INFORME LAB. N. 3 GENETICAELECTROFORESIS

MONICA ALEJANDRA MONTOYA OVIEDOJULY ALEXADNRA HERNANDEZ LOPEZHEIDY JULIETH CALDERON HERRADA

UNIVERSIDAD DEL TOLIMALIC. EN EDUCACION BÁSICA CON ENF. EN CIENCIAS NATURALES Y

EDU. AMBIENTALGENETICA Y BIOLOGIA MOLECULAR

IBAGUE2009

INFORME LAB. N. 3 GENETICAELECTROFORESIS

MONICA ALEJANDRA MONTOYA OVIEDOCOD: 050950022005

JULY ALEXADNRA HERNANDEZ LOPEZCOD: 050950252005

HEIDY JULIETH CALDERON HERRADACOD: 050950542005

Presentado a:MARIBEB CASTRO GONZALEZ

UNIVERSIDAD DEL TOLIMALIC. EN EDUCACION BÁSICA CON ENF. EN CIENCIAS NATURALES Y

EDU. AMBIENTALGENETICA Y BIOLOGIA MOLECULAR

IBAGUE2009

OBJETIVOS

- Realizar la separación de macromoléculas de DNA utilizando la técnica analítica de Electroforesis.

- Observar la diferente movilidad que presentan las moléculas cargadas de DNA de células de epitelio bucal y células vegetales, cuando son sometidas a la influencia de un campo eléctrico.

INTRODUCCIÓN

En el presente informe se describe lo ocurrido en la práctica de laboratorio donde se llevó a cabo un proceso metodológico en el cual se aplica una técnica para la separación de moléculas de DNA según la movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica. Los ácidos nucleicos en nuestro caso el DNA de células del epitelio bucal, y de células vegetales de una cebolla cabezona, ya disponen de una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polo positivo.

El método utilizado es el de electroforesis en gel, un grupo de técnicas empleadas por los científicos para separar moléculas basándose en propiedades como el tamaño, la forma o el punto isoeléctrico. El gel de agarosa se refiere a la matriz usada en nuestra práctica de laboratorio para separar las moléculas, ya que para separar ácidos nucleicos grandes (más de unos centenares de bases), la matriz empleada es agarosa purificada.

La primera parte del nombre, electroforesis, se refiere a la fuerza electromotriz que es empleada para desplazar las moléculas a través del gel. Al situar las moléculas en el gel y aplicar una diferencia de potencial eléctrico, las moléculas se mueven a diferentes velocidades, hacia el cátodo, si están cargadas positivamente, y hacia el ánodo, si están cargadas negativamente.

En los ácidos nucleicos qué es el caso de nuestro análisis, la dirección de migración es del electrodo negativo al positivo, y esto es debido a la carga negativa presente en el esqueleto azúcar-fosfato. Cuando esto ha finalizado continuamos con la revelación de lo ocurrido, haciendo uso de un colorante específico que las hizo visibles, el bromuro de etidio, y puesto que era un reactivo fluorescente se pudo realizar la observación en la cámara de luz UV.

MARCO TEÓRICO

La electroforesis es una técnica de separación que consiste en el transporte de iones a través de una disolución por la acción de un campo eléctrico. Se aplica una diferencia de potencial eléctrico entre dos electrodos con cargas eléctricas opuestas y los iones presentes en la disolución se mueven hacia uno u otro electrodo según su propia carga:

- Los cationes (iones con una carga eléctrica positiva) se mueven hacia el cátodo (iones con una carga eléctrica negativa).

- Los aniones (iones con una carga eléctrica negativa) se mueven hacia el ánodo (electrodo con una carga eléctrica positiva).

Movilidad electroforética

En un sistema electroforético actúan dos fuerzas opuestas sobre cada molécula con carga eléctrica:

- La fuerza debida al campo eléctrico,

F = Q.E

Donde: Q = carga eléctrica del ión (positiva o negativa); E = Intensidad del campo eléctrico.

- La fuerza debida a la resistencia de la disolución que viene dada por la ley de Stock,

F’ = 6 . . r . t .v

Donde:

= Constante r = radio del iónt = viscosidad de la soluciónv = velocidad del ión

El resultado de ambas fuerzas es el movimiento del ión a través de la disolución a una velocidad constante. Esta velocidad dividida por la intensidad del campo eléctrico se conoce como movilidad electroforética. La movilidad electroforética es directamente proporcional a su tamaño y a la viscosidad de la disolución en la que discurre la electroforesis.

La electroforesis en gel es una técnica empleada para separar moléculas o fragmentos de moléculas de ácidos nucleicos. Los materiales más comunes para separar las moléculas de los ácidos nucleicos son polímeros como la poliacrilamida o la agarosa. Estos geles se colocan en la cubeta de

electroforesis, sumergidos en un tampón de pH alrededor de 8. De esta forma, las moléculas de DNA o RNA sometidas a electroforesis se desplazarán al polo positivo ya que a pH superiores a 5 poseen carga negativa. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Así, moléculas de DNA de diferente tamaño, van a emigrar de forma distinta en un gel de electroforesis. La distancia recorrida por cada fragmento de DNA va a ser inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. Es importante la utilización de marcadores de tamaño conocido porque nos permitirán calcular los pesos moleculares de las muestras de DNA problema.

En los geles de agarosa se debe añadir bromuro de etidio, sustancia que se intercala entre las bases del DNA y es fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. Tras la electroforesis, se visualiza el gel con una lámpara de luz UV, y se verán las bandas correspondientes a las muestras de DNA aplicado y los marcadores de peso molecular.

METODOLOGIA

ELECTROFORESIS

MATERIALES

- Gel Agarosa 0.9%

- Buffer de Tris-borato EDTA (0,45m TRIS 0,45 M)

- Ácido bórico, 10mM EDTA pH 8,0

Procedimiento

1. Prepare un gel de agarosa 0.9%. sumerja la placa de gel de agarosa en buffer TBE depositado en la cámara horizontal de Electroforesis.

2. Sirva 10µl de las muestras respectivas más 1µl de buffer carga en la gel de agarosa.

3. Corra una electroforesis a 110 V. 1 hora.

4. Sumergir el gel de agarosa donde corrió el ADN en Bromuro de Etidio durante 15-20 minutos.

5. Lavar con buffer.

6. Visualice ADN bajo la luz UV.

RESULTADOS Y ANALISIS DE RESULTADOS

Preparación de gel agarosa al 0.9% Placa de Gel donde se colocaran las muestras

Preparación de la cámara horizontal con buffer de TBE.

Muestras respectivas de ADN de células epiteliales y células vegetales.

Placa de Gel agarosa lista para meter en la cámara horizontal de Electroforesis.

Buffer de carga de azul de fromofenol. 10µl de Buffer y muestra servidos.

Se distribuyen las muestras con el buffer de carga en la gel de agarosa para correr la electroforesis.

Electroforesis a 110V durante 1 hora.

Parte de la placa del gel de agarosa luego de la electroforesis. Bromuro de Etilo para depositar la gel.

Se saca luego de 15 minutos de sumergida. Se lava con Buffer de TBE.

Placa de gel de agarosa vista en la luz UV.

ANÁLISIS DE RESULTADOS

- Se añadió una muestra de ADN vegetal (cebolla) y ADN animal (tejido epitelial) en un extremo del gel de agarosa, aplicamos carga eléctrica y los fragmentos de ADN se empezaron a desplazar a través de los poros de la gel hacia el polo positivo ya que el ADN tiene carga negativa, lo que significa que el fragmento más pequeño migrará más hacia el polo positivo, utilizamos un buffer de carga que permitía ver mejor el desplazamiento de la muestra, por último para poder observan en la luz UV se sumergió en Bromuro de Etidio con las medidas de seguridad necesario ya que se trataba de una sustancia altamente cancerígena. Éste último con el fin de hacer la revelación de la existencia de los fragmentos de ADN puesto que es el colorante fluorescente que se inserta entre estos para permitir evidenciar la existencia de los mismos bajo la luz UV.

- Podemos ver que la placa observada indica que tres de las muestras presentan más fluorescencia que las otras dos. Sin embargo también sucede que las dos muestras que presentan menor fluorescencia para su detección genera un desplazamiento mayor a lo largo de la placa indicando que su desplazamiento hacia el polo positivo fue más rápido ya que poseen diferente peso molecular, las muestras que corrieron más debieron presentar menor tamaño y peso.

CONCLUSIÓNES

La electroforesis en gel de agarosa es de las más empleadas para analizar y caracterizar ácidos nucleicos de distintas procedencias. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma.

Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Así, moléculas de DNA de diferente tamaño, van a emigrar de forma distinta en un gel de electroforesis. La distancia recorrida por cada fragmento de DNA va a ser inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular.

La rapidez con que migren las moléculas puede ser regulada por la concentración de agarosa disuelta en buffer que usemos: a mayor concentración, mayor compactación de la red y por tanto menor velocidad de migración. La concentración que elijamos dependerá de lo que se quiera separar en cada corrida.

La electroforesis en general permite la separación de moléculas como consecuencia de su diferente movilidad en un campo eléctrico.

BIBLIOGRAFÍA

1. Fuentes X; Castiñeiras M; Queraltó J. 1997. Bioquímica clínica y Patología molecular. Vol I. Editorial Reverté S.A. Barcelona. Pág: 169

2. A.A. 2008. Protocolos y métodos de laboratorio de Biología Molecular, Facultad de Medicina UASLP. Preparación de Buffer TBE.

3. Schmidt A; Fuchs. M; Fuenmayor F. 2007. La Electroforesis de Isoenzimas: principios y aplicaciones en el cultivo de la yuca. ISSN: 1690-4117. Venezuela.

4. Padilla C; Diez J; Martínez E; Bárcena J; García C. 2005. Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa. Aislamiento y caracterización electroforética de DNA plasmídico. Departamento de Bioquimica y biología Molecular. Campo Universaitario de Rabanales. Argentina.

5. García H. 2000. Electroforesis en geles de poliacrilamida: fundamentos, actualidad e importancia. Laboratorio Beterá. Cuba.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué es la electroforesis y cuál es su fundamento?

R/:

El término electroforesis fue creado por Michaelis en el 1909, para describir la migración de los iones por la influencia de un campo eléctrico, ya que se cumple con un principio simple “las moléculas con carga negativa migran para el polo positivo, y las de carga positiva al polo negativo”. La electroforesis es una técnica relativamente simple, rápida y de alto valor informativo. Su aplicación en la identificación de proteínas ha sido aplicada en estudios de taxonomía, fisiología y genética de plantas, animales y microorganismos. La electroforesis también puede ser empleada en la determinación de pesos moleculares de proteínas y en la caracterización de moléculas como los ácidos nucleicos DNA y RNA.

Fundamentos de la Electroforesis:

Alta sensibilidad, resolución y versatilidad. Método de separación de: Acidos nucleicos, proteínas y

otras biomoléculas. Alto criterio de pureza. Separa mezclas complejas. Permite determinar: peso molecular de una proteína, punto

isoeléctrico, número de cadenas polipéptidas de una proteína. Migracion de solutos en un campo eléctrico. Se mueven las partículas en base a: su carga neta, peso

molecular y estructura tridimensional.

2. ¿Qué tipo de sustratos se utilizan para realizar una electroforesis, cual es la aplicación de cada uno de ellos?

R/:

Electroforesis en gel de poliacrilamida: Los geles de poliacrilamida constituyen un excelente medio de soporte para separaciones electroforéticas, dado que reúnen una serie de propiedades idóneas: transparencia, elasticidad, porosidad controlable y compatibilidad con una gran variedad de compuestos químicos. La poliacrilamida se forma por copolimerización de dos compuestos, la acrilamida y la bis-acrilamida (N,N'-metilén-bis-acrilamida), en una reacción iniciada por la tetrametiletiléndiamina (TEMED) y el persulfato de amonio. El radical persulfato activa al TEMED, el cual a su vez activa al monómero de acrilamida para que polimerice. Las cadenas de poliacrilamida son entrecruzadas al azar por la bisacrilamida, formándose así una red de

porosidad bastante uniforme, que puede ser regulada variando las condiciones de la reacción y las concentraciones de los monómeros. Entre las diversas técnicas de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE, por sus siglas en inglés "polyacrylamide gel electrophoresis"), probablemente la más utilizada es la modalidad que se lleva a cabo en presencia del detergente duodecilsulfato de sodio (SDSPAGE), tanto para analizar mezclas de proteínas, como para ser combinada con técnicas de inmunoelectrotransferencia.

Electroforesis en geles de agarosa: La agarosa es un polisacárido extraído de algas marinas que tiene la propiedad de mantenerse en estado sólido a temperatura ambiente pero que a altas temperaturas se torna líquida. Esta característica permite una fácil preparación de una matriz porosa para ser usada en electroforesis. Este gel esta constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras poliméricas embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda el paso de las moléculas, se usa usualmente para separar moléculas grandes de alrededor 20.000 nucleótidos.

Electroforesis en geles de gradiente: es una técnica de huella, rastreo o trazado molecular (vulgarmente conocida en Inglés como molecular fingerprinting) usada en diversas disciplinas de la biología y la química, que consiste en la separación de cadenas de ADN de doble cadena dependiendo de su punto de desnaturalización, siendo dicha desnaturalización definida en éste caso como la separación de cadenas

complementarias de ADN. El uso de geles de poliacrilamida que tienen

un gradiente creciente de concentración de acrilamida+bisacrilamida, y en consecuencia un gradiente decreciente en el tamaño de poro, pueden tener ventajas sobre los geles de concentraciones uniformes de acrilamida. Generalmente los gradientes se establecen entre el 3 y el 30% de acrilamida en gradientes lineales o cóncavos. El rango a emplear dependerá del tamaño de las proteínas a separar. En un gel en gradiente la proteína migra hasta que alcanza una zona donde el tamaño de poro impide cualquier avance. Una vez se alcanza el “límite de poro” no se produce una migración apreciable aunque no se detiene completamente. Los geles en gradiente se preparan mezclando las soluciones de acrilamida de las concentraciones extremas en un formador de gradientes. Se suele adoptar la inclusión en la solución de polimerización de glicerol o sacarosa para aumentar la densidad de las soluciones y evitar las mezclas en el proceso de preparación del gradiente.

MATERIALES USADOS EN EL PROCESO DE ELECTROFORESIS

Bromuro de Etidio es empleado para la visualización de los ácidos nucleicos utilizado como colorante fluorescente. Este colorante tiene la propiedad de intercalarse entre las bases nitrogenadas del ADN y el ARN. Debido a esta propiedad es un agente mutagénico y debe manipularse con cuidado. El bromuro de etidio generalmente se incorpora a la agarosa antes de “chorrear” el gel, o puede incorporarse luego de la corrida electroforética.

Buffer de tris-borato-EDTA (TBE) Posee alta fuerza iónica, alta capacidad para tamponar (no requiere re-circulación), se emplea para electroforesis de fragmentos pequeños y se emplea para geles analíticos. La movilidad electroforética del ADN se ve afectada por la composición y la fuerza iónica del tampón de electroforesis. En ausencia de iones, la conductancia eléctrica es mínima y el ADN migra lentamente o ni siquiera se desplaza. En un tampón de elevada fuerza iónica la conductancia eléctrica es muy elevada y se genera una importante cantidad de calor.

Buffer de Siembra (Azul de Bromofenol) es un colorante que permite ver la corrida (corre como si tuviera 500 pb de peso, es decir, está en el frente de la corrida), durante la electroforesis, controla a la muestra para que esta no cambie de orientación o se pase del lugar donde se encuentra dicho gel.

3. ¿Qué observaciones se hicieron, durante la práctica?¿Qué diferencia encontró entre las muestras analizadas?¿ a que se deben las diferencias?

R/:

En la práctica se trabajo con dos muestras diferentes una célula animal (tejido epitelial) y célula vegetal (cebolla). A la hora se someter estas muestras a electroforesis en gel de agarosa se observo que la vegetal corría mas rápido debido a que el ADN es más liviano en comparación al recorrido que realizo la muestra de tejido epitelial que lo hizo más lento ya que el ADN es más pesado. Y como sabemos el gel de agarosa permite un buen desplazamiento pero este se ve afectado por el tamaño del ADN analizar al igual que el tamaño del poro de dicha gel.