Infect. Immun.-1979-Ewert-269-75.pdf

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    1/7

    V o l . 2 4 , N o .

    1

    N F E C T I O N AND

    I M M U N I T Y ,

    A p r .

    1 9 7 9 , p .

    2 6 9 - 2 7 5

    0 0 1 9 - 9 5 6 7 / 7 9 / 0 4 - 0 2 6 9 / 0 7 0 2 . 0 0 / 0

    L o c a l

    A n t i b o d y

    R e s p o n s e

    i n

    C h i c k e n s :

    A n a l y s i s o f A n t i b o d y

    S y n t h e s i s

    t o N e w c a s t l e

    D i s e a s e

    V i r u s b y

    S o l i d - P h a s e

    R a d i o i m m u n o a s s a y

    a n d I m m u n o f l u o r e s c e n c e

    w i t h

    C l a s s -

    S p e c i f i c

    A n t i b o d y

    f o r

    C h i c k e n

    I m m u n o g l o b u l i n s

    DONALD

    L .

    EWERT,t*

    BRUCE 0.

    BARGER,

    AND

    CASWELL

    S .

    EIDSON

    P o u l t r y

    D i s e a s e R e s e a r c h C e n t e r ,

    D e p a r t m e n t o f A v i a n

    M e d i c i n e ,

    C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e ,

    U n i v e r s i t y o f

    G e o r g i a ,

    A t h e n s ,

    G e o r g i a 3 0 6 0 5

    R e c e i v e d

    f o r

    p u b l i c a t i o n

    1 4

    J a n u a r y

    1 9 7 9

    The a n t i b o d y

    response

    t o N e w c a s t l e

    d i s e a s e v i r u s

    was

    m o n i t o r e d i n

    t h e

    sera

    a n d

    s a l i v a s

    o f a d u l t

    c h i c k e n s

    i m m u n i z e d

    b y

    two

    m e t h o d s :

    i )

    c o m b i n e d

    i n t r a t r a -

    c h e a l - i n t r a n a s a l v a c c i n a t i o n f o l l o w e d

    b y

    i n t r a t r a c h e a l

    r e v a c c i n a t i o n

    or

    i i )

    i n t r a -

    m u s c u l a r

    v a c c i n a t i o n

    f o l l o w e d

    b y

    i nt r a t r a c h e a l r e va c c i n a t io n .

    By

    s o l i d - p h a s e

    r a d i o i m m u n o a s s a y , o n l y i m m u n o g l o b u l i n

    G

    ( I g G )

    a n d

    I g A

    a n t i b o d i e s t o

    N e w c a s -

    t l e d i s e a s e

    v i r u s were

    d e t e c t e d

    i n

    t h e

    s a l i v a s ,

    w h e r e a s

    I g A

    a n d

    Ig M

    a n t i b o d i e s

    were p r e s e n t

    i n

    e g g w h i t e s . The

    f i r s t

    m e t h o d

    p r o d u c e d t h e h i g h e s t a n t i b o d y

    l e v e l s

    i n b o t h serum

    a n d

    s a l i v a

    a n d ,

    i n

    a d d i t i o n , p r e v e n t e d d e t e c t a b l e

    v i r u s m u l t i p l i c a -

    t i o n

    i n t h e

    r e s p i r a t o r y

    t r a c t s

    upon

    r e v a c c i n a t i o n

    4

    w e e k s

    l a t e r . P l a s m a c e l l s

    o f a l l

    t h r e e

    c l a s s e s

    were d i s t r i b u t e d

    t h r o u g h o u t

    t h e t i s s u e s

    l i n i n g

    t h e o r a l

    c a v i t i e s . Th e

    h i g h e s t

    d e n s i t i e s

    o f

    p l a s m a

    c e l l s were

    i n t h e

    H a r d e r i a n

    g l a n d s ; I g G

    was t h e

    p r e d o m i n a n t c l a s s ,

    w h e r e a s

    I g A

    a n d

    Ig M

    p l a s m a

    c e l l s

    were

    p r e s e n t

    i n

    a l m o s t

    e q u a l

    b u t

    l o w e r

    n u m b e r s .

    Th e

    H a r d e r i a n

    p l a s m a

    c e l l s were t h e most

    l i k e l y

    source

    o f

    t h e

    a n t i b o d y

    f o u n d

    i n

    s a l i v a .

    The

    i m p o r t a n c e

    o f

    l o c a l l y

    p r o d u c e d

    a n t i b o d -

    i e s

    i n

    t h e

    d e f e n s e

    o f

    m u c o s a l s u r f a c e s

    a g a i n s t

    v i r a l

    i n f e c t i o n s

    h a s

    b e e n

    w e l l

    d o c u m e n t e d

    i n

    humans

    a n d

    a n i m a l s

    ( 1 2 ,

    2 4 , 2 6 , 2 7 ) .

    S e v e r a l

    r e p o r t s

    h a v e

    d e m o n s t r a t e d

    t h e

    i m p o r t a n c e

    o f

    s u c h

    a n t i b o d i e s

    i n t h e

    r e s p i r a t o r y

    t r a c t s

    o f

    c h i c k -

    e n s

    s u b j e c t e d

    t o l o c a l

    a p p l i c a t i o n

    o f

    a n t i g e n 2 ,

    1 3 , 2 3 ,

    3 0 , 3 5 , 3 6 ) .

    I n

    p a r t i c u l a r ,

    s i n c e

    t h e

    p r i m a r y

    s i t e

    o f i n f e c t i o n

    o f

    N e w c a s t l e

    d i s e a s e v i r u s

    N D V )

    i s t h e

    r e s p i r a t o r y

    t r a c t

    ( 1 7 , 1 8 ) ,

    e m p h a s i s

    h a s

    b e e n

    p l a c e d

    o n

    t h e

    l o c a l

    a p p l i c a t i o n

    o f

    NDV

    v a c c i n e s

    b y e y e d r o p

    a n d

    a e r o s o l

    m e t h o d s

    2 , 3 ,

    3 0 ) . H o w e v e r , a n a l y s i s

    o f

    t h e l o c a l

    a n t i b o d y

    r e -

    s p o n s e

    h a s

    b e e n f r u s t r a t e d

    b y

    t h e

    p a u c i t y

    o f

    a n t i b o d y p r o d u c e d

    a n d t h e

    d i f f i c u l t y

    o f

    q u a n t i -

    t a t i v e l y c o l l e c t i n g

    s a m p l e s . C o n s e q u e n t l y ,

    d e -

    s p i t e

    i n d i c a t i o n s

    t h a t u n d e r

    g i v e n

    c o n d i t i o n s

    l o c a l

    i m m u n i t y

    i n t h e

    r e s p i r a t o r y

    t r a c t

    may

    d e -

    v e l o p

    i n

    t h e

    a b s e n c e

    o f

    s e r u m

    a n t i b o d y ,

    t h e

    p r i m a r y

    i n d i c a t o r

    o f t h e

    e f f i c a c y

    o f

    v a c c i n a t i o n

    m e t h o d s

    h a s b e e n s e r u m

    h e m a g g l u t i n a t i o n

    i n -

    h i b i t i o n t i t e r s .

    The

    a i m s

    o f t h e

    p r e s e n t w o r k

    w e r e

    t o

    d e t e r -

    m i n e t h e e f f e c t t h a t t h e

    r o u t e o f

    p r i m a r y

    v a c c i -

    n a t i o n h a s

    o n

    t h e

    a p p e a r a n c e o f a n t i b o d y o f

    e a c h

    i m m u n o g l o b u l i n

    c l a s s

    i n

    s e c r e t i o n s

    b o t h

    t

    P r e s e n t a d d r e s s : L u r l e n e W a l l a c e Tumor

    I n s t i t u t e ,

    U n i -

    v e r s i t y o f

    A l a b a m a , B i r m i n g h a m ,

    A L 3 5 2 9 4 .

    b e f o r e a n d

    a f t e r

    r e e x p o s u r e b y

    t h e

    r e s p i r a t o r y

    r o u t e ,

    t h e d u r a t i on

    o f t h e l o c a l

    r e s p o n s e ,

    a n d

    t h e

    c o r r e l a t i o n

    o f

    t h e

    d e v e l o p m e n t

    o f l o c a l

    a n t i b o d y

    l e v e l s

    w i t h s e r u m

    a n t i b o d y .

    A

    s e n s i t i v e s o l i d -

    p h a s e r a d i o i m m u n o a s s a y

    w a s

    d e v e l o p e d i n

    t h i s

    l a b o r a t o r y

    t o

    p e r m i t q u a n t i t a t i o n

    o f

    l o w

    l e v e l s

    o f

    a n t i b o d y

    i n s e c r e t i o n s .

    MATERIALS

    A N D METHODS

    A n i m a l s . F i f t e e n

    W h i t e

    L e g h o r n

    c h i c k e n s

    w e r e

    h a t c h e d f r o m

    e g g s

    p u r c h a s e d f r o m

    S p e c i f i c

    P a t h o g e n

    F r e e

    A v i a n

    S u p p l y ,

    N o r w i c h , C o n n . The b i r d s

    w e r e

    r a i s e d

    i n

    b a t t e r i e s m a i n t a i n e d

    i n

    r o o m s

    s u p p l i e d

    w i t h

    f i l t e r e d

    a i r

    a n d

    u n d e r

    n e g a t i v e

    p r e s s u r e .

    T r e a t m e n t . A t

    6 w e e k s o f a g e , t h e b i r d s

    w e r e

    d i v i d e d i n t o t h r e e

    s e p a r a t e

    g r o u p s

    o f

    f i v e e a c h :

    i )

    f i v e

    w e r e

    i n o c u l a t e d

    i n t r a m u s c u l a r l y

    ( i . m . ) w i t h 0 . 2

    m l

    o f

    a s t o c k

    B - i - t y p e

    L a s o t a

    s t r a i n o f ND

    c o n t a i n i n g

    1 0 8 4

    5 0

    e f f e c t i v e l e t h a l d o s e s

    p e r

    m l ; i i )

    f i v e

    w e r e i n o c u -

    l a t e d

    i n t r a t r a c h e a l l y i . t . )

    a n d

    i n t r a n a s a l l y w i t h 0 . 4

    a n d

    0 . 1

    m l ,

    r e s p e c t i v e l y ,

    o f t h e s a m e

    s t o c k

    o f v i r u s

    d i l u t e d 1 : 1 0 i n

    s t e r i l e p h o s p h a t e - b u f f e r e d

    s a l i n e

    P B S ) ;

    a n d

    i i i )

    f i v e

    r e m a i n e d

    u n e x p o s e d

    t o NDV

    a n d s e r v e d

    a s

    c o n t r o l s .

    On

    d a y s 4 , 7 , 1 0 , 1 4 , 2 1 ,

    a n d

    2 8 a f t e r v a c c i n a t i o n ,

    s a l i v a a n d

    b l o od w e r e o b t a i n e d f r o m

    e a c h b i r d . T h i r t y

    d a y s

    a f t e r

    p r i m a r y

    e x p o s u r e

    t o N DV,

    b o t h

    g r o u p s

    w e r e

    r e i n o c u l a t e d i . t . w i t h t h e

    s a m e s t r a i n

    o f NDV

    a s

    t h a t

    d e s c r i b e d

    a b o v e . A 0 . 6 - m l

    a m o u n t

    o f

    t h e

    v a c c i n e

    s t o c k d i l u t e d

    1 : 3 i n

    PBS w a s

    i n j e c t e d

    i n t o t h e

    t r a c h e a

    2 6 9

    onM

    ay4

    ,2

    01

    6

    byguest

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  • 7/26/2019 Infect. Immun.-1979-Ewert-269-75.pdf

    2/7

    2 7 0 EWERT,

    BARGER,

    AND

    EIDSON

    o f e a c h

    b i r d . S e r u m

    a n d s a l i v a r y

    s a m p l e s

    w e r e

    o b -

    t a i n e d f r o m

    e a c h b i r d o n

    t h e s a m e s c h e d u l e

    a s

    t h a t

    a f t e r p r i m a r y e x p o s u r e .

    C o l l e c t i o n

    and

    t e s t i n g

    o f

    s a m p l e s .

    B l o o d

    w a s

    o b t a i n e d

    f r o m

    t h e

    w i n g

    v e i n a n d s e r u m

    w a s

    e x t r a c t e d

    f r o m

    c l o t t e d b l o o d .

    E a c h

    c h i c k e n

    w a s

    i n d u c e d

    t o

    s a l i -

    v a t e b y i n j e c t i n g

    0 . 5 t o 0 . 7

    m l

    o f

    a 1 s o l u t i o n o f

    p i l o c a r p i n e

    n i t r a t e

    S i g m a

    C h e m i c a l

    C o . ,

    S t

    L o u i s ,

    M o . )

    i n PBS v i a t h e

    w i n g

    v e i n . S a l i v a

    w a s

    a s p i r a t e d

    f r o m t h e o r a l

    c a v i t y

    w i t h

    a

    1 0 - m l s y r i n g e

    w i t h a s h o r t

    p i e c e

    o f

    p l a s t i c t u b i n g e x t e n d i n g

    f r o m a n

    1 8 - g a u g e

    n e e d l e .

    B e t w e e n 0 . 5 a n d 1 . 0 m l o f

    t h e f i r s t

    s a l i v a

    a s p i r a t e d

    w a s

    p l a c e d

    i n

    a

    t u b e

    o n

    i c e ,

    d i l u t e d f o u r f o l d

    w i t h

    P B S ,

    a n d s u b j e c t e d

    t o

    s o n i c

    t r e a t m e n t f o r 0 . 5

    m i n a t

    s e t t i n g

    n o .

    3

    ( S o n i f i e r

    m o d e l

    W 1 8 5 ;

    H e a t

    S y s -

    t e m s - U l t r a s o n i c s ,

    I n c . ,

    P l a i n v i e w , N . Y . ) t o b r e a k

    u p

    t h e

    m u c i n .

    The

    s a m p l e

    w a s

    c e n t r i f u g e d

    a t

    5 0 0

    x

    g

    f o r

    1 5

    m i n t o

    r e m o v e s o l i d

    d e b r i s ,

    a n d

    t h e

    s u p e r n a t a n t

    w a s

    t r a n s f e r r e d

    t o

    v i a l s

    a n d

    f r o z e n

    u n t i l

    a s s a y e d .

    S e r u m

    a n t i - N D V

    a n t i b o d y

    w a s

    q u a n t i t a t e d b y t h e

    h e m a g g l u t i n a t i o n

    i n h i b i t i o n

    ( H I ) a s s a y ( 2 5 ) , u s i n g

    4 U

    o f

    a n t i g e n . S a l i v a r y

    a n t i - N D V

    a n t i b o d y

    w a s

    a s s a y e d

    b y

    t h e p l a q u e

    n e u t r a l i z a t i o n t e s t

    8 ) .

    The

    l e v e l s o f

    g i v e n

    c l a s s e s

    o f a n t i - N D V a n t i b o d y

    i n

    s a l i v a ,

    u n d i l u t e d

    a n d d i l u t e d

    1 : 2 ,

    w e r e

    d e t e r m i n e d

    b y

    t h e

    r a d i o i m m u -

    n o a s s a y

    d e s c r i b e d

    b e l o w .

    S a l i v a r y

    s a m p l e s

    w e r e

    t e s t e d

    f o r t h e

    p r e s e n c e

    o f

    i m m u n o g l o b u l i n s b y

    t h e O u c h t e r -

    l o n y

    m e t h o d

    ( 2 9 ) ,

    u s i n g

    1

    a g a r o s e g e l c o n t a i n i n g

    2

    p o l y e t h y l e n e

    g l y c o l ( 6 , 0 0 0

    m o l e c u l a r

    w e i g h t )

    a n d

    c l a s s - s p e c i f i c

    a n t i s e r a .

    R a d i o i m m u n o a s s a y .

    T h e

    s o l i d - p h a s e

    r a d i o i m -

    m u n o a s s a y

    d e s c r i b e d

    p r e v i o u s l y

    7 ,

    1 4 - 1 6 ,

    3 2 )

    w a s

    m o d i f i e d

    f o r

    q u a n t i t a t i o n

    o f

    c l a s s - s p e c i f i c

    a n t i - N D V

    i m m u n o g l o b u l i n s

    i n

    c h i c k e n s

    ( t e c h n i q u e t o

    b e

    r e -

    p o r t e d e l s e w h e r e ) .

    B r i e f l y ,

    s t o c k s o f NDV

    a n t i g e n

    w e r e

    p r e p a r e d

    i n

    c e l l c u l t u r e .

    M o n o l a y e r s

    o f

    V e r o

    m o n k e y k i d n e y

    c e l l s w e r e

    i n o c u l a t e d w i t h a s t r a i n o f

    NDV

    a d a p t e d

    t o

    g r o w t h

    i n V e r o c e l l s

    ( k i n d l y s u p p l i e d

    b y

    P .

    L u k e r t , D e p a r t m e n t

    o f M e d i c a l

    M i c r o b i o l o g y ,

    U n i v e r s i t y

    o f

    G e o r g i a , A t h e n s ) .

    A f t e r

    5

    d a y s

    o f i n c u -

    b a t i o n ,

    w h e n a b o u t

    5 0 o f

    t h e

    m o n o l a y e r

    s h o w e d

    c y t o p a t h i c e f f e c t s ,

    t h e

    medium

    a n d c e l l s

    w e r e f r o z e n

    a n d t h a w e d t h r e e

    t i m e s

    a n d

    s u b j e c t e d

    t o s o n i c

    t r e a t -

    ment

    f o r

    1

    m i n

    o n

    s e t t i n g

    n o .

    5 ,

    a n d

    t h e v i r u s

    w a s

    i n a c t i v a t e d

    w i t h

    f i - p r o p i o l a c t o n e .

    T h e

    p r e p a r a t i o n

    w a s

    c l a r i f i e d ,

    a n d

    t h e

    s u p e r n a t a n t

    was

    h a r v e s t e d

    a n d

    f r o -

    z e n . S t o c k s

    o f

    n o n v i r a l

    a n t i g e n s

    w e r e

    p r e p a r e d

    t o s e r v e

    a s

    n e g a t i v e

    c o n t r o l s .

    A l l a n t o i c

    f l u i d

    c o n t a i n i n g

    some

    w h i t e s w a s

    a s p i r a t e d

    f r o m

    e g g s

    l a i d

    b y

    d a m s

    f r e e

    o f

    NDV

    a n t i b o d y ,

    c l a r i f i e d

    b y c e n t r i f u g a t i o n ,

    a n d

    f r o z e n .

    N o n i n f e c t e d

    V e r o

    m o n k e y k i d n e y

    c e l l s w e r e

    g r o w n

    a n d

    p r o c e s s e d

    a s

    d e s c r i b e d

    a b o v e

    e x c e p t

    t h a t t h e c e l l

    p e l l e t

    w a s w a s h e d

    t w o

    more

    t i m e s ,

    r e s u s p e n d e d

    i n

    P B S ,

    a n d

    f r o z e n . P r ot ei n c o n c e nt r a t i on s w e r e

    d e t e r -

    m i n e d

    b y

    t h e

    m e t h o d o f

    L o w r y

    e t

    a l .

    ( 2 2 ) .

    F l a t - b o t t o m

    p o l y v i n y l

    m i c r o t i t e r

    p l a t e s

    w e r e

    t r e a t e d

    w i t h a w a t e r - s o l u b l e

    s o l u t i o n

    o f

    s i l i c o n e

    S i l i -

    c l a d ;

    C l a y - A d a m s ,

    I n c . ,

    P a r s i p p a n y ,

    N . J . ) .

    A n

    e x p e r i -

    m e n t a l l y

    d e t e r m i n e d

    o p t i m u m

    d i l u t i o n o f

    a n t i g e n

    was

    made i n

    P B S ,

    a n d 0 . 0 5

    m l

    was

    p l a c e d

    i n

    e a c h

    w e l l .

    The

    a n t i g e n s

    w e r e d r i e d

    i n

    t h e

    w e l l s

    o v e r n i g h t

    a t

    room

    t e m p e r a t u r e .

    The

    a n t i g e n s

    w e r e f i x e d

    b y

    f i l l i n g

    t h e

    w e l l s w i t h a

    c o l d s o l u t i o n

    o f 1 0

    F o r m a l i n i n PBS

    a n d

    i n c u b a t i n g

    t h e

    p l a t e s

    a t

    4 C

    f o r

    1 5 m i n .

    The F o r m a l i n

    s o l u t i o n

    was

    r e m o v e d ,

    a n d

    t h e

    p l a t e s

    were

    w a s h e d

    I N F E C T .

    I M M U N .

    t h r e e

    t i m e s w i t h PBS

    c o n t a i n i n g

    1 0 f e t a l c a l f s e r u m

    a n d

    0 . 5

    T w e e n - 2 0 ( b u f f e r 1 ) b e f o r e

    u s e .

    S a m p l e s o f

    s e r u m o r

    s a l i v a w e r e d i l u t e d i n b u f f e r 1 .

    A 0 . 0 2 5 - m l

    p o r t i o n o f

    e a c h d i l u t i o n

    w a s p l a c e d

    i n

    d u p l i c a t e w e l l s o f v i r a l a n d

    c o n t r o l a n t i g e n s . The

    p l a t e s

    w e r e

    i n c u b a t e d

    i n

    a h u m i d i f i e d

    c h a m b e r

    a t

    3 7 C

    f o r

    1 h . The

    s a m p l e s w e r e

    r e m o v e d ,

    a n d t h e p l a t e s

    w e r e

    w a s h e d t h r e e

    t i m e s w i t h PBS

    c o n t a i n i n g

    1 f e t a l

    c a l f

    s e r u m a n d

    0 . 0 5 T w e e n - 2 0

    ( b u f f e r

    2 ) .

    T h e n

    0 . 0 2 5

    m l o f

    a n o p t i m a l d i l u t i o n o f 1 2 5 I - l a b e l e d a n t i - i m m u n o -

    g l o b u l i n a n t i b o d y ( i n

    b u f f e r

    2 )

    w a s

    a d d e d t o e a c h

    w e l l ,

    i n c u b a t e d

    a s b e f o r e f o r

    1

    h , a n d t h e n w a s h e d t h o r -

    o u g h l y

    w i t h PBS

    a n d

    a i r d r i e d .

    The w e l l s

    w e r e

    c u t

    o u t ,

    a n d

    e a c h o n e

    w a s

    p l a c e d

    i n a

    7 - m l s c i n t i l l a t i o n

    v i a l . F o u r

    m i l l i l i t e r s o f

    s c i n t i l l a t i o n c o c k t a i l ,

    0 . 0 5

    2 a 7 0

    R e s e a r c h

    P r o d u c t s

    I n t e r n a t i o n a l

    C o r p . ,

    E l k

    G r o v e

    V i l l a g e , I l l . )

    i n

    s c i n t i l l a t i o n

    g r a d e T o l u e n e ,

    w a s

    a d d e d t o e a c h

    v i a l ,

    a n d

    t h e

    r a d i o a c t i v i t y

    w a s

    c o u n t e d

    i n

    a

    P a c k a r d

    T r i - C a r b

    l i q u i d s c i n t i l l a t i o n

    s p e c t r o p h o -

    t o m e t e r ,

    m o d e l 3 3 8 0 .

    N o n s p e c i f i c a d s o r p t i o n s

    o f

    b o t h

    a n t i b o d y

    a n d

    1 2 5 1 I

    l a b e l e d

    a n t i - i m m u n o g l o b u l i n

    w e r e a s s e s s e d

    b y

    p l a c i n g

    d u p l i c a t e

    a m o u n t s o f e a c h

    d i l u t i o n i n w e l l s

    c o n t a i n i n g

    c o n c e n t r a t i o n s o f n o n v i r a l

    p r o te in a n ti g e n e q u a l t o

    t h o s e

    p l a c e d

    i n t h e

    v i r a l

    a n t i g e n

    w e l l s .

    P r e p a r a t i o n

    o f

    a n t i s e r a .

    A f f i n i t y - p u r i f i e d , c l a s s -

    s p e c i f i c g o a t

    a n t i b o d i e s t o

    c h i c k e n

    i m m u n o g l o b u l i n s

    i m m u n o g l o b u l i n

    G

    [ I g G ]

    a n d

    I g M

    f r o m

    s e r u m a n d

    I g A

    f r o m

    b i l e )

    w e r e

    p r e p a r e d , t e s t e d f o r s p e c i f i c i t y ,

    a n d

    c o n j u g a t e d

    w i t h f l u o r o c h r o m e s a s d e s c r i b e d

    p r e -

    v i o u s l y

    9 ,

    1 0 ) . M o n o s p e c i f i c

    a n t i b o d y

    w a s

    i o d i n a t e d

    w i t h

    1 2 5 1 I

    b y

    t h e

    c h l o r a m i n e - T

    o x i d a t i o n

    p r o c e d u r e

    ( 1 1 ) .

    I m m u n o h i s t o l o g i c a l

    m e t h o d s . A f t e r c o l l e c t i o n

    o f

    t h e l a s t s a l i v a

    s a m p l e s ,

    t w o

    b i r d s

    f r o m

    e a c h v a c c i n a -

    t i o n

    g r o u p

    w e r e s a c r i f i c e d . T i s s u e s

    f r o m t h e u p p e r

    r e s p i r a t o r y

    t r a c t ,

    o r a l

    c a v i t i e s ,

    a n d

    o r b i t s

    o f

    n o r m a l

    a d u l t

    c h ic k en s w e r e

    p r o c e s s e d

    f o r

    i m m u n o h i s t o l o g i c a l

    e x a m i n a t i o n

    b y

    t h e

    p a r a f f i n

    e m b e d d i n g t e c h n i q u e o f

    S a i n t e - M a r i e

    ( 3 3 ) .

    F o u r - m i c r o m e t e r

    s e c t i o n s

    o f

    e a c h

    s p e c i m e n

    w e r e

    m o u n t e d

    o n

    g l a s s

    s l i d e s , d e p a r a f f i n i z e d ,

    a n d

    r e h y d r a t e d

    i n

    PBS

    b e f o r e

    s t a i n i n g .

    E a c h

    s e c t i o n

    w a s c o v e r e d

    w i t h

    a

    d r o p o f

    f l u o r e s c e i n -

    o r r h o d a m i n e -

    c o n j u g a t e d a n t i b o d y

    t o

    y , u

    o r

    a

    c h a i n s a n d i n c u b a t e d

    i n

    a

    h u m i d i f i e d

    c h a m b e r

    f o r

    1

    h

    a t

    3 7 C .

    U n b o u n d

    a n t i b o d y

    was

    r i n s e d

    o f f

    i n

    a

    s t a i n i n g

    d i s h w i t h

    t h r e e

    c h a n g e s

    o f

    P B S ,

    1 5 m i n

    e a c h ,

    a n d

    t h e

    s l i d e s

    w e r e a i r

    d r i e d .

    S p e c i m e n s

    w e r e

    m o u n t e d

    w i t h a 1 0

    E l v a n o l

    m o u n t i n g

    m e d i u m

    a n d

    e x a m i n e d w i t h

    a

    s e r i e s

    1 0 M i -

    c r o s t a r

    m ic r o s c o p e A m e r i c a n

    O p t i c a l C o r p . , B u f f a l o ,

    N . Y . ) e q u i p p e d

    w i t h a n

    i n c i d e n t - l i g h t f l u o r e s c e n t

    i l -

    l u m i n a t o r .

    A p p r o p r i a t e

    e x c i t e r a n d b a r r i e r f i l t e r s w e r e

    u s e d

    f o r

    o b s e r v i n g

    f l u o r e s c e i n a n d r h o d a m i n e

    c o n j u -

    g a t e s . P h o t o g r a p h s

    w e r e

    t a k e n

    w i t h P a n a t o m i c X f i l m

    E a s t m a n

    K o d a k

    C o . , R o c h e s t e r , N . Y . ) .

    RESULTS

    A n t i b o d y

    i n egg

    w h i t e s .

    D u r i n g

    p r e l i m i -

    n a r y e x p e r i m e n t s ,

    NDV

    a n t i g e n s g r o w n

    i n

    e m -

    b r y o n a t e d e g g s

    a n d

    a l l a n t o i c f l u i d

    p r o v e d

    t o b e

    s u i t a b l e a s v i r u s

    a n d

    c o n t r o l

    a n t i g e n s ,

    r e s p e c -

    t i v e l y ,

    i n

    t h e

    r a d i o i m m u n o a s s a y . H o w e v e r , when

    r a d i o l a b e l e d

    a n t i - I g A

    o r

    - I g M

    a n t i s e r a

    w e r e

    t e s t e d

    i n t h i s

    s y s t e m , h i g h

    l e v e l s

    o f

    b a c k g r o u n d

    onM

    ay4

    ,2

    01

    6

    byguest

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  • 7/26/2019 Infect. Immun.-1979-Ewert-269-75.pdf

    3/7

    LOCAL A N T I BOD Y R E SPON SE

    I N CHICKENS

    2 7 1

    a c t i v i t y w e r e

    o b t a i n e d

    i n t h e

    c o n t r o l

    a n t i g e n

    w e l l s .

    E x a m i n a t i o n

    o f t h e a l l a n t o i c

    f l u i d o f 1 2

    e g g s f o r t h e presence

    o f

    i m m u n o g l o b u l i n s

    b y

    t h e

    d o u b l e

    d i f f u s i o n

    t e s t i n

    g e l

    w i t h

    c l a s s - s p e c i f i c

    a n t i s e r a r e v e a l e d

    t h e

    presence

    o f

    b o t h

    I g A

    a n d

    I g M ,

    b u t

    no

    I g G .

    A

    f u r t h e r

    a n a l y s i s

    was

    made

    o f

    t h e

    e g g

    w h i t e s

    o b t a i n e d

    f r o m dams f r e e

    o f

    serum

    a n t i - N D V a n t i b o d y

    a n d

    dams

    p o s s e s s i n g

    serum

    a n t i - N D V n e u t r a l i z i n g a n t i b o d y .

    The

    w h i t e s

    f r o m

    6 eg gs

    o f

    e a c h source

    were

    i n d i v i d u a l l y

    e x t r a c t e d ,

    a n d

    t h e

    p r o t e i n

    o f e a c h was

    p r e c i p i -

    t a t e d

    b y

    a d d i t i o n

    o f an

    e q u a l

    volume

    o f s a t u -

    r a t e d

    ammonium

    s u l f a t e . Th e

    p r e c i p i t a t e

    was

    r e s u s p e n d e d

    i n

    1 / 5

    t h e

    o r i g i n a l

    v o l u m e o f

    e g g

    w h i t e .

    A f t e r

    d i a l y s i s

    a g a i n s t

    P B S ,

    e a c h

    s a m p l e

    was

    t e s t e d

    f o r

    NDV

    p l a q u e - n e u t r a l i z i n g a c t i v i t y .

    A l l 6 o f t h e e g g

    w h i t e

    s a m p l e s

    o b t a i n e d f r o m

    d a m s h a v i n g

    a n t i - N D V

    a n t i b o d y

    had

    t i t e r s

    o f

    1 :

    8 .

    N o

    n e u t r a l i z i n g a c t i v i t y

    was

    d e t e c t e d

    i n

    un-

    d i l u t e d

    c o n c e n t r a t e s

    o f

    e g g

    w h i t e s f r o m

    a n t i -

    b o d y - f r e e

    b i r d s .

    C o n s e q u e n t l y ,

    t o

    a v o i d

    i n t e r f e r -

    ence

    b y

    e i t h e r

    s p e c i f i c

    or

    n o n s p e c i f i c

    a n t i b o d i e s

    i n t h e

    e g g w h i t e s ,

    r a d i o i m m u n o a s s a y s

    were

    per-

    f o r m e d

    w i t h

    v i r u s

    p r o p a g a t e d

    i n V e r o

    monkey

    c e l l s

    a n d

    e x t r a c t s o f n o n i n f e c t e d c e l l s

    as

    v i r a l

    a n d

    c o n t r o l

    a n t i g e n s ,

    r e s p e c t i v e l y .

    Development

    o f

    a n t i b o d y

    i n

    a d u l t

    c h i c k e n

    salivas.

    Th e l e v e l s o f

    s p e c i f i c

    c l a s s e s

    o f

    a n t i - N D V

    a n t i b o d y

    and

    p l a q u e - n e u t r a l i z i n g

    a n t i b o d y

    f o u n d i n s a l i v a

    a n d

    HI

    a n t i b o d y

    f o u n d

    i n serum

    o f

    b i r d s v a c c i n a t e d e i t h e r

    i . t .

    and i n t r a -

    n a s a l l y

    or

    i . m . w i t h

    NDV are

    g i v e n

    i n T a b l e

    1

    a n d

    F i g .

    1 a n d

    2 . HI a n d

    p l a q u e - n e u t r a l i z i n g

    t i t e r s

    were

    e a c h

    p l o t t e d

    as t h e

    g e o m e t r i c

    mean

    0

    70

    40 ~

    :J

    ..

    20

    .

    3

    Z ~ ~

    F I G .

    1 . Anioylvl

    nsrm Ittr

    n

    0

    so

    0 _

    CP 3

    20

    4.0

    40

    .4

    -2

    a )

    0 4 7

    10

    14

    2 1

    28

    34

    3740

    44

    5 58

    4

    DAYS

    POST

    VACCINATION

    FIG. 1.

    Antibody

    levels in

    serum

    HI

    titer

    and

    s a l i v a

    p l a q u e n e u t r a l i z a t i o n ,

    I g G , and I g A ) o f

    c h i c k -

    ens

    v a c c i n a t e d l o c a l l y

    w i t h NDV f o l l o w e d b y

    l o c a l

    r e v a c c i n a t i o n

    a r r o w ) .

    GMT, G e o m e t r i c mean

    t i t e r .

    70 140

    60O

    -

    1

    20

    5 0 . - 5 0

    A

    1 0 0 . ,

    0

    W~~~~~~~~~~~~~

    471014 2 1

    2 8

    343740 44

    1

    58

    DAYS

    POST

    VACCINATION

    FIG.

    2. Antibody

    response in serum

    HI t it er

    and

    saliva

    plaque

    neutralization, IgG, andIgA of

    chick-

    ens vaccinated

    im.

    with

    NDV

    followed

    by

    local

    re-

    v a c c i n a t i o n a r r o w ) .

    GMT Geometric

    mean t i t e r .

    TABLE

    1 .

    Anti-NDV

    a n t i b o d y

    l e v e l s i n s e r u m

    and

    s a l i v a

    o f

    c h i c k e n s

    v a c c i n a t e d

    i . m .

    o r

    l o c a l l y ,

    v i a

    t h e

    r e s p i r a t o r y t r a c t , f o l l o w e d

    b y

    l o c a l

    r e v a c c i n a t i o n a t

    3 0

    d a y s

    a f t e r

    i n i t i a l

    e x p o s u r e

    Days

    Serum HI t i t e r '

    S a l i v a

    a f t e r

    P l a q u e

    n e u t r a l i z a t i o n

    Anti-NDV

    I g A

    ( r e l a t i v e

    Anti-NDV

    I g G

    ( r e l a t i v e

    i m .nit ial l

    P l a q u t i t e r a

    a c t i v i t y )

    b

    a c t i v i t y )

    b

    e x p o -

    i . m .

    L o c a l

    s u r e

    i . m .

    L o c a l

    i . m . L o c a l

    i . m .

    L o c a l

    0 0

    0

    0

    0

    0 0

    0

    0

    4

    0 0

    0 0 1 2 3 . 0

    334.7

    72.3

    293.9

    7 20 1 . 8 46 1 . 4

    4

    2 . 3

    55

    1 . 8

    11

    2 . 7

    57 8 . 8 114.2

    506.7

    1 0

    6 1

    1 . 9 1 3 9

    1 . 4 8

    1 . 8

    5 6

    1 . 8 2 5

    4 . 5 4 7

    1 0 . 4

    5 0

    1 . 2

    1 0 0

    7 . 1

    1 4 7 0

    1 . 4

    1 1 3

    1 . 5 6

    1 . 6

    7 6

    1 . 4 1 8

    1 . 7

    5 8

    6 . 4

    2 4

    2 . 6

    83

    1 0 . 6

    2 1

    19

    4 . 5

    9 2

    1 . 4

    41.8 32 1 . 0 0 . 2 0 . 3 49 5 . 1

    18 2 . 8 100

    1 0 . 3

    2 8 17 1 . 4 53

    1 . 5

    4

    2 . 2 2 2

    1 . 5 8 1 . 0

    2 1

    3 . 7

    6

    1 . 5

    669.2

    3 4

    8

    2 . 0 53

    1 . 6

    4

    1 . 2 2 5

    1 . 4

    1 1

    1 . 4

    2 2

    4 . 0

    2

    0 . 3

    36

    6 . 8

    3 7 2 4

    3 . 3 5 7

    1 . 5 8

    3 . 8

    3 7

    2 . 1

    1 5 2 . 5 2 3

    3 . 0

    2 1

    +

    2 . 0

    5 6

    5 . 8

    4 0

    1 1 3 3 . 8

    702.1

    1 3

    1 . 5

    24

    1 . 9

    2 9 3 . 6

    224.4

    9 7

    1 1 . 7

    6 4

    1 1 . 4

    4 4 1 3 5

    1 . 9 1 2 2

    3 . 2

    1 1

    2 . 0

    3 7

    2 . 5 1 6 2 . 9

    3 2

    7 . 2

    1 0 0

    2 0 . 5

    6 6

    8 . 5

    5 1

    1 0 1

    2 . 2 80

    2 . 7 1 6

    2 . 1 2 7 1 . 9 16 3 . 8 2 2

    7 . 3 1 1 2 2 3 . 1 6 7 7 . 6

    5 8

    5 7

    4 . 4

    80 3 . 5

    3 1

    2 . 1

    3 2

    1 . 7 13 2 . 5 25 7 . 5

    70 5 . 4

    7 9

    8 . 9

    a

    G e o m e t r i c mean

    t i t e r

    s t a n d a r d

    e r r o r .

    b

    A v e r a g e

    s t a n d a r d

    e r r o r

    o f

    t h e

    r e l a t i v e a c t i v i t y

    a v e r a g e

    c o u n t s p e r

    m i n u t e )

    o f t h e s a m p l e d i v i d e d

    b y t h e

    a c t i v i t y

    o f a

    s a l i v a s t a n d a r d

    m u l t i p l i e d b y 1 0 0 ) .

    V O L .

    2 4 ,

    1 9 7 9

    onM

    ay4

    ,2

    01

    6

    byguest

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  • 7/26/2019 Infect. Immun.-1979-Ewert-269-75.pdf

    4/7

    2 7 2

    E W E R T , B A R G E R ,

    A N D

    EIDSON

    t i t e r o f

    f o u r o r

    f i v e

    s a m p l e s c o l l e c t e d

    o n a g i v e n

    d a y . The l e v e l s o f a n t i - N D V

    I g G a n d a n t i - N D V

    I g A w e r e e a c h

    r e p r e s e n t e d a s t h e

    a r i t h m e t i c

    mean o f t h e

    c o u n t i n g r a t i o s

    ( t h e

    p e r c e n t a g e

    o f

    t h e

    a c t i v i t y

    o f a

    t e s t

    s a m p l e

    d i v i d e d

    b y

    t h e

    a c t i v i t y

    o f

    a

    s a l i v a

    s t a n d a r d )

    f o r

    s a m p l e s

    c o l -

    l e c t e d o n a g i v e n d a y

    a f t e r

    v a c c i n a t i o n .

    N o

    Ig M

    w a s d e t e c t e d i n

    f r e s h ,

    u n d i l u t e d

    s a l i v a s a m p l e s

    b y

    t h e

    O u c h t e r l o n y m e t h o d .

    A l s o , i n a

    p r e l i m i -

    n a r y s tu d y w i t h

    2 5 I - l a b e l e d a n t i - I g M

    a n t i b o d y ,

    a n t i b o d y

    a g a i n s t

    NDV

    c o u l d

    n o t

    b e

    d e t e c t e d i n

    f r e s h s a l i v a s o b t a i n e d f r o m

    b i r d s 7

    a n d

    1 4

    d a y s

    a f t e r i . t .

    v a c c i n a t i o n . B o t h o f

    t h e a b o v e t e s t s

    r e v e a l e d

    t h e

    p r e s e n c e

    o f

    I g G

    a n d

    I g A

    a n t i b o d i e s

    i n

    s a l i v a .

    T h e r e f o r e , f u r t h e r

    a s s a y s f o r

    a n t i - N D V

    Ig M w e r e

    n o t

    p e r f o r m e d i n

    t h i s

    s t u d y .

    Among t h e

    b i r d s

    v a c c i n a t e d

    i . t .

    a n d

    i n t r a n a -

    s a l l y ,

    t h e

    l e v e l s

    o f

    a n t i b o d y

    a c t i v i t y

    f o l l o w e d

    e a c h

    o t h e r

    v e r y c l o s e l y . A f t e r

    r e a c h i n g m a x i -

    mum v a l u e s

    b e t w e e n 1 0 a n d 1 4

    d a y s p o s t v a c c i n -

    a t i o n ,

    t h e l e v e l s

    d r o p p e d

    o n

    d a y 2 8 . A f t e r

    i t

    r e v a c c i n a t i o n ,

    t h e r e

    w a s

    a

    s l i g h t

    r i s e i n

    t h e s e -

    rum HI

    t i t e r ,

    w h i c h

    r e a c h e d a

    maximum

    a r o u n d

    2

    w e e k s a f t e r

    r e e x p o s u r e a n d t h e n

    r e t u r n e d

    t o

    a

    l e v e l

    s l i g h t l y h i g h e r

    t h a n

    t h a t s e e n

    b e f o r e

    r e v a c -

    c i n a t i o n .

    A n t i b o d y

    l e v e l s i n

    s a l i v a

    r e m a i n e d

    e s -

    s e n t i a l l y u n c h a n g e d

    a f t e r

    r e v a c c i n a t i o n .

    A n t i b o d y

    l e v e l s

    o f

    t h e

    i . m . - v a c c i n a t e d

    b i r d s

    r e a c h e d

    maximums

    a b o u t

    1 0

    t o 1 4

    d a y s

    a f t e r

    e x p o s u r e

    a n d

    t h e n

    d r o p p e d

    t o

    b a r e l y

    d e t e c t a b l e

    l e v e l s

    b y

    d a y 2 1 . Wh en

    c o m p a r e d w i t h t h e

    i . t . -

    v a c c i n a t e d g r o u p ,

    t h e l e v e l s

    o f s e r u m HI a n t i -

    b o d y ,

    s a l i v a r y

    a n t i - N D V

    p l a q u e - n e u t r a l i z i n g

    a n -

    t i b o d y , a n d

    I g G

    a n t i b o d y w e r e a b o u t

    h a l f

    a s

    h i g h

    a s t h e i r

    maximum

    l e v e l s . S a l i v a r y

    a n t i -

    NDV

    I g A w a s

    b a r e l y

    d e t e c t a b l e . L i v e

    v i r u s w a s

    d e t e c t e d i n

    s a l i v a r y

    s a m p l e s u p

    t o 7

    d a y s

    a f t e r

    i . t . r e v a c c i n a t i o n

    o f t h e

    i . m . - v a c c i n a t e d

    b i r d s .

    The v a c c i n e

    v i r u s

    w a s r e c o g n i z e d

    b y

    t h e a p p e a r -

    a n c e

    o f

    p l a q u e s

    2

    d a y s

    a f t e r

    t h e p l a q u e s

    o f t h e

    v e l o g e n i c

    s t r a i n s o f

    NDV

    h a d

    a p p e a r e d

    i n

    t h e

    n e u t r a l i z a t i o n

    t e s t .

    No

    l i v e

    v a c c i n e v i r u s

    w a s

    d e t e c t e d

    i n

    s a l i v a s

    o f

    i . t . - r e v a c c i n a t e d

    b i r d s

    w h i c h

    h a d

    b e e n

    p r e v i o u s l y

    v a c c i n a t e d i t

    A f t e r

    i . t .

    r e v a c c i n a t i o n

    o f t h e

    i . m . - v a c c i n a t e d

    g r o u p , a

    m a r k e d r i s e i n

    s e r u m HI a n t i b o d y

    a n d

    s a l i v a r y a n t i - N D V

    I g G o c c u r r e d ,

    r e a c h i n g a

    p e a k

    a b o u t 1 4

    d a y s a f t e r

    r e e x p o s u r e .

    O n l y a

    s l i g h t

    r i s e

    i n

    s a l i v a r y

    p l a q u e - n e u t r a l i z i n g a c t i v i t y

    a n d

    a

    g r a d u a l

    r i s e

    i n

    s p e c i f i c

    s a l i v a r y

    I g A o c -

    c u r r e d

    a f t e r

    r e v a c c i n a t i o n .

    I m m u n o h i s t o l o g y .

    T i s s u e s

    f r o m

    c h i c k e n s o f

    e a c h

    v a c c i n a t i o n

    g r o u p

    w e r e

    e x a m i n e d

    f o r

    p l a s m a

    c e l l s

    w i t h

    f l u o r o c h r o m e - l a b e l e d a n t i b o d -

    i e s t o

    I

    y ,

    a n d a

    c h a i n s

    t o

    d e t e r m i n e

    t h e

    s o u r c e

    o f

    t h e

    a n t i b o d y

    f o u n d

    i n

    s a l i v a r y

    s e c r e t i o n s .

    A

    s p a r s e

    d i s t r i b u t i o n o f

    p l a s m a c e l l s

    w a s

    f o u n d i n

    t h e l a m i n a

    p r o p r i a

    o f t h e

    r o o f

    a n d

    f l o o r

    o f t h e

    o r a l

    c a v i t y

    a n d t h e

    t o n g u e . T h e s e c e l l s

    w e r e

    p r i m a r i l y o f

    t h e

    I g G a n d Ig M

    c l a s s e s ,

    w i t h f e w

    I g A - p o s i t i v e

    p l a s m a c e l l s b e i n g d e t e c t e d .

    S a l i -

    v a r y g l a n d s i n t h e

    a b o v e

    t i s s u e s ,

    h o w e v e r , c o n -

    t a i n e d

    e x c l u s i v e l y I g A - p o s i t i v e

    p l a s m a

    c e l l s

    w i t h in t h e

    i n t e r a c i n o u s

    s p a c e s . The

    l a r g e s t n u m -

    b e r s

    o f

    p l a s m a

    c e l l s

    f o u n d

    i n

    t h e

    h e a d

    r e g i o n s o f

    t h e

    c h i c k e n s

    w e r e i n t h e

    H a r d e r i a n

    g l a n d s .

    A l l

    t h r e e c l a s s e s

    o f

    i m m u n o g l o b u l i n - p r o d u c i n g

    p l a s m a

    c e l l s w e r e

    f o u n d

    i n

    t h e i n t e r a c i n o u s

    s p a c e s o f

    t h e

    g l a n d s

    ( F i g . 3 ) .

    The m a j o r i t y

    o f

    t h e s e

    c e l l s

    c o n t a i n e d

    I g G , w h e r e a s

    I g M -

    a n d

    I g A - c o n t a i n i n g

    p l a s m a c e l l s

    r e p r e s e n t e d o n l y a

    s m a l l

    p r o p o r t i o n

    o f t h e

    c e l l s

    p r e s e n t .

    DISCUSSION

    O b s e r v a t i o n s

    r e p o r t e d

    i n t h i s

    s t u d y

    i n d i c a t e

    t h a t I g G

    a n d

    I g A

    a r e

    t h e

    p r e d o m i n a n t

    i m m u -

    n o g l o b u l i n s

    i n s a l i v a .

    T h e s e

    f i n d i n g s

    a r e

    i n

    a g r e e m e n t

    w i t h s e v e r a l

    o t h e r

    r e p o r t s

    ( 1 9 - 2 1 , 2 8 ) .

    I m m u n o h i s t o l o g i c a l

    e x a m i n a t i o n o f v a r i o u s

    t i s -

    s u e s

    o f

    u p p e r

    r e s p i r a t o r y

    t r a c t s r e v e a l e d

    t h a t

    I g G - c o n t a i n i n g

    p l a s m a c e l l s

    c o m p r i s e

    t h e

    m a j o r

    p o r t i o n

    o f

    t h e

    p l a s m a

    c e l l s

    p r e s e n t

    i n

    r e i m m u -

    n i z e d

    b i r d s . B o t h

    I g A -

    a n d

    I g M - c o n t a i n i n g c e l l s ,

    w h i c h

    w e r e a b o u t

    e q u a l l y p r e v a l e n t ,

    r e p r e s e n t e d

    o n l y

    a s m a l l

    p r o p o r t i o n

    o f t h e t o t a l

    n u m b e r o f

    p l a s m a

    . c e l l s .

    O f

    a l l

    t h e

    t i s s u e s

    e x a m i n e d ,

    t h e

    H a r d e r i a n

    g l a n d

    c o n t a i n e d

    t h e

    h i g h e s t

    d e n s i t y

    o f

    p l a s m a

    c e l l s

    o f

    a l l

    t h r e e

    c l a s s e s .

    I n

    u n i m m u -

    n i z e d

    b i r d s , t h e

    p r o p o r t i o n s

    o f

    c e l l s

    c o n t a i n i n g

    e a c h o f

    t h e

    t h r e e c l a s s e s o f

    i m m u n o g l o b u l i n

    a r e

    a b o u t

    e q u a l

    i n

    t h e

    H a r d e r i a n

    g l a n d

    u n p u b l i s h e d

    d a t a ) .

    The

    a p p a r e n t

    h i g h e r p r o p o r t i o n

    o f

    I g G -

    c o n t a i n i n g

    p l a s m a

    c e l l s

    o b s e r v e d

    i n

    t h i s

    s t u d y

    may

    h a v e b e e n a r e s u l t o f

    l o c a l

    i m m u n i z a t i o n .

    B i e n e n s t o c k e t a l .

    ( 4 )

    l i k e w i s e

    f o u n d

    t h e

    H a r -

    d e r i a n

    g l a n d

    t o

    c o n t a i n

    a s m a l l

    p r o p o r t i o n

    o f

    I g A - s y n t h e s i z i n g

    p l a s m a

    c e l l s ;

    b u t

    t h e y

    r e p o r t e d

    t h a t

    IgM

    c e l l s

    w e r e

    m o r e

    p r e v a l e n t

    t h a n

    I g G -

    c o n t a i n i n g

    c e l l s .

    T h i s d e n s e

    c o n c e n t r a t i o n

    o f

    p l a s m a

    c e l l s

    i n

    t h e

    H a r d e r i a n

    g l a n d s

    a n d

    t h e

    d u c t s

    o f

    t h e l a t e r a l

    n a s a l

    g l a n d 1 )

    a s w e l l a s

    t h o s e

    d i s t r i b u t e d

    t h r o u g h o u t

    t h e

    i n t e r a c i n o u s

    s p a c e s

    o f

    s a l i v a r y

    g l a n d s

    a n d

    t h e l a m i n a

    p r o p r i a

    o f t h e

    o r a l

    c a v i t y

    m o s t

    l i k e l y

    c o n t r i b u t e t o

    t h e

    s e c r e t i o n s w h i c h

    d i s c h a r g e

    i n t o t h e

    e y e s , m o u t h ,

    a n d

    n a s a l

    v e s t i b u l e ,

    t h u s

    b a t h i n g

    t h e

    u p p e r

    r e s -

    p i r a t o r y

    t r a c t

    a n d

    p o s s i b l y

    t h e a n t e r i o r

    e n d

    o f

    t h e t r a c h e a

    w i t h

    a n t i b o d y .

    M u e l l e r e t a l .

    ( 2 4 )

    r e p o r t e d

    t h a t

    s h e e p

    e r y t h r o c y t e s

    w h i c h

    w e r e

    d r o p p e d

    i n t o t h e

    e y e

    o f

    a

    b i r d

    c o u l d

    a l m o s t

    i m m e d i a t e l y

    b e

    d e t e c t e d i n t h e

    m o u t h . T h e r e -

    f o r e ,

    t h e

    s e c r e t i o n s

    a n d

    c e l l s

    d i s c h a r g e d

    f r o m

    t h e

    H a r d e r i a n

    g l a n d s ,

    w h i c h

    e m p t y

    i n t o t h e

    o r b i t ,

    c a n

    q u i c k l y

    f i n d

    p a s s a g e

    t o

    t h e

    n a s a l a n d

    o r a l

    c a v i t i e s

    v i a

    t h e

    l a c r y m a l

    d u c t s .

    T h i s

    same

    g r o u p

    d e m o n s t r a t e d t h a t

    a n t i b o d y - p r o d u c i n g

    c e l l s

    a p -

    p e a r e d

    i n

    t h e H a r d e r i a n

    g l a n d s

    when

    a n t i g e n

    w a s

    i n t r o d u c e d

    i n

    t h e

    e y e

    b u t

    n o t when i t was

    I N F E C T . IMMUN

    onM

    ay4

    ,2

    01

    6

    byguest

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  • 7/26/2019 Infect. Immun.-1979-Ewert-269-75.pdf

    5/7

    LOCAL

    A N T IBO DY RESPONSE

    I N CHICKENS 273

    .

    oS.S

    F I G . 3 .

    S e c t i o n s

    o f

    H a r d e r i a n

    g l a n d s

    f r o m

    N D V - r e v a c c i n a t e d

    c h i c k e n s ,

    s t a i n e d w i t h

    f l u o r o c h r o m e - l a b e l e d

    a n t i b o d y

    t o

    a , b )

    y

    c h a i n s ,

    c ,

    d )

    , u

    c h a i n s ,

    and

    e ,

    / )

    a c h a i n s .

    M a g n i f i c a t i o n s :

    ( a ) x l 1 0 , b )

    x 4 0 0 , c ) x 8 0 ,

    d )

    x 3 7 0 , e )

    x 9 5 ,

    ( D

    x 3 7 0 .

    g i v e n

    i n t r a v e n o u s l y , t h u s i n d i c a t i n g t h e l o c a l

    n a t u r e

    o f t h i s

    l y m p h o i d

    s y s t e m .

    The

    e f f e c t s o f v a c c i n a t i o n a n d

    r e v a c c i n a t i o n

    w i t h

    r e s p e c t

    t o t h e

    s e r u m

    a n t i b o d y

    r e s p o n s e

    a r e

    c o m p a r a b l e

    t o t h o s e o b t a i n e d

    i n

    a s i m i l a r

    s t u d y

    c o n d u c t e d

    b y

    B e a r d a n d

    E a s t e r d a y

    2 ) ,

    i n

    w h i c h

    i . m .

    a n d

    a e r o s o l m e t h o d s

    o f

    v a c c i n a t i o n

    a n d

    a e r o s o l

    c h a l l e n g e

    w e r e

    u s e d .

    B i r d s v a c c in a t e d

    b y

    t h e

    r e s p i r a t o r y

    r o u t e h a d

    h i g h e r

    HI

    t i t e r s t h a n

    d i d t h e i . m . - v a c c i n a t e d

    b i r d s . A f t e r a e r o s o l c h a l -

    l e n g e , t h e y

    d e t e c t e d n o

    a p p r e c i a b l e

    r i s e

    i n

    s e r u m

    a n t i b o d y

    l e v e l s

    i n

    t h e a e r o s o l - v a c c i n a t e d b i r d s

    b u t

    f o u n d

    a

    p r o n o u n c e d

    i n c r e a s e

    i n

    t h e i . m . -

    v a c c i n a t e d

    g r o u p .

    I n t h e

    p r e s e n t

    s t u d y ,

    t h e p e -

    r i o d

    b e t w e e n

    p r i m a r y

    v a c c i n a t i o n a n d

    r e e x p o -

    s u r e

    w a s ,

    7

    d a y s

    l o n g e r

    t h a n

    t h a t

    i n

    t h e i r

    s t u d y ;

    c o n s e q u e n t l y ,

    t h e

    s e r u m

    a n t i b o d y

    d r o p p e d

    t o

    r e l a t i v e l y

    l o w e r

    l e v e l s ,

    b u t

    t h e

    c h a n g e

    i n t h e s e

    l e v e l s

    a f t e r v a c c i n a t i o n

    c o r r e s p o n d s

    t o t h e i r f i n d -

    i n g s .

    T h e y

    a l s o o b s e r v e d

    t h a t

    a l t h o u g h

    n o v i r u s

    c o u l d

    b e i s o l a t e d

    f r o m t h e t r a c h e a s

    o f

    a e r o s o l -

    v a c c i n a t e d

    b i r d s

    f r o m

    1

    h

    t o

    8

    d a y s

    a f t e r c h a l -

    l e n g e ,

    v i r u s

    w a s

    i s o l a t e d

    f r o m

    i . m . - v a c c i n a t e d

    b i r d s

    f r o m 8 h

    t o

    4

    d a y s

    a f t e r

    c h a l l e n g e .

    T a k e n

    t o g e t h e r ,

    t h e s e

    o b s e r v a t i o n s

    p r o v i d e

    a

    s t r o n g

    a r g u m e n t

    f o r

    t h e

    p r o t e c t i o n

    o f t h e

    r e s p i r a t o r y

    t r a c t

    b y

    l o c a l

    immune m e c h a n i s m s

    w h i c h

    a r e

    a c t i v a t e d

    b y

    l o c a l

    a p p l i c a t i o n

    o f

    a n t i g e n

    a n d

    V O L .

    2 4 ,

    1 9 7 9

    onM

    ay4

    ,2

    01

    6

    byguest

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  • 7/26/2019 Infect. Immun.-1979-Ewert-269-75.pdf

    6/7

    2 7 4 EWERT, BARGER, A N D

    EIDSON

    w h i c h n e u t r a l i z e v i r u s u p o n r e e x p o s u r e , i n t h e

    a b s e n c e

    o f d e t e c t a b l e

    s y s t e m i c a n t i b o d y s y n t h e -

    s i s . The

    d a t a p r es e n t e d h e r e i n

    s u g g e st t h at t h i s

    p r o t e c t i o n

    i s

    i n

    p a r t

    m e d i a t e d

    b y

    s p e c i f i c a n t i -

    b o d y o f

    t h e

    I g A

    a n d

    I g G c l a s s e s f o u n d

    i n t h e

    s e c r e t i o n s

    o f t h e

    r e s p i r a t o r y

    t r a c t .

    i . t .

    v a c c i n a t i o n p r o d u c e d

    a h i g h e r

    s u s t a i n e d

    l e v e l o f

    a n t i b o d y

    i n

    s a l i v a

    t h a n d i d i . m . v a c c i -

    n a t i o n .

    O u r

    f a i l u r e

    t o d e t e c t a

    s i g n i f i c a n t

    r i s e

    i n

    l o c a l

    a n t i b o d y l e v e l s

    i n

    i . t . - v a c c i n a t e d

    b i r d s a f t e r

    r e v a c c i n a t i o n i s

    m o s t l i k e l y

    d u e t o t h e n e u t r a l i -

    z a t i o n

    o f

    v i r u s b y a n t i b o d y w h i c h w a s p r e s e n t a t

    t h e

    t i m e o f c h a l l e n g e , b u t i t

    may

    a l s o b e d u e t o

    t h e

    f a i l u r e

    o f

    t h e

    l o c a l

    immune s y s t e m

    t o

    p r o -

    d u c e

    a

    s e c o n d a r y a n t i b o d y

    r e s p o n s e .

    An a s p e c t

    o f

    p a r t i c u l a r i n t e r e s t

    a n d

    w o r t h y

    o f f u r t h e r

    s t u d y

    i s t h e d u r a t i o n o f t h e l o c a l a n t i b o d y s y n t h e s i s

    a n d

    r e s i s t a n c e

    t o i n f e c t i o n

    p r o d u c e d

    b y

    l o c a l

    i m m u n i z a t i o n , w h i c h i n

    t h i s

    a n d a p r e v i o u s

    r e -

    p o r t ( 2 ) p e r s i s t e d f o r a t l e a s t 4

    a n d

    3

    w e e k s ,

    r e s p e c t i v e l y .

    A f t e r

    v a c c i n a t i o n , t h e

    a p p e a r a n c e

    o f

    s p e c i f i c

    I g G

    a n d

    I g A

    a n t i b o d y

    c o i n c i d e s w i t h t h a t o f

    p l a q u e - n e u t r a l i z i n g a c t i v i t y

    i n

    s a l i v a .

    A l t h o u g h

    t h e

    i n i t i a l

    r i s e

    i n

    a n t i b o d y

    l e v e l s

    m ay b e

    t h e

    r e s u l t

    o f t r a n s u de d s e r u m

    a n t i b o d y ( 1 0 ) ,

    t h e

    h i g h

    l e v e l s

    o f

    a n t i b o d y

    w h i c h w e r e

    s u s t a i n e d

    b e y o n d

    t h e

    p e r i o d

    o f v i r a l

    p a t h o l o g y

    i n t h e

    i . t . -

    v a c c i n a t e d

    g r o u p

    w a s

    m o s t

    l i k e l y

    d u e

    t o l o c a l

    p r o d u c t i o n

    o f

    a n t i b o d y .

    The

    c o n t r i b u t i o n o f

    I g G

    a n d I g A

    t o

    t h e

    s a l i v a r y a n t i bo d y c o r r e s p o n ds

    t o

    t h e

    r e l a t i v e o c c u r r e n c e

    o f t h e s e

    p l a s m a

    c e l l s

    t h r o u g h o u t

    t h e

    u p p e r

    r e s p i r a t o r y

    t r a c t s o f b i r d s

    v a c c i n a t e d

    i . t . a n d

    i n t r a n a s a l l y .

    T h e s e

    d a t a

    d o

    n o t d e f i n e

    a r o l e f o r t h e

    I g M - s e c r e t i n g c e l l s ,

    w h i c h we

    k n o w

    a r e

    p r e s e n t

    i n

    t h e

    H a r d e r i a n

    g l a n d

    i n a b o u t

    e q u a l

    p r o p o r t i o n s

    t o t h e

    I g A -

    a n d

    I g G - s e c r e t i n g

    c e l l s b e f o r e

    a n t i g e n

    c h a l l e n g e .

    T h a t

    i t

    i s

    m i n i m a l c a n

    b e

    d i s c e r n e d

    f r o m

    t h e

    l a c k

    o f

    p r o l i f e r a t i o n

    o f

    t h e

    I g M

    c e l l s

    a f t e r c h a l -

    l e n g e

    a n d

    t h e

    a b s e n c e

    o f

    I g M

    i n

    t h e

    s a l i v a ,

    a s

    d e t e r m i n e d

    b y

    a

    s e n s i t i v e

    r a d i o a s s a y .

    D e f i n i t i o n

    o f

    t h e i r

    r o l e

    r e q u i r e s

    f u r t h e r

    s t u d y .

    The o b s e r v a t i o n s

    r e p o r t e d

    h e r e i n

    e m p h a s i z e

    t h e

    i m p o r t a n c e

    o f

    a p p l y i n g

    v a c c i n e t o

    t h e

    u p p e r

    r e s p i r a t o r y

    t r a c t .

    T h i s

    r e g i o n

    a p p e a r s

    t o

    b e

    p a r -

    t i c u l a r l y

    e n d o w e d

    w i t h

    a

    d e n s e

    p o p u l a t i o n

    o f

    B

    c e l l s

    w h i c h a r e

    e a s i l y

    a c c e s s i b l e

    t o s t i m u l a t i o n

    b y

    l o c a l

    a p p l i c a t i o n

    o f

    a n t i g e n s .

    I n

    t h e

    c a s e

    o f

    a e r o s o l

    v a c c i n a t i o n , d r o p l e t

    s i z e s s h o u l d

    b e u s e d

    w h i c h

    c a n b e

    e a s i l y

    r e t a i n e d

    i n

    t h e

    u p p e r r e s p i -

    r a t o r y

    t r a c t .

    S m a l l

    d r o p l e t s

    m ay

    e a s i l y

    p e n e t r a t e

    t o

    t h e l o w e r

    r e g i o n s

    o f t h e

    r e s p i r a t o r y

    t r a c t

    a n d

    t h e r e b y

    s t i m u l a t e

    a h u m o r a l

    immune

    r e s p o n s e

    ( 3 4 )

    b u t

    f a i l

    t o

    a c t i v a t e

    i m m u n o c y t e s

    i n t h e

    u p p e r r e s p i r a t o r y

    t r a c t .

    C o n s e q u e n t l y ,

    a e r o s o l

    g e n e r a t o r s

    w h i c h

    p r o d u c e

    a

    w i d e

    r a n g e

    o f

    d r o p -

    l e t

    s i z e s

    m ay

    e f f e c t

    t h e

    b e s t

    o v e r a l l s t i m u l a t i o n

    o f

    b o t h l o c a l

    a n d

    h u m o r a l

    i m m u n i t i e s .

    I N F E C T .

    I M M U N .

    The d e t e c t i o n

    o f Ig M

    a n d

    I g A b u t

    n o t I g G

    i n

    t h e w h i t e s o f u n e m b r y o n a t e d e g g s i s c o n s i s t e n t

    w i t h t h e f i n d i n g s o f

    R o s e

    e t a l . ( 3 1 ) . H o w e v e r ,

    t h e

    d e t e c t i o n o f

    a n t i - N D V

    a c t i v i t y

    i n

    e g g

    w h i t e s

    h a s

    n o t

    b e e n

    p r e v i o u s l y

    r e p o r t e d . B r a d l y e t a l .

    ( 6 )

    w e r e

    n o t

    a b l e

    t o

    d e t e c t

    N D V - n e u t r a l i z i n g

    a c t i v i t y

    i n d i l u t e d ( f i v e t i m e s ) e g g

    w h i t e s

    o b -

    t a i n e d f r o m

    e g g s

    o f i m m u n i z e d h e n s ,

    a l t h o u g h

    h i g h

    l e v e l s

    o f a c t i v i t y

    w e r e f o u n d

    i n

    t h e y o l k s .

    A l s o ,

    B o r n s t e i n e t a l .

    ( 5 ) f a i l e d t o d e t e c t HI

    a n t i b o d y

    i n

    w h i t e s o f

    e g g s f r o m

    i m m u n i z e d

    h e n s

    I n t h e

    f i r s t r e p o r t

    i t

    i s

    l i k e l y t h a t a n y

    a n t i - N D V

    a c t i v i t y ,

    i f

    p r e s e n t , may

    h a v e b e e n

    d i l u t e d

    b e -

    y o n d d e t e c t i o n , a n d

    i n t h e s e c o n d

    r e p o r t

    t h e t e s t

    u s e d

    f o r

    d e t e c t i o n w a s

    n o t

    s e n s i t i v e

    e n o u g h .

    S i mi l a r n e g a ti ve r e s u l t s

    w e r e o b t a i n e d

    i n

    t h i s

    s t u d y

    w h e n

    e g g w h i t e s w e r e a s s a y e d f o r

    HI

    a c t i v i t y .

    T h i s

    f u r t h e r

    c o n f i r m s t h e

    s e n s i t i v i t y

    o f

    t h e

    r a d i o i m m u n o a s s a y d e s c r i b e d

    h e r e i n .

    The

    r e s u l t s

    r e p o r t e d h e r ei n s u gg e s t t h a t i n

    b i r d s ,

    a s i n m a m m a l s , m a t e r n a l a n t i b o d y

    p r i -

    m a r i l y o f t h e

    I g A

    a n d

    Ig M

    c l a s s e s

    may

    b e a c -

    q u i r e d

    b y o f f s p r i n g

    b y i n g e s t i o n r a t h e r

    t h a n

    b y

    d i r e c t a b s o r p t i o n

    i n t o

    t h e f e t a l

    c i r c u l a t i o n .

    Ma-

    t e r n a l

    I g A

    a n d

    Ig M p r e s e n t i n t h e o vi du c t

    a n d

    i n c o r p o r a t e d

    i n

    t h e e g g w h it e s m i x w i t h t h e

    a m n i o t i c

    f l u i d a n d b a t h e t h e

    e x t e r n a l a n d

    i n t e r -

    n a l s u r f a c e s o f

    t h e e m b r y o , p r o v i d i n g

    t r a n s i e n t

    p r o t e c t i o n

    f o r

    t h e

    e m e r g i n g

    c h i c k .

    ACKNOWLEDGMENTS

    W e

    t h a n k

    W.

    L .

    R a g l a n d

    f o r h i s a d v i c e a n d d i s c u s s i o n s

    a n d

    B i l l H a l l ,

    N a n c y U n d e r w o o d ,

    a n d

    B e c k y

    E s c o e f o r

    t h e i r

    t e c h -

    n i c a l a s s i s t a n c e .

    LITERATURE

    CITED

    1 .

    B a n g ,

    B .

    G . ,

    and F . B .

    B a n g .

    1 9 6 8 .

    L o c a l i z e d

    l y m p h o i d

    t i s s u e s a n d

    p l a s m a

    c e l l s i n

    p a r o c u l a r

    a n d

    p a r a n a s a l

    o r g a n s y st e ms

    i n

    c h i c k e n s .

    Am.

    J . P a t h o l . 5 3 : 7 3 5 - 7 5 1 .

    2 .

    B e a r d ,

    C .

    W . ,

    and

    B .

    C .

    E a s t e r d a y . 1 9 6 7 .

    T h e i n f l u e n c e

    o f

    r o u t e

    o f a d m i n i s t r a t i o n

    o f

    N e w c a s t l e d i s e a s e

    v i r u s o n

    h o s t

    r e s p o n s e .

    I .

    S e r o l o g i c a l

    a n d

    v i r u s i s o l a t i o n s t u d i e s .

    J .

    I n f e c t .

    D i s .

    1 1 7 : 5 5 - 6 1 .

    3 . B e a r d ,

    C .

    W . ,

    and

    B .

    C . E a s t e r d a y .

    1 9 6 7 . The

    i n f l u e n c e

    o f t h e

    r o u t e

    o f a d m i n i s t r a t i o n o f N e w c a s t l e d i s e a s e

    v i r u s

    o n h o s t

    r e s p o n s e .

    I I . S t u d i e s

    o n

    a r t i f i c i a l

    p a s s i v e

    i m -

    m u n i t y .

    J . I n f e c t . D i s . 1 1 7 : 6 2 - 6 5 .

    4 .

    B i e n e n s t o c k ,

    J . ,

    J .

    G a u l d i e ,

    and D .

    Y .

    E .

    P e r e y .

    1 9 7 3 .

    S y n t h e s i s

    o f

    I g G ,

    I g A

    a n d

    I g M b y

    c h i c k e n

    t i s s u e s :

    i m m u n o f l u o r e s c e n t

    a n d 4 C a m i n o

    a c i d

    i n c o r p o r a t i o n

    s t u d i e s .

    J . I m m u n o l .

    1 1 1 : 1 1 1 2 - 1 1 1 8 .

    5 . B o r n s t e i n , S . ,

    A .

    R a u t e n s t e i n - A r a z i ,

    and

    Y .

    Sam-

    b e r g .

    1 9 5 2 . Some

    a s p e c t s

    o f

    c o n g e n i t a l

    p a s s i v e

    i m m u -

    n i t y

    t o N e w c a s t l e

    d i s e a s e

    i n

    c h i c k s .

    I . The

    t r a n s f e r

    o f

    h e m a g g l u t i n i n

    i n h i b i t o r s

    f r o m

    t h e m a t e r n a l

    y o l k

    t o t h e

    c h i c k .

    A m .

    J .

    V e t . R e s . 1 3 : 3 7 3 - 3 7 8 .

    6 .

    B r a d l y ,

    C .

    A . ,

    H .

    E .

    M o s e s ,

    and

    E .

    L .

    J u n g h e r r .

    1 9 4 6 .

    T r a n s m i s s i o n

    o f a n t i v i r a l

    a c t i v i t y

    v i a t h e

    e g g

    a n d

    t h e

    r o l e o f

    c o n g e n i t a l p a s s i v e i m m u n i t y

    t o d i s e a s e

    i n c h i c k -

    e n s .

    A m . J .

    V e t .

    R e s . 7 : 3 3 3 - 3 4 2 .

    7 .

    C l e l a n d ,

    G .

    B . ,

    D . Y . E .

    P e r e y ,

    and

    P .

    B . D e n t . 1 9 7 5 .

    M i c r o - r a d i o i m m u n o a s s a y

    f o r a n t i b o d i e s t o N e w c a s t l e

    d i s e a s e

    v i r u s

    i n

    t h e c h i c k e n . J . I m m u n o l .

    1 1 4 : 4 2 2 - 4 2 5 .

    8 .

    C u n n i n g h a m ,

    C .

    H .

    1 9 6 6 . A

    l a b o r a t o r y

    g u i d e

    t o

    v i r o l o g y ,

    onM

    ay4

    ,2

    01

    6

    byguest

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  • 7/26/2019 Infect. Immun.-1979-Ewert-269-75.pdf

    7/7

    LOCAL

    A N T IBO DY

    RESPONSE

    IN

    CHICKENS

    2 75

    6 t h e d . B u r g e s s P u b l i s h i n g

    C o . , M i n n e a p o l i s .

    9 .

    E w e r t ,

    D .

    L . ,

    and

    C .

    S . E i d s o n .

    1 9 7 7 .

    E f f e c t

    o f

    b u r s e c -

    t o m y

    a n d

    d e p l e t i o n o f

    i m m u n o g l o b u l i n

    A o n

    a n t i b o d y

    p r o d u c t i o n

    a n d

    r e s i s t a n c e t o

    r e s p i r a t o r y

    c h a l l e n g e

    a f t e r

    l o c a l

    o r

    s y s t e m i c

    v a c c i n a t i o n o f

    c h i c ke ns w i t h

    N e w c a s -

    t l e

    d i s e a s e v i r u s . I n f e c t . I m m u n .

    1 8 : 1 4 6 - 1 5 0 .

    1 0 .

    E w e r t ,

    D .

    L . ,

    C .

    S .

    E i d s o n ,

    and

    D .

    L .

    Dawe.

    1 9 7 7 .

    F a c t o r s

    i n f l u e n c i n g

    t h e

    a p p e a r a n c e

    o f

    a n t i b o d y

    i n t r a -

    c h e a l

    w a s h e s

    a n d s e r u m

    o f

    y o u n g c h i c k e n s

    a f t e r

    e x p o -

    s u r e t o N e w c a s t l e d i s e a s e

    v i r u s . I n f e c t .

    I m m u n . 1 8 : 1 3 8 -

    1 4 5 .

    1 1 .

    G r e e n w o o d ,

    F

    C . ,

    W. M.

    H u n t e r ,

    and J . S . G l o v e r .

    1 9 6 3 . The

    p r e p a r a t i o n

    o f 3 ' I - l a b e l e d human

    g r o w t h

    h o r m o n e

    o f

    h i g h s p e c i f i c

    a c t i v i t y .

    B i o c h e m .

    J .

    8 9 : 1 1 4 -

    1 2 3 .

    1 2 .

    H e r e m a n s ,

    J . F .

    1 9 7 5 . Th e

    s e c r e t a r y immune

    s y s t e m .

    A

    c r i t i c a l

    a p p r a i s a l , p .

    3 7 6 - 3 8 5 . I n F .

    M i l g r o m a n d E .

    N e t e r

    ( e d . ) ,

    The

    i m m u n e s y s t e m

    a n d i n f e c t i o u s

    d i s -

    e a s e s :

    P r o c e e d i n g s . I n t e r n a t i o n a l

    C o n v o c a t i o n Immu-

    n o l o g y ,

    4 t h ,

    B u f f a l o , N . Y . ,

    J u n e 1 9 7 4 .

    K a r g e r ,

    B a s e l .

    1 3 . H o l m e s ,

    H .

    C .

    1 9 7 3 .

    N e u t r a l i z i n g a n t i b o d y

    i n n a s a l

    s e c r e -

    t i o n s

    o f

    c h i c k e n s

    f o l l o w i n g a d m i n i s t r a t i o n

    o f

    a v i a n

    i n -

    f e c t i o u s

    b r o n c h i t i s

    v i r u s .

    A r c h .

    G e s a m t e

    V i r u s f o r s c h .

    4 3 : 2 3 5 - 2 4 1 .

    1 4 .

    H u t c h i n s o n ,

    H .

    D . ,

    and

    D .

    W.

    Z i e g l e r .

    1 9 7 2 .

    S i m p l i f i e d

    r a d i o i m u n o a s s a y f o r

    d i a g n o s t i c s e r o l o g y . A p p l . M i c r o -

    b i o l .

    2 4 : 7 4 2 - 7 4 9 .

    1 5 .

    H u t c h i n s o n ,

    H .

    D . ,

    and D . W.

    Z i e g l e r .

    1 9 7 4 . C r i t e r i a

    f o r

    p r e p a r i n g , e v a l u a t i n g ,

    a n d

    s t a n d a r d i z i n g

    i o d i n a t e d

    g l o b u l i n s

    f o r

    r a d i o i m m u n o a s s a y

    p r o c e d u r e s .

    A p p l .

    M i -

    c r o b i o l . 2 8 : 9 3 5 - 9 4 2 .

    1 6 .

    H u t c h i n s o n ,

    H .

    D . ,

    D . W.

    Z i e g l e r ,

    and P .

    W. F e o r i n o .

    1 9 7 5 .

    R a d i o i m m u n o a s s a y

    f o r

    d e t e c t i o n

    o f

    a n t i b o d i e s t o

    E p s t e i n - B a r r

    v i r u s

    i n

    human

    i n f e c t i o u s

    m o n o n u c l e o s i s

    s e r u m

    s p e c i m e n s .

    J .

    C h i n . M i c r o b i o l . 1 : 4 2 9 - 4 3 3 .

    1 7 .

    J u n g h e r r ,

    E . L .

    1 9 6 4 .

    P a t h o g e n i c i t y

    o f N e w c a s t l e

    d i s e a s e

    v i r u s

    f o r

    t h e

    c h i c k e n ,

    p .

    2 5 7 - 2 7 2 .

    I n R .

    P .

    H a n s o n

    e d . ) ,

    N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s :

    a n

    e v o l v i n g

    p a t h o g e n .

    U n i v e r -

    s i t y

    o f

    W i s c o n s i n

    P r e s s ,

    M a d i s o n .

    1 8 .

    K o h n ,

    A .

    1 9 5 5 .

    Q u a n t i t a t i v e

    a s p e c t s

    o f N e w c a s t l e

    d i s e a s e

    v i r u s

    i n

    i n f e c t i o n : e f f e c t

    o f

    r o u t e o f

    i n f e c t i o n s o n

    t h e

    s u s c e p t i b i l i t y

    o f

    c h i c k s . Am.

    J . V e t .

    R e s .

    1 6 : 4 5 0 - 4 5 7 .

    1 9 .

    L e b a c q - V e r h e y d e n ,

    A .

    M

    J .

    P .

    V a e r m a n ,

    and

    J . F .

    H e r e m a n s . 1 9 7 4 .

    Q u a n t i f i c a t i o n

    a n d

    d i s t r i b u t i o n o f

    c h i c k e n

    i m m u n o g l o b u l i n s I g A , Ig M

    a n d

    I g G

    i n s e r u m

    a n d s e c r e t i o n s .

    I m m u n o l o g y

    2 7 : 6 8 3 - 6 9 2 .

    2 0 .

    L e s l i e ,

    G .

    A . ,

    a n d

    L N .

    M a r t i n . 1 9 7 3 .

    S t u d i e s o n t h e

    s e c r e t a r y

    i m m u n o l o g i c s y s t e m

    o f f o w l .

    I I I . S e r u m a n d

    s e c r e t a r y I g A

    o f

    t h e

    c h i c k e n . J .

    I m m u n o l .

    1 1 0 : 1 - 9 .

    2 1 .

    L e s l i e ,

    G .

    A . ,

    and

    L

    N .

    M a r t i n .

    1 9 7 4 .

    The

    s e c r e t a r y

    i m m u n o l o g i c s y s t e m

    o f

    f o w l .

    I V .

    S e r u m

    a n d

    s a l i v a r y

    i m m u n o g l o b u l i n s i n

    n o r m a l ,

    a g a mm a g l o b u l i n e mi c a n d

    d y s g a m m a g l o b u l i n e m i c c h i c k e n s . I n t .

    A r c h .

    A l l e r g y

    A p p l . I m m u n o l . 4 6 : 8 3 4 - 8 4 1 .

    2 2 .

    L o w r y , 0 .

    H . , N . J .

    R o s e b r o u g h ,

    A .

    L .

    F a r r ,

    and

    R . J .

    R a n d a l l . 1 9 5 1 .

    P r o t e i n

    m e a s u r e m e n t

    w i t h t h e F o l i n

    p h e n o l

    r e a g e n t .

    J .

    B i o l .

    C h e m .

    1 9 3 : 2 6 5 - 2 7 5 .

    2 3 . M a l k i n s o n ,

    M . ,

    and

    P .

    A . S m a l l ,

    J r .

    1 9 7 7 .

    L o c a l

    i m -

    m u n i t y

    a g a i n s t N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s

    i n t h e n e w l y

    h a t c h e d

    c h i c k e n ' s r e s p i r a t o r y

    t r a c t .

    I n f e c t .

    I m m u n .

    1 6 :

    5 8 7 - 5 9 2 .

    2 4 .

    M u e l l e r , A . P . ,

    K .

    S a t o ,

    and

    B .

    G l i c k . 1 9 7 1 .

    The

    c h i c k e n

    l a c r i m a l g l a n d ,

    g l a n d

    o f

    H a r d e r ,

    c a e c a l

    t o n s i l ,

    a n d a c -

    c e s s o r y

    s p l e e n s a s

    s o u r c e s

    o f

    a n t i b o d y - p r o d u c i n g

    c e l l s .

    C e l l .

    I m m u n o l . 2 : 1 4 0 - 1 5 2 .

    2 5 .

    N a t i o n a l

    R e s e a r c h C o u n c i l . 1 9 7 1 . M e t h o d s f o r e x a m -

    i n i n g

    p o u l t r y

    b i o l o g i c s

    a n d

    f o r

    i d e n t i f y i n g

    a n d

    q u a n t i -

    f y i n g a v ia n p a th o g en s .

    N a t i o n a l

    Academy

    o f S c i e n c e s ,

    W a s h i n g t o n , D . C .

    2 6 .

    O g r a ,

    P .

    L ,

    and

    D .

    T .

    K a r z o n .

    1 9 7 0 . R o l e

    o f i m m u n o -

    g l o b u l i n s

    i n

    t h e

    m e c h a n i s m o f

    m u c o s a l

    i m m u n i t y t o

    v i r u s

    i n f e c t i o n .

    P e d i a t r .

    C l i n . N o r t h

    Am. 1 7 : 3 8 5 - 4 0 0 .

    2 7 .

    O g r a ,

    P

    L ,

    R .

    B .

    W a l l a c e ,

    G .

    Vmana,

    S . S .

    O g r a ,

    D .

    K e r r - G r a n t ,

    and

    A .

    M o r g g .

    1 9 7 4 .

    I m p l i c a t i o n o f

    s e -

    c r e t o r y

    immune

    s y s t e m ,

    p .

    2 7 1 - 2 8 2 .

    I n

    J .

    M e s t e c k y

    a n d

    A .

    R .

    L a w t o n

    H I

    ( e d . ) ,

    The

    i m m u n o g l o b u l i n

    A

    s y s t e m .

    P l e n u m

    P u b l i s h i n g

    C o r p . ,

    N e w Y o r k .

    2 8 .

    O r l a n s , E . ,

    and

    M. E . R o s e . 1 9 7 2 .

    An

    I g A - l i k e i m m u n o -

    g l o b u l i n i n t h e f o w l .

    I m m u n o c h e m i s t r y 9 : 8 3 3 - 8 3 8 .

    2 9 .

    O u c h t e r l o n y ,

    0 .

    1 9 4 9 .

    A n t i g e n - a n t i b o d y

    r e a c t i o n s

    i n

    g e l s .

    A c t a P a t h o l . M i c r o b i o l .

    S c a n d . 2 6 : 5 0 7 - 5 1 5 .

    3 0 . P a r r y , S . H . , and I . D . A i t k e n . 1 9 7 3 .

    I m m u n o g l o b u l i n

    A

    i n

    t h e

    r e s p i r a t o r y

    t r a c t o f

    t h e c h i c k e n

    f o l l o w i n g e x p o -

    s u r e t o

    N e w c a s t l e

    d i s e a s e v i r u s .

    V e t . R e c .

    6 3 : 2 5 8 - 2 5 9 .

    3 1 .

    R o s e ,

    M.

    E . ,

    E .

    O r l a n s ,

    and

    N .

    B u t t r e s s . 1 9 7 4 . Immu-

    n o g l o b u l i n

    c l a s s e s

    i n

    t h e h e n ' s e g g s : t h e i r

    s e g r e g a t i o n i n

    y o l k

    a n d

    w h i t e .

    E u r . J .

    I m m u n o l .

    4 : 5 2 1 - 5 2 3 .

    3 2 .

    R o s e n t h a l ,

    J .

    D . ,

    K .

    H a y a s h i ,

    and A . L .

    N o t k i n s .

    1 9 7 3 .

    C o m p a r i s o n

    o f

    d i r e c t a n d i n d i r e c t

    s o l i d - p h a s e

    m i c r o r a -

    d i o i m m u n o a s s a y s

    f o r

    t h e

    d e t e c t i o n

    o f

    v i r a l

    a n t i g e n s

    a n d

    a n t i v i r a l

    a n t i b o d y .

    A p p l .

    M i c r o b i o l .

    2 5 : 5 6 7 - 5 7 3 .

    3 3 .

    S a i n t e - M a r i e , G .

    1 9 6 2 .

    A p a r a f f i n

    e m b e d d i n g

    t e c h n i q u e

    f o r

    s t u d i e s

    e m p l o y i n g

    i m m u n o f l u o r e s c e n c e .

    J .

    H i s t o -

    c h e m .

    C y t o c h e m .

    1 0 : 2 5 0 - 2 5 6 .

    3 4 . Waldman, R .

    H . ,

    and

    R . G a n g u l y . 1 9 7 4 .

    T h e r o l e o f t h e

    s e c r e t a r y

    immune

    s y s t e m

    i n

    p r o t e c t i o n

    a g a i n s t

    a g e n t s

    w h i c h

    i n f e c t

    t h e

    r e s p i r a t o r y t r a c t , p . 2 8 3 - 2 9 4 .

    I n

    J .

    M e s t e c k y

    a n d

    A .

    R .

    L a w t o n

    I I I

    ( e d . ) ,

    The

    i m m u n o g l o b -

    u l i n

    A

    s y s t e m .

    P l e n u m

    P u b l i s h i n g C o r p . , N e w

    Y o r k .

    3 5 .

    Z a k a y - R o n e s , Z . , and

    R .

    L e v y .

    1 9 7 3 .

    I m m u n o l o g i c r e -

    s p o n s e

    o f

    c h i c k s t o i n a c t i v a t e d

    N e w c a s t l e

    d i s e a s e v i r u s .

    A v i a n D i s .

    1 7 : 4 5 0 - 4 5 2 .

    3 6 .

    Z a k a y - R o n e s ,

    Z . ,

    R .

    L e v y , and G .

    S p i r a .

    1 9 7 1 L o c a l

    i m m u n o l o g i c

    r e s p o n s e

    t o

    i m m u n i z a t i o n

    w i t h

    i n a c t i -

    v a t e d N e w c a s t l e

    d i s e a s e v i r u s . J .

    I m m u n o l .

    1 0 7 : 1 1 8 0 -

    1 1 8 3 .

    VOL.

    2 4 ,

    1 9 7 9

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