INFORME FINAL DEL SERVICIO SOCIAL

NOMBRE: EDITH CORTES BARBERENA

MATRICULA: 89239054

LICENCIATURA: BIOLOGIA EXPERIMENTAL. DIVISION DE C . B . S . UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA - I Z T .

TRIMESTRE LECTIVO: 93-0.

HORAS SEMANA: 30 HRS.

TITULO: "DETECCION DE CELULAS RESISTENTES A LA 6- TIOGUANINA EN MEDULA OSEA DE RATAS DESNUTRIDAS DURANTE LA LACTANCIA"

ASESORES: DR. ALDA ROC10 ORTIZ MUNIZ PROFESOR TITULAR "C" DE TIEMPO COMPLETO. LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR. DEPTO. DE CIENCIAS DE LA SALUD. D I V I S I O N D E C . B . S .

LUGAR: LABORATORIO DE BIOLOGIAXELULAR. C . B . S . UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA, UNIDAD IZTAPALAPA.

FECHA DE INICIO: 15 DE JUNIO DE 1993.

FECHA DE TERMINACION: 15 DE DICIEMBRE DE 1993.

C L A V E : S S . C B S . 3 7 7 . 9 3

NOMBRE DEL PROYECTO: "EFECTOS A NIVEL CELULAR DE LA DESNUTRICION"

'EDITH C ~ T E S BARBERENA (ALUMNO 1

DRA. A L O A ROC10 ORTIZ (ASESOR 1

MURIZ

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

UNIDAD IZTAPALAPA

DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD

"DETECCION DE CELULAS RESISTENTES A LA 6-TIOGUANINA EN MEDULA

OSEA DE RATAS DESNUTRIDAS DURANTE LA LACTANCIA"

INFORME FINAL DE SERVICIO FINAL

QUE PARA OBTENER LA LICENCIATURA EN BIOLOGIA EXPERIMENTAL

P R E S E N T A

EDITH CORTES BARBERENA

ASESOR: DRA. ALDA ROC10 ORTIZ "I12

INDICE

I ANTECEDENTES

A 1 DESNUTRICION

1 ) D e f i n i c i b n e importancia

2 ) Estudios sobre desnutr ic ibn

B MUTACIONES

C ) GEN HPRT

1-9

1

2

5

7

I 1 J U S T I F I C A C I O N 10

I11 OBJETIVO 10

IV H I P O T E S I S 10

V METODOLOGIA 11-13

1 ) Desnutricidn experimental durante l a l a c t a n c i a 1 1

2 ) Extraccibn de medula dsea 1 1

3) Siembra de c 6 l u l a s 12

4 ) Cosecha 12

5 ) Real i zac idn de DreDaraciones y t i n c i b n 13

VI RESULTADOS 14

VI1 DISCUSION 21

VI11 CONCLUSION 24

BIBLIOGRAFIA 25

Alumna: Edith Cortes Barberena. Asesor: Dra. Alda Rocio O r t i z

MuAi z .

Labora tor io de B i o l o q j a C e l u l a r , Departamento de C ienc ias de l a

Salud, D.C.B.S.

I ANTECEDENTES

A 1 DESNUTRICION

1 ) D e f i n i c i d n e Importancia.

Actualmente se sabe que e l medio puede a f e c t a r e l d e s a r r o l l o

de l hombre, desde e l momento de su concepcibn hasta e l momento de

su muerte. En cada estadlo de su desar ro l lo , e l o rgan ismo humano

es e l Droducto de l a i n t e r a c c i d n de su dotacidn gendtica Y e l

medio que l o rodea (Crav ioto y A r r i e t a , 1985).

Una etapa importante del humano, despues de su nacimiento.

es l a i n f a n c i a . D u r a n t e e s t a e t a p a l a n u t r i c i b n es un factor muy

importante para su crecimiento y desar ro l lo bp t imos. Desde hace

tiempo se ha aceptado que para e l humano e l a l imento representa

a lgo m& que n u t r i e n t e s . Algunos a u t o r e s l a .jrlrzgan Dot- lo menos

desde t r e s b n q u l o s : e l n u t r i o l d g i c o , que comprende e l e s t u d i o de

l a d i e t a : e l d i e t o l d g i c o que es e l e s t u d i o de los al imentos que

componen l a d i e t a : y e l ps ico l¿qico que comprende l a

1

est imu lac lbn aue Dara e l desar ro l lo emoc lona l deber la ser

efectuada Dor medio de l a d l e t a . ( C r a v i o t o Y A r r i e t a . 1 9 8 5 ) .

Cuando e x i s t e un problema en l a i n t e r a c c l b n e n t r e e s t o s t r e s

aspectos se produce l a d e s n u t r i c i b n c a l b r i c o - p r o t e i c a (DCP) l a

cual es un sjndrome c l i n i c 0 que se presenta principalmente en

n i f ios lac tan tes y preescolares, debido a una ba ja inqes t ibn de

pro te inas de or igen animal, o p o r s u u t i l i z a c i d n d e f i c i e n t e ,

acompafiada de inges t iones var iab les de a l imentos r i cos en

carbohidratos. (Crav ioto y A r r i e t a . 1 9 8 5 ) .

La DCP es uno de los Drincipales problemas de salud pllrblica

en Dajses subdesarrollados. Estudios sobre l a m o r t a l i d a d i n f a n t i l

en palses lat inoamericanos revelan que l a DCP es responsable

d i r e c t a o ind i rectamente de mbs de un t e r c i o de las muertes de

n iRos en t re las edades de O a 5 afios de edad. ( A r r i e t a y

Crav ioto, 1982 1.

2 1 Estudios sobre desnutr ic ibn.

Los es tud ios en humanos son ind ispensables. s in embargo.

para entendimiento de los efec tos de l a DCP en diversos aspectos

son imposibles e inaceptab les es te t ipo de e s t u d i o s en nifios,

ademas l a d e s n u t r i c i d n v i e n e acompafiada de o t r o s padecimientos

(p r inc ipa lmente in fecc iones) . Es por esta razdn que se proponen a

estudios en animales desnutr idos experimentalmente como modelos,

de esta manera se pueden con t ro la r d i ve rsas va r iab les . Los

2

animales u t i l i z a d o s e n e s t e t i o o de estuldios san Drlncioalmente

ratdn, r a t a , cone.)o, cerdo Y mono. ( O r t i z , 1 9 8 7 ) .

La desnut r i c idn en animales se ha inducido en d i f e r e n t e s

grados, disminuyendo l a c a n t i d a d o ca l idad de l a l imento . Tambien

se ha provocado en d i fe ren tes e tapas de l a v i d a de l organismo.

desde l a prenatal hasta l a a d u l t a . La l a c t a n c i a se considera

como l a e t a p a c r i t i c a , ya que en e s t a e l crecimiento es muy

acelerado y corresponder fa a l a etapa de nifiez temprana donde l a

desnu t r i c i bn es prevalente. ( O r t i z , 1 9 8 7 ) .

La d e s n u t r i c i h ha s ido ob. je to de va r ios es tud ios , t an to a

n i v e l de e fec tos de organismos, t ratamientos, y e fec tos a n i v e l

ce lu la r , b ioqu im ico , c i t ogene t i co , e t c .

Estudios en humanos y en animales muestran aue los t e j i d o s

l i n f o i d e s s u f r e n a t r o f i a . Se han d e s c r i t o cambios anatbmicos en

l o s t e j i d o s l i n f o j d e s d u r a n t e l a d e s n u t r i c i b n . E l t imo t iene una

reduccibn en peso y tamafio, adernas p i e r d e d i f e r e n c i a c i b n

cort icomedular. encontrandose muy Docas c e l u l a s l i n f o i d e s . E l

bazo t a m b i b se ve a fectado, ya que p i e r d e c e l u l a s l i n f o i d e s

a l rededor de los vasos sanguineos. En los n b d u l o s l i n f a t i c o s , l a s

areas paracort icales dependientes del t imo no t i e n e n l i n f o c i t o s .

Tambidn se ha observado que l o s l i n f o c i t o s T maduros se reducen

en ndmero. (Chandra, 1991 ) .

Tambidn se han r e a l i z a d o e s t u d i o s con metodos c i t o g e n e t i c o s

como son : l a e v a l u a c i b n d e l c i c l o c e l u l a r t a n t o i n v i v o como i n

3

v i t ro , aber rac iones cromosdmlcas e intercambio entre cromat idas

hermanas. (Betancourt M. Y O r t i z R . . 1 9 9 1 1 .

Con los es tud ios de aberraclones cromosdmicas se han

obtenido di ferentes resul tados. Algunos autores encontraron

d i fe renc ias s ign i f i ca t i vas en t re los o rgan ismos desnut r idos y l os

tes t igo , pero o t ros no encontraron d i ferenc ia a lguna ent re las

aberraciones presentes entre los dos grupos. (Betancourt M. y

O r t i z R. , 1 9 9 1 )

E l es tud io de la f recuenc ia de in te rcambios de cromdtidas

hermanas ( I C H ) es complementario a l e s t u d i o de las aberraciones,

pues imp l i ca un proceso de daRo y reparac ibn de l ADN. Se han

rea l i zado en c e l u l a s de medula dsea. en ratas desnutr idas durante

l a l a c t a n c i a . En c e l u l a s de medula &sea de ratas desnutr idas

durante l a l a c t a n c i a t i e n e n un inc remento en la f recuenc ia de ICH

(Betancourt y c o l . , 1986). E l es tud io de Gonzhlez y c o l . en 1983

se h i zo en c u l t i v o s de l i n f o c i t o s de nifios desnutr idos y e l l o s no

mostraron aumento en l a f r e c u e n c i a de ICH p o r c k l u l a , a l i g u a l

que en o t r o t r a b a j o de Mutchinick en 1979 . Mient ras tanto, en

o t ros t raba jos , l os au to res s i obse rva ron aumento en l a

f recuencia de ICH en l o s l i n f o c i t o s de nif ios desnutr idos (Murthy

y c o l . , 1 9 8 0 : O r t i z y c o l . , en prensa) .

Tambien ha s i d o e s t u d i a d a l a d u r a c i d n d e l c i c l o c e l u l a r

t an to en c u l t i v o s de l i n f o c i t o s de niRos desnutr idos como en

c k l u l a s de medula 6sea de ra tas desnu t r i das . En estos traba.jos se

4

han obtenldo resul tados diferentes. Dues alqunos autores

encuentran un incremento en l a d u r a c i 6 n d e l c i c l o c e l u l a r en l os

orqanismos desnutr idos (Murthy Y c o l . . 1982: O r t i z Y Betancourt,

1990 ) , Y otros observan o e r i odos mbs co r tos de l c i c lo en l o s

organismos desnutr idos con resoecto a los b i e n n u t r i d o s

(Mutch in ick Y c o l . , 1 9 7 9 : Gonzdlez Y c o l . , 1990: Y O r t i z Y c o l . ,

1993, en prensa).

B MUTACIONES

E l mater ia l genht ico. a pesar de l o s mecanismos de

Droteccidn. puede su f r i r cambios que no se deben a l a

recombinacidn. Estos cambios son mutaciones y a l t e r a n l a

secuencia de ADN o l a c a n t i a d de ADN (Ayala y Kiger, 1984). Las

mutaciones se c l a s i f i c a n en gknicas y en cromosbmicas.

1 . - Gbni cas, que son modi f i caci ones causadas por s u s t i t u c i d n ,

a d i c i b n o e l im inac ibn de nuc lko t idos dent ro de l ADN o de l ARN de l

gen.

2 . - Cromos6micas. que pueden s u b d i v i d i r s e en:

a) Rearreglos cromosdmicos estructurales que a f e c t a n e l modo de

agruoarse de l os genes en l o s cromosomas, debido a l a Dhrdida de

un segmento cromos6mico ( d e l e c i 6 n ) . o oor l a d u p l i c a c i d n de un

segmento, l a i n v e r s i b n de un segmento o por su t r a s l o c a c i 6 n .

b ) Cambios en e l ndmero de los cromosomas, en donde algunos no

5

a l t e r a n l a c a n t i d a d t o t a l d e l m a t e r l a l hereditario ( fus iones Y

f i s i o n e s ) , Der0 o t r o s s i l o hacen (aneuoloidla, monoDlojdia y

D o l i o l o i d i a ) . ( A y a l a y K i q e r . 1 9 8 4 )

Las mutaciones cromosdmicas son las mas estudiadas y algunas

de e l l a s ya han sido observadas en DCP. S in embargo, no se sabe

como a f e c t a r l a l a d e s n u t r i c i d n s o b r e l a f r e c u e n c i a de mutaciones

gbnicas, s i es capaz de aumentar l a f r e c u e n c i a o no.

La de tecc idn de las mutaciones genicas en e l hombre debidas

a enfermedades o a l a e x p o s i c i d n de substanc ias tdx icas. es de

gran importancia, debido a Que estos implican procesos

p a t o l b g i c o s t a l e s como transformaciones mal ignizantes. as1 como

tambien algunos aspectos de d i f e r e n c i a c i b n c e l u l a r normal i n v i v o

( A l b e r t i n i y c o l . , 1990) . Algunas de estas mutaciones se han

estudiado en a l t e r a c i o n e s de l o s genes de l a hemoglobina o en e l

gen de l a g l i c o f o r i n a . Los genes de l a hemoglobina estan en dos

grupos de l o c i l i g a d o s en e l b razo cor to de l cromosoma 11 (llp) Y

- e l b razo cor to de l cromosoma 16 ( 1 6 ~ ) Y e l gen de l a g l i c o f o r i n a

e s t d en e l b razo l a rgo de l cromosoma 4 ( 4 q ) . Los an ter io res son

muy clrt i les en e r i t r o c i t o s . p e r o e n los l i n f o c i t o s se han

u t i 1 izado los s igu ien tes genes: e l gen de l a enzima

hipoxant ina-guanina fos for r ibos i l t ransferasa (HPRT) y uno de los

genes para los ant igenos de l e u c o c i t o s humanos ( H L A ) . E l gen HPRT

se encuentra en e l brazo largo de l cromosoma X ( X q ) ; los genes

HLA estdn en e l b r a z o c o r t o d e l cromosoma 6 ( 6 p ) . ( A l b e r t i n i y

c o l * 1990).

6

C ) GEN HPRT

Un sen aue ha sido ampliamente estudiado y Que ha s i d o b t i l

Dara e l e s t u d i o de mutaciones en c b l u l a s humanas es e l gen HPRT.

Este gen se encuentra en l a r e g i b n a del cromosoma X , mi@e 44 kb

y cont iene 9 exones ( A l b e r t i n i y c o l . , 1 9 9 0 ) . Su l o c a l i z a c i b n en

e l cromosoma X hace a l a s c e l u l a s de los organismos machos

hemic igdt icas, y este hecho permi te que es te gen sea ampliamente

usado en los estudios de c u l t i v o s de mamiferos (Stout and

Caskey , 1985 l .

E l gen HPRT c o d i f i c a p a r a una enzima que c a t a l i z a l a

f o s f o r i l a c i b n de l a h i p o x a n t i n a y guanina en l a r u t a de ahorro o

a l t e r n a t i v a de las pur inas . Es ta enzima tambihn f o s f o r i l a l o s

andlogos de l a s p u r i n a s , t a l e s como l a 8-azaguanina y l a 6-

t i oguan ina (6 -TG) . l os cua les i nh iben l a p ro l i f e rac idn ce lu la r .

Los l i n f o c i t o s T normales est imulados con f i tohemaglutinina en

c u l t i v o , no son capaces de p r o l i f e r a r cuando estdn en contac to

con l a 6-TG. m ien t ras l as cb lu las de f i c ien tes en e l gen HPRT son

r e s i s t e n t e s a este andlogo, debido a que no es incorporado al 1

se muestra en l a f i qu ra 1 :

7

Cdlula normal:

HPRT

6-TG ---_--__- > Nucledtidos del analog0 -------- > Toxic idad

C h l u l a d e f i c i e n t e :

6-TG --------- > No hay formacibn de ----------- > ADN normal

nucleotide del analog0

F igu ra l .

La de tecc idn de las ce lu las res is ten tes se ha rea l i zado por

medio de l a a d i c i d n de t i m i d i n a t r i t i a d a (3H-TdR). S i l a c e l u l a

no s i n t e t i z a l a ~" enzima del gen HPRT. no incorpora 6-TG, de este

modo l a c b l u l a puede p r o l i f e r a r e incorporar 3H-TdR: cuando l a

enzima de e s t e gen funciona, l a c d l u l a i n c o r p o r a 6-TG y muere

antes de i n c o r p o r a r 3H-TdR. P a r a i d e n t i f i c a r a l as cd lu las

r e s i s t e n t e s , e s d e c i r l a s c d l u l a s p r o l i f e r a n t e s , s e hace una

eva luac ibn con au to r rad iog ra f i a (A lbe r t i n i y c o l , 1 9 8 8 ) .

Un metodo a l t e r n a t i v o c o n s i s t e en l a i n c o r p o r a c i b n de

bromodesoxiuridina (BrdU) en el ADN de c e l u l a s e n p r o l i f e r a c i b n ,

8

se hace una tincibn diferencial con el metodo de fluorescencla

m& Giemsa, para poder identificar tres clases d e ndcleos de

linfocitos y as? distinquir los Que habjan incorDorado BrdU. Los

ndcleos que han incorDorado BrdU representarian a las CklulaS

resistentes a 6-TG en un cultivo (Ostrosky-Wegman y col. 1987).

Posteriormente, la tincidn fue modificada, se uti 1 izaron

anticuerpos monoclonales contra BrdU para la identificacibn de

los nlrcleos de las chlulas que Droliferaron. facilitando de esta

manera la identificacidn de las cdlulas resistentes (Montero y

col 9 1991 1 .

Norman y colaboradores en 1988 propusieron una metodologla

alternativa para evaluar a las chlulas resistentes , la cual

utiliza la citocalasina B ( C B ) que se une a los extremos de los

microfilamentos inhibiendo as1 la adicibn de moldculas de actina,

Drovocando un desequilibrio dinAmico entre los filamentos de

actina y molkulas de actina libres, y causando asi la

despolimerizacidn de los filamentos (Vorgias y col, 1988) . Por

medio de este mecanismo, la CB inhibe la citocinesis (divisibn

citoplasmAtica) de cc3lulas en divisibn. pero permite que la

celula complete la carioghesis (divisibn nuclear): de esta

manera se pueden identificar a las c6lulas proliferantes en

Dresencia de 6-TG por ser celulas binucleadas.

9

I1 JUSTIFICACION

Dentro del Droqrama "Efectos a n i v e l c e l u l a r de l a

d e s n u t r i c i b n " . se han e s t u d i a d o l a D r o l i f e r a c i d n c e l u l a r y l a

f recuencia de in te rcambio de cromAtidas hermanas en c e l u l a s de

medula bsea ( M . O . 1 , encontrandose d i ferenc ias ent re los

organismos desnutr idos Y l os b ien nu t r i dos . Ahora r e s u l t a de

i n t e r & e s t u d i a r e l n i v e l de mutaci6n genica en donde se a fecta

un gen en p a r t i c u l a r i n a c t i v a n d o l o o cambiando su expres idn, por

lo aue ahora se pretende determinar l a frecuencia de ct3lulas

va r ian tes en un locus somatico en c b l u l a s de organismos

desnutr idos. Se e l i g i b e l gen HPRT dado que ha sido ampliamente

carac ter izado y p o r l a f a c i l i d a d de de tec tar a l a s c d l u l a s

d e f i c i e n t e s en e s t e gen.

I11 OBJETIVO

E l p r o p d s i t o de es te es tud io es la determinacibn de l a

f recuencia de - va r ian tes (HPRT de f ic ien tes) , por med io de l a

r e s i s t e n c i a a 6- t ioguanina, en c b l u l a s de medula bsea de ra tas

desnutr idas experimentalmente durante l a l a c t a n c i a .

IV H I P O T E S I S

S i l a d e s n u t r i c i d n s e v e r a Droduce a l t e r a c i 6 n en e l gen HPRT,

se de tec tar& mayor ntlrmero de cd lu las va r ian tes en l o s c u l t i v o s de

medula &ea de r a t a d e s n u t r i d a que en los c u l t i v o s de r a t a s b i e n

nu t r i das .

10

V METODOLOGIA

1 ) Desnutr icibn Exoerimental Durante l a L a c t a n c i a

Ratas de l a ceDa w is ta r rec ien nac idas se l es d i s t r i buye ron

en dos l o tes : lo te exoer imenta l (desnut r idas) y l o t e t e s t i g o

( b i e n n u t r i d a s ) . La desnu t r i c i bn se indujo oor comoetencia de

a l i m e n t o d u r a n t e l a l a c t a n c i a , y p a r a l o g r a r l o se colocaron 15

c r l a s con una n o d r i z a ( l o t e e x p e r i m e n t a l 1 y e l l o t e t e s t i g o s o l o

t u v o c i n c o c r l a s con su nodriza. Se determind e l peso cada dos

d las , has ta los 21 d l a s de edad.

Se consideraron desnutr idas aquel las aue t u v i e r a n un d e f i c i t

de peso mayor a l 40 % en r e l a c i h a r a t a s de l a m i s m a edad. Se

emDlearon solo r a t a s macho. E l nlrmero de ra tas en es te es tud io

f u e de 6 b ien nu t r i das Y 6 desnutr idas.

2 ) Extracc idn de medula dsea

Cuando las ra tas cumpl ie ron los 21 d las de edad ( f i n a l de l a

l a c t a n c i a ) , se s a c r i f i c a r o n con &ter . Poster iormente se d isectd

el femur en condic iones de e s t e r i l i d a d Y se co locd dentro de una

c a j a de p e t r i con medio McCoy 5a. Modi f icado.

La medula se ext ra jo de l femur. cor tando las dos cabezas e

introduciendo en un extremo la aguja de una je r i nga con 5 m1 de

11

medio McCoy su~lementado con 2%3% de suero fetal bcv lno . 2% de

qlutamina v 0 . 1 de a n t i b i b t i c o s . Se resusDendi6 suavemente con

3 ) Siembra de c e l u l a s

DesDues de l a r e f r i g e r a c i d n . l a suspensidn c e l u l a r se l l e v d

a 10 m1 con medio McCoy suplementado, se resusDendi6 y 5 m1 se

colocaron en dos ca jas de p e t r i . A una de 1 as ca jas se l e

aRadieron 3 gotas de Hepes, y 0.5 m1 de 6-TG en una concentracibn

de 2 mM.

Los c u l t i v o s se incubaron a 370C con atmdsfera de CO a l 2

5%. A l a s 24 horas de efectuada l a siembra, se l e agregd a todos

los c u l t i v o s C8 Dara tener una concentracibn de 3 ug/ml. Despuks

de 28 horas de haber puesto l a CB. l a s c k l u l a s se cosecharon.

4 1 Cosecha

La susoensidn ce lu lar se c e n t r i f u g b a 1000rDm durante 10

min. Se r e t i r d l a mayor parte del sobrenadante, dejando solamente

0 .5 mL. E l paquete ce lu lar se resuspendid y se l e aRadid gota a

go ta e l f i . j ado r f r f o , (me tano l -Ac ido ace t i c0 3:1), hasta tener

4mL y se d e j 6 reDosando 15 minutos. La suspensi6n celular se

c e n t r i f u g d a 1 0 0 0 r D m durante 10 min. Se r e t i r 6 e l sobrenadante Y

se af iadieron otros 4 mL de f i j a d o r f r l o , se resusoendid Y se

1 2

centr- i fuqb de i g u a l manera. Se a u i t 6 el sabrenadante Y e l oaauete

celular se resusoend16 en 3 mL de f i l a d a r . Se h l c l e r o n l a s

oreoaraciones.

5 ) Real izac idn de PreDaraciones Y T inc idn

Las preparaciones se rea l izaron de jando caer 3 gotas de l a

suspensidn celular sobre un por taobJetos l imp io Y se t i f l i e r o n con

May-Grunwald a l 10% durante 20 minutos, Doster iormentese t i f ieron

con Giemsa a l 5% durante 5 minutos, se montaron con Entellan y se

revisaron al microscoDio con e l o b j e t i v o de 4 0 x . En cada

oreparacibn se contaron 2000 ck lu las reg is t rando cuantas de e l l a s

eran mononucleadas Y cuantas mul t inuc leadas (ck lu las con dos

n k l e o s o mas).

E l ndmero de var iantes a l a 6-TG s e c a l c u l d con las

s igu ien tes fb rmulas :

13

VI RESULTADOS

En e l cuadro 1 se presentan los pesos de l a s r a t a s BN v DN a

l a edad de 21 djas. Las ra tas desnut r idas tuv ie ron un d e f i c i t de

peso del 40% o mAs, con resoecto de l as b ien nu t r i das . E l

promedio del peso de l a r a t a s EN fue de 53.58 g ~f: 2 . 9 2 : l a s r a t a s

DN t u v i e r o n un peso promedio de 22.66 g 2 3 . 1 1 . lo aue

rep resen ta un de f i c i t de aproximadamente de l 57 % aue i n d i c a

desnu t r i c i dn de tercer grado. Se r e a l i z b una prueba de "t". l a

c u a l m o s t r d d i f e r e n c i a s i g n i f i c a t i v a en e l peso e n t r e ambos

l o t e s . E n l a g r d f i c a 1 se presenta la curva de aumento de peso

de las ra tas duran te los 21 d l a s de lac tanc ia ; en es ta g rd f i ca se

ouede a o r e c i a r l a d i f e r e n c i a e n l a ganancia de peso e n t r e l o s dos

1 o tes .

Los datos de l porcenta je de c e l u l a s monoucleadas.

binucleadas y mult inucleadas se muestran en los cuadros 2 y 3 .

En c u l t i v o s s i n 6-TG e l promedio de ce lu las mononucleadas fue de

87.98 2 2 . 7 3 en ra tas BN Y 86.36 2 2.88 en DN: l a s c b l u l a s

binucleadas tuvieron un promedio de 10.83 2.35 en BN y 12.06 2

2.50 en DN; Y las mult inucleadas tuvieron un promedio de 1.38 k

0.60 en BN y 1 . 5 7 0.71 en DN. En c u l t i v o s en presencia de 6-TG,

e l promedio de cdlulas mononucleadas fue de 93.48 2 2 . 2 6 en r a t a s

BN Y 92 .79 2 2.47 en DN: b inucleadas 5 . 8 0 k 2 .12 en BN y 6.70 2

2.25 en DN: multinucleadas 0.71 5 0.42 en BN y 0.76 5 0.25 en DN.

~ ~.. ..~

14

E l ndmero de ce lu las va r ian tes en los cultivos se c a l c u l 6

segllln l a fd rmula descr i ta en l a metodologla. E l Drornedio de

va r ian tes f ue de 0 . 5 2 3 5 0 . 1 5 9 en ratas BN Y 0 . 5 3 7 % 0 . 1 8 9 en

r a t a s DN. E l cuadro 4 m u e s t r a l a s c i f r a s de c&lulas va r ian tes en

cada ra ta ; es tos da tos t ienen una g r a n d i s p e r s i h , Dor l o t a n t o

se us6 l a Drueba U de Mann-Withney. Esta Drueba no mostr6

d i f e renc ia es tadAs t i ca en t re l os dos lotes de animales estudiados

( D > 0 . 0 5 ) .

1 5

CUADRO I

PESO DE LAS RATAS BIEN NUTRIDAS Y DESNUTRIDAS A LOS 21 DIAS DE

EDAD.

Rata Bien Nutridas Desnutridas

""""""""""""""""""""""""""""""""

5 1 . 3

5 4 . 2

5 0 . 2

5 6 . 9

5 7 . 0

5 1 . 9

"

2 1 . 2

2 4 . 3

1 8 . 5

2 3 . 9

2 0 . 6

28.1

2 2 . 0

""""""""""""""""""""""""""""""""

x = 5 3 . 5 8

D . E . = 2 . 9 2

~~

t = 1 8 . 4

D < 0 . 0 5

22 .66

3 . 1 1

\

1 6

u3

I i, \ \ I \ \ \ \ r I i \

. . i \ \

1 I I 1

4 I

1 7

n, ", n LJi -Ub L

pCRCiYiA?E DE CELyLAS U C N C H U C : E \ D A S , B I N U C L E A E A S 7 Y b L T I N L C L E A D A S E N C5LT:JOS Oi H E 2 U L A O S E 4 3E R A T A S

B I E N N U T R I D A S S I N 6 - T G Y CON 5 - i G .

__"""___""_"__"""""""""""""""""""""""""""""""""""-"-----------

Ratas sin 6 - T G :on 5-TG

Monanuceladas Blnucleadas Multinucleadas Mononucleadas fl~nucieadas Uultlnucleadas

"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""-""---------

1 88.50 11.00 0.50 90.55 a. 90 0.55

2 89,15 9.55 1.30 95.30 3.d5 O .85

3 92 ,O5 1.00 0,95 95.90 3.50 0.60

4 83.80 14,20 2.00 90 I90 7.60 1.50

5 8 7 I 7 0 10.80 1.50 94.50 5.10 0,40

6 86,70 11,25 2.05 93.75 5.37 0.37

"""""""_""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""~ x : 87.98 10.63 1.38 93.48 5.80 0.11

D . E . = 2.13 2.35 0.60 2.26 2.12 0.42

18

____"""_~_""_~_""""""""""~"""""""""""""""~"""---"---"------------"--

1 82.60 16.10 1-30 91.90 7,20 0.90

2 89.15 9.90 0.95 91 -30 8.00 0.10

3 a4 I 70 1 2 , 6 0 2.70 89.20 9.60 1.20

4 87.10 11.45 1.15 94.80 4.15 0.45

5 89.15 9.45 1.40 96 85 2,65 0.50

6 83.05 14.55 2.40 93.00 6.20 0.80

7 88.80 10.40 0.80 92.50 6,70 0.80

_______"_"__""""""""""""""""""""""""""""""""""""""----"""""

X : 86.36 12,06 131 92.79 6.70 0.76

D . E . :: 2.88 2.50 0,ll 2.41 2.25 0.25

U :: 13

19

CUADRO 4

NUMERO DE VARIANTES EN MEDULA OSEA EN RATAS BIEN NUTRIDAS y EN

RATAS DESNUTRIDAS

"~"""""""""""""~""""""-""--------------- -"

R a t a B ien nutr idas D e s n u t r i d a s

""""""""""""""""""""""""""-------------

1 0.82 0.47

2 0 . 4 3 0.80

3 0.51 0 . 7 1

4 0.56 0.40

5 0.45 0.29

6 0.47 0.42

7 " 0.67

""""""""""""""""""""""""""""""""

X - 0.523 0.537

D . E . = o. 159 O. 189

-

U = 14

p < 0.183

2 0

V I 1 DISCUSION

Los modelos animales avudan a rea . l i zar es tud los aue en

humanos ser fa impos ib le de r e a l l z a r , ademas se Dueden con t ro la r

d iversas var iab les . las cua les Dodr jan in te r fe r i r con los e fec tos

d i r e c t o s aue causa l a d e s n u t r i c i b n . La desnut r i c ibn en l as ra tas

se indu.jo durante l a l a c t a n c i a dado que es ta reDresen ta r ia l a

ni f iez temprana en humanos. E l metodo de inducc idn de

desnu t r i c i bn Dor competencia de alimento es adecuado, ya que se

logrd obtener en es tas ra tas un d e f i c i t de peso mayor a l 40 X, e l

cua l ind ica desnut r i c idn severa d de tercer qrado. Ademas e l

porcenta je de mor ta l idad en es tas camadas fue de 3%. que es

s i m i l a r a lo normalmente observado en e l B i o t e r i o de l a UAM-I Y

es aCeDtad0 en o t r o s b i o t e r i o s .

Los estudios reportados de aberraciones cromosdmicas , I C H (

Murthy y co l . , 1 9 8 1 : Betancourt . y c o l . , 1986) y c i c l o c e l u l a r

i nd i can aue l a d e s n u t r i c i d n p r o v o c a dafio en l a s c e l u l a s d e l

orqanismo, pero no se han reoor tado estud ios en donde se

demuestre aue a l t e r e l a f r e c u e n c i a de mutaciones en un gen. En

es te t raba jo se u t i 1 i z d e l gen HPRT para detectar dafio a este. ya

aue es de f a c i l manejo y p o r e l l o se ha u t i l i z a d o ampliamente

oara detectar e l e fecto sustanc ias genotdx icas. caDaces de

provocar mutac iones (A lber t in i y c o l . , 1 9 9 0 ) . Pero, en ambos

l o t e s . se Dudo observar gran d ispers idn de los datos de l a s

Var iantes, y no se e n c o n t r b d i f e r e n c i a e n t r e e l l o s . E s t e hecho

i n d i c a que l a d e s n u t r i c i d n no a f e c t a l a f r e c u e n c i a de c e l u l a s

r e s i s t e n t e s a l a 6-TG ( de f i c ien tes en el qen HPRT) . Po r l o

~~

2 1

t a n t o , e l dafio Drevlamente reDortado

d e s n u t r i c i d n no t i enen re lac idn con l a ve

e l locus HPRT en organismos desnut r idos .

en los estud ios de

locidad de mutacibn en

Una e x p l i c a c i b n p a r a entender l a causa de l dafio observado

po r o t ros au to res a n i v e l c e l u l a r y c i t o g e n k t i c o , s e r i a aue

e x i s t e una d e f i c i e n c i a en l a s i n t e s i s de prote inas. debido a l

ba jo apor te de n u t r i e n t e s . E s t o e x p l i c a r l a Dor quk los te . j idos de

a l t o recambio, no permanecen dafiados cuando e l organismo se

recupera de l a d e s n u t r i c i b n ( B e t a n c o u r t y col . , 1989).

A l b e r t i n i y co l . (1988) most ra ron la impor tanc ia de los

ensayos de au to rad iog ra f i a y de incorporac ibn de BrdU p a r a e l

monitoreo basado en l a r e l a t i v a s i m p l i c i d a d , ba.jo costo y a l

po tenc ia l de au tomat izac idn . Es ta carac ter is t i ca hace p o s i b l e

real izar estas metodologias en pajses subdesarrol lados. Sin

embargo se sugieren que es tos es tud ios se comDlementen con

a n a l i s i s mas deta l lados como l a s e l e c c i b n c l o n a l ( A l b e r t i n i y

c o l . . 1988) o con ensayos moleculares (Albert in i Y c o l . . 1990) .

E l metodo de bloqueo de l a c i t o c i n e s i s p r o p u e s t o p o r Norman y

c o l . en 1988, pa ra de tec ta r l a f recuenc ia de c k l u l a s r e s i s t e n t e s .

se cons idera fac t ib le , y a que las cc j lu las en p r o l i f e r a c i b n en

medio conteniendo 6-TG son fAc i lmente iden t i f i cadas por su

aPar ienc ia b inuc leada o mul t inuc leada, hac iendo a l metodo una

a l te rna t i va pa ra eva lua r e l p o t e n c i a l mutageno i n v i v o .

2 2

En es tud ios o rev ios , las ch lu las se han congelado antes del

c u l t i v o para e l im ina r a l a s c e l u l a s en o ro l i f e rac idn an tes de l a

ad ic i6n de l a 6-TG. loqrando as j l a s inc ron izac ibn ce lu la r y l a

e l im inac ibn de las denominadas “ fenocooias” (Albert in i y c o l .

1981). En es te es tud io , l as ck lu las sblc se r e f r i g e r a r o n a 4 C .

un metodo menos a g r e s i v o . s i n embargo e f e c t i v o p a r a s i n c r o n i z a r

l a p r o l i f e r a c i d n c e l u l a r i n v i t r o . Resul tados previos real izados

con c u l t i v o s s i n r e f r i g e r a c i d n m o s t r a r o n una f recuencia de

cd lu las b inuc leadas s ign i f i ca t i vamente menor, lo cual estA

indicando que a l r e f r i g e r a r l a s c d l u l a s estamos s inc ron izando e l

c u l t i v o ,

O

En e s t e t r a b a j o , l a f r e c u e n c i a de cd lu las var iantes es mayor

que l a observada por A l b e r t i n i y col. (1988) y Ostrosky y c o l .

(19901, es to podr ia deberse a l t ipo ce lu la r , dado que e l l o s

a n a l i z a r o n l i n f o c i t o s de sangre pe r i f e r i ca de humanos, mient ras

que en e l Dresente estudio se emplearon cdlulas de medula bsea de

r a t a , e l c u a l es un t e j i d o con a l t o recambio c e l u l a r y l a espec ie

es d i f e ren te .

Algunas investigaciones han ido mas a l l a de observar e l daRo

por medio de l a r e s i s t e n c i a a 6-TG, ya aue han u t i l i z a d o l a s

tdcnicas de c lonacic jn (Nick las y c o l . , 1990) y de b i o l o g j a

molecular Dara detectar e l l u g a r d e l gen afectado (Hou y col..

1 9 9 3 ) .

Nuestros resul tados son s i m i l a r e s a los obtenidos Dor Norman

y colaboradores en 1988. quienes obtienen valores uno a dos

2 3

drdenes de magnitud mayor aue los reportados DOT Strauss Y

A l b e r t i n i ( 1 9 7 9 ) .

VI11 CONCLUSION

E l mhtodo de induccidn de la desnutricidn fue adecuado Dara

este estudio, cumple con las necesidades de los estudios

real i zados en este 1 aboratorio.

La desnutricidn severa no afecta la frecuencia de mutaciones

en el gen HPRT, mesto aue la frecuencia de variantes fue similar

en las ratas desnutridas y bien nutridas. De esta manera, se

puede concluir aue el la alteracibn en el ciclo celular, el

incremento en la frecuencia de aberraciones cromosdmicas e ICH.

Dreviamente reportado en cblulas de organismos desnutridos, se

deberia a un daRo postranscriDciona1 temporal.

24

BIBLIOGRAFIA

A l b e r t i n i R . J . . A l l e n E . F . , Q u ~ n n A . S . Y A l b e r t i n i M . R . 1 9 8 1 .

Human somatic c e l l mutatJon: I n v i v o va r ian t 1vmDhocvte

f reauencies as determined by 6-thioguanine resistance. En: E.B.

Hook Y I.H. Porter (Eds. ) , Pooulat ion and B io log i ca l AsDects o f

Human Mutat ion, B i r t h D e f e c t s I n s t i t u t e Syposium X I , Academic

Press, Nueva York. E . U . A . 235-326 p ~ .

A l b e r t i n i R . J . , L. M. Su l l i van , J . K . Berman. C . J. Greene. J.

A . Stewart y J . P. O ’ N e i l l . 1988. Mutagen ic i ty mon i to r ing in

human by autoradiographic assay for mutant lymohocytes. Mutat.

Res. 204. 481-492.

A lber t in i R .J . , N ick las J .A . . O ’Ne i l l J.P. y Robins0nS.H. 1990.

I n v i v o somatic mutations i n humans: measurement and ana lys i s .

Ann. Rev. Genet., 24, 305-326.

A r r i e t a R . y Crav io to J . 1982 . C l n i c a de - 7 a d e s n u t r i c i b n

o ro te i co -ca lb r i ca de l a i n f a n c i a .

Ayala. F Y Kiger J. A . 1984. Gendtica moderna. Fondo Educat ivo

Interamericano, Espana. 534-536 y 561-563.

Betancourt M . , Balvanera P. y O r t i z R. 1986. Freauency Of

s is te r -chromat id exchange ( S C E ) i n bone marrow c e l l s o f s e v e r e l y

malnour ished an imals dur ing ear ly l i fe . Mutat . Res.. 1 7 5 . 29-31.

2 5

Betancourt M . , O r t i z R . , Gbmez i . 1 , Hernandez M . E . Y Cravioto J.

1 9 8 9 . E f f e c t o f r e n u t r i t i o n on c e l l u l a r D r o l i f e r a t l o n and SCE i n

bone marrow cel ls f rom malnour ished ra ts . Nutr . Reo. I n t . , 40 .

959-963.

Betancourt M . y O r t i z R. 1991. Efectos de l a D e s n u t r i c i b n a N i v e l

C i toqenkt ico. Cienc ia, 42, 367-373.

Crav ioto J . y A r r i e t a R. 1985. Nut r i c idn , desar ro l lo menta l .

conducta y aprendiza je. 2a. ed. INCYTAS-DIF, Mdxico. 191 pp.

DemDsey J.L. y Morley A.A. 1983. Evidence tha t thioguanine-

resistant lymphocytes detected by autoradiograchy are mutant

ce l ls . Mutat ion Research, 119: 203-211.

GonzAlez C . . V i l laseRor L. y Betancourt M . 1990. C i n b t i c a de l a

p r o l i f e r a c i d n i n v i t r o de l i n f o c i t o s de niRos desnutr idos. Rev.

de I n v . C l i n . , 42, 18-22. ~

Hou S . M . , Steen A.M. , Fait S. y Anderson B. 1993. Molecular

soectrum o9f background mutation at the HPRT l o c u s i n human T-

lymphocytes. Mutagenesis, 8, 43-49.

Montero R . , Norpoa H . , Au t io K . . Lindholm C. , Ostrosky-Wegman p.

Y Sorsa M. 1991. Determinat ionof 6- th ioguanine resistant

1 ymphocytes i n human blood by immunohistochemical

antibromodeoxyuridine staining. Short communication. Mutagenesis

2 6

6 . 1 6 9 - 1 7 0 .

Murthv P . E . . Bnaskaram P. Y S r ~ k a n t i a S . G . 1980 . Slster chromat id

exchanges i n p ro te in -energy ma lnu t r i t i on . Hum. Genet., 5 5 . 405-

406.

Murthv P.B. y S r i k a n t i a S.G. 1981. SCE freauency i n malnourished

mice. Metabolism, 30, 1-2 .

Murthy P.B, Rahman M . A . y Tu lpu le P.G. 1982. Lymphocyte

p r o l i f e r a t i o n k i n e t i c s i n m a l n o u r i s h e d c h i l d r e n measured by

d i f f e r e n t i a l c h r o m a t i d s t a i n i n g . B r . J . Nutr . . 47 , 445-450.

Mutch in ick O. , L i ske r R . . Ruz L. Salamanca F. Y Armendares S .

1979. Freauency o f s i s t e r c h r o m a t i d exchanges i n severe prote in

c a l o r i e m a l n u t r i t i o n . Ann. Genet., 2 2 , 129-132.

N ick las J.A. F a l t a M.T . , Hunter T .C . . O 'Nei l l J .P. , Jacobson-Kram

D . , Wil l iams J.R. y A l b e r t i n i R . J . 1990. Molecular analysis of ~-

" i n v i v o HPRT m u t a t i o n s i n human T lymphocytes. V . Effects of

t o t a l body i r r a d i a t i o n secondarv t o radioimmunoglobulin theraoy

( R I T ) . Mutagenesis, 5 , 461-468.

Norman A , , J . C . M i t c h e l l y K . S . Iwamoto. 1988. A s e n s i t i v e

assay for 6-thioguanine-resistant lymphocytes. MutatRes.. 208:

17 -19 .

2 7

O r t i z R . y Betancourt M . 1 9 9 0 . Length o f c e l l c y c l e 79 v ~ t r o and

s i s te r - ch romat id exchange ( S C E ) frequency i n bone marrow c e l l s

f rom severely malnour ished rats. Mutat . Res., 2 3 2 , 7 1 - 7 5 .

O r t i z R . 1 9 8 7 . Efecto de l a d e s n u t r i c i h s o b r e l a s c & l u l a s de

medula bsea de r a t a . UNAM, Tes is doc tora l .

O r t i z R . , Campos C . , Gdmez J . L . . E s ~ i n o z a M . , Ramos-Motilla M . Y

Betancourt M . 1 9 9 3 . Sister-chromatid exchange ( S C E ) and c e l l

p r o l i f e r a t i o n i n lymphocytes from infected and non-infected

c h i l d r e n w i t h s e v e r e p r o t e i n m a l n u t r i t i o n (PCM). Mutat. Res. En

prensa.

Ostrosky-Wegman P. , M. R . Montero, C. Cor t inas de Nava, R. R .

T i c e y R . A l b e r t i n i . 1 9 8 7 . The use of bromodeoxyur id ine label ing

i n the human lymphocyte HGPRT somatic mutation assay. Mutat. Res.

191 : 21 1 -214.

Ostrosky-Wegman P . , Montero R . , Palao A , , Cort inas de Nava C . .

Hurtado F. y A l b e r t i n i R.J. 1 9 9 0 . 6-Thioguanine-resistant T-

Lymphocyte au torad iograph ic assay . Determinat ion o f var ia t ion

f reauencies i n i n d i v i d u a l s susDected o f r a d i a t i o n exposure.

Mutat. Res., 2 3 2 , 4 9 - 5 6 .

Stout J.T. y Caskey C.T. 1 9 8 5 . HPRT: Gene s t ruc tu re exp ress ion .

and mutat ion. Ann. Rev. Genet., 1 9 : 1 2 7 - 1 4 8 .

Strauss, G.H. y A l b e r t i n i R.J. 1 9 7 9 . Enumeration o f 6-thioguanine

2 8

resistant D e r i o h e r a l b l o c d lvmchocvtes i n man as a Dotential test

f o r somatlc cell mutatiGn a r ~ s l n q ~n v i v o . Mutat. Res. , 6 1 . 3 5 3 -

3 7 9 .

Vorqias E . C . , Perides G . A . , Traub P. Y Seker is C.E . 1988.

Colchicine, colcemide and cy tocha las in B do n o t a f f e c t

t r a s l o c a t i o n o f t h e g l u c o c o r t i c o i d o r e h r l i c h a s c i t e s c e l l s .

Bioscience Reports, 8: 193 -197 .