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INMOVILIZACION DE ENZIMASDr. J. V. Sinisterra

Biotransformations GroupFaculty of Pharmacy

Universidad Complutensewww.biotransformaciones.com

INMOVILIZACION DE ENZIMAS

Estabilidad de la lipasa de C. rugosa almacenada a distintas temperaturas

Reacción test. Hidrólisis de aceite de oliva.

Moreno et al. J .Mol .Catal. 1993,83,261-271

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Diseño de biocatalizadores con una elevada actividad por unidad de volumen

Una elevada actividad específica (U/ cat) es beneficiosa para un proceso escalablepues así se requiere menor volumen de reactor para lograr la msima actividad.

En general el boiocatalizador no supera el 10% de la masa total y el “catalizador”Suele ocupar entre el 10-20% del reactor.

Hay dos metodologías para obtener biocatalizadores robustos con altas cargasde actividad

High payload carriers .- soportes que admiten una gran cantidad de enzimaimmobilizada.

CLEA.- Carrier-bound-cross linked enzymes

Ca0 L. Curr. Opinion Chem. Boiol. 2005, 9, 217-226

High payload carriers .- soportes que admiten una gran cantidad de enzima inmovilizada.

Se obtienen jugando con la superficie del soporte y el tamaño de poro.

La relación enzima/soporte varia entre 0.1 y 0.2

El soporte suele tener unos 200 m2 /g y el tamaño de poro es de unos 100nm

Esto permite que muchas moléculas de enzima entren en el interior del soporte

Ca0 L. Curr. Opinion Chem. Boiol. 2005, 9, 217-226

CLEAS.- Carrie – bound cross-linked enzyme aggregates

CLEAs are prepared by 1) aggregation of enzymes2) chemical cross-linking of enzyme aggregates

The main problem is that the particles size is < 10 µm- difficult to separatefrom the reaction mixture

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Inmovilización y Estabilización

Una técnica necesaria: La inmovilización para re-úso

Una estrategia adicional para mejorar una de las propiedades principales de una enzima industrial: su estabilidad

ESTABILIZACION DE LA ESTRUCTURA CUATENARIA DE ENZIMAS MULTIMERICAS

PARA EVITAR INACTIVACIONES POR DISSOCIACIÓN DE SUBUNIDADES

PARA EVITAR DESORCIONES DE SUB-UNIDADES

Inmovilización y Estabilización

IMNOVILIZACION MULTISUBUNIDADESIMNOVILIZACION MULTISUBUNIDADES

Inmovilización y Estabilización de Enzimas Multiméricas

ENTRECRUZAMIENTO CON POLIMEROS POLIFUNCIONALESENTRECRUZAMIENTO CON POLIMEROS POLIFUNCIONALES((polialdehídospolialdehídos))

ENTRECRUZAMIENTO CON POLIMEROS POLIFUNCIONALESENTRECRUZAMIENTO CON POLIMEROS POLIFUNCIONALES((polialdehídospolialdehídos))

C

O

H

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IMNOVILIZACION MULTISUBUNIDADESIMNOVILIZACION MULTISUBUNIDADES

Inmovilización y Estabilización de Enzimas Multiméricas

ENTRECRUZAMIENTO CON POLIMEROS POLIFUNCIONALESENTRECRUZAMIENTO CON POLIMEROS POLIFUNCIONALES(polialdehídos)(polialdehídos)

ENTRECRUZAMIENTO CON POLIMEROS POLIFUNCIONALESENTRECRUZAMIENTO CON POLIMEROS POLIFUNCIONALES(polialdehídos)(polialdehídos)

C

O

H

Inmovilización de enzimasInmovilización de enzimas

ENZIMASENZIMAS

ADSORCIÓNUNIÓN COVALENTE

ATRAPAMIENTO

1.-atrapamiento en micelas2.- atrapamiento en organogeles3.- atrapamiento en sistemas sol-gel

CLEAS

Inmovilización de enzimasInmovilización de enzimas

Requerimientos del método de inmovilización

1) Método sencillo2) Método reproducible3) Método suave en las condiciones de reacción4) Método económico)5) Método seguro6) Método versátil7) Método factible de escalado8) Buena congruencia geométrica entre la superficie del soporte y la enzima9) Elevada densidad de grupos activos por unidad de superficie en el soporte.

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Inmovilización de enzimasInmovilización de enzimas

ENZIMASENZIMAS

ADSORCIÓNUNIÓN COVALENTE

ATRAPAMIENTOATRAPAMIENTO1.-atrapamiento en micelas2.- atrapamiento en organogeles3.- atrapamiento en sistemas sol-gel

CLEAS

La inmovilización covalente permite rigidificar la enzima evitandola desnaturalización por desplegamiento de la proteína

Métodos de inmovilización de una enzima monomérica

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¿Es inerte el soporte?En los procesos en que se trabaja con poca agua, la capacidad de captación deagua por el soporte es determinante de la actividad catalítica´Se determina mediante la AQUOFILIA

Se dteermina con 1% de agua, 100mg de soporte y 1,5 mg deEnzima unida

Breslow et al. Eur,J, Biochem. 172,573-8 (1988)

Actividad de la α-quimotripsina inmovilizada en distintos soportes,en la esterificación de L-N-acetilfenilalanina con etanol

Breslow et al. Eur,J, Biochem. 172,573-8 (1988)

¿Qué residuos aminoacídicos se pueden utilizar para la inmovilización?

Los mas abundantes y Los mas expuestos almedio

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Grupos reactivos

Criterios para seleccionar la metodología de inmovilizaciónp g1) Estabilidad del biocatalizador inmovilizado2) Facilidad de manejo del biocatalizador inmovilizado3) Soporte: precio, aquofilia, estabilidad, resistencia a la contaminación

Bacteriológica.4) Naturaleza y estructura de la enzima

Criterios para seleccionar una reacción de inmovilización1) Reacción sencilla2) Reacción reproducible3) Reacción que se lleve a cabo en condiciones suaves de T, medio de reacción etc.4) Reacción barata5) Reacción segura6) Reacción escalable

Tipos de soportes

1) polisacaridos: sefadex, celulosa, agarosa, agar, quitina, etc

2) Soportes inorgánicos: óxidos metálicos vidrio poroso silice etc2) Soportes inorgánicos: óxidos metálicos, vidrio poroso, silice etc.

3) Proteinas fibrosas : colágeno, queratina etc.

4) Polímeros sintéticos : poli-acrilatos, poli- acrilamidas, alcohol polivinílico

5) Hidrogeles iónicos: alginato, pectato, carraginano etc.

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Inmovilización por adsorción

Inmovilización por adsorción

La funcionalización mas utilizada de los soportes es el grupo epóxidoya que permite muchas modificaciones de la superficie para interaccionar

con los distintos grupos funcionales de la proteína

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El proceso de unión covalente es un proceso que ocurre en varios pasos

Union covalente a soportes polifuncionales

Si se quiere inmovilizar vía grupos ácido de la proteínaEl empleo de las carbodiimidas se considera como el método

de elección

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Inmovilización vía grupos sulfuro

N

S

O

OO OH

O

H2N HCOOCH3 +

HO

N

S

O

OO OH

O

HN H

O

OH

Cefamandol

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Inmovilización

Ventajas:Mayor estabilidad enzimática.Disminución interacciones proteína-proteína.Facilidad de manipulación del microentornoDisminución de costes por reutilizaciónFácil separación del biocatalizador del producto

Métodos de inmovilización:

InconvenientesAlteración de la conformación enzimática.Existencia de sistema soporte-enzima heterogéneo.Posible pérdida de actividad enzimática

Proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente los grados de libertadde movimiento de enzimas, orgánulos, células, etc... por su unión a un soporte(Taylor, Protein immobilization: fundamentals and applicatrions, 1991.)

Físicos: Atrapamiento, encapsulación, inclusiónQuímicos: entrecruzamiento o unión directa al soporte

Unión directa:

Inmovilización por adsorción: hidrofóbica (Octil-Agarosa, EP100), iónica (Duolite)

OH2N

Eupergit C Enzima

OH

NH

Inmovilización covalente (Eupergit)

O

O

CH3 O

O

CH3

OH

+RML

acetate of (R,S)-1-phenyl-propanol-2 R-1-phenyl-propanol-2 acetate of (S)-1-phenyl-propanol-2

Enantioselectivity of immobilized RML in the hydrolysis of the racemic ester

Support yield (%) at 24h e.e.(%) E(R)

Native enzyme 37 99 >200Octyl agarose 50 98 >200EP-100 35 99 >200Butyl sepabeads 47 99 >200Decaoctyl sepabeads 49 98 >200Amberlite 8 95 42Eupergit C 34 83 16

Enz. Microb, Technol. 2005, 37,514-520

Derivado Conversión (%)

Actividad (mM/min mg

prot.)

V0 (mM/min)

eep (%)

E

nativa 37 0,019 0,51±0,03 >99 >100

Hidrólisis del acetato del (R,S)1-(2-fenil)-etilo

O

O

derivado enzimático OH O

O

+

R S

tampón

, 0,51±0,03 Lip-Duolite 50 0,037 0,76±0,04 79 20 Lip-Agarosa 50 0,037 0,84±0,04 98 >100 Lip--Eup-25mM 25 0,016 0,92±0,05 93 18 Lip-Eup-1M 34 0,027 0,66±0,03 83 16 Lip-EP100 35 0,026 0,52±0,03 98 >100

Me

OH

PhMe

OH

PhMe

O

Ph

O

+

R S(iPr2)O

Me

O

O

Alcántara y col. Chemistry & Physics of Lipids 1998, 93,169-184

Lipasa de Rh. miehei

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Condiciones monofásicas.Efecto de disolventes “duros” sobre la estabilidad de PGA de E. coli. pH=5(○) 50% DMF T=4ºC; (●) 50% DMFT=25ºC; (∆) 50% acetona T= 4ºC; (□) 50% 1,4-dioxano T=25ºC

Lopez-Lafuente y col. 1995

Desactivación de PGA de K. citrophila en 50% DMF, T=25ºC(○) derivado covalente multipuntual sobre agarosa preparado en ausencia de inhibidor. Sulfóxido de Penicilina(●) idem preparado en presencia de inhibidor(∆) derivado covalente unipuntual

Lopez-Lafuente y col. 1995

Inmovilización de enzimasInmovilización de enzimas

ENZIMASENZIMAS

ADSORCIÓNUNIÓN COVALENTE

ATRAPAMIENTO

1.-atrapamiento en micelas2.- atrapamiento en organogeles3.- atrapamiento en sistemas sol-gel

CLEAS

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El atrapamiento busca evitar el desplegamiento de la proteinaPor efecto de las colisiones con moléculas de agua

Inmovilización por atrapamiento.La enzima no se une químicamente a la matriz

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Fundamentos del reactor de membrana

Inmovilización de enzimas en reactores de membranasCon reciclado de la enzima

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Inmovilización de enzimas en reactores de membranasCon la enzima inmovilizada en la membrana

ORGANOGELSORGANOGELS

“DOUBLE” IMMOBILIZATIONLIPASES IN WATER IN

OIL REVERSE MICELLS

ORGANOGELS

ADITION OF GELLING AGENT:

AGAR, CELLULOSE, GELATIN, ETC

IMMOBILIZATION OF LIPASES INTO IMMOBILIZATION OF LIPASES INTO ORGANOGELSORGANOGELS

Water in oil reverse micellesWater in oil reverse micelles

FEATURES:

LIPASESLIPASES

FEATURES:

• Optically isotropic

• Spontaneously formed

• Solubilization of hydrophylic

and lipophylic substrates

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FORMATION OF ORGANOGELSFORMATION OF ORGANOGELS

HYDROXYPROPYLMETHYLCELLULOSE (CELLULOSE)(CELLULOSE)

Modelo propuesto de organogeles basado en estudiosde técnicas SANS (Small-Angle Neutron-Scattering)

(Atkinson y cols., 1988, 1989, 1991).

FORMATION OF ORGANOGELSFORMATION OF ORGANOGELS

ENZYMATIC BIOCONVERSION WITH ORGANOGELS

RE-USE OF BIOCATALYSTS

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LIPASASLIPASAS

GLICEROL ÉSTER HIDROLASAS E.C. 3.1.1.3

HIDRÓLISIS DE GRASAS, ACEITES Y TRIGLICÉRIDOSTRIGLICÉRIDOS

OOCR1

R2COO

OOCR3

+ HO

OH

OH

+ ++Lipasa

Lipasa3 H2O R3CO2HR2CO2HR1CO2H

ESTRUCTURA DE LA Lip1ESTRUCTURA DE LA Lip1

CERRADA ABIERTA

TAPADERA