Clínica Universitária de Oncologia Médica

Influência da microbiota intestinal na resposta aos anti-PD1

Carlota de Oliveira Damas Mora

Junho’2019

Clínica Universitária de Oncologia Médica

Influência do microbioma intestinal na resposta aos anti-PD1

Carlota de Oliveira Damas Mora

Orientado por:

Drª Ana Rita Teixeira de Sousa

Junho’2019

3

RESUMO

O cancro é uma das doenças mais prevalentes na população humana, para o qual a

imunoterapia veio revolucionar o tratamento. As proteínas PD-1 e PD-L1, inerentes ao

sistema imunitário, são utilizadas pelas células neoplásicas de forma a evitar a sua

erradicação, constituindo um alvo terapêutico importante. Com aplicabilidade em

diversas neoplasias, a resposta ao bloqueio do eixo PD-1/PD-L1 tornou-se cada vez mais

heterogénea, para as quais através de diversos estudos se estabeleceu uma correlação com

os componentes da flora intestinal. As espécies Bifidobacterium, Faecalibacterium e

Akkermansia muciniphila foram mais frequentemente isoladas em doentes que

responderam a imunoterapia, enquanto a espécie Bacteroidales predominava em quem

não se obteve resposta. Mais ainda, o uso prévio ou concomitante de antibiótico também

mostrou diminuir a resposta à terapêutica com imunoterapia e consequente sobrevivência

dos doentes. Sendo a flora modificável, o uso de próbióticos, alteração da dieta e

transplante fecal poderão constituir estratégias a adotar para a alteração da mesma e

potenciar a resposta á terapêutica anti- neoplásica.

Palavras-chave: cancro; eixo PD-1/PD-L1; flora intestinal; antibiótico; modulação da

flora

ABSTRACT

Cancer is one of the most prevailing diseases in human population, for whom

immunotherapy has come to revolutionize the treatment. Proteins PD-1 and PD-L1,

inherent to the immune system, are used by neoplastic cells in order to avoid eradication.

Response to blockade of the PD-1/PD-L1 axis, applied in various neoplasia, started to

become heterogeneous which, through studies, correlated with the components present in

the gut microbiota. The species Bifidobacterium, Faecalibacterium and Akkermansia

muciniphila were the most frequently isolated in responsive patients, while Bacteroidales

specie predominated in non-responsive patients. Moreover, previous or concomitant use

of antibiotics was related to diminished therapeutic response. Since the microbiota is

modifiable, the use of probiotics, diet changing and fecal transplant may be strategies to

adopt for its alteration and therefore potentiate the anti-neoplastic treatment.

Key Words: cancer; PD-1/PD-L1 axis; gut microbiome; antibiotic; microbiota

modulation.

O Trabalho Final de Mestrado exprime a opinião da autora e não da Faculdade de

Medicina da Universidade de Lisboa

4

ABREVIATURAS

ADN - Ácido desoxirribonucleico

B7H1 - B7 homolog 1

CTLA-4 - cytotoxic T-lymphocyte antigen 4

FDA- Food and Drug Administration

NSCLC – Non-small cell lung cancer (Carcinoma do pulmão de não pequenas células)

PD-1- Programmed cell death protein-1

PD-L1 -Programmed death-ligand 1

5

Índice

RESUMO ........................................................................................................................................ 3

ABSTRACT ...................................................................................................................................... 3

ABREVIATURAS .............................................................................................................................. 4

INTRODUÇÃO ................................................................................................................................ 6

PROTEÍNA PD-1 E O SEU LIGANDO PD-L1 ..................................................................................... 8

O EIXO PD-1/PD-L1 COMO ALVO TERAPÊUTICO ........................................................................... 9

FATORES QUE INFLUENCIAM A RESPOSTA À TERAPÊUTICA ................................................... 10

FLORA INTESTINAL ...................................................................................................................... 12

IMPACTO DA DIETA NA FLORA INTESTINAL ............................................................................ 12

IMPACTO DOS ANTIBIÓTICOS NA FLORA INTESTINAL ............................................................ 13

INFLUÊNCIA DA FLORA INTESTINAL NA RESPOSTA AOS ANTI PD-1/PD-L1 ................................. 14

A RELEVÂNCIA DOS ANTIBIÓTICOS ......................................................................................... 18

MANIPULAÇÃO DA FLORA PARA OBTER MELHORES RESPOSTAS ............................................... 20

PROBIÓTICOS .......................................................................................................................... 20

PREBIÓTICOS E DIETA .............................................................................................................. 20

TRANSPLANTE FECAL ............................................................................................................... 21

CONCLUSÃO ................................................................................................................................ 22

AGRADECIMENTOS...................................................................................................................... 23

BIBLIOGRAFIA .............................................................................................................................. 24

6

INTRODUÇÃO

O cancro é uma doença genética, na qual o crescimento de células tumorais é potenciado

por mutações que ativam moléculas oncogénicas. Muitas vezes, há uma acumulação de

diversas mutações, que podem conceder uma vantagem seletiva à população tumoral1,2

Esta doença continua a ser uma das maiores causas de mortalidade a nível global, com

um número estimado de 12.7 milhões de pessoas afetadas em 2011, fazendo com que a

previsão seja de 21 milhões em 20303.

O desenvolvimento e consequente progressão do tumor é um processo mediado pela

relação entre células tumorais, células normais do estroma e mecanismos de defesa do

hospedeiro. Células T CD8⁺ citotóxicas (CTL) e as células T helper CD4⁺ Th1 restringem

o desenvolvimento cancerígeno através de mecanismos que envolvem produção de

interferão-γ e citotoxinas4. Apesar do sistema imunitário ter um papel crítico na

manutenção do equilíbrio entre o reconhecimento das células tumorais pelo sistema

imunitário e o desenvolvimento tumoral, os tumores adotam estratégias para evitar o seu

reconhecimento e consequente destruição5. Destaca-se a expressão tumoral de uma das

moléculas inibidoras como o PD-L1/B7H1, cujo efeito deletério nas células reativas

contra os tumores tenha levado a que se tornasse um alvo terapêutico relevante6

Apesar de ser uma área em constante evolução, a imunoterapia veio revolucionar o

tratamento do cancro, juntando-se a outras estratégias terapêuticas como a quimioterapia,

a radioterapia e a cirurgia2.

Desde 1890 que é descrita uma relação entre imunidade e cancro, sendo referida em

diversos estudos a capacidade do sistema imune em reconhecer e eliminar células

cancerígenas. Com um maior reconhecimento público em 2013 pelos resultados

promissores a médio prazo conhecidos7, consiste na administração de agentes que possam

modificar e estimular o sistema imunitário, como vacinas e citocinas, mas também de

vírus oncolíticos e inibidores dos checkpoints do sistema imunitário8. Historicamente, foi

utilizada no tratamento de diversas neoplasias como no caso de tumores vesicais, com a

administração intravesical de Bacillus Calmette-Guérin (BCG), ou administração de

interferão para obtenção de um efeito anti-tumoral como terapêutica adjuvante. Também

em 1985 foi demonstrado que a administração de Interleucina 2 (IL-2) levava a uma

regressão tumoral, tendo esta terapêutica sido aprovada no tratamento de tumores de

células renais metastizado e melanoma maligno em 1998.9

7

A imunoterapia com inibidores dos checkpoints revolucionou o tratamento de vários tipos

de neoplasias8. Nos últimos anos os anticorpos bloqueadores para o cytotoxic T-

lymphocyte antigen 4 (CTLA-4) e o programmed cell death protein-1 (PD-1), têm sido

aprovados no tratamento de uma panóplia de tumores, alterando a sua história natural ao

prolongar a sobrevivência livre de progressão e sobrevivência global dos doentes. Ao

bloquearmos estas moléculas conseguimos restituir a capacidade das células T de

reconhecerem as células cancerígenas, despoletando uma reação anti tumoral e,

idealmente, à sua consequente erradicação10.

No entanto, existem também limitações dos inibidores dos checkpoints. Cada vez mais

são realizados estudo com o objetivo de identificar potenciais biomarcadores ou fatores

que podem contribuir para uma maior eficácia desta 2, considerando os fatores inerentes

ao próprio tumor e mecanismos do hospedeiro, nomeadamente a composição do

microbioma intestinal.

O objetivo deste trabalho é fazer uma revisão detalhada na bibliografia disponível sobre

os mecanismos inerentes à relação da flora intestinal individual de doentes com cancro e

a resposta à terapêutica com anti-PD-1/PD-L1.

Figura 1: Evolução cronológica dos eventos marcantes na história da imunoterapia9

8

PROTEÍNA PD-1 E O SEU LIGANDO PD-L1

Programmed cell death protein-1 (PD-1) foi descoberto em 1992 como uma proteína com

28 aminoácidos encontrada na superfície das células T e que estava associada a

apoptose11. Foi caracterizada posteriormente como uma cadeia de aminoácidos com um

domínio extracelular do tipo IgV, um domínio transmembranar e um domínio

citoplasmático com dois imunoreceptores com resíduos de tirosina 8,12.

O PD-1 é expresso em células dendríticas (DCs), células B, células T (CD4⁺e CD8⁺) e

células natural killer (NK)8. A sua função permanecia desconhecida até ter sido feito um

estudo onde se descobriu o aparecimento espontâneo de doenças autoimunes lupus-like

em ratos cujas células não expressavam PD-1 13,14. A molécula PD-1 limita então a

ativação e proliferação das células T ao mesmo tempo que promove tolerância do self,

prevenindo a autoimunidade e reações auto-inflamatórias no hospedeiro saudável15. O

seu subsequente ligando, PD-L1, só foi caracterizado em 1999/2000 16,17, sendo cada vez

mais utilizada esta relação como alvo terapêutico para neoplasias.

O PD-L1 é uma glicoproteína transmembranar tipo I, composta por domínios

extracelulares IgC e IgV-type. Muitos tecidos expressam elevadas quantidades deste

ligando, nomeadamente a placenta, o coração, os pulmões e o fígado e, em menores

quantidades, o baço, nódulos linfáticos e timo, sendo a sua expressão nula no cérebro12.

O PD-L1 pode também ser utilizado pelos tumores para escaparem ao ataque do sistema

imunitário, induzido pelo IFN-γ durante a resposta imune anti tumoral 18. A interação PD-

1/PD-L1 leva à supressão das células T, a fim de regular o sistema imunitário e impedir

a sua excessiva estimulação, prevenindo a autoimunidade. No entanto, este mecanismo é

utilizado no microambiente tumoral, permitindo assim a evasão tumoral19.

9

O EIXO PD-1/PD-L1 COMO ALVO TERAPÊUTICO

O bloqueio do eixo PD-1/PD-L1 é considerado um dos alvos mais importantes da

imunoterapia, com medicamentos já aprovados pela FDA, nomeadamente Nivolumab,

Pembrolizumab, Atezolizumab, Durvalumab e Avelumab20.

Figura 2: Bloqueio do eixo PD-1/PD-L1 restaura imunidade anti-neoplásica21

O Nivolumab é um anticorpo monoclonal IgG4 anti-PD-1 que foi aprovado inicialmente

para o tratamento do melanoma avançado metastático, irresecável e, posteriormente,

como terapêutica adjuvante, apresentando taxas de sobrevivência de 1 ano em 62% dos

doentes e de 2 anos em 43%, com uma média de sobrevivência de 16.8 meses22. É também

utilizado no cancro do pulmão de não pequenas células metastizado23, no cancro do

urotélio, carcinoma células renais em estadio avançado, carcinoma da cabeça e pescoço24,

linfoma de Hodgkin, cancro colorretal e carcinoma hepatocelular. Ao ligar-se ao recetor

do PD-1, impede a interação das células tumorais com o PD-L1 ou PD-L2 e restaura a

função das células T para promover uma resposta imune anti-tumoral 25.

O Pembrolizumab é também um anticorpo anti-PD-1, apresenta um mecanismo de ação

e uma atuação sobreponíveis ao Nivolumab26, A destacar ainda a sua aprovação para

tumores irresecáveis com dMismatch Repair/ Microsatelite Instability27. Em relação ao

melanoma metastático avançado, quando comparado diretamente com um anticorpo anti-

CTLA-4 como o Ipilimumab, tinha uma taxa de sobrevivência de 74.1% quando tomado

a cada duas semanas e 68.4% se tomado a cada 3 semanas, comparativamente aos 58.2%

do segundo28. No caso do NSCLC metastizado, sempre que o tumor cumpra os seguintes

critérios: expressão tumoral de PD-L1 de pelo menos 50% e sem alterações detetáveis ao

nível do EGFR negativo ou ALK positivo, é usado como monoterapia em primeira

linha.29

10

O Atezolizumab é um anticorpo IgG1 anti-PD-L1, assim como o Avelumab. O primeiro

foi aprovado para o carcinoma de não pequenas células do pulmão metastizado30 e para

carcinoma urotelial avançado31, enquanto o segundo é desde 2017 utilizado no carcinoma

das células de Merkel avançado ou metastizado32.

O Durvalumab é uma imunoglobulina G1 kappa que bloqueia a interação do PD-L1 com

o PD-1 e com o CD80. Foi aprovado para o carcinoma de não pequenas células do pulmão

irresecável estadio III que não mostraram progressão pós quimioterapia33.

A utilização desta terapêutica é muitas vezes realizada concomitantemente com o uso de

CTLA-4 ou com quimioterapia. Relativamente ao perfil de toxicidade, os doentes

apresentam efeitos secundários imuno-mediados, decorrentes da estimulação do sistema

imunitário. Os sintomas moderados mais frequentes são diarreia, prurido, rash, náusea e

anorexia não selectiva28,34. Como efeitos severos apresentaram colite, aumento dos níveis

de transaminases, tiroidites e nefrite intersticial35. Foram também descritos casos de

exacerbação de doenças autoimunes já existentes previamente 36, ou o desenvolvimento

de diabetes mellitus tipo 137. Dada a etiopatogenia dos efeitos secundários, o seu manejo

inclui tratamento com corticóides e agentes biológicos, para supressão da resposta

imunitária38.

FATORES QUE INFLUENCIAM A RESPOSTA À TERAPÊUTICA

Uma das grandes áreas investigacionais na área da imunoterapia é a procura por um

biomarcador e fatores que possam influenciar a resposta, quer do próprio tumor ou do

hospedeiro, de forma a identificar a população de doentes que maior beneficia deste tipo

de terapêutica.

A expressão de PD-L1 pelas células tumorais é atualmente o principal biomarcador para

seleção de doentes em alguns tipos de tumores. Existe, atualmente, falta de concordância

bibliográfica sobre a definição de “PD-L1 positivo”29,39,40. Em alguns tumores a

expressão de PD-L1 é utilizada para selecionar doentes com indicação para terapêutica

com anti-PD1 mas, noutros tumores, verificou-se que apesar de predizer maior

possibilidade de resposta, não era com exatidão suficiente para excluir doentes da sua

realização15. Esta relação entre a expressão de PD-L1 e a resposta a terapêutica foi

11

observada no melanoma34,41, mas não no carcinoma de células escamosas, carcinoma de

células de Merkel e NSCLC.23,24,32

A presença de células T CD8⁺ e células do sistema imune do hospedeiro que expressem

PD-1 e PD-L1 nas margens tumorais, juntamente com uma população de células T com

menor especificidade antigénica, faz com que o tumor seja sensível à ação dos inibidores

dos checkpoints. Ou seja, o facto de já ter havido um reconhecimento prévio do tumor

pelo hospedeiro aumenta muito a taxa de sucesso desta terapêutica.1,21,42 Conclui-se assim

que, para prever os efeitos da terapêutica, deverá ser feita uma avaliação mais ampla do

microambiente tumoral e não só das células tumorais.43

Um biomarcador promissor em estudo é o ADN tumoral circulante. Em vários estudos

verificou-se que a resposta ao tratamento foi mais favorável em doentes cujo ADN em

circulação era negativo, quer antes quer após o tratamento.44

Relativamente ao hospedeiro, a idade do doente pode consistir também num fator

influenciador da resposta a terapêutica. Pacientes mais jovens, com menos de 62 anos,

mostraram-se mais resistentes ao tratamento com anti-PD-1. A fisiopatologia baseia-se

no facto de terem níveis mais elevados de FOXP3 e Tregs juntamente com níveis mais

baixos de células CD8⁺. Num estudo realizado, 50% dos pacientes com menos de 62 anos

com melanoma responderam ao Pembrolizumab versus os 73% com mais de 62 anos.45

Há ainda outro fator de heterogeneidade que condiciona a magnitude das respostas do

sistema imune: polimorfismos na linha germinativa dos genes reguladores do sistema

imune. Poderão haver single-nucleotide polymorphisms (SNPs) que estão relacionados

com o grau de resposta e de infiltração aquando do aparecimento de um tumor.

Atualmente foi identificado um polimorfismo no gene que codifica o recetor CCR5 de

uma citoquina, associado a um aumento de resposta ao tratamento com IL-2 46. Será

necessário transpor esta investigação para os anti-PD1.

Um dos fatores que pode influenciar também a resposta, e ao qual este trabalho dá enfâse,

é a composição da flora intestinal. A presença de certos microrganismos favorece a

resposta ao tratamento com anticorpos bloqueadores do eixo PD-1/PD-L1. Existem vários

estudos em curso, para avaliar e caracterizar esta relação, uma vez que é um fator

potencialmente modificável e aumentar assim o sucesso terapêutico.47

12

FLORA INTESTINAL

O trato intestinal humano apresenta cerca de 3.8x10¹³ microrganismos, com cerca de 1012

organismos por cada grama de colón48. No entanto, a flora intestinal é variável ao longo

da vida, não sendo a mesma aquando do nascimento e na idade adulta. Os primeiros

microrganismos são adquiridos na passagem pelo canal vaginal materno ou contacto

direto com a pele e, posteriormente, através da amamentação49.

O microbioma é definido como o conjunto genómico dos microrganismos numa

determinada comunidade, enquanto a microbiota se refere a todos os microrganismos no

agregado50. Esta estabiliza e matura para um ecossistema adulto por volta dos 2-3 anos

de idade, no qual estabelece um equilíbrio com o hospedeiro, denominado de eubiose. É

principalmente constituída por Firmicutes e Bacteriodetes, que constituem cerca de 90%,

seguido de membros da família das Cyanobacteria, Fusobacteria, Actinobacteria,

Verrumicrobioa e Proteobacteria49,51.

A microbiota tem um papel no desenvolvimento das células do sistema imunitário,

condicionando quer a imunidade inata quer a adaptativa. Mais ainda, tem um efeito de

estimulação do mesmo, ao recrutar as células imunitárias e estimular a função protetora

das células epiteliais52, podendo então modular a resposta do organismo e a própria

progressão tumoral53.Sendo dinâmico, é afetado por fatores extrínsecos nomeadamente

estilo de vida do hospedeiro, composição e tipo de alimentação e toma de fármacos como

antibióticos, o que pode condicionar as respostas a tratamentos anti tumorais, ativar vias

inflamatórias e propiciar evasão cancerígena ao sistema imunitário.10,49,54

IMPACTO DA DIETA NA FLORA INTESTINAL

Com as constantes inovações alimentares e de estilo de vida, os alimentos existentes com

excesso de açúcar ou excesso de gordura alteraram a composição e atividade metabólica

da microbiota intestinal.55

Lawrence et al.56 comparou o efeito de duas dietas distintas no flora intestinal: uma com

alimentos à base de plantas, e outra com alimentos provenientes de produtos animais. O

resultado foi de uma alteração significativa da flora intestinal na segunda dieta, com um

13

aumento exponencial de B. wadsworthia, cuja produção de H₂S está relacionada com uma

maior propensão para doenças inflamatórias do intestino.

IMPACTO DOS ANTIBIÓTICOS NA FLORA INTESTINAL

Cada vez mais são realizados estudos, desde a sua descoberta na década de 1940, para

caracterizar o efeito dos antibióticos em determinados microrganismos e a sua

repercussão no equilíbrio do microbioma intestinal 57.

Noriho et al.58 injetaram células de linfoma, cancro colo rectal e melanoma em ratos que

previamente tinham recebido um cocktail antibiótico durante três semanas composto por

Vancomicina, Imipenem e Neomicina. Uma semana após a cessação antibiótica, a

diversidade bacteriana estava a aumentar, nunca voltando ao estado pré antibiótico. Os

microrganismos mais afetados foram os Ruminococcus e Alistipes, responsáveis por

induzir a produção de Tumor Necrosis Factor (TNF), o que resultou numa reduzida

regressão tumoral comparativamente aos ratos que não tinham feito antibiótico.

Hedvig et al.59 administraram Claritromicina e Metrodinadazol per os a 6 indivíduos

saudáveis durante uma semana. Imediatamente após o fim do tratamento, a flora intestinal

dos indivíduos passou a ser dominada por Firmicutes e Proteobacteria, sendo que as

bactérias do grupo Actinobacteria, nomeadamente Bifidobacterium, o Clostridium e os

Bacteroides foram os mais afetados, permanecendo assim até quatro semanas após

tratamento.

14

INFLUÊNCIA DA FLORA INTESTINAL NA RESPOSTA AOS ANTI PD-1/PD-

L1

Com o sucesso terapêutico demonstrado dos inibidores dos checkpoints, tornou-se

imperativo perceber a razão pela qual apenas alguns doentes apresentam uma alta taxa de

resposta terapêutica em detrimento de outros.

Com a informação prévia de que a flora intestinal modulava a resposta à

quimioterapia,58,60 foram realizados estudos em ratos com neoplasia que seriam depois

tratados com anti-PD-1.

Em 2015, Sivan et al61 estudaram dois grupos de ratos, geneticamente semelhantes, que

provinham de ambientes diferentes: um grupo provinha dos laboratórios Jackson, sendo

denominado de rato JAX, e o outro de uma quinta, intitulado de rato TAC. A principal

diferença entre eles residia na composição da microbiota intestinal.

Foram injetadas células neoplásicas de melanoma subcutâneo B16.SIY em ambos, e,

antes de qualquer manipulação, foi estudada a taxa de crescimento tumoral, no qual os

ratos TAC exibiam um crescimento tumoral mais agressivo, que se traduzia num maior

volume tumoral no período após o procedimento. Isto era explicado por diferenças a nível

imunitário: os ratos JAX exibiam um maior número de células T específicas do tumor e

uma maior acumulação de células CD8⁺ intratumoralmente.

Quando tratados ratos de cada grupo com bloqueadores do eixo PD-1/PD-L1, constatou-

se que esta terapêutica foi muito mais eficaz nos ratos JAX.

Para estabelecer uma relação de causa-efeito, foi realizada uma transferência de material

fecal de um dos ratos JAX para um rato TAC, tendo ocorrido uma diminuição da taxa de

crescimento tumoral. Paralelamente, outros ratos TAC foram transplantados com material

fecal JAX juntamente com anticorpo anti PD-L1, obtendo-se a melhor resposta de

controlo tumoral nos ratos TAC neste estudo.

15

Figura 3: Em cima o crescimento tumoral nos ratos TAC: sem tratamento, tratados só

com o transplante fezes de ratos JAX, tratados apenas com ANTI-PD-L1 ou tratados com

a combinação fezes de rato JAX e anti PD-L1.

Em baixo o crescimento tumoral nos dois grupos de ratos, sem tratamento e com

tratamento com ANTI-PD-L1.61

Depois de monitorizado o conteúdo fecal, o único dado relevante foi a predominância do

Bifidobacterium, que se encontrava 400 vezes mais aumentado nos ratos JAX, com

isolamentos das espécies B. breve, B. longum, e B. adolescentis. Seguidamente, fez-se

suplementação oral do mesmo aos ratos com uma flora não favorável, nos quais se

observou um restauro da resposta à terapêutica. A presença desta bactéria resultava numa

hiper-regulação de genes interferão tipo I nas células apresentadoras de antigénio nos

órgãos linfoides secundários, associado a uma maior maturação das células dendríticas e

aumento da atividade de células T CD8⁺ específicas do tumor.

Tendo como base o resultado deste estudo, foram então realizados novos estudos à flora

intestinal de doentes que estavam atualmente a ser tratados com anti-PD-1, de forma a

correlacionar também a composição da sua flora com a resposta á terapêutica instituída.

Frankel et al 62, em 2017, usou uma técnica de sequenciação dos componentes da flora

intestinal de doentes com melanoma metastático, antes de iniciarem terapêutica com

inibidores de checkpoint – Ipilimumab em monoterapia; Ipilimumab com Nivolumab;

Nivolumab ou Pembrolizumab em monoterapia. O objetivo deste ensaio seria determinar

16

as diferenças significativas nas populações da flora intestinal entre os doentes que

respondiam ao tratamento e os que, apesar do mesmo, tinham uma progressão da doença

Na generalidade, todos os que respondiam ao tratamento tinham uma flora abundante em

Bacteroides caccae e Streptococcus Parasanguinis,no qual se incluía o único doente

tratado com Nivolumab em monoterapia. Em relação aos tratados com Ipilimumab com

Nivolumab, a predominância era de Faecalibacterium prausnitzii, Holdemania Filiformis

e Bacteroides thetaiotamicron. Nos doentes tratados apenas com Pembrolizumab, a flora

era enriquecida com Dorea formicigenerans. Apesar destes achados, as limitações do

estudo foram o facto de não serem conhecidos os mecanismos pelas alterações

encontradas e a análise ter sido apenas realizada antes do tratamento e não também depois,

podendo perceber-se qual a influência desta terapêutica algumas espécies da flora.

Em 2018, Gopalakrishnan et al.63 estudou a flora intestinal e oral de doentes com

melanoma metastático. O intuito era mais uma vez diferenciar a flora dos doentes

responsivos à terapêutica (resposta completa, parcial ou doença estável com duração de

pelo menos 6 meses) dos não responsivos (progressão da doença ou doença estável com

duração de menos de 6 meses)64.

No grupo dos responsivos, havia uma abundância de bactérias dos

Clostridiales/Ruminococcaceae, com predominância de espécies de Faecalibacterium,

enquanto os não responsivos tinham um maior número de Bacteroidales. Em relação á

flora oral, não houve diferenças significativas.

Tendo isto em consideração, foram estudados os mecanismos pelos quais esta flora

poderia influenciar a resposta: nos responsivos, os grupos de bactéria faziam

maioritariamente funções anabólicas e biossíntese de aminoácidos, ao invés dos não-

responsivos nos quais se observavam funções catabólicas. Constatou-se também uma

correlação positiva entre os grupos bacterianos e um maior infiltrado tumoral de células

T CD8⁺ nos responsivos, juntamente com maior diversidade de células imunitárias.

Para confirmar esta causalidade foi realizado um transplante fecal para ratos germ-free,

seguido de inoculação de células de melanoma e tratamento com anti-PD-1. Ao dia 14,

os ratos que tinham sido transplantados com flora de doentes responsivos apresentavam

uma melhor resposta ao tratamento, menos crescimento tumoral e uma flora intestinal

abundante em Faecalibacterium. Mais ainda, apresentaram uma maior densidade de

CD8+, coincidente com os resultados nos humanos.

17

Routy et al.65 investigaram estas interações mas em doentes com tumores epiteliais,

nomeadamente em pacientes com carcinoma do pulmão ou carcinoma de células renais.

Os resultados a destacar foram uma abundância de Akkermansia muciniphila nos doentes

que apresentaram uma melhor resposta clínica e sobrevivência livre de progressão

tumoral. Esta bactéria aumentava um recrutamento de linfócitos CCR9⁺CXCR3⁺CD4⁺ T

para o combate do tumor. Depois de um transplante fecal de flora de doentes não

responsivos para ratos germ-free, percebeu-se que a eficácia do tratamento com anticorpo

anti-PD-1 podia ser restaurada através da administração de Akkermansia muciniphila.

Matson et al66 estudaram 42 pacientes com melanoma metastizado , dos quais 26 foram

responsivos ao tratamento com anti-PD1 e 16 tiveram progressão da doença . Foram

isoladas 8 espécies mais comuns: Enterococcus Faecium, Collinsella aerofaciens,

Bifidobacterium adolescentis, Klebsiella pneumoniae, Veillonella parvula,

Parabacteroides merdae, Lactobacillus sp. e Bifidobacterium longum. A Akkermansis

Mucinipila, descrita por Routy65, foi apenas isolada em 4 dos responsivos. Seguidamente,

realizaram também uma transferência para ratos germ-free de flora intestinal humana,

seguido de uma inoculação com melanoma. Não só os ratos que receberam a flora

intestinal dos doentes responsivos apresentaram um menor crescimento tumoral antes do

tratamento em comparação aos que receberam flora dos não-responsivos, como acabaram

por mimetizar a flora intestinal dos dadores, acompanhado por um aumento das células T

ativadas. A resposta à terapêutica com anti-PD-1 foi também concordante com a dos

dadores. Houve, no entanto, um grupo que não mostrou o mesmo padrão intestinal que o

dador nem resposta ao tratamento, pelo que se pode concluir que, apesar de na maioria

das vezes as experiências em ratos mimetizarem a resposta dos dadores humanos, pode

haver a possibilidade de certas bactérias expandirem mais e alterarem o fenótipo do

recetor.

Este estudo veio validar que a presença abundante de bactérias benéficas associada a fraca

expressão de bactérias com impacto negativo é preditor de um resultado clinico e

terapêutico mais favorável.

De acordo com a literatura disponível, não existe uma grande concordância entre as

bactérias específicas associadas a uma maior taxa de resposta, apesar de algumas bactérias

pertencerem a grupos filogeneticamente relacionados. Estas diferenças podem ser devido

18

às diferentes técnicas de sequenciamento genómico utilizadas nos vários estudos,

influências geográficas e a diversidade alimentar.50

Mais ainda, apesar de ainda não ser conhecido o mecanismo exato desta causalidade entre

a flora intestinal e a resposta à imunoterapia, os mecanismos hipotéticos principais são a

estimulação de resposta pelas células T contra os antigénios bacterianos, que por sua vez

auxiliam as respostas imunes contra o tumor; formação de um padrão de reconhecimento

de recetores que medeiam os efeitos imunes e anti-inflamatórios ou, por fim, através de

pequenos metabolitos desconhecidos que tenham efeitos sistémicos no hospedeiro.52

A RELEVÂNCIA DOS ANTIBIÓTICOS

A toma de antibióticos afeta a flora intestinal como descrito previamente, condicionando

assim o potencial terapêutico de tratamentos usados para combater o cancro.

Já tinha sido previamente descrito que uma depleção da microbiota em ratos com cancro

do pulmão tratados com antibiótico, que posteriormente foram tratados com

quimioterapia (cisplatina), tinha um efeito deletério na sobrevivência e eficácia

terapêutica quando comparada com ratos que tinam sido apenas tratados com cisplatina67.

Routy et al65começou por estudar o efeito dos antibióticos em ratos com melanoma ou

sarcoma, que seriam posteriormente tratados com anti-PD-1. Um grupo receberia

terapêutica antibiótica, com duração de 14 dias, que consistia em ampicilina, colistina e

estreptomicina. Este tratamento resultou num aumento do tamanho do tumor e uma menor

sobrevivência global em relação ao grupo que não recebeu o antibiótico, estabelecendo-

se uma associação entre a diminuição da eficácia do tratamento com anti-PD-1 e o uso

prévio de antibiótico.

Figura 4: Crescimento tumoral do melanoma (esquerda) e do sarcoma (direita) tratados

com anti-PD-1 ou solução controlo, com ou sem antibioterapia prévia65

19

Seguidamente, foi transposta a experiência para um grupo de doentes com carcinoma do

pulmão de não pequenas células, carcinoma de células renais ou carcinoma do urotélio,

tratados com terapêutica anti-PD-1. Os 29% que tinham sido tratados com antibióticos

(maioritariamente β-lactâmicos, fluroquinolonas ou macrólidos) até 4 meses prévios ou

durante a terapêutica apresentaram uma menor sobrevivência livre de progressão tumoral

(PFS) e menor sobrevivência global quando comparados com os restantes que não tinham

recebido antibiótico.

Figura 5: Comparação da sobrevivência sem progressão tumoral (esquerda) e

sobrevivência global (direita) após terapêutica com anti-PD-1, entre doentes que tinham

sido tratados com antibióticos (vermelho) e os que não tinham (preto)65

Este estudo foi depois reforçado por Huemer et al68 em doentes com carcinoma do pulmão

de não pequenas células.

Tendo em consideração que a flora intestinal demora entre 30 a 90 dias a restabelecer

após a toma de um antibiótico59, Derosa et al69 administraram β-lactâmicos 30 dias antes

do início da terapêutica com anti-PD1 em doentes com NSCLC e carcinoma de células

renais. Os resultados foram sobreponíveis aos já descritos na literatura65. No entanto, o

impacto do antibiótico na resposta ao tratamento após 60 dias do início do anti-PD-1 era

menor, e foi progressivamente diminuindo, podendo ser explicado pela recuperação

parcial da flora.

Os antibióticos parecem ser um determinante de pior prognóstico no contexto de

tratamento com inibidores dos anti-PD-1, independente dos restantes fatores já

conhecidos. Apesar de não estar caracterizado o mecanismo exato pelo qual os

antibióticos exercem um efeito deletério no prognóstico, há uma alta probabilidade de ser

pela erradicação das bactérias imunogénicas responsáveis pela resposta do sistema imune

ao tratamento.

20

MANIPULAÇÃO DA FLORA PARA OBTER MELHORES RESPOSTAS

Sendo a composição da flora um fator modificável, estratégias para a sua manipulação

têm vindo a ser desenvolvidas com o objetivo final de potenciar a resposta aos tratamentos

anti-tumorais.Com o intuito de colonizar a flora intestinal com as bactérias que foram

apontadas como “favoráveis” em determinado tumor, está a ser estudada a utilização de

prebióticos e probióticos. Mais ainda, a utilização de transplante fecal entre humanos

poderá ser uma estratégia terapêutica a considerar.

PROBIÓTICOS

A Organização Mundial de Saúde define probióticos como microrganismos vivos que,

quando administrados na dose adequada, conferem benefício para a saúde do

hospedeiro70. A maioria são bactérias produtoras de ácido láctico, nomeadamente

Bifidobacterium. A administração isolada desta bactéria tinha abolido praticamente o

crescimento tumoral em ratos com melanoma tratados com anti-PD-161.

No entanto, aguarda-se ainda um maior consenso em relação às bactérias “ideais” que

possam ser administradas.

PREBIÓTICOS E DIETA

Os prebióticos são definidos como os componentes não viáveis dos alimentos que

promovem o crescimento/atividade de certos microrganismos no cólon71.A maioria destes

são fibras, que serão depois fermentadas pelas bactérias comensais. Ao favorecer uma

descida de pH, promove o crescimento de bactérias benéficas para a resposta aos anti-

PD-1 como os Bifidobacterium72. A eliminação de gordura animal da dieta humana foi

associada à diminuição da espécie Bacteroidales na flora intestinal73, um elemento

presente nos doentes não responsivos à terapêutica63.

Encontra-se a decorrer um estudo em doentes com diversos tipos de neoplasia, no qual é

adicionado à alimentação meio copo de feijões por dia, com o intuito de perceber as

mudanças da flora (NCT02843425).50

21

TRANSPLANTE FECAL

Se um doente não é colonizado por bactérias favoráveis que auxiliem a resposta à

terapêutica, é intuitivo considerar um transplante fecal de um dador que a tenha. Sendo o

meio mais direto de manipular a flora intestinal, tem uma alta taxa de eficácia no

tratamento da diarreia refratária a Clostridium difficile74 ou na doença inflamatória do

intestino75.

Com o transplante fecal, todo o ecossistema é transplantado de um dador, ao invés da

administração de uma única bactéria isolada. Este método é mais vantajoso para o recetor,

uma vez que ao serem introduzidas várias bactérias, há uma menor exclusão competitiva

pela flora pré existente, permitindo a sobrevivência da maior parte da flora

transplantada.76

O critério major para a escolha de dador deve consistir num individuo com uma flora

previamente descrita como favorável para a resposta ao tratamento com anti-PD-152. No

entanto, ainda não há um consenso total sobre qual a flora favorável e desfavorável,

aguardando-se mais estudos e suporte científico para que a modulação da flora possa ser

instituída como parte do tratamento anti tumoral.

22

CONCLUSÃO

O tratamento das neoplasias mantém-se um desafio, perante a heterogeneidade tumoral e

de resposta existentes. Apesar da imunoterapia, nomeadamente o bloqueio do eixo PD-

1/PD-L1, ter alterado de forma surpreendente a história natural de vários tumores, persiste

a necessidade de biomarcadores que possam melhorar ainda mais o prognóstico e

sobrevivências dos doentes. Com fatores de prognóstico já estabelecidos, o papel da

microbiota intestinal revelou uma importância significativa neste processo.

Com diversos estudos a estabelecerem uma relação benéfica entre a presença de certos

componentes da flora intestinal e a resposta à terapêutica com inibidores de checkpoint

anti-PD-1, torna-se imperativo a realização de mais estudos para que possa haver uma

maior uniformização para cada tipo de neoplasia passível de ser tratada desta forma. Mais

ainda, é consensual a disrupção da flora intestinal pela utilização de diversos tipos de

antibióticos, devendo estes ser evitados por diminuírem a taxa de sucesso terapêutico.

Visto que a flora pode ser modificada por vários fatores, o uso de estratégias para modular

a mesma com vista a otimizar a sobrevivência livre de progressão tumoral e a

sobrevivência global devem ser consideradas.

23

AGRADECIMENTOS

À minha família, em especial, aos meus pais, tios, avó e Tiago pela motivação e apoio

incondicional, pelo carinho e paciência, ao longo de todo o meu percurso académico.

Aos meus amigos pela partilha e pelo apoio, ao longo, não só deste último ano, como ao

longo de todo o curso.

À minha orientadora, Dra. Rita Sousa, pela disponibilidade, apoio e contribuições

valiosas para o trabalho.

24

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