Diagnóstico de laboratorio del cólera

Taller “El papel de laboratorio en la prevención y control del cólera”

INCIENSA, 8 de noviembre de 2013

Dra. Elena Campos Chacón, Coordinadora

Centro Nacional de Referencia de Bacteriología, INCIENSA

Centro de Excelencia Regional WHO-Global Foodborne Infections Network para

Centroamérica, México y Caribe de Habla Hispana

Esta charla fue actualizada el 06/12/2013

Bajo condiciones sanitarias deficientes

el cólera se propaga rápidamente

Tiempo necesario para establecer el diagnóstico de V. cholerae O1

por cultivo y mediante pruebas rápida de Cholera SMART

Bolaños H. et al. 2004. Desempeño de los sistemas Cholera-SMART y Pathogen Detection Kit en el

diagnóstico del cólera. Rev. Panam. Salud Pública 16:233-241.

Tipo de muestra Tiempo requerido para establecer el diagnóstico

Cultivo Prueba rápida

Heces “agua de arroz” y líquidas sin moco 18 – 24 horas 15 minutos

Hisopados, heces semiformadas, heces con moco y

sangre, contenido intestinal post-mortem

24 – 48 horas 6 horas

Heces o hisopados de personas tratadas con

antibióticos antes de la obtención de la muestra y de

asintomáticos

24 – 48 horas 18 horas

Cólera: espectro de la infección

Vibrio cholerae O1, El Tor

75% infección asintomática*

2% enfermedad grave diarrea “agua de arroz”

5% enfermedad moderada

18% enfermedad leve

* Portadores: personas que no presentan síntomas, pero pueden transmitir la enfermedad. Importantes en diseminación del cólera.

La única manera

de confirmar la presencia de cólera epidémico

es mediante pruebas de laboratorio que demuestren la

presencia de Vibrio cholerae O1 o de V cholerae O139

Red Nacional de Laboratorios de Bacteriología (RNLB = 80 labs)

Centro Nacional de Referencia en Bacteriología, Coordinador

Clínicos humanos (59 públicos + 4 privados )

Clínicos veterinarios (2 públicos)

Alimentos para consumo humano (4 públicos + 3 privados )

Alimentos para animales (1 públicos + 1 privado)

Aguas (2 públicos + 1 privados )

Empresas productoras de alimentos (3 privados)

10/12/2013 9

Compartir información

específica, oportuna y confiable

En esta etapa se debe Intensificar la vigilancia de laboratorio del cólera

mediante coprocultivo de rutina (TCBS) en:

En pacientes con enfermedad diarreica aguda , (secretora), brotes y defunciones

asociadas a EDA.

En los casos que cumplen las definiciones de «sospechoso de cólera» del

protocolo de vigilancia, se deben emplear además los métodos rápidos

(Cholera Smart) con el fin de detectar la presencia de Vibrio cholerae O1

epidémico en forma inmediata.

Toda persona que presente diarrea aguda secretora grave (heces tipo “agua de arroz”) y/o

vómitos de alta tasa.

Toda persona que presente diarrea aguda secretora (leve, moderada o grave),

proveniente de un área con cólera.

Toda persona que presente diarrea aguda secretora (leve, moderada o grave), relacionada a

un brote.

Toda persona que muera con antecedentes de diarrea, vómitos, deshidratación y/o

por complicaciones debidas a la deshidratación

La función del laboratorio en la etapa de alerta pre-epidémica

La función del laboratorio en la vigilancia,

prevención y control del cólera

Etapa epidémica

Una vez confirmada la presencia de casos de cólera en una zona y que se

compruebe la transmisión continua de la infección, únicamente se realizará

el estudio de V.cholerae en el 10% de los casos sospechosos

Vigilancia estricta de la susceptibilidad a los antibióticos

Apoyar las investigaciones de brote para determinar

Vehículo de infección

Mecanismos de transmisión

Avance de la epidemia

Valoración de la definición de caso

Repercusión de medidas de control

Selección del tipo de muestra a recolectar

en el diagnóstico e investigación del cólera

Razón para tomar la muestra Tipo de muestra a recolectar

Tiene diarrea ahora Heces

Tiene diarrea ahora, pero recibió al menos una dosis de antibiótico

Heces y suero

Tuvo diarrea durante la última semana Heces y suero

Tuvo diarrea hace 15 días o 1 mes Suero

No ha tenido diarrea, pero es contacto de una persona con cólera

Heces y suero

Otro Heces y suero

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as c

lín

icas

• Sangre

• Tubos vacutainer

(tapón rojo)

• Agujas para

vacutainer

• Torniquete

• Gradilla para tubos

• Algodón

• Alcohol 70°C

• Cary Blair (medio de

transporte)

• Hisopos estériles

• Heces

• Frascos estériles,

boca ancha,

con tapa cierre

hermético

Medidas básicas de protección para recolección y

procesamiento de muestras

Normas de bioseguridad Nivel II

Lavado de manos con agua, jabón y alcohol 70°

Guantes

Gabacha, bozal

Bolsas para

material

contaminado

Usar guantes, lentes, bata de

laboratorio bozal, protectores

de zapatos y gabinete de

bioseguridad según el riesgo de

actividad.

Usar tubos o frascos con tapas

herméticas irrompibles

No enviar elementos punzantes

o cortantes

No envolver los frascos de las

muestras en las boletas de

solicitud de análisis

Boleta de solicitud de análisis

• Datos demográficos

• Fecha inicio de síntomas

• Fecha recolección muestra

• Relacionado a brote?

• Signos – síntomas

• Antibioticoterapia

• Tipo de muestra

• Origen

• Fecha de recepción INCIENSA

Boleta de diagnóstico

Boleta de confirmación / tipificación

• Patógeno referido

• Resultados PSA (NO)

Boleta de alimentos

Sistema de información

Bio

logic

al substa

nce C

ate

gory

B

UN 3373

http://www.inciensa.sa.cr/servicios/boletas/USEC-

R01%20Solicitud%20de%20Diagnostico.pdf

http://www.inciensa.sa.cr/servicios/boletas/USEC-

R02%20Solicitud%20de%20Confirmacion%20Diagnostica.pdf

Diagnóstico de laboratorio cólera

(Red Nacional de Laboratorios de Costa Rica)

Nivel local

Aislamiento e identificación de Vibrio cholerae O1

Presencia o ausencia de leucocitos y eritrocitos en heces

Observación microscópica 100X de la motilidad y morfología bacteriana

Enriquecimiento en (APA)

Prueba rápida Cholera Smart

Agar TCBS, AS y McConkey y otros medios para coprocultivo.

Pruebas de oxidasa, crecimiento en 0 y 1% NaCl y cordón

Identificación bioquímica convencional, Vitek, Microscan, Api

Medio de Transporte Cary Blair

Toda cepa sospechosa de Vibrio cholerae debe ser referida al CNRB

con carácter de urgencia para su confirmación y caracterización

Diagnóstico de laboratorio cólera

(Red Nacional de Laboratorios de Costa Rica)

Centro Nacional de Referencia

Diagnóstico de cólera y otros enteropatógenos (brotes)

Detección de Vibrio cholerae O1 en alimentos

Confirmación y tipificación de:

Vibrio cholerae y otras especies

Serogrupo: O1, O139

Serotipo: Inaba, Ogawa, Hikojima

Biotipo: El Tor, Clasico

Vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos

Caracterización de factores de virulencia: toxina colérica

Electroforesis de campo pulsado (PFGE)

Determinación de anticuerpos vibriocidas

Tomado de: El laboratorio en la vigilancia y control del cólera en México. Instituto Nacional de Diagnóstico

y Referencia Epidemiológicos (INDRE), julio 1991.

Cólera: historia natural y marcadores de laboratorio

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 15

Antes de procesar las muestras

Leer la información clínico-epidemiológica

• Cumple con definición de caso sospechoso de cólera

• Edad

• Síntomas

• Apariencia de las heces

• Otros enfermos asociados

• Viajes

Determinar la calidad de la muestra

• Tipo de muestra

• Fecha de inicio de síntomas

• Fecha de recolección de muestra

• Fecha de recepción de la muestra

en el laboratorio

• Consumo de antibióticos previo

a la recolección de la muestra

• Transporte de la muestra

Análisis macro y microscópico

bacteriana

El reporte de laboratorio

• Se deben reportar los resultados negativos y positivos, de

acuerdo a lo investigado

• Aclarar las limitaciones del resultado

• Calidad de la muestra

• Fecha de inicio de síntomas vs. fecha de recolección de la

muestra

• Fecha de recolección de la muestra vs. fecha de recepción en

el laboratorio

• Uso de antibióticos previo a la recolección de la muestra

• Comentarios o sugerencias que permitan actualizar el

conocimiento en relación a los hallazgos clínico –

epidemiológicos

• Confidencialidad de la información.

http://images.google.com/imgres?imgurl=http://www.intralytix.com/zemphira.jpg&imgrefurl=http://www.intralytix.com/sciencemag.htm&h=361&w=459&sz=36&tbnid=t9glgtkpu4UJ:&tbnh=98&tbnw=124&start=98&prev=/images%3Fq%3Dmicrobiologist%26start%3D80%26hl%3Des%26lr%3D%26sa%3DN

Coprocultivo

Vibrios de importancia clínica

Especie

Presentación clínica

Gastrointestinal Infección de

heridas, oídos

Septicemia

V. cholerae O1 ++ (+)

V. cholerae no O1

(incluyendo O:139)

++ + +

V. mimicus ++ +

V. parahaemolyticus ++ + (+)

V. vulnificus + ++ ++

V. alginolyticus ++

++: Presentación más común; +: otra presentación clínica; (+) presentación poco usual

Cólera: diagnóstico diferencial

Otros enteropatógenos, además de Vibrio cholerae O1 y

V. cholerae O139 tienen la habilidad de elaborar toxinas

similares a la CT, por lo que producen cuadros clínicos

indistinguibles del cólera (ej. V. mimicus, E. coli enterotoxigénica,

Aeromonas).

Dado su potencial epidémico, cuando se diagnostica

V. cholerae O1 y V. cholerae O139 se deben realizar de

manera urgente las medidas de control de foco específicas,

a fin de contener la diseminación de la enfermedad.

El diagnóstico de la enfermedad se debe establecer

mediante la identificación del agente por el laboratorio.

Cólera: diagnóstico de laboratorio

Aislamiento primario

Agua peptona alcalina pH 8.5 ± 0.2 (APA)

Agar tiosulfato sales biliares sacarosa (TCBS)

Ver Capítulo IV del Manual del CDC: Métodos de laboratorio para el

diagnóstico de Vibrio cholerae en:

http://www.cdc.gov/cholera/pdf/es/Aislamiento-de-Vibrio-cholerae-a-partir-de-muestras-fecales_cap%C3%ADtulo-4.pdf

Identificación bioquímica y serológica

Determinación de factores de virulencia

Prueba de sensibilidad a los antibióticos

Métodos rápidos (ej. Cholera SMART II TM)

No sustituyen el cultivo tradicional

Diagnóstico serológico (anticuerpos vibriocidas)

Cuando no se puede realizar el cultivo

En pacientes que ya recibieron antibióticos

Bioquímica convencional

Tradicionalmente se ha considerado el estándar de oro (confirmación)

Al respecto se recomienda consultar el Capítulo VI del Manual del CDC: Métodos de

laboratorio para el diagnóstico de Vibrio cholerae en:

http://www.cdc.gov/cholera/pdf/es/Identificaci%C3%B3n-de-Vibrio-cholerae-en-ellaboratorio-

cap%C3%ADtulo-6.pdf

Galerías API 20 E (preparar el inóculo bacteriano en SS 0,85%)

Tarjetas GN / Sistema Vitek 2

Paneles ID para Gram Negativos/ NUC 45,50 o 55 / Sistema MicroScan

Sin embargo, es importante hacer notar que: En la literatura hay estudios que reportan que los métodos automatizados y

miniaturizados presentan dificultad en la identificación, de Vibrio, Aeromonas y

Plesiomonas tanto a nivel de género como de especies *.

Identificación bioquímica de Vibrio cholerae

* O’Hara, CM. et al. Accuracy of six commercially available systems for identification of members of Family Vibrionaceae. J. Clin. Microbiol. 2003:5654-5659.

Saini A. et al. Discrepancies in identification of Vibrio cholerae strains as members of Aeromonadaceae and Enterobacteriaceae by automated microbial identification system. Lett. Appl. Microbiol. 2012;55:22-26. Accesado en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22502586

Por lo anterior y tomando en cuenta que la mayoría de los laboratorios

del país están empleando métodos automatizados o miniaturizados:

SE SOLICITA QUE:

.

Identificación bioquímica de Vibrio cholerae

* O’Hara, CM. et al. Accuracy of six commercially available systems for identification of members of Family Vibrionaceae. J. Clin. Microbiol. 2003:5654-5659.

Saini A. et al. Discrepancies in identification of Vibrio cholerae strains as members of Aeromonadaceae and Enterobacteriaceae by automated microbial identification system. Lett. Appl. Microbiol. 2012;55:22-26. Accesado en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22502586

Todo aislamiento de Vibrio, Aeromonas o Plesiomonas,

realizado en cualquier laboratorio clínico del país, que utilice

VITEC, MicroScan o API debe ser referido de inmediato al

CNRB-INCIENSA, a fin de realizar la confirmación

correspondiente por los métodos convencionales

Importante:

Para los laboratorios que emplean equipos automatizados y

miniaturizados de identificación bacteriana, es fundamental que sigan las

instrucciones del fabricante, por ejemplo:

Se debe tomar en cuenta que los vibrios son bacterias que tienden a

formar grumos, difíciles de homogenizar, por lo que en la preparación

del inóculo para las pruebas de identificación y de sensibilidad a los

antibióticos se requiere de especial cuidado.

En el caso de los laboratorios que emplean API 20E, el inóculo

bacteriano se debe preparar en solución salina 0.85%.

Para los que emplean Microscan, el panel debe ser hidratado con el

Prompt y separadamente preparar una suspensión de la bacteria 0,5

Mc Farland en solución salina 0,85%. Posteriormente, inocular

manualmente 50 µl de esta suspensión en cada uno de los pocillos.

Para una correcta identificación pueden requerir de la realización de

pruebas complementarias, para lo que se recomienda revisar los

manuales de los equipos.

Identificación bioquímica de Vibrio cholerae

Determinación de serogrupo y serotipo

• Antígeno: puro, cultivo fresco y de

medios no selectivos

• No auto aglutina

• Opciones cuando autoaglutina

• Antisueros de calidad

Experiencia en el uso de pruebas rápidas

como apoyo al diagnóstico del cólera en Costa Rica

http://www.inciensa.sa.cr/ensenanza/ensenanza_documentos/taller_colera/pruebas%20rapidas%20para%20el%20diagnostico%20del%20colera/Validacion%20prueba%20rapida%20CHOLERA%20SMART%20%20CR%202004.pdf

Motilidad de Vibrio cholerae

40 X

100 X

Motilidad en dardo: En un campo 100x se pueden observar bacterias que cruzan el campo de un extremo al otro, esta motilidad es característica de los miembros de la familia Vibrionaceae.

Movimiento

browniano Otros tipos de movimiento

(Salmonella)

http://www.inciensa.sa.cr/vigilancia_epidemiologica/Observacion_vibrio%20cholerae.aspx

En el link a continuación puede acceder los videos sobre la movilidad de Vibrio cholerae y otras bacterias:

Flujograma para el uso de pruebas rápidas

como apoyo al diagnóstico del cólera en los

laboratorios del nivel local *

Con la estrategia propuesta (observación de motilidad + prueba

rápida):

Es posible aumentar la especificidad y sensibilidad de las pruebas

rápidas

Establecer el diagnóstico del cólera en un tiempo menor que

empleando el cultivo

Recurso accesible para ser utilizado en la vigilancia del cólera, aún

en países en vías de desarrollo.

El uso de pruebas rápidas no excluye la realización del cultivo.

* Fundamentado en la experiencia de Costa Rica en el uso de estas pruebas: Bolaños H. et al. 2004.

Desempeño de los sistemas Cholera-SMART y Pathogen Detection Kit en el diagnóstico del cólera.

Rev. Panam. Salud Pública 16:233-241.

= Coprocultivo

Sensibilidad ≥107 ufc / ml

http://www.inciensa.sa.cr/vigilancia_epidemiologica/Observacion_vibrio%20cholerae.aspx

Ver video movilidad

Tiempo necesario para establecer el diagnóstico de V. cholerae O1

por cultivo y mediante pruebas rápida de Cholera SMART

Bolaños H. et al. 2004. Desempeño de los sistemas Cholera-SMART y Pathogen Detection Kit en el

diagnóstico del cólera. Rev. Panam. Salud Pública 16:233-241.

Tipo de muestra Tiempo requerido para establecer el diagnóstico

Cultivo Prueba rápida

Heces “agua de arroz” y líquidas sin moco 18 – 24 horas 15 minutos

Hisopados, heces semiformadas, heces con moco

y sangre, contenido intestinal post-mortem

24 – 48 horas 6 horas

Heces o hisopados de personas tratadas con

antibióticos antes de la obtención de la muestra

y de asintomáticos

24 – 48 horas 18 horas

http://www.inciensa.sa.cr/ensenanza/ensenanza_documentos/taller_colera/pruebas%20rapidas%20para%20el%20diagnostico%20del%20colera/CHOLERA%20O1%20SMARTTM%20II%20-%20prueba%20rapida%20(traduccion%20panfleto).pdf

Diagnóstico serológico del cólera

• Tipos

• Anticuerpos vibriocidas (bactericidas) dirigidos contra antígeno “O” )

• Antitoxina (cruzan con otras toxinas), dirigidos contra toxina CT

• Usos:

• Exposición previa al cólera

• Circulación silenciosa del agente

• Grado de avance de una epidemia

• Diseminación de la enfermedad

(se requiere de suero agudo y convalesciente)

Insumos requeridos

DESCRIPCION

Costo unitario $ (aproximado)

Medio de transporte Cary Blair (caja de 50 unidades). Incluir certificado de control de calidad del lote que se está entregando. (Fecha de vencimiento no menor a un año al momento de ingreso al laboratorio). Catálogo BBL 220097

45

Prueba rápida para diagnóstico del cólera – CHOLERA SMART II, caja para 25 determinaciones (Fecha de vencimiento no menor a 1 año al momento de ingreso al laboratorio). Catálogo New Horizons 89-113225

250 *

Agua peptona alcalina, caldo para enriquecimiento de Vibrio spp. Presentación 500 gramos. Incluir certificado de control de calidad del lote que se está entregando. (Fecha de vencimiento no menor a un año al momento de ingreso al laboratorio). Catálogo Sigma A0340- 500G u Oxoid 1028B

120

Agar TCBS, presentación 500 gramos. Incluir certificado de control de calidad del lote que se está entregando (Fecha de vencimiento no menor a un año al momento de ingreso al laboratorio). Catalogo OXOID CM0333B

120

Tiras de Oxidasa Microbact. Presentación de 50 tiras. (Fecha de vencimiento no menor a un año al momento de ingreso al laboratorio). Catálogo Oxoid MB0266A

50

Deoxycolato de sodio (C24H39NaO4) >= 97% (titulación). Presentación en frasco de 25 gramos. Debe incluir ficha de seguridad. (Fecha de vencimiento no menor a un año al momento de ingreso al laboratorio). Catálogo Sigma-Aldrich D6750-25G

40 **

Antisuero polivalente, Vibrio cholerae O1. Presentación 2 ml. (Fecha de vencimiento no menor a un año al momento de ingreso al laboratorio). Incluir certificado de control de calidad del lote que se está entregando. Catálogo Denka 293831

165

…..Gracias!!