, junto con Smal-Fspl de pCX2TK1 para constituir el pCA21.
Finalmente se construyó el plásmido vector pCA24N cambiando el GFP original
por la forma mutante resistente al calor al unir el fragmento Stul-Smal con el PCR
amplificado de pGFPgcn4 [35].
IPTG es el inductor del promotor PT5-lac, encargado de activar la sobreexpresión
del gen clonado. Mientras no exista lactosa en el medio, el promotor estará
reprimido por el gen lacl.
24
3. METODOLOGÍA
3.1 SELECCIÓN DE CLON DE E. COLI
La selección del clon con el cual se trabajó en el proyecto se basó en una
búsqueda bibliográfica de los genes que interfieren en la ruta metabólica del
glicerol para la producción de ácido succínico de E. coli, como se observa en la
figura 3. Con base en los resultados de los estudios en ingeniería metabólica para
la producción de succinato se escogió trabajar con E. coli K-12 W3110/pCA24N
pcc+ el cual tiene sobreexpresado el gen fosfoenolpiruvato carboxilasa o ppc, pues
como se muestra en la figura 3 es el encargado de convertir PEP a OOA en la ruta
del succinato.
Además se encontró que en los estudios desarrollados anteriormente sobre
producción de ácido succínico con E. coli, empleando el glicerol como sustrato, el
gen ppc es uno de los genes sobreexpresados junto con frdABC. Mientras que
otros genes como ptsG, pykF, pykA, pfl, Idh, pta y ack son inactivados al impedir
que la mayoría del glicerol sea metabolizado hacia ácido succínico [20], [32].
Figura 5. Plásmido pCA24N [35]
25
En la figura 5 se presenta el mapa del plásmido usado como vector de clonación.
En este plásmido, como se dijo anteriormente, el promotor PT5-las es el encargado
de la sobreexpresión de los genes clonados en pCA24N, en este caso el gen ppc.
Por lo cual es necesario un inductor (lactosa) para que el promotor se libere del
represor [35].
3.2 MEDIOS DE CULTIVO
En el desarrollo del proyecto se emplearon tres medios de cultivo diferentes.
Inicialmente se utilizó un agar en placa para crecer el microorganismos para luego
inocular el microorganismo en un medio líquido y finalmente inocularlo en el medio
fermentativo.
Cultivo en placa
Inicialmente la bacteria estudiada fue cultivada en agar LIU sólido, con el fin de
favorecer el crecimiento celular de E. coli por la presencia de sales. La
composición del medio utilizado es: 8 g/L de glucosa, 8 g/L de extracto de
levadura, 3 g/L de KH2PO4, 3 g/L de K2HPO4, 1 g/L de NH4(SO4)2, 0.41 g/L de
CaCl2, 0.3 g/L de MnSO4, 4 g/L de MgSO4 y 15 g/L de agar- agar. Además, se
adicionan 50 μg/ml de cloranfenicol como antibiótico para obtener la selectividad
en el medio y para evitar que la bacteria pierda el plásmido.
En la preparación de este medio todos los componentes son esterilizados en
conjunto en un autoclave a excepción de la glucosa, el sulfato de magnesio y el
cloranfenicol. Las soluciones de glucosa y de sulfato de magnesio son
autoclavadas por separado para evitar caramelizar o quemar los compuestos [36].
Finalmente, la solución de cloranfenicol se esteriliza por medio de irradiación con
luz UV durante 24 horas.
26
Cultivo en medio líquido
Con el fin de montar la primera etapa de la fermentación fue necesario cultivar las
bacterias en el mismo medio LIU pero sin agar-agar, para evitar la solidificación
del medio.
Cultivo fermentativo
Finalmente, para realizar las fermentaciones se utilizó el medio LIU modificado. A
la composición del medio inicial se le retiró el agar-agar, las sales de potasio y la
glucosa. Ésta fue reemplazada por glicerol, en 3 concentraciones 10, 15 y 20 gr/L
de prueba. Además, se le agregó lactosa en concentraciones de 1 y 2 gr/L para
probar la mejor cantidad de inductor en la sobreexpresión del gen.
3.3 RECUPERACIÓN Y CRECIMIENTO DE E. Coli K-12 W3110/pCA24N pcc+
La cepa con el gen ppc clonado, objeto de estudio, fue identificado por el id:
JW3928 y localizado en las placas de la librería ASKA. Luego se sembró en el
medio de cultivo en placa dentro de la cabina de flujo laminar, previamente
limpiada y esterilizada con luz UV.
Las bacterias fueron sembradas por aislamiento en el medio de cultivo en placa y
colocadas durante 1 día a 37ºC en incubadora.
3.4 FERMENTACIÓN
3.4.1 Proceso fermentativo
El proceso fermentativo constó de dos partes: el preinóculo y la fermentación.
Primero se realizó el preinóculo, al tomar una colonia grande de la caja de petri e
inocularla en 40 ml de medio de cultivo. Luego, se incubó a 37ºC con agitación de
250 rpm durante 24 horas
27
Seguido a esto, se realizaron las fermentaciones. Para el montaje de cada curva
de crecimiento se empleó un erlenmeyer de 500 mL, con 180 mL de agar LIU
modificado, al cual se le agregaron 20 mL del preinóculo, para así tener un 10%
de inoculo. Las fermentaciones se realizaron anaeróbicamente por lo que fue
necesario agregarle a cada erlenmeyer un flujo de 8000 ml/min de nitrógeno
durante 5 minutos. Finalmente cada erlenmeyer se tapó con gaza y papel aluminio
para evitar contaminación y se colocaron en el agitador a 37 ºC a 150 rpm durante
77 hrs. Se tomaron muestras de 1.5 mL dos veces día. Por semana se montó un
experimento con 4 replicas. Las muestras son almacenada en el congelador hasta
su análisis.
3.4.2 Diseño experimental
Con base en lo explicado en la realización de medios, se manipularon dos
variables durante el proceso experimental: el glicerol con 3 concentraciones y la
lactosa con 2 concentraciones. Por lo anterior se planteó la siguiente combinación
de variables manipuladas (Tabla 2).
Tabla 2. Combinaciones de variables manipuladas
Medio Glicerol (g/L) Lactosa (g/L)
A 20 1
B 20 2
C 15 1
D 15 2
E 10 1
F 10 2
G x 0
28
Donde se aprecian 7 combinaciones de las variables para probar. De éstos, 6
medios definidos (A-F) y un medio control (G) con concentración de glicerol
desconocida inicialmente, ya que esta curva se realizó al final con la concentración
de glicerol que mejor rendimiento mostró en la producción de ácido succínico. Se
realizaron 4 réplicas de cada experimento.
3.5 CURVA DE CRECIMIENTO
Para medir el progreso de la reproducción celular, se cuantificó la biomasa
empleando un espectrofotómetro a 600 nm usando un estimado de masa celular
de 1 OD = 0.34 gr peso seco/L [31]. Utilizando celdas de plástico con un volumen
de 1 mL de muestra. Por cada experimento se tomaron 8 muestras en total, para
la cuantificación de la biomasa de las primeras 3 muestras (0, 5 y 24hr) se utilizó
1mL de la muestra directa. Mientras que para el resto de muestras (29-77 hr), se
diluyó 0.5 mL de muestra en 0.5 mL de medio, porque a partir de 1.5 OD se
generan factores de incertidumbre en el espectrofotómetro reduciéndose la
precisión y la exactitud de la medición.
3.6 CUANTIFICACIÓN DEL GLICEROL
Al igual que para la curva de crecimiento se realizaron muestreos de la
concentración de glicerol en cada muestra tomada usando un refractómetro digital.
Previamente se elaboró una curva de calibración del glicerol con diferentes
concentraciones del mismo en medio agotado.
El medio agotado se obtiene al final de una fermentación cuando la bacteria ha
consumido la mayoría de reactivos y producido diferentes sustratos que
interferirían con la curva de glicerol si se realizara con medio puro.
Una vez se obtiene el medio agotado, se centrifuga para remover las células y los
residuos sólidos. Con el líquido sobrenadante se realiza la curva de cuantificación
29
del glicerol. Para esto, se calcula la cantidad de glicerol necesaria para obtener
una concentración 1 g/L en el medio, se toma 1 ml de la solución y se mide en el
refractómetro digital. Luego, se hacen los mismos cálculos para concentraciones
de 2 a 20 gr/L de glicerol, con el respectivo volumen restante. Así, finalmente se
obtiene la curva del glicerol de 0 a 20 gr/L, que es la máxima cantidad de glicerol
aportada al medio.
3.7 CUANTIFICACIÓN DEL ÁCIDO SUCCÍNICO
La producción de ácido succínico fue cuantificada por medio de cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC). Empleando una columna C 18 de fase reversa,
utilizada para ácidos grasos. La columna fue operada a un flujo de 0.355 mL/min y
a una temperatura de 25ºC, usando 40 mM de buffer KH2PO4 con 2% de
acetonitrilo ajustado a un pH de 2.5 con HCl. La muestra fue leída con detección
de UV a 210 nm. Para esto, se toma 0.5 mL de muestra del medio, se
centrifugaron a 10.000 rpm por 10 min a 4ºC y el sobrenadante fue diluido con la
fase móvil (vol de muestra:buffer = 0.2:0.8 mL). Por último, se filtró en membranas
millipore de 0.22 μm [10]. Para cada corrida se prepararon estándares de 0, 0.5, 1,
1.5, 2 y 2.5 mg/ml de ácido succínico [10]
30
4. RESULTADOS Y ANÁLISIS
4.1 CURVAS DE CRECIMIENTO CELULAR
Con el fin de determinar el crecimiento celular de E. coli K-12 W3110 ppc en los
diferentes medios propuestos para este proyecto, se tomó lectura de la densidad
óptica de las diferentes muestras obteniendo las curvas de crecimiento para cada
caso. Se observó un crecimiento exponencial simple [37],
(1)
Donde X representa la concentración de microorganismo y la tasa efectiva de
crecimiento, la cual se obtiene siguiendo el modelo de la cinética de Monod [37],
(2)
Donde es la tasa efectiva de crecimiento, S el sustrato y Ks es la constante de
Monod.
En las figuras 6, 7 y 8 se muestra el crecimiento para cada concentración de
glicerol estudiada junto con las diferentes concentraciones de lactosa.
Para todos los casos estudiados se presentó un crecimiento similar, en donde la
reproducción celular empezó desde la hora cero sin presentar fase de adaptación
al medio. En la duración de la fase exponencial o de crecimiento se observaron
diferencias según la cantidad de glicerol adicionado al medio, ya que se observa
que las fermentaciones con 15 gr/L de glicerol tuvieron una fase exponencial de 48
hr, mientras que las fermentaciones con 20 y 10 gr/L presentaron la fase
exponencial por un lapso de tiempo entre 29 y 77 hr.
Sin embargo, al analizar el efecto de la concentración del sustrato sobre la
biomasa producida no se encontraron diferencias significativas entre el
crecimiento máximo alcanzado y la concentración inicial de glicerol. Obteniendo un
crecimiento óptimo para cada concentración de sustrato experimentada.
31
Figura 6. Crecimiento celular de E. coli K-12 W3110/pCA24N pcc+ en 20 gr/L de glicerol
con diferentes concentraciones de lactosa: 1 gr/L () y 2 gr/L()
Figura 7. Crecimiento celular de E. coli K-12 W3110/pCA24N pcc+ en 15 gr/L de glicerol
con diferentes concentraciones de lactosa: 1 gr/L (), 2 gr/L() y 0 gr/L()
Figura 8. Crecimiento celular de E. coli K-12 W3110/pCA24N pcc+ en 10 gr/L de glicerol
con diferentes concentraciones de lactosa: 1 gr/L () y 2 gr/L()
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0 20 40 60 80
Cre
cim
ien
to c
elu
lar
(OD
6
00
)
Tiempo (hr)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0 20 40 60 80
Cre
cim
ien
to c
elu
lar
(OD
6
00
)
Tiempo (hr)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0 30 60 90
Cre
cim
ien
to c
elu
lar
(OD
6
00
)
Tiempo (hr)
0 30 60 90
Tiempo (hr)
0 30 60 90
Tiempo (hr)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0 20 40 60 80Cre
cim
ien
to c
elu
lar
(OD
6
00
)
Tiempo (hr)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0 20 40 60 80Cre
cim
ien
to c
elu
lar
(OD
6
00
)
Tiempo (hr)
32
Así mismo, la concentración de lactosa no presentó un efecto significativo en el
crecimiento bacteriano para los montajes con 10 y 20 gr/L. No obstante, para la
fermentación con 15 gr/L en la figura 7 se observa un efecto significativo causado
por el aumento de la concentración del inductor. El cual puede ser explicado
posiblemente como la respuesta de la cepa en cuestión a un medio con dichas
concentraciones de sustrato e inductor, donde al aumentar la cantidad de lactosa
reprime de cierta forma la vía inducida hacia la producción de ácido succínico
utilizando el glicerol para generar biomasa en lugar del producto deseado.
4.1.1 Velocidad de crecimiento celular
Para establecer la velocidad específica máxima de crecimiento de cada
experimento, se ajustaron los datos a una cinética de Monod de primer orden.
Figura 9. Velocidad máxima de crecimiento de E. coli K-12 W3110/ pCA24N pcc+ en
diferentes concentraciones de glicerol y lactosa
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
20 15 10Ve
loc
idad
esp
ec
ífic
a m
áx
ima
de
cre
cim
ien
to (
gr/
Lh
r)
Glicerol (gr/L)
Lactosa 1 gr/L
Lactosa 2 gr/L
Lactosa 0 gr/L
33
Con base en el análisis de varianza de los datos mostrados en la figura 9, las
concentraciones de glicerol y de lactosa no son factores que afecten
evidentemente la cinética de crecimiento ya que se obtuvo un p-value de 0.289
para el glicerol y de 0.266 para lactosa, los cuales son menores a 3.01. Por otra
parte, la mayor velocidad máxima de crecimiento fue de 0.019 gr/Lhr en el ensayo
de 20 gr/ de glicerol y 2 gr/L de lactosa. Y la menor velocidad máxima obtenida fue
de 0.0083 gr/L en el ensayo de 15 gr/ de glicerol y 1 gr/L de lactosa.
4.2 CONSUMO DE GLICEROL
El consumo de glicerol como fuente de carbono para E. coli K-12 W3110 ppc se
cuantificó por la medición del índice de refracción (IR) de cada muestra. Primero
se realizó la curva de calibración del glicerol en medio agotado (Anexo 1) y luego
se transformaron los datos de IR a concentración de glicerol por medio de la
siguiente ecuación
(3)
Figura 10. Velocidad de consumo del glicerol por E. coli K-12 W3110/pCA24N pcc+ en
diferentes concentraciones de glicerol y lactosa
0
0,1
0,2
0,3
0,4
20 15 10
Velo
cid
ad
de c
on
su
mo
de
gli
cero
l (h
-1)
Glicerol (gr/L)
Lactosa 1 gr/L
Lactosa 2 gr/L
Lactosa 0 gr/L
34
En la figura 10 se presenta la velocidad de consumo de glicerol para cada
experimento. De esta gráfica a simple vista se infiere que la cantidad de glicerol
administrada al medio afecta la velocidad de consumo del sustrato por parte de
bacteria, pues se observan variaciones para cada concentración de glicerol. Sin
embargo al realizar el análisis estadístico se encontró que ningún factor posee un
diferencia significativa, pues se obtuvieron p-value menores a 3.01 (0.41 y .0.497
para glicerol y lactosa). Aún así, según estos datos las mayores velocidades de
consumo se consiguen al adicionar 15 gr/L de glicerol, implicando una mejoría en
el metabolismo del glicerol por parte E. coli K-12 W3110/pCA24N pcc+ y una
disminución en el tiempo de generación de biomasa.
4.3 PRODUCCIÓN DE ÁCIDO SUCCÍNICO
Por último se realizó seguimiento a la producción de ácido succínico mediante
cromatografía líquida de alta resolución.
Figura 11. Producción de ácido succínico por E. coli K-12 W3110/pCA24N pcc+
0
1
2
3
4
5
20 15 10
Ác
ido
su
ccín
ico
(g
r/L
)
Glicerol (gr/L)
Lactosa 1 gr/L
Lactosa 2 gr/L
Lactosa 0 gr/L
35
Según los valores de p-value obtenidos 0.333 (glicerol) y 0.230 (lactosa) < 3.01
no existe una diferencia significativa entre las diferentes concentraciones de
glicerol y de lactosa para la producción de succinato. Lo anterior se corrobora en
la figura 11 al analizar el efecto de la variación de glicerol no existe una tendencia
generalizada entre las distintas fermentaciones respecto a la cantidad de ácido
sintetizado. Sin embargo, al evaluar la producción de acuerdo a las variaciones de
lactosa se encuentra una tendencia, donde a menor cantidad de lactosa
adicionada mayor es la cantidad de ácido succínico producido.
Conforme a lo anterior, aunque no hayan diferencias significativas entre la
cantidad de lactosa adicionada al medio, se observa que con 1 gr/L lactosa se
obtienen concentraciones mayores de ácido succínico, lo cual sugiere que para
obtener mayores rendimientos se deberá trabajar con esta concentración.
Mientras que con 2 gr/L lactosa las cantidades del producto fueron bajas,
sugiriendo un posible inhibición de la sobreexpresión del gen ppc.
Por otro lado, los resultados obtenidos presentaron un comportamiento no
conforme a lo esperado respecto a la fase de producción del ácido succínico. Pues
este ácido al ser un metabolito secundario debería sintetizarse durante la fase
estacionaria y no desde principios del crecimiento celular comportándose como un
metabolito primario
4.4 ANÁLISIS DE LA INTERACCIÓN ENTRE LA CINÉTICA DE
CRECIMIENTO, LA CONCENTRACIÓN DE GLICEROL Y LACTOSA Y LOS
RENDIMIENTOS
Finalmente, se hallaron los rendimientos de sustrato y producto para cada
tratamiento para ser analizados en conjunto con los demás parámetros
encontrados, empleando las siguientes ecuaciones [7]:
(4)
36
(5)
Donde las letras i e f representan las condiciones iniciales y finales de la variable
enunciada (biomasa, producto o sustrato).
Tabla 3. Parámetros encontrados para cada fermentación realizada
Glicerol (gr/L)
Lactosa (gr/L)
μmax (gr/Lhr)
Vel de consumo
glicerol (h-1)
Ácido succínico
(gr/L) Yp/s Yp/x
20 1 0.011 0.132 3.033 0.298 1.423
15 1 0.008 0.283 4.849 0.357 2.602
10 1 0.010 0.121 0.401 0.046 0.246
20 2 0.019 0.177 0.918 0.072 0.394
15 2 0.012 0.291 0.733 0.052 0.313
10 2 0.011 0.088 0.013 0.002 0.006
15 0 0.013 0.240 0.240 0.132 0.780
Al analizar en conjunto los datos suministrados en la tabla 3, se evidencia un
efecto importante entra la cantidad de lactosa y el rendimiento producto-sustrato
(YP/S), dado que se obtuvieron mayores YP/S a concentraciones bajas de lactosa.
Es decir, que la ruta del glicerol hacía acido succínico es inducida por el gen
sobreexpresado (ppc) a concentraciones de 1 gr/L de inductor y entre 20 y 15 gr /L
de glicerol.
Por otro lado, se evidencia que los rendimientos producto-sustrato son muy bajos
para los casos en los que se utilizaron concentraciones de 2 y 0 gr/L de lactosa.
Es decir, que estas concentraciones de inductor no logran inducir la ruta del
glicerol hacia el producto deseado.
Por otra parte, al analizar el rendimiento producto-biomasa (YP/X) se encuentra una
relación directamente proporcional al YP/S en las fermentaciones con 1 gr/L de
lactosa. Implicando que dicha concentración de lactosa no solamente induce
directamente la ruta metabólica del glicerol hacia el ácido sino que también
37
indirectamente optimiza el uso de la fuente de carbono para lograr un aumento en
la cantidad de ácido producido por biomasa.
No obstante, al comparar las concentraciones obtenidas de producto con los
valores de otros estudios realizados empleando E. coli mutantes en condiciones
anaerobias donde obtuvieron entre 5 y 112 gr/L de ácido succínico realizando
alrededor de 4 mutaciones entre sobreexpresiones y supresiones de diversos
genes involucrados en la vía metabólica del glicerol y por cepa [7], se deduce que
aunque E. coli K-12 W3110/pCA24N pcc+ tiene buenos rendimientos, lo resultados
obtenidos no son tan efectivos debido, seguramente, a la cantidad de mutaciones
realizadas en los estudios anteriores [7].
38
CONCLUSIONES
Se puede concluir que las combinaciones de diferentes concentraciones de
glicerol y lactosa no tienen un efecto significativo en la velocidad específica
máxima de crecimiento celular.
Se encontró que a una concentración de 15 gr/L de glicerol se obtienen
velocidades de consumo del sustrato mas altas, aunque no haya efectos
significativos en el crecimiento celular. Por lo tanto se puede establecer que 15
gr/L de glicerol es la concentración más adecuada para disminuir el tiempo de
crecimiento de la bacteria.
Así mismo, se demostró que la mutación escogida logra aumentar la producción
de ácido succínico final. Al inducir de ruta metabólica del glicerol hacia el ácido
succínico cuando se le agrega 1 gr/L de lactosa, concentración de inductor capaz
de activar la sobreexpresión del gen deseado.
Finalmente, la cantidad máxima producida es baja al compararla con otros
estudios previamente realizados enunciados en [7] donde en condiciones
anaerobias se obtienen entre 5 – 112 gr/L de ácido succínico, por lo cual la cepa
E. coli K-12 W3110/pCA24N pcc+ no es apropiada para la producción del
succinato, si se planea montar una producción industrial del ácido de interés.
39
RECOMENDACIONES
Se recomienda relizar las fermentaciones anaerobias sustituyendo con dióxido de
carbono en lugar de nitrogéno el óxigeno disponible. Ya que el dióxido de carbono
al ser utilizado dentro de la ruta metábolica del glicerol podría mejorar la
producción del ácido succínico.
Sería conveniente en un estudio posterior buscar una técnica para cuantificar el
glicerol mas precisa y confiable en lugar el indice de refracción. Puesto que se
presentaron muchos problemas con esa mediciones y si se observan las curvas
de consumo de glicerol son las que presentan mayores desviaciones estandares.
Dado que no se cuenta con la posibilidad de realizar mas mutaciones a las cepas
sería bueno probar diferentes E. coli con otros genes sobreexpresados ó aliarse
con el departamento de microbiología para realizar las mutaciones encontradas en
literatura, para obtener mejores rendimientos de ácido succínico.
40
BIBLIOGRAFÍA
[1] G. Andrade, C. Pelayo, V. González, R. Corona, V. Alcaraz. “Modelamiento
matemático de la producción de ácido succínico por Actinobacillus
succinogenes ZT-130” en X Congreso Nacional de Biotecnología y
Bioingeniería, Jalisco, 2003.
[2] O. Kirk, “Encyclopedia of chemicals technology”. New York: Editorial Board,
1995, vol. 18, pp. 1250-1280.
[3] Royal society of chemistry.(2010). “Biosuccinic acid ready for take off?,” [En
línea]. Disponible:
http://www.rsc.org/chemistryworld/News/2010/January/21011003.asp
[4] Centro de información de innovación biotecnológica. (2011). Una cepa
microbiana transforma eficientemente el glicerol subproducto del biodiesel en
bioetanol. [En línea]. Disponible: http://www.ibercib.es/info_noticia/una-cepa-
microbiana-transforma-eficientemente-el-glicerol-subproducto-del-biodiesel-
en-bioetanol.aspx
[5] S. Yasdani and R. González, “Anaerobic fermentation of glycerol: A path to
economic viability for the biofuel industry,” Current opinion in biotechnology,
vol. 18, pp 213-219, 2007.
[6] Y. Dharmadi, A. Murarka & R. González, “Anaerobic fermentation of glycerol by
Escherichia coli: A new platform for metabolic engineering,” Biotechnology and
Bioengineering, vol. 94(5), pp. 321-329, 2006.
[7] H. Lin, G. Bennett, and S. Ka-Yiu, “Metabolic engineering of aerobic succinate
production systems in Escherichia coli to improve process productivity and
achieve the maximum theorical succinate yield,” Metabolic Engineering, vol. 7,
pp. 116-127, 2004.
[8] C. Andersson, “Succinic acid production using metabolically engineered
Escherichia coli,” Lulea: Lulea University of Technology, 2007.
[9] S. Nicolaou, S. Gaida & E. Papoutsakis, “A comparative view of metabolite and
substrate stress and tolerance in microbial bioprocessing: From biofuels and
41
chemical, to biocatalysis and bioremediation,” Metabolic Engineering, vol 12,
pp 307-331, 2010.
[10] G. García, R. Quintero & M. López, Biotecnología alimentaria. México:
Editorial Limusa, 2004, pp 553 – 576
[11] A. Hepburn, “The synthesis of succinic acid and its extraction from
fermentation broth using a two-phase partitioning biorreactor,”
Kingston:Queen’s University, 2011.
[12] A. Lehninger. Lehninger principles of biochemistry. New York: Freeman and
company, 2005.
[13] The Chemical Company. (2010). Succinic acid overview. [En línea].
Disponible: http://www.farmaciameritxell.com/productes/ru21.html
[14] J. Zeikus, M. Jain, P. Elankovan, “Biotechnology of succinic acid production
and markets for derived industrial products,” Applied Microbiology
Biotechnology, vol. 51, pp. 545-552, 1999.
[15] Yu-Peng, Pu Zheng, S. Zhi-Hao, Ye Ni, D. Jin-Jun, Z. Lei-Lei. “Economical
succinic acid production from cane molasses by Actinobacillus succinogenes,”
Bioresource Technology, vol. 99, pp 1736-1742, 2007.
[16] Z. Xueli, K. Shanmugam, and O. Lonie, “Fermentation of glycerol to succinate
by metabolic engineered strains of Escherichia coli,” Applied and
environmental microbiology, vol. 76, pp. 2397-2401, 2010.
[17] H. Lin, G. Bennett, and S. Ka-Yiu, “Metabolic engineering of aerobic succinate
production systems in Escherichia coli to improve process productivity and
achieve the maximun theorical succinate yield”, Metabolic Engineering, vol. 7,
pp. 116-127, 2004.
[18] C. Pyung, G. Woo, T. Sang, Ho Nam. “Succinic acid production with reduced
by-product formation in the fermentation of Anaerobiospirillum
succiniciproducens using glycerol as a carbon source,” Biotechnology and
Bioengineering, vol. 74, pp 41-48, 2001.
[19] J. Sang, S. ohak and L. Sang, “Genome-Based Metabolic Engineering of
Mannheimia succiniciproducens for Succinic Acid Production,” Applied
Environmental Microbiology, vol 72, pp. 1939-1948, 2006.
42
[20] S. Hyohak and Y. Sang, “Production of succinic acid by bacterial
fermentation,” Enzyme and Microbial Technology, vol. 19, pp. 352-361, 2006.
[21]C. Barreto, J. Ramirez, J. Gomez, A. González, “Optimización In Silico de la
Producción de Etanol en Escherichia coli en un Medio de Glicerol
Implementando Análisis de Flux Metabólico Dinámico y Validación
Experimental” en Primer Congreso Colombiano de Biología Computacional,
Bogotá, vol. 1, pp. 60, 2011.
[22] M. Basto y R. Jay-Pang R, “Ingeniería metabólica de Escherichia coli para la
producción de etanol a partir de glicerol,” Proyecto de grado de pregrado,
Universidad de los Andes, Bogotá, 2010
[23] S. Cañas y D. Díaz, “Optimización de la producción de etanol a partir de la
fermentación anaerobia del glicerol empleando herramientas de ingeniería
metabólica en la cepa Escherichia coli W3110,” Proyecto de grado de
pregrado., Universidad de los Andes, Bogotá, 2010.
[24] C. Urrego, “Aumento de la producción de etanol mediante la fermentación
anaeróbica de glicerol con Escherichia coli al sobreexpresar el gen pflB,”
Proyecto de grado de pregrado, Universidad de los Andes, Bogotá, 2009.
[25] A. Solares, C. La Rotta, J. Mejia, M. Nitschke, A. González, “Generación de
energía a partir de Glicerol en celdas de combustible de Pseudomonas
aeruginosa” en XIX Congreso de la SIBAE Sociedad Iberoamericana de
Electroquímica, España, 2010.
[26] L. Avellaneda, D. Urbina, A. González, “Modelaje dinámico de una celda de
combustible microbiana a partir de un modelo a escala genómica de P.
aeruginosa PAO1acoplado con un modelo en dos dimensiones en COMSOL,”
en Primer Congreso Colombiano de Biología Computacional, Bogotá, pp 59,
2011.
[27] A. Montouto, “Diseño de una plana piloto para la bioconversión del glicerol
procedente de la industria de los biocombustibles,” Proyecto de grado de
pregrado, Universidad de Cadiz, España, 2010.
[28] Paper blog (2011). Escherichia coli. [En línea]. Disponible:
http://es.paperblog.com/e-coli-643781/
43
[29] E. Conn, P. Stumpf, G. Bruening, D. Roy. Bioquímica fundamental. México:
Editorial Limusa, 1996.
[30] A. Murarka, Y. Dharmadi, S. Shams, R. González, “Fermentative utilization of
glycerol by Escherichia coli and its implications for the production of fuels and
chemicals,” Applied and Environmental Microbiology, vol 74, pp. 1124-1135,
2007.
[31] A. Murarka, Y. Dharmadi, S. Shams, R. González, “A new model for the
anaerobic fermentation of glycerol in enteric bacteria: trunkand auxiliary
pathways in Escherichia coli,” Metabolic Engineering, vol. 10, pp. 234-245,
2008.
[32] J. Sang, L. Dong, Y. Tae, “Metabolic engineering of Escherichia coli for
enhanced production of succinic acid, based on genome comparison and in
silico gene knockout simulation,” Applied and Environmental Microbiology, vol.
71, pp. 7880-7887, 2005.
[33] M. Kitawaka, A. Takeshi, A. Mohammad, I. Tomoko, I. Eiji, T. Hiromi and M.
Hirotada, “Complete set of ORF dones of Escherichia coli ASKA library (A
complete set of E. coli k-12 ORF Archive): Unique resources for biological
research,” DNA Research, vol. 12, pp. 291-299, 2005.
[34] C. Andersson, D. Hodge, K. Berglund, U. Rova. “Effect of different carbon
sources on the production of succinic acid using metabolically engineered
Escherichia coli,” Biotechnology Progress, vol. 23, pp. 381-388, 2007.
[35] M. Kitagawa, T. Ara, M. Arifuzzaman, T. Ioka-Nakamichi, E. Inamoto, H.
Toyonaga & H. Mori, “Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA
library (a complete set of E. coli K-12 ORF archive): unique resources for
biological research,” DNA Research, vol 12, pp. 291 – 299, 2006
[36] M. Basto y R. Jay-Pang R, “Ingeniería metabólica de Escherichia coli para la
producción de etanol a partir de glicerol,” Proyecto de grado de pregrado,
Universidad de los Andes, Bogotá, 2010.
[37] S. Fogler, “Elements of chemical reaction engineering”. U.S.A: Prentice Hall,
2004, 4° edición
44
ANEXOS
Anexo 1. Curva de calibración del glicerol
Figura 1. Curva de calibración del glicerol
y = 8482,2x - 11338 R² = 0,9754
-5
0
5
10
15
20
25
1,336 1,3365 1,337 1,3375 1,338 1,3385 1,339 1,3395
Indice de refracción
Indice de refracción
Lineal (Indice de refracción)
[Glicerol](gr/L) IR
20 1.3391
18 1.3387
16 1.3385
14 1.3381
12 1.3380
10 1.3379
8 1.3377
6 1.3375
4 1.3373
2 1.3369
0 1.3365
45
Anexo 2. Curvas de consumo del glicerol
Figura 2. Consumo de glicerol de E. coli K-12 W3110/pCA24N pcc+ en medio con 20 gr/L
de glicerol y diferentes concentraciones de lactosa: 1 gr/L () y 2 gr/L()
Figura 3. Consumo de glicerol de E. coli K-12 W3110/pCA24N pcc+ en medio con 15 gr/L
de glicerol y diferentes concentraciones de lactosa: 1 gr/L (), 2 gr/L() y 0 gr/L ()
0
5
10
15
20
25
0 20 40 60 80
Glicero
l (g
r/L
)
Tiempo (hr)
0
5
10
15
20
25
0 20 40 60 80G
licero
l (g
r/L
) Tiempo (hr)
0 30 60 90Tiempo (hr)
0 30 60 90Tiempo (hr)
0
3
6
9
12
15
18
0 30 60 90
Glic
ero
l (gr
/L)
Tiempo (hr)
46
Figura 4. Consumo de glicerol de E. coli K-12 W3110/pCA24N pcc+ en medio con 10 gr/L
de glicerol y diferentes concentraciones de lactosa: 1 gr/L () y 2 gr/L()
0
2
4
6
8
10
12
0 20 40 60 80
Glicero
l (g
r/L
)
Tiempo (hr)
0
2
4
6
8
10
12
0 20 40 60 80
Glicero
l (g
r/L
)
Tiempo (hr)
47
Anexo 3. Curvas de producción del ácido succínico
Figura 5. Producción de ácido succínico por E. coli K-12 W3110 ppc en medio con 20 gr/L
de glicerol y diferentes concentraciones de lactosa: 1 gr/L () y 2 gr/L()
Figura 6. Producción de ácido succínico por E. coli K-12 W3110 ppc en medio con 15 gr/L
de glicerol y diferentes concentraciones de lactosa: 1 gr/L (), 2 gr/L() y 0 gr/L ()
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
0 20 40 60 80
[Ác
ido
su
ccín
ico
] g
r/L
Tiempo (hr)
0
1
2
3
4
5
0 50
[Ác
ido
su
ccín
ico
] g
r/L
Tiempo (hr)
48
Figura 7. Producción de ácido succínico por E. coli K-12 W3110 ppc en medio con 10 gr/L de glicerol y diferentes concentraciones de lactosa: 1 gr/L () y 2 gr/L()
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0 20 40 60 80
[Ác
ido
su
ccín
ico
] g
r/L
Tiempo (hr)
