Implementação de um método para determinação de arsénio em ...

Implementação de um método para determinação de

arsénio em pescado por espectroscopia de absorção

atómica na câmara de grafite

Gonçalo Miguel Duarte Pereira

Dissertação para obtenção do grau de mestre em

Engenharia Biológica

Orientadores:

Prof. Margarida Maria Portela dos Santos Romão

Dr. Vera Cristina Calção Canelas

Júri

Presidente: Prof. Marília Clemente Velez Mateus

Orientadores:

Dr. Vera Cristina Calção Canelas

Vogais:

Dr. Maria Ascensão Rebelo Trancoso

Novembro 2018

2

Abstract

The present work intended to implement a method for the determination of arsenic by graphite

furnace atomic absorption spectroscopy in fish and fish products.

The process can be divided in two steps in which some parameters had to be manipulated and

optimized. The first step consists of digesting the solid samples and extracting the arsenic into a liquid

solution. The best results were found when weighing 0,75g of sample and using a final volume of 50 ml.

The samples were digested with 5 ml of HNO3 and 3 ml de H2O2 in a microwave oven using the following

program: 3 min at 300 W, 1 min of rest, 4 min at 500 W, 3 min at 650 W and 3 min at 900 W. The second

step consists of the actual determination of the arsenic concentration by atomic absorption. Magnesium

nitrate and palladium nitrate were used as matrix modifiers. The working wavelength was 193,7 nm, the

slit width was 0,7 nm, the signal corresponds to the peak area and the number of reads per sample was

tow.

Sixteen samples of fish and fishmeal were analyzed with the purpose of finding the percentage

of recovery after establishing the parameters related to the sample digestion step. After discarding some

anomalous results that were produced by some peculiar samples, the percentage of recovery was

estimated to be 101% with a standard deviation of 13,7%. The lowest limit of quantification achieved

experimentally was 0,70 mg/kg wet weight. The theoretical limits of detection and quantification obtained

are respectively 0,04 mg/kg and 0,10 mg/kg. The estimated intermediate precision is 14,7%. The

methods uncertainty is 11,7%.

Key words: arsenic, fish, graphite furnace atomic absorption, method validation

3

Resumo

O presente estudo teve como objetivo, a implementação de um método para determinação de

arsénio em pescado por espetroscopia de absorção atómica em câmara de grafite. Para tal foi

necessário manipular e otimizar vários parâmetros do processo que se divide em dois passos principais.

Após vários ensaios concluiu-se que os melhores resultados foram obtidos, no passo de

digestão das amostras sólidas e extração de arsénio, com uma toma de 0,75 g, um volume final de 50

ml e utilizando na digestão 5 ml de HNO3 e 3 ml de H2O2. As amostras foram digeridas em forno micro-

ondas segundo o seguinte programa de potência: 3 min a 300 W, 1 min de repouso, 4 min a 500 W, 3

min a 650 W e 3 min a 900 W.

No passo de determinação de concentração de arsénio por espetroscopia de absorção atómica

foram utilizados nitrato de paládio e nitrato de magnésio como modificadores de matriz. O comprimento

de onda utilizado foi 193,7 nm, a largura da fenda foi 0,7 nm, o sinal medido corresponde á área do

pico, e foram feitos dois replicados.

Após se definirem os parâmetros relacionados com a digestão de amostras, foram realizadas

análises de 16 amostras sendo a recuperação média, após a eliminação de resultados anómalos

correspondentes a amostras particulares, 101% com um desvio padrão de 13,7%. O limite de

quantificação menor atingido experimentalmente foi de 0,70 mg/kg peso húmido. Os limites de deteção

e quantificação obtidos teoricamente são respetivamente 0,04 mg/kg e 0,10 mg/kg. Estimou-se uma

precisão intermédia de 14,72%. A incerteza estimada para o método é 11,7%.

Palavras-chave: arsénio, absorção atómica em camara de grafite, validação de método, pescado

4

Agradecimentos

O desenvolvimento desta dissertação foi um processo complexo e repleto de impasses que por

vezes pareceram impossíveis de ultrapassar desde o início até ao final. Com empenho, persistência e

algum apoio, os obstáculos foram sendo ultrapassados e os objetivos alcançados.

Agradeço à minha família e amigos, aos meus pais e irmã que me apoiam diariamente.

Agradeço à minha falecida avó que tinha como desejo viver até que o neto se formasse engenheiro.

Agradeço à professora Margarida Romão por ter aceite a posição de orientadora interna, pela

disponibilidade demonstrada e pelos conselhos essenciais para resolver alguns problemas com que

me deparei.

Agradeço à doutora Vera Canelas por ter desempenhado o papel de orientadora externa e por

me ter auxiliado sempre que possível apesar de estar constantemente sobrecarregada de trabalho e

responsabilidades.

Agradeço à engenheira Mónica Antunes por ter tido a disponibilidade de me receber e por me

ter presenteado com a oportunidade de realizar o estágio a dissertação da tese de mestrado no

laboratório de química da SGS Portugal SA.

Finalmente, agradeço a toda a equipa de colaboradores do laboratório de química da SGS

Portugal SA por me terem recebido de braços abertos e por terem tornado este estágio numa

experiência mais agradável, interessante e enriquecedora.

5

Índice

Abstract.................................................................................................................................................... 2

Resumo ................................................................................................................................................... 3

Agradecimentos ....................................................................................................................................... 4

Índice ....................................................................................................................................................... 5

Lista de figuras ........................................................................................................................................ 7

Lista de Tabelas ....................................................................................................................................... 8

Lista de Abreviaturas .............................................................................................................................. 11

1 Introdução ........................................................................................................................................... 13

1.1 Motivação ........................................................................................................................................ 13

1.2 Objetivos .......................................................................................................................................... 15

2 Metais tóxicos ..................................................................................................................................... 15

2.1 Análise de arsénio ........................................................................................................................... 16

2.2 Espectroscopia de absorção atómica ............................................................................................. 17

2.2.1 Fonte de radiação em espectroscopia de absorção atómica....................................................... 18

2.2.2 Espectroscopia de absorção atómica na câmara de grafite ........................................................ 19

2.2.3 Modificadores de matriz em espectroscopia de absorção atómica na câmara de grafite ........... 20

2.3 Espectroscopia de absorção atómica com geração hidretos vs Espectroscopia de absorção

atómica na câmara de grafite ................................................................................................................ 21

2.4 Digestão de amostras...................................................................................................................... 22

3 Validação de métodos ........................................................................................................................ 22

3.1 Seletividade e especificidade .......................................................................................................... 23

3.2 Linearidade e gama de trabalho ...................................................................................................... 24

3.3 Precisão e exatidão ......................................................................................................................... 25

3.4 Limites de deteção e quantificação ................................................................................................. 25

3.5 Cartas de controlo ........................................................................................................................... 26

4 Parte experimental ............................................................................................................................. 27

4.1 Preparação de amostras ................................................................................................................. 27

6

4.2 Digestão de amostras...................................................................................................................... 28

4.3 Determinação da concentração de arsénio..................................................................................... 28

4.4 Espectro de absorção...................................................................................................................... 29

5. Resultados ......................................................................................................................................... 31

5.1 Determinação do LQ experimental .................................................................................................. 33

5.2 Análise de brancos, Limite de deteção e limite de quantificação .................................................... 36

5.3 Padrões de controlo e homogeneidade de variância ...................................................................... 37

5.4 Análise de ensaios de recuperação ................................................................................................ 41

5.5 Análise de duplicados ...................................................................................................................... 43

5.6 Controlo da sensibilidade ................................................................................................................ 44

5.7 Repetibilidade e precisão intermédia .............................................................................................. 46

5.8 Exatidão ........................................................................................................................................... 49

5.9 Incertezas ........................................................................................................................................ 50

6 Trabalho futuro ................................................................................................................................... 52

7 Conclusão ........................................................................................................................................... 53

8 Referências Bibliográficas .................................................................................................................. 54

9 Anexos ................................................................................................................................................ 56

9.1 Resultados preliminares .................................................................................................................. 56

9.2 Análise de “farinha de peixe” e método de adição padrão .............................................................. 65

9.3 Análise pontual de “farinha de bebé” ............................................................................................... 71

7

Lista de figuras

Figura 1- programa de temperaturas utilizado no espetrofotómetro de absorção atómica durante todos

os ensaios.............................................................................................................................................. 29

Figura 2- programa de temperaturas utilizado no espetrofotómetro de absorção atómica otimizado para

deteção de arsénio ................................................................................................................................ 30

Figura 3- espectro de absorção atómica obtido com recurso á curva de temperatura utilizada durante

os ensaios.............................................................................................................................................. 30

Figura 4- espectro de absorção atómica obtido com recurso á curva de temperatura otimizada para a

deteção de arsénio ................................................................................................................................ 31

Figura 5- carta de controlo do padrão de arsénio de concentração 10 µg/L. A linha azµl representa a

média, as linhas verdes representam a média ± 2S (limites de alerta) e as linhas vermelhas representam

a média ± 3S (limites de controlo) ......................................................................................................... 40

Figura 6- carta de controlo do padrão de arsénio de concentração 50 µg/L. A linha azµl representa a

média, as linhas verdes representam a média ± 2S (limites de alerta) e as linhas vermelhas representam

a média ± 3S (limites de controlo) ......................................................................................................... 41

Figura 7- carta de controlo de sensibilidade com declive das curvas de calibração no eixo das

ordenadas e data de obtenção da curva no eixo das abcissas. As linhas verdes correspondem á média

±2S (linhas de alarme) .......................................................................................................................... 45

8

Lista de Tabelas

Tabela 1- condições de potência aplicadas na digestão de amostras em forno micro-ondas .............. 32

Tabela 2- resultados do ensaio realizado a 18/06/2018 com o objetivo de calcular a recuperação de

arsénio em que a toma foi de 0,75g e o volume final 50 ml .................................................................. 32

Tabela 3- resultados do ensaio realizado a 20/06/2018 com o objetivo de calcular a recuperação de

arsénio em que se fizeram tomas de 0,75 g e 1 g para um volume final de 50 ml ............................... 33

Tabela 4- resultados do ensaio realizado a 21/06/2018 em que a toma foi de 0,75 g e o volume final 50

ml obtidos nos dias 21, 22 e 26 de junho de 2018 ................................................................................ 34

Tabela 5- concentrações obtidas nos dias 21, 22 e 26 de junho de 2018 para os padrões de controlo

preparados a 21/06/2018 ...................................................................................................................... 34

Tabela 6- resultados do ensaio realizado a 27/06/2018 em que a toma foi de 0,75 g e o volume final 50

ml ........................................................................................................................................................... 35

Tabela 7- resultados dos ensaios com objetivo de determinação experimental do limite de quantificação

............................................................................................................................................................... 36

Tabela 8- carta de controlo de brancos- concentrações dos ensaios brancos em g/L. ...................... 37

Tabela 9- concentrações do padrão de arsénio de concentração 10 µg/L para determinação da

homogeneidade de variância ................................................................................................................ 38

Tabela 10- concentrações do padrão de arsénio de concentração 50 µg/L para determinação da

homogeneidade de variância ................................................................................................................ 38

Tabela 11- controlo da concentração do padrão de arsénio de concentração 10 µg/L ........................ 39

Tabela 12- controlo da concentração do padrão de arsénio de concentração 50 µg/L ........................ 40

Tabela 13- resultados dos ensaios de recuperação .............................................................................. 42

Tabela 14- resultados comparativos das amostras e seus duplicados ................................................. 43

Tabela 15- controlo de sensibilidade. Registo do coeficiente correlação e declive das curvas de

calibração, média dos declives até ao respetivo dia e média do declive ± 2 variância ....................... 45

Tabela 16- 10 leituras de concentração em 3 amostras que representam matrizes diferentes, farinha de

peixe, pescado e vegetais para determinação da repetibilidade do método ........................................ 46

Tabela 17- 15 leituras de concentração em 3 amostras que representam matrizes diferentes, farinha de

peixe, pescado e vegetais para determinação da repetibilidade do método ........................................ 47

Tabela 18- coeficiente de variação em função da concentração de analito ......................................... 48

Tabela 19 resultados de ensaios de recuperação com concentrações distribuídas ao longo da gama de

trabalho para cálculo da exatidão do método ....................................................................................... 49

9

Tabela 20- Recuperação do analito em função da concentração ......................................................... 50

Tabela 21- cálculo da incerteza combinada no LQ e na gama de trabalho com passe no desvio padrão

dos padrões de controlo de duplicados ................................................................................................. 51

TabelaA 1- resultados do ensaio realizado a 09/05/2018 com o objetivo de calcular a recuperação de

arsénio e a precisão em que a toma foi de 0,25 g e o volume final 50 ml ............................................ 56


arsénio e a precisão em que a toma foi 0,25 g e o volume final 20 ml ................................................. 57

TabelaA 3- resultados do primeiro ensaio realizado a 14/05/2018 com o objetivo de calcular a

recuperação de arsénio e a precisão em que a toma foi 1 g e o volume final 20 ml ............................ 58

TabelaA 4- resultados do segundo ensaio realizado a 14/05/2018 com o objetivo de calcular a



arsénio e a precisão em que a toma foi 1 g e o volume final 10 ml ...................................................... 59








arsénio e a precisão em que a toma foi 0,25 g e o volume final 10 ml ................................................. 61

TabelaA 10- concentrações obtidas na leitura dos padrões de controlo a 11/06/2018 ......................... 61


recuperação de arsénio e a precisão em que a toma foi 0,25 g e o volume final 50 ml ....................... 62

TabelaA 12- concentrações obtidas na leitura dos padrões de controlo a 12/06/2018 ........................ 62


recuperação de arsénio e a precisão em que a toma foi 0,25 g e o volume final 50 ml ....................... 63

TabelaA 14- concentrações obtidas na leitura dos padrões de controlo a 12/06/2018 ........................ 63


recuperação de arsénio e a precisão em que a toma foi de 1 g e o volume final 50 ml ....................... 64


arsénio e a precisão em que a toma foi de 0,5 g e o volume final 50 ml .............................................. 64

10



TabelaA 18- volumes em µl de solução de arsénio 103ppb e de solução de farinha de peixe 0,1g/ml

utilizados para obtenção de cada padrão de calibração utilizado na obtenção da reta de calibração no

espetrofotómetro de absorção atómica ................................................................................................. 66

TabelaA 19- concentração definida para cada padrão de calibração e respetivas concentrações obtidas,

com a primeira abordagem de adição padrão, por leitura no espetrofotómetro de absorção atómica 66

TabelaA 20- volumes em µl de solução de arsénio 103ppb, solução de diluição e de solução de farinha

de peixe 0,1g/ml utilizados para obtenção de cada padrão de calibração utilizado na obtenção da reta

de calibração no espetrofotómetro de absorção atómica ..................................................................... 67


com a segunda abordagem de adição padrão, por leitura no espetrofotómetro de absorção atómica 67

TabelaA 22- volumes em µl de solução de arsénio 103ppb e volumes em ml de água e de solução de

farinha de peixe 0,1g/ml utilizados para obtenção de cada padrão de calibração utilizado na obtenção

da reta de calibração no espetrofotómetro de absorção atómica ......................................................... 68


com a abordagem de diluição manual de adição padrão, por leitura no espetrofotómetro de absorção

atómica .................................................................................................................................................. 69


com a abordagem de diluição manual de adição padrão, por leitura no espetrofotómetro de absorção

atómica segundo a reta de calibração com os pontos: 10, 25, 50, 75 e 100 µg/L, declive 0,00273 e

coeficiente de correlação 0,997966 ...................................................................................................... 69


arsénio e a precisão em que a toma foi de 0,75g e o volume final 50 ml ............................................. 70


arsénio e a precisão numa amostra de “farinha de bebé” .................................................................... 71


arsénio numa amostra de “farinha de bebé” ......................................................................................... 72

11

Lista de Abreviaturas

NAA Neutron activation analysis

HPLC

ICP

AES

MS

High-performance liquid chromatography

Inductively coupled plasma

Atomic emission spectroscopy

Mass spectrometry

HG

FAAS

ETAAS

FIAS

GF

LD

LQ

S

R

PI

EDL

Hydride generation

Flame atomic absorption spectroscopy

Electrothermal atomic absorption spectroscopy

Flow injection automatic system

Graphite furnace

Limite de deteção

Limite de quantificação

Sinal

Ruído

Precisão intermedia

Electrode-less discharge lamp

13

1 Introdução

1.1 Motivação

Arsénio (As) é um metaloide, ou semimetal, que surge em alguns minerais, normalmente agrupado

com enxofre ou metais e também puro como cristal. O arsénio metálico é principalmente utilizado em

ligas de chumbo utilizadas em baterias de automóveis e munições. Os compostos de arsénio como, o

trióxido de arsénio, são utilizados em pesticidas, herbicidas, inseticidas e tratamento de madeiras

devido á sua toxicidade para insetos, bactérias e fungos. Outras fontes de arsénio podem ser vinho,

tabaco ou qualquer produto de origem vegetal que tenha sido pulverizado com pesticidas que

contenham arsénio. Alguns processos industriais que também levam á libertação de arsénio são a

remoção de enxofre de gases industriais, queima de combustíveis fósseis, queima de madeiras tratadas

com preservantes contendo arsénio, construção de dispositivos eletrónicos, endurecimento de ligas

metálicas, preservação de peles de animais, clarificação de vidros e cerâmicas[1].

A solubilidade de arsénio em água é 20 g/l (a 25°C), o que faz com que os seus níveis sejam

consideravelmente mais elevados em ambientes aquáticos do que em ambientes terrestres[2].

Os organismos aquáticos possuem a capacidade de acumular arsénio do ambiente que os rodeia,

o que torna o pescado uma fonte de arsénio para as espécies que se encontram acima destes na

cadeia alimentar, nomeadamente os humanos[3].

Arsénio pode ser encontrado sob formas orgânicas e inorgânicas, apresentando quatro estados de

oxidação: arsenato (+5), arsenito (+3), arsina (-3) e a forma elementar (0). No entanto, as espécies

solúveis geralmente ocorrem nos estados de oxidação +3 e +5. As toxicidades dos compostos de

arsénio diminuem na seguinte ordem: arsina (-3), derivados orgânicos de arsina, arsénio inorgânico

(+3), arsénio orgânico (+3), arsénio inorgânico (+5), arsénio orgânico (+5), compostos de arsénio e

arsénio elementar[4].

A toxicidade em mamíferos varia ainda de acordo com o estado físico, a solubilidade, a dimensão

das partículas, taxas de absorção e eliminação e presença de impurezas. Geralmente, as formas

inorgânicas têm maior toxicidade, no entanto estudos em animais demonstraram que metil-arsenato e

fenil-arsenato podem levar a efeitos semelhantes aos gerados pelas formas inorgânicas de arsénio.

As(III) é mais tóxico do que As(V) devido á sua maior absorção celular porém, se as concentrações

intracelulares forem iguais, As(III) e As(V) apresentam a mesma toxicidade. Arsénio metaloide,

normalmente, não é considerado venenoso pois não é solúvel em água nem em fluidos corporais. O

composto de arsénio mais tóxico, a Arsina (AsH3) no estado gasoso, é utilizado na indústria da

microeletrónica e pode ser também encontrado em processos metalúrgicos e de exploração mineira[5].

14

Os compostos de arsénio são classificados como carcinogéneos de Grupo 1 para humanos, pela

agência internacional de investigação sobre cancro[6].

Arsénio pode provocar alterações a nível genético e está relacionado com alguns tipos de cancro,

incluindo pele, pulmões, fígado e baço[1][7].

Um dos motivos para a sua toxicidade provém de o arsénio se ligar ao grupo sulfidrilo, de proteínas

DNA-binding, interrompendo o mecanismo de replicação de DNA[1]. Adicionalmente, são conhecidos

dois mecanismos de toxicidade de arsénio que afetam a respiração. O arsénio, principalmente As(III),

liga-se a grupos sulfidrilo quebrando as enzimas que contêm estes grupos, resultando na inibição das

vias de oxidação de piruvato e succinato e do ciclo dos ácidos tricarboxílicos, prejudicando a

gliconeogénese e diminuindo a fosforilação oxidativa. Outro mecanismo envolve a substituição de

fósforo por As(V) em diversas reações bioquímicas. Esta substituição origina a hidrólise rápida de

ligações de alta energia em moléculas como ATP. O envenenamento por gás de Arsina provoca efeitos

diferentes dos descritos. Após a inalação, a arsina fixa-se aos glóbulos vermelhos, provocando danos

irreversíveis na membrana celular.

A união europeia carece de legislação que defina limites de concentração de arsénio em pescado,

que será a principal fonte deste semimetal para humanos. Porém, existe legislação relativa a outros

tipos de alimentos. O REGULAMENTO TÉCNICO MERCOSUL SOBRE LIMITES MÁXIMOS DE

CONTAMINANTES INORGÂNICOS EM ALIMENTOS, aprovado pela Resolução-RDC nº 42, de 29 de

agosto de 2013 estabelece os teores máximos de arsénio, na forma inorgânica, permitidos em produtos

cárneos sendo que os limites variam entre 0,10 e 1,00 mg/kg. O REGULAMENTO (UE) N.o 1275/2013

DA COMISSÃO de 6 de dezembro de 2013 estabelece os teores máximos de arsénio total em alguns

alimentos para animais sendo que os limites variam entre 2 e 100 mg/kg com um teor de humidade de

12%. O REGULAMENTO (UE) 2015/1006 DA COMISSÃO de 25 de junho de 2015 define teores

máximos de arsénio na forma inorgânica em arroz e em produtos derivados de arroz, estando estes

limites entre 0,10 e 0,20 mg/kg.

Devido á toxicidade elevada de arsénio e seus compostos para os seres vivos, torna-se importante

definir e fiscalizar limites para as concentrações de arsénio, em pescado, de modo a garantir que os

níveis de exposição a que a população está sujeita não são prejudiciais.

15

1.2 Objetivos

A presente dissertação tem como objetivo principal a implementação de um método de

determinação de arsénio em pescado por espectroscopia de absorção atómica na câmara de grafite.

O laboratório atualmente possui métodos acreditados para a determinação de outros metais pesados,

sendo estes, cádmio, chumbo e mercúrio. O objetivo desta dissertação é munir o laboratório com um

método que permita realizar as análises a arsénio de forma a não ser necessário subcontratar as

análises referidas a laboratórios de outras empresas.

Para tal será necessário manipular e otimizar vários parâmetros do processo que se divide em dois

passos principais. O primeiro passo consiste na digestão das amostras sólidas, em vaso fechado em

forno micro-ondas, obtendo-se uma solução no final da digestão. O segundo passo consiste na leitura

e determinação da concentração de arsénio por espectroscopia de absorção atómica na câmara de

grafite. Na fase de digestão, os parâmetros a manipular são a toma, quais os reagentes utilizados na

digestão e seus respetivos volumes, o programa de potência a ser aplicada na digestão e o volume

final onde a amostra será depositada. Na fase de leitura alguns dos parâmetros a ser manipulados são

o volume de solução de amostra, a presença ou ausência de modificadores de matriz, as suas

concentrações e volumes e programa de temperaturas.

2 Metais tóxicos

Metais e semimetais são frequentemente substâncias tóxicas, parte deles não apresenta

propriedades organoléticas (cheiro, sabor, cor) e provocam sintomas semelhantes aos de diversas

doenças, o que faz com que raramente seja considerada a suspeita de intoxicação[8].

No passado, arsénio era obtido na fundição do cobre e estanho e usado como elemento decorativo

de túmulos egípcios. Apesar do arsénio ser utilizado historicamente, muitos dos metais com importância

toxicológica nos nossos dias são conhecidos do homem há relativamente pouco tempo. Cerca de 80

dos 105 elementos da tabela periódica são considerados metais, porém menos de 30 foram

identificados como substâncias tóxicas para o homem[9]. Os metais, ou semimetais, mais comumente

associados a intoxicações são o arsénio, antimónio, chumbo, lítio, mercúrio e tálio[8].

Algumas substâncias deste grupo, como o arsénio, sofrem uma extensa metabolização após serem

ingeridas. Estes fatores são de elevada relevância nas investigações analíticas aplicadas a amostras

biológicas e na sua interpretação. A colheita das amostras deve ser efetuada com extremo cuidado,

bem como a seleção das análises toxicológicas. Os métodos de análise de metais mais vulgarmente

usados são os colorimétricos, eletroquímicos, a espectrofotometria eletrotérmica de absorção atómica,

a espectrofotometria de emissão com fonte de plasma acoplado indutivamente e a espectrometria de

massa com fonte de plasma acoplado indutivamente [8]. A investigação da exposição crónica a metais

tóxicos deve revestir-se de grandes cuidados relativamente ao controlo da precisão e exatidão dos

16

resultados analíticos. Deve recorrer-se a materiais que permitam controlar de qualidade interna dos

resultados, assim como participar em ensaios inter-laboratoriais para controlo externo dos resultados.

2.1 Análise de arsénio

A determinação de arsénio pode ser feita recorrendo a métodos diversos. A análise por ativação

neutrónica (NAA- Neutron activation analysis) permite a quantificação de arsénio ao nível dos ng/g.

Esta técnica, contudo, é limitada em Portugal devido a apenas existir um reator nuclear que é

necessário para a irradiação das amostras[10]. As técnicas de espectroscopia de absorção atómica

(chama, câmara de grafite, geração de hidretos, vapores frios) permitem determinar mais de 60

elementos entre os quais se encontra o metaloide de arsénio[10]. A combinação HPLC-ICP-AES (High

performance liquid chromatography - ICP-AES) tem sido útil na especiação de arsénio. A técnica ICP-

MS (Inductively coupled plasma mass spectrometry) tem maior sensibilidade e já demonstrou

aplicabilidade em várias matrizes biológicas (ossos, peixe e marisco, alimentos, plasma/soro, sangue,

tecidos). Com este método, é necessário considerar a possibilidade de existirem interferências

espectrais devido à presença de 40Ar35Cl. Em algumas amostras justifica-se a remoção do cloro por

precipitação sob a forma de cloreto de prata. A técnica HG-ICP-MS (Hydride generation-ICP-MS)

permite atingir limites de deteção muito baixos. A combinação do ICP-MS com cromatografia iónica e

HPLC tem originado resultados satisfatórios em estudos de especiação do arsénio. A técnica FAAS

(Flame atomic absorption spectrometry) não se adequa á determinação de arsénio devido à grande

absorção de fundo e perdas por volatilização.

A técnica HG-AAS (Hydride generation atomic absorption spectrometry) é uma das melhores

técnicas para a análise vestigial de arsénio[11], pois, apresenta vantagens como a

separação/enriquecimento online, a automatização através da aplicação de sistemas de injeção e fluxo

contínuo (FIAS - Flow injection automatic system), a rapidez na análise das amostras e a possibilidade

de efetuar estudos de especiação. No entanto, este ensaio envolve processos químicos complexos,

sendo muito suscetível a várias fontes de erro[10] devido a: pré-tratamento da amostra; comportamento

diferente das diferentes espécies de arsénio – As3+, As5+; interferências. A partir de soluções contendo

arsénio inorgânico trivalente – As(III) ou As3+, AsO33-, AsO2

- e outras espécies hidrolisadas ou

complexadas, produz-se arsina (AsH3) com elevado rendimento numa ampla gama de pH. Usualmente

as concentrações de ácido clorídrico encontram-se entre 0,5 e 2M. Um aumento de acidez seria

benéfico para o controlo de interferências e maior rapidez na pré-redução do As(V) a As(III). É, no

entanto, impraticável utilizar concentrações superiores a 5-6M de HCl devido à obtenção de brancos

de reagentes com leituras elevadas de absorbância, ao elevado consumo de reagentes, e à maior

corrosão de todo o equipamento analítico. O arsénio inorgânico pentavalente ou As(V) é um dos

estados de oxidação típicos deste analito. Esta espécie forma arsina muito mais lentamente e apenas

na presença de concentrações de ácido clorídrico superiores a 0,1M. Adicionalmente, o sinal produzido

por esta espécie é inferior ao produzido pelo As(III) pelo que, a maioria dos procedimentos na técnica

HG-AAS se baseiam na medição de As(III), a espécie que produz um maior sinal, envolvendo sempre

17

um passo de pré-redução de arsenato a arsenito. Salienta-se ainda o facto de a aplicação da técnica

de geração de hidretos ao arsénio pentavalente ser mais suscetível a interferências. A pré-redução do

analito ao estado trivalente demora cerca de 1 hora, sendo muito afetada quanto à rapidez, extensão

da redução e estabilidade das soluções pela presença de resíduos de agentes oxidantes e da matriz.

Apresentam-se, em seguida, os agentes de pré-redução mais eficientes[10]: KI-ácido ascórbico-HCl

diluído; L-cisteína; KI-tiouréia-HCl diluído; Tiouréia-ácido ascórbico; KI-tiouréia-ácido ascórbico;

NH2OH.HCl-KI-HCl diluído; NH2OH.HCl-KI-ácido oxálico.

A pré-redução online é cada vez mais vulgar devido aos sistemas de fluxo contínuo e fluxo de

injeção automáticos. A concentração do agente redutor não tem grande influência neste analito. As

soluções redutoras de menor concentração, são preferíveis para facilitar o controlo das interferências

da fase líquida e obtenção de brancos de reagentes com leituras de absorbância inferiores. Para que

estas soluções se mantenham estáveis devem ser ligeiramente alcalinizadas (0,05 a 1% m/v NaOH).

Para além de algumas possíveis interferências, uma outra fonte de erro comum nas determinações de

arsénio é a subestimativa do arsénio orgânico. Neste caso, o uso do método adição padrão é totalmente

ineficiente, aconselhando-se o uso da correção de background cada vez que se estuda uma nova matriz

ou se aplica um novo procedimento.

2.2 Espectroscopia de absorção atómica

Como referido anteriormente, as técnicas de espectroscopia de absorção atómica permitem

determinar mais de 60 elementos entre os quais se encontra o metaloide arsénio[10] e a sensibilidade

destes métodos atinge concentrações na ordem de ppm (partes por milhão) até ppb (partes por bilião)[8].

A Espectrofotometria de Absorção Atómica é uma técnica adequada a determinações de rotina sem

necessidade de grande formação dos operadores[12]. A grandeza que permite quantificar certo elemento

é a quantidade de radiação absorvida ao comprimento de onda de ressonância do referido elemento.

A radiação absorvida é proporcional ao número de átomos no caminho da luz, esta relação é descrita

pela lei de Beer.

𝐴 = 𝑎𝑏𝑐 (1)

Onde A é a absorvância, uma grandeza adimencional, a é absorbtividade molar da substância, b é a

distância que a luz atravessa, c é a concentração da substância absorvente no meio.

Medindo a quantidade de radiação absorvida é possível determinar quantitativamente o

elemento[12]. A utilização de fontes de luz com um comprimento de onda específico permite determinar

um elemento mesmo que outros estejam presentes.

18

2.2.1 Fonte de radiação em espectroscopia de

absorção atómica

Serão abordados dois tipos de lâmpada utilizados em espetroscopia de absorção atómica: as

lâmpadas de cátodo oco e as lâmpadas de descarga sem elétrodo (EDL)

Uma lâmpada de cátodo oco produz uma linha estreita de alta intensidade ao comprimento de

onda do elemento a determinar. A lâmpada de cátodo oco é composta por um cilindro de vidro

preenchido com um gás inerte a baixa pressão e pelo cátodo do metal a determinar. A linha de emissão

da lâmpada corresponde ao comprimento de onda do elemento a ser analisado. A janela final da

lâmpada é geralmente feita de quartzo ou pirex e transmite as linhas espectrais do elemento a ser

determinado.

A emissão de luz numa lâmpada de cátodo oco envolve os seguintes passos: Pulverização em

que o gás é ionizado quando é aplicada uma diferença de potencial entre o ânodo e o cátodo e os iões

de gás inerte positivamente carregados atingem o cátodo negativamente carregado e desalojam

átomos de metal; Excitação em que os átomos de metal são excitados e colidem com o gás inerte;

Emissão em que luz com o comprimento de onda do metal constituinte do cátodo é emitida quando os

átomos passam do estado excitado para o estado normal.

Lâmpadas de cátodo oco possuem prazo de validade bem como a vida útil definida em

miliamperes. O aumento da corrente aumenta a intensidade da lâmpada, mas a corrente excessiva

reduz a vida útil da lâmpada e também resulta no alargamento da auto absorção, isto é, os átomos na

lâmpada de cátodo oco começam a absorver a luz emitida pela própria lâmpada. Isso leva a uma menor

absorbância e redução na faixa linear da curva de calibração.

As lâmpadas de cátodo oco apresentam algumas limitações: têm um prazo de validade; com a

exceção de lâmpadas de multielementos, é necessário trocar a lâmpada para determinar os diferentes

elementos; a pulverização deposita átomos de metal nos lados e nas janelas das extremidades, o que

afeta a vida útil da lâmpada, principalmente para elementos voláteis; alguns materiais catódicos liberam

hidrogénio no aquecimento, o que contribui para a emissão contínua de fundo.

Para a maioria dos elementos, a lâmpada de cátodo oco é uma fonte de luz satisfatória. No

caso de elementos voláteis, a vida útil reduzida da lâmpada e a baixa intensidade podem ser superadas

pelo uso de lâmpadas de descarga sem elétrodo. Lâmpadas de descarga sem elétrodo estão

comumente disponíveis para Sb, As, Bi, Cd, Cs, Pb, Hg, K, Rb, Sn, Te, etc.

Uma lâmpada EDL é composta por um bolbo de quartzo preenchido com um gás que contém

o elemento ou um sal do elemento ao qual a lâmpada corresponde. O bolbo é colocado dentro de um

cilindro cerâmico no qual a antena de um gerador de RF é enrolada. Quando um campo de RF é

aplicado ao bolbo, o gás inerte é ionizado e a energia acoplada excita os átomos vaporizados dentro

do bolbo e causa a emissão de luz característica. A vantagem principal das lâmpadas EDL são os

19

limites de deteção mais baixos e tempo útil de vida superior quando comparada com uma lâmpada de

cátodo oco do mesmo elemento[13][14].

2.2.2 Espectroscopia de absorção atómica na

câmara de grafite

EAA em câmara de grafite é forma mais comum de EAA com atomização eletrotérmica. Neste

método, o equipamento onde ocorre a atomização é um tubo de grafite. Esta técnica permite utilizar

amostras no estado líquido, de suspensão ou sólido. A amostra é introduzida num forno ou câmara de

grafite, que é submetido a um aquecimento progressivo e adequado para o tipo de matriz da amostra

e analito em questão. A precisão e exatidão dos resultados obtidos por esta técnica são influenciadas

pelo tempo e temperatura programados para cada etapa[7]. O programa de aquecimento divide-se em

quatro etapas distintas: secagem, pirólise, atomização e limpeza[15].

Na etapa de secagem, ocorre a evaporação do solvente resultando num filme sólido de material

depositado na superfície do tubo. Esta deve ser feita de modo suave, a uma temperatura inferior ao

ponto de ebulição do solvente, para evitar projeções da amostra que afetariam a precisão. Podem

utilizar-se dois passos de secagem. A temperatura nesta etapa geralmente encontra-se entre 50 e

200oC. Nesta etapa, um fluxo de gás inerte atravessa o tubo de grafite permitindo uma secagem rápida

e suave da amostra.

Na etapa da pirólise dá-se a mineralização dos componentes da matriz que são separados do

analito. A pirólise deve realizar-se na temperatura máxima que permita evitar perdas de analito.

Normalmente a temperatura encontra-se entre 200 e 1500oC. Nesta etapa, para remover vapores de

constituintes da matriz, também se faz passar um fluxo de gás inerte através do tubo.

Na etapa de atomização ocorre a produção do vapor atómico com recurso a um aquecimento

brusco. A atomização deve ser conduzida à menor temperatura que permita obter a máxima atomização

do elemento a analisar. Normalmente a temperatura encontra-se entre 2000 e 3000oC. Geralmente,

nesta etapa, o fluxo de gás inerte é interrompido, pois este diminui o tempo de residência dos átomos

no tubo de grafite, levando a uma menor sensibilidade do método.

A etapa de limpeza tem como objetivo a eliminação de vapores constituintes da matriz e recorre

novamente à passagem de fluxo de gás inerte. Na limpeza aplica-se uma temperatura superior à da

etapa de atomização para garantir que se elimina a memória do tubo[15].

20

2.2.3 Modificadores de matriz em

espectroscopia de absorção atómica na

câmara de grafite

Os modificadores químicos têm demonstrado bastante influência na diminuição de interferências

em espectrometria de absorção atómica em câmara de grafite. Estes compostos são introduzidos no

tubo de grafite em conjunto com a amostra com o objetivo de reduzir o efeito de matriz[16].

O modificador de matriz converte o analito numa forma com menor volatilidade, permitindo utilizar

temperaturas superiores na etapa de pirólise sem que ocorra perdas. O modificador químico também

pode ter a função de tornar a matriz mais volátil, facilitando a sua remoção. A mistura de Pd com Mg é

das mais utilizadas como modificador de matriz pois possui a capacidade de estabilizar a maioria dos

elementos analisados por GFAAS[17].

Para além de diminuir a volatilidade do analito e/ou aumentar a volatilidade da matriz, um

modificador químico deve ser aplicável a vários elementos, ser puro e não possuir o analito em

concentrações mensuráveis, não diminuir consideravelmente o tempo de vida dos tubos de grafite e

não provocar grande atenuação de fundo em redor do comprimento de onda do analito.

Apesar dos benefícios referidos para a utilização de modificadores de matriz é necessário

considerar possíveis desvantagens. A injeção de um volume elevado de modificador químico pode

provocar efeitos negativos como um alto sinal de fundo, corrosão do tubo de grafite, diminuição da

sensibilidade ou contaminação se o modificador não for de elevada pureza. O tipo de modificador e sua

concentração devem ser otimizados de modo a minimizar os malefícios referidos.

Alguns dos modificadores de matriz mais usuais são Cu, Ni, Pd, Mg(NO3)2 e ácido cítrico. Como já

referido, a mistura de paládio com nitrato de magnésio é frequentemente utlizada por ser adequada a

grande parte dos elementos determinados por esta técnica e é considerada um “modificador

universal”[17]. No entanto, esta mistura demonstra algumas limitações. Não produz os mesmos

resultados para todos os elementos nem para todos os tipos de matrizes e geralmente necessita de

temperaturas de atomização elevadas. Apesar de esta mistura produzir resultados satisfatórios para

vários elementos, é recomendado a utilização de modificadores alternativos para alguns analitos.

21

2.3 Espectroscopia de absorção atómica com

geração hidretos vs Espectroscopia de

absorção atómica na câmara de grafite

Frequentemente recorre-se a espetroscopia de absorção atómica por geração de hidretos (HG-

AAS) na determinação de quantidades vestigiais de arsénio em matrizes diversas[12]. No entanto, este

método consome uma quantidade elevada de reagentes e envolve vários passos na preparação de

padrões e das amostras, o que influencia a precisão e exatidão do método[18].

A espetroscopia de absorção atómica em câmara de grafite (GF-AAS) tem também sido utilizada

com sucesso na determinação de vários metais, quando se consegue diminuir as interferências[19].

HG-AAS é uma técnica exata para a medição de elementos formadores de hidretos em baixas

concentrações. Este método possui as vantagens de ter elevada sensibilidade e elevada tolerância a

interferências devido à separação completa do analito, na forma de hidreto, da matriz durante o passo

de atomização. No entanto, este método requere um processo moroso de preparação dos padrões e

das amostras e utiliza reagentes perigosos.

GF-AAS teve um aumento considerável ao nível da sensibilidade após a introdução de sais de Pd

e Mg como modificadores de matriz. Este método possui um bom limite de deteção para a maioria dos

elementos e necessita normalmente apenas de um volume de amostra igual ou inferior a 20 µl para

realizar a análise[20].

GF-AAS e HG-AAS possuem níveis semelhantes de exatidão e precisão. A principal vantagem de

GF-AAS está relacionada com o pré-tratamento da amostra envolver menos passos. Num estudo

comparativo de GF-AAS e HG-AAS para determinação de arsénio em vários tecidos de frango

observou-se um limite de deteção inferior para GF-AAS e um nível adequado de precisão e exatidão

num material de referência e em amostras de frango quando comparada com HG-AAS[19].

Ambas as técnicas demostram elevada precisão e exatidão na determinação de As. Como tal, GF-

AAS é uma técnica mais simples e igualmente adequada para monitorização regular das concentrações

de arsénio.

22

2.4 Digestão de amostras

O processo de digestão continua a ser otimizado nos dias presentes, pois é um fator fundamental

e a escolha de um processo de digestão inadequado pode resultar na perda do analito, por

contaminação das amostras através de contaminantes provenientes do ar, do material de laboratório,

por adsorção na matéria orgânica residual ou pela utilização de ácidos com pureza insuficiente[21].

Recorre-se a dois tipos de digestão: a digestão húmida e a digestão seca. A digestão seca consiste

na incineração da matéria orgânica recorrendo a temperaturas desde os 450ºC aos 800ºC em vasos

abertos. A digestão seca encontra-se limitada devido à volatilidade das ligações de alguns elementos.

A adição de compostos como óxido de magnésio (MgO) ou nitrato de magnésio (Mg(NO3)2) diminui a

volatilidade dos elementos e diminui o tempo de decomposição da amostra. Devido aos cuidados

necessário, este processo torna-se bastante moroso.

No processo de digestão húmida a matéria orgânica é decomposta aplicando ácidos

concentrados com efeito oxidante. Os ácidos nítrico e sulfúrico são os mais comuns. Esta digestão

pode realizar-se em sistema aberto ou fechado, comumente denominados por digestão húmida em

vaso aberto ou digestão húmida em vaso fechado.

A digestão em vaso aberto encontra-se limitada devido às baixas temperaturas de decomposição

que podem ser atingidas. As temperaturas não podem exceder o ponto de ebulição do ácido ou mistura

de ácidos, utilizados na digestão, à pressão atmosférica. Há que considerar um maior risco de

contaminação, a necessidade de utilizar um maior volume de ácidos e a possível perda de analito

devido à sua volatilidade.

A digestão em vaso fechado diminui o risco de contaminação e perdas de analito causadas pela

volatilidade dos elementos. A digestão com recurso a micro-ondas, geralmente, diminui o tempo de

preparação da amostra e permite alcançar a digestão completa da matéria orgânica. A perda de

elementos e a contaminação da amostra também é menor quando comparada com outros métodos de

digestão.

3 Validação de métodos

Um método de ensaio é um processo que envolve manipulações suscetíveis á acumulação de erros

sendo estes sistemáticos e/ou aleatórios, podendo em algumas situações, afetar de forma significativa

o valor do resultado. É essencial que os Laboratórios disponham de meios e critérios objetivos, para

demonstrarem, através da Validação, que os métodos internos de ensaio que executam, conduzem a

resultados credíveis e adequados à qualidade pretendida[22].

23

3.1 Seletividade e especificidade

Um método instrumental de separação que produz resposta para uma única substância de

interesse, normalmente um dado elemento, pode ser designado como específico (e.g. métodos

espectrofotométricos) e um método que produz resposta para vários compostos químicos, com uma

característica em comum pode ser designado como seletivo (e.g. métodos cromatográficos). Os

métodos espectrofotométricos garantem resposta para uma única substância devido à utilização de

uma lâmpada específica que emite radiação ao comprimento de onda característico do elemento em

estudo[23].

Especificidade, de um método analítico, pode ser definida como a capacidade de avaliar de forma

inequívoca as substâncias e interesse na presença de componentes que podem interferir com a sua

determinação numa amostra complexa. A especificidade avalia o grau de interferência de espécies

como impurezas e produtos de degradação, bem como outros compostos de propriedades similares

que possam estar presentes[23][24]. Em absorção atómica, as interferências podem ser de dois tipos:

interferências espectrais e não espectrais[12].

Nas interferências espectrais, a energia absorvida é medida incorretamente devido à absorção

por espécies diferentes do analito. A interferência espectral mais comum é a absorção de background

e resulta do facto de nem todos os materiais da matriz serem completamente atomizados. Para

solucionar este problema, o equipamento de espectrofotometria de absorção atómica está equipado

com a função de correção de background emitindo luz branca de forma contínua, proveniente de uma

lâmpada designada como lâmpada de background. Esta técnica permite a medição e correção

automática de qualquer componente de background que esteja presente numa medição de absorção

atómica.

As interferências não espectrais afetam o sinal da amostra e o sinal dos padrões de calibração de

forma diferente e estão relacionadas com problemas de atomização. As interferências não espectrais

podem ser devido a efeito de matriz, interferências químicas ou interferências de ionização.

Um método com boa especificidade assegura que o pico de resposta seja unicamente do composto

de interesse. Se a especificidade não for comprovada, a linearidade, precisão e exatidão estarão

comprometidas.

Uma das abordagens mais simples para avaliar a especificidade de um método analítico consiste

em demonstrar que não existem sinais provenientes de interferentes, num mínimo de seis amostras,

em que o analito está ausente, de origens diferentes[24][25].

. Esta abordagem não considera, no entanto, interferências relativamente raras que não estejam

presentes nas amostras utilizados[25]. A ausência total de interferências não é normalmente possível

por como tal, é necessário aceitar a presença de interferências, desde que não se comprometa de

forma inaceitável a identificação e/ou quantificação do analito[26].

24

Outra abordagem para avaliar a especificidade implica fortificar as soluções de branco com a

substância de interesse na concentração mais baixa esperada e avaliar se os resultados são aceitáveis.

Neste caso, a presença de um interferente é inaceitável quando afeta a capacidade de identificação

e/ou a exatidão da quantificação da substância para concentrações próximas do seu limite de

quantificação[27]. Comparam-se os sinais analíticos produzidos pela solução de branco, que não possui

a substância de interesse, com os sinais produzidos pela matriz com a substância de interesse[23].

Como nem sempre é possível ter uma matriz isenta da substância de interesse, por vezes, aplica-se o

método adição padrão, onde se compara a curva analítica com adição da substância de interesse na

amostra com a curva analítica sem a presença da matriz[23]. Se as duas curvas forem paralelas, pode

dizer-se que o método é específico pois não se observa interferência da matriz.

3.2 Linearidade e gama de trabalho

Num método analítico, a linearidade é a propriedade que permite obter resultados diretamente

proporcionais à concentração do analito numa amostra, dentro de uma determinada gama de

concentrações[28]. Para o estudo de relações lineares recomenda-se a utilização de cinco a oito pontos

e possivelmente mais pontos no caso de relações não lineares[29]. Outra abordagem possível envolve

a utilização de um menor número de níveis de calibração com um maior número de replicados, o que

facilita a identificação de pontos anómalos ou a necessidade de utilizar fatores de ponderação na

calibração [26]. Depois de se garantir a linearidade de um método pode recorrer-se a um menor número

de pontos para construção de curvas de calibração para análises rotineiras[29].

Devem definir-se inequivocamente os critérios de aceitação da calibração. Um dos parâmetros

utilizados como critério pode ser o coeficiente de correlação que normalmente deve ser igual ou

superior a 0,995. Este critério não é universal, podendo por vezes o coeficiente de correlação assumir

valores inferiores se assim for definido[26]. Deve evitar-se a extrapolação, pelo que é importante definir

a menor e a maior concentração que se conseguem medir com precisão e exatidão satisfatórias. O

intervalo entre estes dois valores define a gama de trabalho. Gama esta, que não coincide

obrigatoriamente com a gama de concentrações dos padrões utilizados na curva de calibração[26][29].

25

3.3 Precisão e exatidão

A precisão de um método analítico representa a dispersão de resultados entre ensaios

independentes repetidos de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões[23]. A precisão é

expressa como o coeficiente de variação em percentagem ou o desvio padrão relativo desses

resultados. Devem considerar-se três níveis de precisão: repetibilidade, precisão intermédia e

reprodutibilidade [24].

A repetibilidade, ou precisão intra-ensaio, exprime a precisão obtida em condições de trabalho

idênticas e num curto intervalo de tempo, representando a concordância entre os resultados de

medições sucessivas de um mesmo método. A precisão intermédia é função das variações de

resultados num laboratório devido a vários fatores (e.g. equipamentos, analistas ou momentos

diferentes). Este parâmetro é reconhecido como o mais representativo da variabilidade dos resultados

dentro de um mesmo laboratório[23].

A reprodutibilidade representa a precisão encontrada ao comparar resultados obtidos em

laboratórios diferentes (e.g. ensaios inter-laboratoriais)[24]. Os dados obtidos num único laboratório são

insuficientes para avaliar a reprodutibilidade. É imperativo recorrer a estudos de colaboração entre

laboratórios para avaliar a reprodutibilidade e estimar a exatidão do método[23].

A exatidão de um método representa o grau de concordância entre os resultados individuais

encontrados por esse método e um valor de referência considerado verdadeiro, podendo expressar-se

sob a forma de um desvio percentual[23][29]. A exatidão exprime o grau de concordância entre o valor

médio de um grande número de medições e um valor de referência.

3.4 Limites de deteção e quantificação

O limite de deteção (LD) de um método analítico corresponde à menor quantidade ou concentração

de um analito que se consegue detetar[24] enquanto que o limite de quantificação (LQ) corresponde à

menor quantidade de um analito que pode ser determinada quantitativamente com uma precisão e

exatidão satisfatórias. A quantificação de quantidades inferiores ao LQ não é aceitável e os resultados

inferiores a este valor são expressos como semi-quantitativos ou meramente qualitativos.

Frequentemente faz-se com que a concentração do calibrador mais baixo corresponda ao limite de

deteção e de quantificação[26].

No caso de se desejar medir valores inferiores à concentração do padrão mais baixo é necessário

determinar os limites referidos. Uma forma de os calcular envolve o estudo da razão entre o sinal e o

ruído (S/R) em métodos analíticos que mostrem o ruído da linha de base. Mede-se e compara-se os

sinais de amostras com baixas concentrações conhecidas do analito e brancos sem o composto em

estudo[23]. Uma das aproximações consiste em considerar que para o LD e o LQ as razões S/R são

iguais a 3 e a 10 respetivamente[24].

26

Em alguns métodos, a estimativa da razão S/R pode ser difícil. Nesses casos, ainda assim, devem

calcular-se esses limites, de outra forma, e verificar se estes correspondem à realidade. Para tal pode

fortificar-se brancos com a concentração estimada para o LQ e verificar se é possível obter resultados

satisfatórios para a exatidão e precisão[29].

Estes limites também podem ser calculados com base em dados obtidos de curvas de calibração

elaboradas partindo da análise de amostras fortificadas no intervalo inferior da gama de trabalho[24][29].

Neste cálculo não se devem utilizar dados obtidos de curvas de calibração estabelecidas para toda a

gama de trabalho, porque os valores de LD e LQ seriam sobrestimados[28].

É essencial a implementação de procedimentos que permitam validar os resultados, para tal,

devem ser introduzidas amostras de controlo cujas identidades e concentrações de analito são

conhecidas[30]. O controlo negativo deve permitir provar a ausência de analito, ou gerar uma resposta

inferior ao limite de deteção no caso de ensaios quantitativos. No controlo positivo, é aceitável que o

valor se encontre num intervalo de ± 20%.

3.5 Cartas de controlo

As cartas de controlo são uma ferramenta utilizada em condições de rotina de métodos quando se

pretende repetir uma determinação de padrões de controlo ou de amostras de teores conhecidos, em

cada sessão de trabalho ou lote de amostras. Existem dois tipos de cartas de controlo.

As cartas de Médias ou de Indivíduos representam um determinado parâmetro ou uma média em

função do teor ao longo do tempo.

As cartas de Amplitude ou de Amplitude Móveis representam a diferença de valores entre vários

ensaios repetidos (dois ou mais) do mesmo material ou de materiais diferentes dentro de uma

determinada gama de trabalho ao longo do tempo.

As cartas de controlo contêm cinco linhas que permitem compreender se o processo se encontra

controlado. A linha Central corresponde à média das leituras efetuadas ou à média dos desvios

verificados. O Limite Superior de Controlo é representado por uma linha que poderá corresponder ao

valor da linha central acrescida de 3s, sendo s o desvio padrão da grandeza controlada. Este acréscimo

depende do rigor desejado, podendo por vezes tomar outro valor. O Limite Inferior de Controlo é uma

linha que poderá corresponder ao valor da linha central subtraída de uma grandeza definida por 3s,

sendo s o desvio padrão das leituras. O Limite Superior de Alerta é uma linha que alerta que se está a

entrar numa zona de perigo ou simplesmente numa zona que não se deve atingir. Frequentemente

define-se esta linha a partir da linha central acrescida de 2s caso o limite superior de controlo tiver sido

definido por 3s. O limite Inferior de Alerta é normalmente definido a partir da linha central subtraída de

2s se o limite inferior de controlo tiver sido definido por 3s.

As cartas de controlo podem ter como objetivos controlo de Equipamentos automáticos, validação

de calibrações, controlo da precisão e exatidão, controlo das operações inerentes à realização do

método de ensaio.

27

O número de determinações atualizar a carta dependerá da frequência com que o método de

ensaio é realizado. Os Laboratórios devem indicar, para cada Carta de Controlo, qual o procedimento

a adotar para a sua atualização. Este procedimento varia entre Laboratórios e entre métodos de

ensaio[31].

4 Parte experimental

Reagentes e soluções: HNO3 65% da marca Honeywell Fluka, H2O2 30% da marca Carlo Erba

reagentes, soluções de modificadores de matriz: solução de nitrato de magnésio (Mg(NO3)2 e paládio

(Pd), ambas de concentração 3 g/L foram preparadas partindo de soluções stock 10 g/L ambas da

marca Sigma-Aldrich, solução de arsénio 10000 µg/ml de marca SCP SCIENCE PlasmaCAL

Material e equipamento: Todo o material de vidro é guardado num banho de HNO3 5% durante

pelo menos 24h antes da sua utilização. A digestão de amostras foi realizada em forno micro-ondas

“Multiwave pro” da marca Anton Paar com rotor 8NXF100. A determinação das concentrações foi feita

com recurso a um espetrofotómetro de absorção atómica “Pin AAcle 900 Z” de marca Perkin Elmer

equipado com um sistema “furnace autosampler As 900”.

Em seguida, são descritas as condições finais utilizadas no procedimento. Para consultar

resultados obtidos com outras condições na fase inicial do trabalho deve consultar-se o capítulo

“Resultados preliminares” que se encontra em anexo.

4.1 Preparação de amostras

As amostras de pescado, por norma, são recebidas no laboratório inteiras. A maioria das

amostras será peixe e marisco sejam estes frescos, congelados ou enlatados. Para realizar a leitura

da concentração de arsénio é necessário que as amostras a inserir no espectrofotómetro de absorção

atómica se encontrem no estado líquido.

O primeiro passo da preparação de amostras consiste em triturar o pescado numa picadora

elétrica, “moulinex clássica 123” até se obter uma mistura homogénea com partículas de pequenas

dimensões de modo a facilitar a pesagem rigorosa de pequenas massas e a estar uma maior área

superficial exposta em contacto com os reagentes na extração de arsénio.

28

4.2 Digestão de amostras

Após as amostras serem moídas, efetua-se uma toma de 0,75 ± 0,01g que são transferidas para

os vazos do micro-ondas. A estas tomas são adicionados 5 ml de HNO3 concentrado e 3 ml de H2O2

30%. Os vasos são de seguida levados ao micro-ondas e sujeitos a uma curva de potências com o

objetivo de digerir toda a matéria orgânica e extrair o arsénio, minimizando as perdas do analito. Foi

utilizada a seguinte curva de potências: 3 min a 300 W, 1 min de repouso, 4 min a 500 W, 3 min a 650

W e 3 min a 900 W. A curva de potências utilizada foi baseada num método utlizado para extração de

arsénio em amostras de frango[32], porém, com uma potência máxima menor por as amostras de

pescado aparentarem mais fáceis de digerir. Após a digestão, as amostras em solução foram

transferidas para balões volumétricos de 50 ml e estes foram preenchidos com água desionizada (mili

Q) até ao traço.

4.3 Determinação da concentração de

arsénio

O primeiro passo consiste na obtenção da reta de calibração. Foram utilizados padrões com as

seguintes concentrações para construção da reta: 10, 20, 30, 40 e 50 µg/L. O comprimento de onda

utilizado foi 193,7 nm, a largura da fenda foi 0,7 nm, o sinal medido corresponde á área do pico, e o

número de replicados foi dois. Posteriormente á obtenção da reta de calibração procede-se á leitura

das concentrações dos padrões de controlo (10 µg/L e 50 µg/L), cujo resultado deve satisfazer critérios

descrito no capítulo “controlo de qualidade”, e finalmente à medição da concentração nas amostras.

Deve proceder-se á medição da concentração dos padrões de controlo a cada 10 amostras para

verificar a estabilidade da reta de calibração. Na medição da concentração de amostras e dos padrões

de controlo os volumes pipetados e introduzidos no tubo de grafite foram os mesmos: 20 µl de

amostra/padrão, 5 µl de nitrato de paládio (3 g/L) e 5 µl de nitrato de magnésio (3 g/L). Foi aplicada o

seguinte programa de temperaturas na câmara de grafite: secagem a 110oC durante 30 s e 130oC

durante 30 s, pirólise a 1200oC durante 20 s, atomização a 2000oC durante 5 s e limpeza a 2450oC

durante 3 s.

29

4.4 Espectro de absorção

Após a realização de todos os ensaios notou-se que o sinal de absorção poderia apresentar

demasiado ruído o que pode provocar interferências que geram resultados incorretos da concentração

do analito. Como tal decidiu-se utilizar um método que recorresse a um aquecimento mais suave pois,

poderia estar a perder-se arsénio devido a um aquecimento brusco.

O método utilizado durante os ensaios recorria ao seguinte programa de temperaturas apresentado na

Figura 1:

Figura 1- programa de temperaturas utilizado no espetrofotómetro de absorção atómica durante todos os ensaios

Este é o método que está definido originalmente pelo fabricante para a determinação de

arsénio, porém, observou-se que os resultados não foram ideais. Pode constatar-se que existem dois

aumentos bruscos de temperatura de 130 0C para 1200 0C no passo 3, entre a secagem e a pirólise,

onde pode ocorrer perda do analito por volatilização, e de 1200 0C para 2000 0C no passo 4, o de

atomização em que é feita a leitura. Este método compreende um total de 5 passos.

Com o objetivo de minimizar as possíveis perdas utilizou-se um método que recorre a um

aquecimento mais gradual, apresentado na Figura 2.

30

Figura 2- programa de temperaturas utilizado no espetrofotómetro de absorção atómica otimizado para deteção de arsénio

Neste segundo método o a temperatura passa dos 1300 C para os 1500 C e a secagem é feita

em dois passos, um a 8000 C e outro a 13000 C. O passo extra de secagem é recomendado em

casos em que as amostras contêm elevadas concentrações de ácido, como no presente em que esta

é de 10% e pode provocar interferências caso não seja totalmente removido. O facto de a secagem

ser feita em dois passos em vez de um com maior diferença de temperatura permite obter uma menor

perda de arsénio que é um analito particularmente volátil. Em seguida são apresentados os espetros

de absorção produzidos pelos padrões de calibração produzidos pelos dois métodos descritos.

Figura 3- espectro de absorção atómica obtido com recurso á curva de temperatura utilizada durante os ensaios

31

Figura 4- espectro de absorção atómica obtido com recurso á curva de temperatura otimizada para a deteção de

arsénio

Como se pode observar na Figura 3 e na Figura 4, com as alterações efetuadas curva de

aquecimento foi possível obter um estreitamento dos picos e uma diminuição do ruído, o que

supostamente produzirá resultados com maior qualidade e mais fiáveis. Em ambos os métodos o

comprimento de onda utilizado foi 193,7 nm por ser o que garante mais seletividade, a largura da fenda

foi 0,7 nm, o sinal medido corresponde á área do pico, e o número de replicados foi dois. Este teste foi

efetuado após a visita de manutenção preventiva e por sugestão do técnico do equipamento. Dado que

foi efetuado já na última semana de estágio não foi possível testar / otimizar o método desenvolvido

nestas condições. Pelo que todos os resultados foram obtidos pelo método descrito na Figura 1.

5. Resultados

As amostras estão designadas por letras e/ou números. As designações aparecem repetidas ao

longo do trabalho. Se a mesma designação aparecer repetida nos resultados de um mesmo dia a

amostra será a mesma. Quando a designação aparece em dias diferentes, trata-se de amostras

diferentes. Quando a amostra tem “R” na sua designação trata-se de um ensaio de recuperação se

tiver “D” trata-se de um duplicado.

Foram realizados vários ensaios com diferentes condições aplicadas na fase de digestão de

amostras. Os resultados detalhados destes ensaios podem ser observados nos anexos, no capítulo

“resultados preliminares”. Em seguida são apresentados os resultados obtidos após serem fixados os

parâmetros associados à fase de digestão das amostras.

Como referido anteriormente foram estipulados os valores de 0,75 ±0,01g para a toma e de 50

ml para o volume final. Os volumes de reagentes utilizados foram 5 ml de HNO3 e 3 ml de H2O2. O

programa de potências utilizado na digestão de amostras no forno micro-ondas é descrito na Tabela 1

32

Tabela 1- condições de potência aplicadas na digestão de amostras em forno micro-ondas

Potência (W) Tempo (min)

300 3

0 1

500 4

650 3

900 3

É de referir que no ensaio realizado a 18/06/2018 foi efetuada a fortificação de amostras com

500 µl de uma solução de arsénio de concentração 1000 µg/L que foi obtida por diluição da solução

stock de concentração 107 µg/L.

Tabela 2- resultados do ensaio realizado a 18/06/2018 com o objetivo de calcular a recuperação de arsénio em

que a toma foi de 0,75g e o volume final 50 ml

Amostra Toma (g) As 103 µg/L (µl) Concentração

(µg/L)

Concentração

esperada (µg/L)

Recuperação %

A 0,7517 --- 9,66 --- ---

AR 0,7540 500 17,68 19,66 80,2

ARD 0,7529 500 17,50 19,66 78,4

Branco --- --- 2,57 --- ---

Como exibido na Tabela 2, verificou-se que a os resultados dos ensaios de recuperação foram

aceitáveis sem que houvesse grande diferença entre ambos. Estes critérios de aceitação serão

discutidos no capítulo “análise de ensaios de recuperação”.

A 20/06/2018 realizou-se um ensaio com tomas de 0,75±0,01g e 1 ±0,01g pois apesar de se

terem obtidos resultados satisfatórios com uma toma de 0,75 g, para amostras de pescado, seria

benéfico aumentar a massa da toma de modo a conseguir alcançar um limite de quantificação inferior.

Todas as outras condições permaneceram constantes relativamente ao ensaio anterior. Os resultados

deste ensaio são expressos na Tabela 3.

33

Tabela 3- resultados do ensaio realizado a 20/06/2018 com o objetivo de calcular a recuperação de arsénio em que se fizeram tomas de 0,75 g e 1 g para um volume final de 50 ml


(µg/L)

Concentração

esperada (µg/L)

Recuperação %

B 0,7440 --- 11,71 --- ---

BR 0,7495 500 20,40 21,71 86,9

BRD 07586 500 20,14 21,71 84,3

B.1 1,0112 --- 14,84 --- ---

B.1R 1,0070 500 19,44 24,84 46,0

B.1RD 1,0183 500 18,01 24,84 31,7

Branco --- --- 0,32 --- ---

BrancoR --- 500 9,10 10,32 87,8

Verificou-se que o aumento da toma para 1g levou a recuperações inferiores. Pode dever-se a

algum efeito de matriz. Dado que com a toma de 0.75g as recuperações foram aceitáveis ficou-se a

toma neste valor.

Neste caso, o limite de quantificação experimental seria 0,67 µg/g. O cálculo do LQ será

explicitado no capítulo “determinação do LQ experimental”.

5.1 Determinação do LQ experimental

O limite de quantificação pode ser estimado com base na massa da toma, no volume final e na

concentração do primeiro padrão da reta de calibração pela seguinte equação:

𝐿𝑄 =𝑃𝑎𝑑𝑟ã𝑜∗𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙

𝑇𝑜𝑚𝑎 (1)

Para que o LQ esteja nas unidades mg/kg, as unidades do padrão devem ser µg/L, as unidades

do volume final devem ser L e as unidades da toma devem ser gramas. Como o menor padrão de

calibração tem concentração de 10 µg/L, o volume final é de 50 ml e toma é de 0,75 g o LQ estimado

é de 0,67 mg/kg tendo-se majorado para 0,7 mg/kg.

A 21/06/2018, com o intuito de testar experimentalmente o limite quantificação, foram

analisadas sete amostras em busca de uma em que a presença de arsénio não fosse detetada.

Adicionalmente, com o objetivo de avaliar a duração de amostras em termos de eventuais perdas de

34

As, após a sua digestão, estas voltaram a ser analisadas no dia seguinte e cinco dias após a digestão.

Os resultados são apresentados na Tabela 4. O mesmo foi feito para testar a duração dos padrões de

10 e 50 µg/L e os resultados são apresentados na Tabela 5.

Tabela 4- resultados do ensaio realizado a 21/06/2018 em que a toma foi de 0,75 g e o volume final 50 ml obtidos

nos dias 21, 22 e 26 de junho de 2018

Amostra Toma (g) 21/6

Concentração

(µg/L)/ (mg/kg)

22/6

Concentração

(µg/L)/ (mg/kg)

26/6

Concentração

(µg/L)/ (mg/kg)

Branco --- 0,34 0 0

A 0,7441 145,6/ 9,78 102,4/ 6,88 139,1/ 9,34

B 0,7513 13,31/ 0,88 7,19/ 0,48 26,35/ 1,75

C 0,7430 5,99/ 0,40 2,53/ 0,17 11,85/ 0,80

D 0,7522 0 0,51/ 0,03 0

E 0,7440 5,18/ 0,35 4,54/ 0,30 20,02/ 1,34

F 0,7568 3,48/ 0,23 1,50/ 0,10 0

G 0,7579 2,67/ 0,17 3,28/ 0,22 0

Tabela 5- concentrações obtidas nos dias 21, 22 e 26 de junho de 2018 para os padrões de controlo preparados a 21/06/2018

Padrão (µg/L) Concentração (µg/L) 21/6 Concentração (µg/L) 22/6 Concentração (µg/L) 26/6

10 11,13 11,46 8,03

50 44,93 50,49 36,35

Observou-se que as concentrações medidas em dias diferentes apresentam alguma variação,

porém não se consegui identificar uma tendência comum a todas as amostras e não terá grande

significado visto que a concentração de várias amostras é inferior ao LQ. No entanto, após 5 dias de

preparados ambos os padrões baixaram a sua concentração, gerando um desvio relativo, á

35

concentração definida, superior a 15% e deixando de cumprir o critério de aceitação. Considerou-se

assim que as soluções poderiam ter uma durabilidade de 1 semana, sendo preferencial prepará-las

sempre no dia da análise. Mais á frente serão discutidas a repetibilidade, a precisão intermédia e outros

índices indicativos da aplicabilidade e qualidade do método.

A 27/06/2018, novamente, com o objetivo de testar experimentalmente o limite quantificação

de 0,70 mg/kg assegurando que este é alcançável, foram analisadas quatro amostras, com os

respetivos duplicados, em busca de uma em que a presença de arsénio não fosse detetada. As

concentrações das amostras apresentam-se na Tabela 6.

Tabela 6- resultados do ensaio realizado a 27/06/2018 em que a toma foi de 0,75 g e o volume final 50 ml

Amostra Toma (g) Concentração (µg/L) Concentração (mg/kg)

I 0,7587 13,18 0,87

ID 0,7524 11,60 0,77

J 0,7503 13,16 0,88

JD 0,7554 13,74 0,91

K 0,7582 3,74 0,25

KD 0,7536 3,80 0,25

L 0,7546 1,20 0,08

LD 0,7471 0,55 0,04

Foram escolhidas as amostras D e L por serem as amostras cuja concentração em arsénio

mais se aproximou de zero. Para testar o LQ, no dia 21/06/2018 fortificou-se a amostra D de forma à

sua concentração em As ser 0,7 mg/kg. A fortificação foi feita com 525 µl de solução 103 ppb de As, o

que se deveria traduzir num aumento de concentração de 10,5 µg/l. No dia 27/06/2018 a amostra L foi

sujeita às mesmas condições.

Uma concentração de 0,8 mg/kg apresenta apenas um desvio de 14,3% relativamente á

concentração pretendida e permite assim confirmar o LQ como sendo 0,7 mg/kg.

A 02/07/2018, novamente, com o objetivo de testar experimentalmente o limite quantificação

de 0,70 mg/kg assegurando que este é alcançável, com desvio inferior ao obtido anteriormente, foi

36

escolhida novamente a amostra D que desta vez foi fortificada com 375 µl de solução 103 ppb de As, o

que se deveria traduzir num aumento de concentração de 7,5 µg/l.

Tabela 7- resultados dos ensaios com objetivo de determinação experimental do limite de quantificação

Data Amostra Toma

(g)

As 103

µg/L (µl)

Concentração

(µg/L)

Concentração

(mg/kg)

Concentração

esperada

(µg/L)

Recuperação

%

21/06/2018 D 0,7454 --- 2,40 0,16 --- ---

21/06/2018 DR 0,7419 525 13,17 0,89 12,9 102,6

21/06/2018 DRD 0,7496 525 12,61 0,84 12,9 97,2

27/06/2018 L 0,7480 --- 2,75 0,18 --- ---

27/06/2018 LR 0,7465 525 12,66 0,84 13,25 94,4

27/06/2018 LRD 0,7464 525 12,65 0,84 13,25 94,4

02/07/2018 D 0,7479 --- 1,55 0,10 --- ---

02/07/2018 DR 0,7580 375 9,35 0,62 9,05 104,9

02/07/2018 DRD 0,7528 375 11,16 0,74 9,05 129,2

Da análise da Tabela 7 podemos verificar que o método desenvolvido permite alcançar o limite

de quantificação de 0,7 mg/kg visto a maioria das amostras selecionadas, após fortificação, apresentou

concentrações com desvio inferior a 20% relativamente ao LQ estimado.

5.2 Análise de brancos, Limite de

deteção e limite de quantificação

O critério de aceitação para os ensaios em branco dita que, em concentração, estes devem ser

inferiores a 1/3 do LQ pois é este o critério utilizado no laboratório no caso de outros metais pesados.

Os limites de deteção e quantificação são calculados respetivamente pelas seguintes equações[30]:

LD = Media + 3,3xDesv. Pad (2)

𝐿𝑄 = Media + 10xDesv. Pad (3)

37

Sendo que a média se refere á média das concentrações dos ensaios em branco realizados até

á data. Como tal, estes limites e critérios são alterados com base nos resultados obtidos ao longo do

tempo. As concentrações obtidas para as soluções de branco apresentam-se na Tabela 8.

Tabela 8- carta de controlo de brancos- concentrações dos ensaios brancos em g/L.

Data Conc (g/L)

09/05/2018 0,10

10/05/2018 0,22

11/05/2018 0,10

14/05/2018 0,00

18/05/2018 0,00

22/05/2018 0,25

24/05/2018 0,28

30/05/2018 0,00

07/06/2018 0,00

14/06/2018 0,00

20/06/2018 0,32

21/06/2018 0,34

21/06/2018 0,00

14/07/2018 0,00

Após a eliminação de alguns resultados anómalos constata-se que os limites de deteção e

quantificação (teóricos com base na reta de calibração) são respetivamente 0,57 µg/L e 1,48 µg/L.

limite. Considerando a toma de 0,75 g e o volume final de 50 ml, os limites de deteção e quantificação

correspondem a concentrações de 0,04 mg/kg e 0,10 mg/kg peso húmido.

5.3 Padrões de controlo e

homogeneidade de variância

Na fase de validação de um método analítico é necessário demonstrar que existe

homogeneidade de variâncias. Para a verificação da homogeneidade de variâncias na gama de

trabalho, devem ser realizadas no mínimo 10 determinações dos padrões extremos da gama de

trabalho. Calcula-se a razão das variâncias dos padrões referidos. Este parâmetro (PG) é sempre

calculado como o quociente entre a maior variância e menor independentemente de a que padrão

correspondem. Compara-se com PG com o valor crítico tabelado pela distribuição de Fisher para um

nível de confiança de 99% (P=99% ou alfa=1%) e n-1 graus de liberdade. Os valores de concentração

e resultados de cálculos necessários para testar a homogeneidade de variância são apresentados na

Tabela 9 e Tabela 10 para os padrões de 10 e 50 µg/L.

38

Tabela 9- concentrações do padrão de arsénio de concentração 10 µg/L para determinação da homogeneidade de variância

Concentração teórica (g/L) Resultados obtidos

xb Desvio %

10,0

10,27 2,7

10,38 3,8

10,18 1,8

10,79 7,9

9,28 7,2

10,48 4,8

10,23 2,3

9,98 0,2

10,44 4,4

9,64 3,6

Valor médio 10,17

DP 0,44

Variância 0,2

Desv. Rel. Médio % 3,9

Tabela 10- concentrações do padrão de arsénio de concentração 50 µg/L para determinação da homogeneidade de variância

Concentração teórica (g/L) Resultados obtidos

xb Desvio %

50

45,19 9,6

45,61 8,8

45,83 8,3

46,34 7,3

49,65 0,7

48,06 3,9

47,32 5,4

48,13 3,7

47,78 4,4

50,45 0,9

Valor médio 47,436

DP 1,7

Variância 2,9

Desv. Rel. Médio % 5,3

DP corresponde ao desvio padrão. A variância é o quadrado do desvio padrão. PG é calculado

como a razão das variâncias dos dois padrões, sendo o seu valor 14,5. Se PG calculado for menor do

que o valor crítico tabelado para alfa igual a 1% pode concluir-se que existe homogeneidade de

variância e que a gama de trabalho está bem ajustada. O valor critico, nestas condições, é 5,35 e como

39

tal pode concluir-se que não existe homogeneidade de variância. Assim sendo, a gama de trabalho

deveria ser alterada de modo a que este critério seja satisfeito.

No início de cada análise de rotina é necessário verificar a concentração dos padrões de

controlo e garantir que esta se encontra com um desvio padrão inferior ao estipulado. A concentração

dos padrões de controlo deverá também ser confirmada no final da análise de todas as amostras e se

se tratar de um elevado número de amostras, a confirmação deve ser realizada a cada 10 amostras.

Para ambos os padrões, de 10 ppb e 50 ppb, foi estipulado um desvio de 15% como aceitável pois era

este o critério estipulado no laboratório para outros metais pesados e assumiu-se como aceitável

também para arsénio. Caso este critério não seja satisfeito, a análise não deverá avançar. Os padrões

deverão ser feitos diariamente antes de se iniciar a análise para garantir a sua qualidade.

Tabela 11- controlo da concentração do padrão de arsénio de concentração 10 µg/L

n Data Resultado Errel % Média Média+3s Média+2s Média-2s Média-3s

1 14/06/2018 10,27 2,70 10,17 11,48 11,04 9,29 8,86

2 27/06/2018 10,38 3,80 10,17 11,48 11,04 9,29 8,86

3 27/06/2018 10,18 1,80 10,17 11,48 11,04 9,29 8,86

4 27/06/2018 10,79 7,90 10,17 11,48 11,04 9,29 8,86

5 27/06/2018 9,28 7,20 10,17 11,48 11,04 9,29 8,86

6 27/06/2018 10,48 4,80 10,17 11,48 11,04 9,29 8,86

7 27/06/2018 10,23 2,30 10,17 11,48 11,04 9,29 8,86

8 27/06/2018 9,98 0,20 10,17 11,48 11,04 9,29 8,86

9 27/06/2018 10,44 4,40 10,17 11,48 11,04 9,29 8,86

10 27/06/2018 9,64 3,60 10,17 11,48 11,04 9,29 8,86

Cálculo contínuo

Média 10,17

S (desv. Pad) 0,44

Média+3xS 11,48

Média+2xS 11,04

Média-2xS 9,29

Média-3xS 8,86

C. Variação % 4,30

Precisão % 8,60 Erro relativo médio% 3,87

40

Figura 5- carta de controlo do padrão de arsénio de concentração 10 µg/L. A linha azµl representa a média, as linhas verdes representam a média ± 2S (limites de alerta) e as linhas vermelhas representam a média ± 3S

(limites de controlo)

Tabela 12- controlo da concentração do padrão de arsénio de concentração 50 µg/L

n Data Resultado Errel % Média Média+3s Média+2s Média-2s Média-3s

1 14/06/2018 45,2 9,62 48,32 54,80 52,64 44,00 41,84

2 14/06/2018 45,6 8,78 48,32 54,80 52,64 44,00 41,84

3 14/06/2018 45,8 8,34 48,32 54,80 52,64 44,00 41,84

4 14/06/2018 46,3 7,32 48,32 54,80 52,64 44,00 41,84

5 14/06/2018 49,7 0,70 48,32 54,80 52,64 44,00 41,84

6 14/06/2018 48,1 3,88 48,32 54,80 52,64 44,00 41,84

7 14/06/2018 47,3 5,36 48,32 54,80 52,64 44,00 41,84

8 14/06/2018 48,1 3,74 48,32 54,80 52,64 44,00 41,84

9 14/06/2018 47,8 4,44 48,32 54,80 52,64 44,00 41,84

10 14/06/2018 50,5 0,90 48,32 54,80 52,64 44,00 41,84

Cálculo contínuo

Média 48,3

S (desv. Pad) 2,2

Média+3xS 54,8

Média+2xS 52,6

Média-2xS 44,0

Média-3xS 41,8

C. Variação % 4,5

Precisão % 8,9 Erro relativo médio% 4,37

8,50

9,00

9,50

10,00

10,50

11,00

11,50

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Va

lor

me

did

o

Data (indicada pelo ponto da tabela 44)

Carta de Controlo (padrão 10 ppb)

41

Figura 6- carta de controlo do padrão de arsénio de concentração 50 µg/L. A linha azµl representa a média, as linhas verdes representam a média ± 2S (limites de alerta) e as linhas vermelhas representam a média ± 3S

(limites de controlo)

As medições dos padrões devem ser registadas e controladas em cartas de controlo com base

nos padrões de controlo e respetivo coeficiente de variação com exemplificado na Tabela 11 e Figura

5 para o padrão de 10 µg/L e na Tabela 12 e Figura 6 para o padrão de 50 µg/L. O valor da concentração

obtida nos padrões deve estar compreendido entre os limites estabelecidos na carta de controlo. O

número de análises para estabelecer os limites da carta de controlo e para atualizar a carta de controlo,

após eliminação dos valores aberrantes, deve ser definido pelo laboratório para cada método[31]. Caso

se observem tendências acima ou abaixo da linha média devem ser tomadas medidas corretivas. Se

necessário, poderá alterar-se a linha da média, no entanto, o valor do desvio padrão em cada

atualização deve ser inferior ou igual ao desvio padrão calculado na atualização anterior.

5.4 Análise de ensaios de

recuperação

Os ensaios de recuperação permitem compreender se há perdas do analito ou contaminações

em algum ponto do procedimento. Num ensaio se recuperação, seleciona-se uma amostra e são feitas

duas tomas com a mesma massa. Numa delas é adicionado um volume definido de uma solução que

contém o analito em questão. Como tal deve ocorrer um aumento de concentração esperado,

relativamente á amostra que não sofreu fortificação. O resultado da recuperação deve rondar os 100%,

sendo que a margem deve ser definida pelo próprio laboratório para cada ensaio[30]. Com base no

41,00

43,00

45,00

47,00

49,00

51,00

53,00

55,00

57,00

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Va

lor

me

did

o

Data (indicada pelo ponto da tabela 45)

Carta de Controlo (padrão 50 ppb)

42

critério já estipulado no laboratório para outros metais pesados decidiu-se que a recuperação deve

situar-se entre os 80 e 120 %. Os resultados podem ser observados na Tabela 13.

Tabela 13- resultados dos ensaios de recuperação

Data Amostra Rec %

09/05/2018 2 91,3

11/05/2018 5 93,2

30/05/2018 14 88,9

30/05/2018 15 104,3

12/06/2018 23 86,4

12/06/2018 24 99,7

18/06/2018 27 81,1

20/06/2018 28 87,6

20/06/2018 30 90,5

21/06/2018 31 101,2

27/06/2018 32 95,6

02/07/2018 33 117,1

04/07/2018 36 100,3

04/07/2018 37 109,7

14/07/2018 38 117,0

A percentagem de recuperação pode ser calculada pela seguinte fórmula:

𝑅𝑒𝑐% =𝐶𝑎𝑝−𝐶𝑡𝑎

𝐶𝑡𝑝∗ 100 (4)

Em que Cap é concentração obtida no ensaio da amostra fortificada, Cta é concentração teórica

da amostra no ensaio de recuperação e Ctp é a concentração teórica do padrão no ensaio de

recuperação.

Como foi descrito anteriormente nos resultados, enquanto não se encontrou uma combinação

correta de massa da toma e volume final da solução os ensaios de recuperação não satisfizeram

consistentemente os requisitos para aceitação. Apenas após se definir a toma de 0,75g e o volume final

de 50 ml, as recuperações começaram a apresentar valores entre 80 e 120%. A média dos resultados

de recuperação foi 101% com um desvio padrão de 13,7%. No entanto, algumas amostras particulares

como “farinha de peixe” continuam a gerar recuperações insuficientes o que se poderá dever a algum

efeito de matriz. Como em geral as “farinhas de peixe” apresentam concentrações de arsénio

superiores às amostras de pescado, pode por exemplo tentar fazer-se uma toma menor para um outro

volume final, sem que a concentração na solução final seja inferior ao limite de quantificação, tentando

deste modo minimizar o efeito de matriz. Pode também recorrer-se ao método da adição padrão,

metodologia que testada, no entanto, foi um estudo que não revelou resultados conclusivos e dado que

é um tipo de matriz que não se recebe em grande número no laboratório não foi possível fazer

novamente esta avaliação durante o período do estágio.

43

5.5 Análise de duplicados

A análise de duplicados deve ser feita diariamente. O critério de aceitação é variável[30], neste

caso arbitrou-se que amplitude relativa deve ser inferior a 10% da média dos duplicados por ser o

critério utilizado no laboratório em métodos de determinação de outros metais pesados. Em seguida,

na Tabela 14, são apresentados todos os resultados de duplicados obtidos ao longo da implementação

do método.

Tabela 14- resultados comparativos das amostras e seus duplicados

Data Amostra [Rep 1] (mg/Kg) [Rep 2] (mg/Kg) Amplitude relativa %

10/05/2018 8 3,61 3,54 2,0

14/05/2018 10 0,24 0,25 8,4

14/05/2018 11 0,00 0,00 0,0

22/05/2018 13 0,07 0,08 5,5

24/05/2018 14 0,00 0,00 0,0

28/05/2018 15 0,90 0,84 6,9

28/05/2018 16 1,03 1,08 4,7

30/05/2018 18 24,30 24,82 2,1

07/06/2018 19 0,00 0,00 0,0

07/06/2018 20 0,00 0,00 0,0

11/06/2018 22 12,06 11,72 2,9

12/06/2018 24 78,45 78,33 0,1

14/06/2018 25 5,58 5,28 5,5

18/06/2018 26 1,17 1,16 0,9

20/06/2018 27 1,36 1,33 2,5

20/06/2018 28 1,29 1,19 8,8

21/06/2018 29 0,89 0,84 5,8

27/06/2018 31 0,88 0,91 3,4

27/06/2018 32 0,25 0,25 0,0

27/06/2018 34 0,84 0,84 0,0

03/07/2018 36 2,63 2,85 8,0

03/07/2018 37 3,40 3,45 1,5

03/07/2018 38 4,39 4,48 2,0

04/07/2018 40 4,89 4,60 6,1

14/07/2018 43 0,00 0,00 0,0

14/07/2018 44 1,58 1,50 5,2

14/07/2018 45 2,37 2,42 2,1

A amplitude relativa é calculada pela seguinte equação:

𝐴𝑚𝑝𝑙𝑖𝑡𝑢𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 (%) = |𝑅𝑒𝑝1−𝑅𝑒𝑝2|

𝑅𝑒𝑝1+𝑅𝑒𝑝2

2

∗ 100 (5)

44

O desvio padrão da amplitude relativa foi de 4,9%.

Calcula-se também a incerteza da precisão com base nos ensaios duplicados pela seguinte equação:

𝑆𝑝𝑟𝑒𝑐𝑖𝑠ã𝑜% =𝑆(𝐴𝑚𝑝𝑙 𝑟𝑒𝑙%)

√2 (6)

Em que S(Ampl rel%) é o desvio padrão da amplitude relativa e o resultado obtido para a precisão foi

3,44%.

Finalmente, a precisão é calculada como:

𝑃𝑟𝑒𝑐𝑖𝑠ã𝑜% = 2 ∗ 𝑆𝑝𝑟𝑒𝑐𝑖𝑠ã𝑜% (7)

O valor obtido para a percentagem de precisão foi 6,87%.

Com base na análise de duplicados é também possível calcular o limite de repetibilidade (r)

multiplicando o valor de 𝑆𝑝𝑟𝑒𝑐𝑖𝑠ã𝑜% por 2,8, que é um valor tabelado para ensaios em duplicado[35] e

corresponde a 2√2. O limite de repetibilidade apresenta um valor 9,63%.

5.6 Controlo da sensibilidade

O controlo da sensibilidade deve ser feito diariamente através do registo do declive da curva de

calibração, da ordenada na origem e do fator de correlação. O critérios de aceitação do declive da

curva, na carta de controlo, são os mesmos que para as concentrações dos padrões de controlo[31]: Se

2 de 3 pontos consecutivos excederem os limites de alerta deve-se analisar outro ponto e se o novo

ponto se encontrar entre os limites de alerta, continuar e aceitar os resultados das análises, caso

contrário interromper as análises e tentar corrigir o problema. Se 6 pontos consecutivos se localizarem

todos acima ou todos abaixo da linha central, e o ponto seguinte se localizar do outro lado da linha

central, continuar e aceitar os resultados das análises, caso contrário, interromper as análises e corrigir

o problema. O fator de correlação deve ser igual ou superior a 0,995. Na fase de implementação do

método, este critério pode não estar ainda bem definido por não se ter um número de resultados

suficiente para se considerar que um valor de declive não satisfaz o critério. Não está definido o número

mínimo de ensaios para que fiquem estabelecidos a média dos declives e o desvio padrão como tal,

na fase de implementação, definiu-se como requisito de aceitação da curva de calibração, o coeficiente

de correlação ser igual ou superior a 0,995 por este critério ser utilizado noutros método no laboratório.

As linhas de aviso +/- 2 x SD que se podem visualizar no gráfico abaixo aparecem aqui à semelhança

do que é aceite nos outros métodos em rotina no laboratório e apenas para ainda que numa fase inicial

possamos ter algum controlo. Poderão ter de ser definidos novos critérios após análise de um maior

histórico de declives. O declives e coeficientes de correlação das curvas de calibração obtidas ao longo

do trabalho apresentam-se na Tabela 15.

45

Tabela 15- controlo de sensibilidade. Registo do coeficiente correlação e declive das curvas de calibração, média dos declives até ao respetivo dia e média do declive ± 2 variância

Data r Declive

(Abs.L.µg-1) média x+2s x-2s

09/05/2018 0,9971 0,00183 0,0026 0,0036 0,0016

10/05/2018 0,9981 0,00243 0,0026 0,0036 0,0016

11/05/2018 0,9987 0,00253 0,0026 0,0036 0,0016

14/05/2018 0,9969 0,00253 0,0026 0,0036 0,0016

17/05/2018 0,9952 0,00172 0,0026 0,0036 0,0016

22/05/2018 0,9991 0,00211 0,0026 0,0036 0,0016

24/05/2018 0,9958 0,00234 0,0026 0,0036 0,0016

28/05/2018 0,9965 0,00369 0,0026 0,0036 0,0016

30/05/2018 0,9958 0,00233 0,0026 0,0036 0,0016

07/06/2018 0,9959 0,00343 0,0026 0,0036 0,0016

08/06/2018 0,9967 0,00226 0,0026 0,0036 0,0016

11/06/2018 0,9975 0,00310 0,0026 0,0036 0,0016

12/06/2018 0,9991 0,00250 0,0026 0,0036 0,0016

14/06/2018 0,9984 0,00238 0,0026 0,0036 0,0016

18/06/2018 0,9979 0,00273 0,0026 0,0036 0,0016

20/06/2018 0,9975 0,00265 0,0026 0,0036 0,0016

21/06/2018 0,9990 0,00283 0,0026 0,0036 0,0016

27/06/2018 0,9985 0,00256 0,0026 0,0036 0,0016

02/07/2018 0,9987 0,00284 0,0026 0,0036 0,0016

03/07/2018 0,9980 0,00303 0,0026 0,0036 0,0016

04/07/2018 0,9978 0,00295 0,0026 0,0036 0,0016

14/07/2018 0,9976 0,00191 0,0026 0,0036 0,0016

Figura 7- carta de controlo de sensibilidade com declive das curvas de calibração no eixo das ordenadas e data de obtenção da curva no eixo das abcissas. As linhas verdes correspondem á média ±2S (linhas de alarme)

Na Figura 7 pode observar-se que os primeiros sete pontos de encontram abaixo da linha central,

o que seria indicação para parar a análise e corrigir o eventual problema porém, tal ocorreu numa fase

0,0010

0,0015

0,0020

0,0025

0,0030

0,0035

0,0040

09/05/2018 23/05/2018 06/06/2018 20/06/2018 04/07/2018

De

cliv

e

Data

Controlo da sensibilidade - Arsénio

46

inicial da implementação do método optou-se por aceitar a reta de calibração obtida nesse dia e realizar

a análise. Deve ser definido um número mínimo de pontos para poder fixar os critérios de aceitação[28].

5.7 Repetibilidade e precisão

intermédia

A repetibilidade e precisão intermédia são parâmetros que se calculam na fase de implementação

de um método ou quando é efetuada alguma alteração a um método já implementado.

No cálculo da repetibilidade, demonstrado na Tabela 16, deve ser selecionada uma amostra, ou

várias amostras que representem tipos de matrizes com caraterísticas diferentes e cada amostra deve

ser analisada pelo menos 10 vezes e no mesmo dia em condições semelhantes.

Tabela 16- 10 leituras de concentração em 3 amostras que representam matrizes diferentes, farinha de peixe, pescado e vegetais para determinação da repetibilidade do método

Farinha de peixe Pescado Vegetais

Data Nº

amostra mg/kg Data

Nº amostra

mg/kg Data Nº amostra mg/kg

03/07/2018 1 5,11 04/07/2018 2 0,89 14/07/2018 3 2,00

5,06 0,90 2,03

5,08 0,79 2,07

4,95 0,88 2,11

5,09 0,78 2,10

4,86 0,93 2,39

5,29 0,97 1,83

4,98

0,89 2,08

4,66

0,78 1,90

5,28 0,81 2,16

Desvio padrão 0,188 Desvio padrão 0,068 Desvio padrão 0,151

Média 5,04 Média 0,86 Média 2,07 N 10 N 10 N 10

CV (%) 3,73 CV (%) 7,83 CV (%) 7,32

A repetibilidade é calculada pelo desvio padrão[30]. Calcula-se também um parâmetro chamado

coeficiente de variação que definido como a razão entre o desvio padrão e média multiplicando por 100

de modo a que o resultado seja expresso em percentagem.

Inicialmente pretendia-se implementar um método adequado para amostras de pescado, no

entanto, decidiu-se também fazer o estudo em farinhas de peixe por ser um tipo de amostra em que a

determinação de arsénio é requisitada algumas vezes e em vegetais por ser possível que estes

47

contenham arsénio devido, principalmente, á utilização de pesticidas com arsénio na sua composição.

Como se observa na tabela, as percentagens de repetibilidade (CV%) obtidas foram 3,73, 7,83 e 7,32

para farinha de peixe, pescado e vegetais respetivamente. Os valores de repetibilidade obtidos podem

ser comparáveis aos valores de repetibilidade dos métodos de determinação de cádmio e chumbo por

absorção atómica realizados no mesmo laboratório que se encontram na ordem dos 10 - 15%.

A precisão intermédia é calculada da mesma forma que a repetibilidade, sendo que as análises

devem ser realizadas em condições diferentes. A determinação de precisão intermédia recorre a

análises que devem ocorrer ao longo de vários dias, na fase de validação de um método ou sempre

que se altere uma parte relevante do método. Esta é a medida de repetibilidade intra-laboratorial com

maior relevância. Os cálculos apresentam-se na Tabela 17.

Tabela 17- 15 leituras de concentração em 3 amostras que representam matrizes diferentes, farinha de peixe,

pescado e vegetais para determinação da repetibilidade do método

Pescado Farinha de Peixe Vegetais

Data Nº

amostra mg/kg Data

Nº amostra

mg/kg Data Nº

amostra mg/kg

04/07/2018

1

1,19 03/07/2018 5,06 09/07/2018 1,76

1,03 4,47 1,7

1,03 4,95 1,9

0,94 4,86 1,72

1,00 4,98 1,71

0,97 4,66 1,69

0,97 04/07/2018 5,18 1,79

1,20 2 4,08 1,71

1,10 4,98 14/07/2018 3 2,00

0,91 5,47 2,03

09/07/2018

0,90 09/07/2018 3,94 2,07

0,81 4,43 2,10

1,07 3,40 1,83

1,04 3,64 2,08

1,15 3,42 1,90

Desvio padrão 0,110 Desvio padrão 0,663 Desvio padrão 0,155 Média 1,02 Média 4,50 Média 1,87 N 15 N 15 N 15

CV (%) 10,80 CV (%) 14,72 CV (%) 8,30

No cálculo da precisão intermédia, á semelhança do que foi feito no cálculo da repetibilidade,

analisou-se amostras que representam três tipos de matrizes de interesse para este estudo.

Realizaram-se 15 leituras por amostra, distribuídas por dois e três dias, e como se observa na tabela,

as percentagens de precisão intermédia (CV%) obtidas foram 10,80, 14,72 e 8,30 para farinha de peixe,

pescado e vegetais respetivamente. Na determinação da precisão intermédia, as análises deveriam

idealmente ter sido distribuídas por um mínimo de 10 dias[30], como tal deveriam ser realizadas mais

análises e recalcular este parâmetro.

48

O coeficiente de variação aceite no cálculo da precisão está relacionado com a concentração do

analito na amostra e é definido pela equação[31]:

𝐶𝑉(%) = 21−0,5𝑙𝑜𝑔𝐶 (8)

Em que C é a concentração do analito em percentagem. Desse modo, substituindo-se os níveis

de concentração nessa equação obtém-se os valores CV apresentados na Tabela 18.

Tabela 18- coeficiente de variação em função da concentração de analito[31]

Concentração do analito (%) Coeficiente de variação (%)

1 2

10-1 2,8

10-2 4

10-3 5,6

10-4 8

10-5 11

10-6 (ppm) 16

10-7 23

10-8 42

10-9 (ppb) 45

Observando o valor de CV para um nível de concentração de 10-6 % (ppm), pois é o nível que

melhor se adequa ás concentrações das amostras analisadas, verifica-se que este é 16%. Este valor é

superior aos valores obtidos na determinação da repetibilidade e precisão intermédia, pelo que se

conclui que o método possui precisão satisfatória.

49

5.8 Exatidão

A exatidão é calculada durante a fase de validação do método e deve ser recalculada sempre

que se efetue uma alteração relevante ao método. Idealmente a determinação da exatidão deve

recorrer a materiais de referência e a ensaios inter-laboratoriais. Quando tal não é possível, como no

caso deste trabalho, a exatidão é determinada com base em análises de amostras fortificadas[32].

Tabela 19 resultados de ensaios de recuperação com concentrações distribuídas ao longo da gama de trabalho para cálculo da exatidão do método

Como se pode observar na Tabela 19, foram selecionadas amostras e fortificadas de modo a

ocorrer um aumento de concentração em arsénio de 10 ppb, 30 ppb e 40 ppb. As concentrações das

amostras fortificadas distribuíram-se ao longo da gama de trabalho. Não foi, no entanto, possível

encontrar uma amostra com concentração de arsénio próxima o suficiente de zero para que esta

pudesse ser fortificada de modo a que apresentasse uma concentração próxima do LQ e testar a

exatidão na parte inferior da gama de trabalho. Realizaram-se dez análises por amostra em que a

maioria gerou resultados de recuperação satisfatórios segundo o critério definido a priori, ou seja, que

se encontram entre 80% e 120%. Este critério foi estabelecido com base em outros métodos realizados

no laboratório contudo, existem valores de recuperação tabelados em função da concentração de

analito sugeridos pelo manual da Association of Official Analytical Chemists (AOAC). Estes valores são

apresentados na Tabela 20.

Concentração

amostra ug/L

Concentração

obtida ug/L

%

Recuperação

Concentração

amostra ug/L

Concentração

obtida ug/L

%

Recuperação

Concentração

amostra ug/L

Concentração

obtida ug/L

%

Recuperação

12,10 22,27 101,70 6,08 29,83 79,17 6,08 43,28 93,00

12,10 16,54 ----- 3,09 30,29 90,67 3,09 47,39 110,75

12,10 20,87 87,70 3,90 30,93 90,10 3,90 41,23 93,33

12,10 22,68 105,80 3,29 31,51 94,07 3,29 41,35 95,15

12,10 22,51 104,10 5,93 31,45 85,07 5,93 42,00 90,18

12,10 20,89 87,90 5,13 35,70 101,90 5,13 42,10 92,43

12,10 21,15 90,50 1,44 27,40 86,53 1,44 41,90 101,15

12,10 20,05 79,50 2,04 31,13 96,97 2,04 43,98 104,85

12,10 20,84 87,40 7,54 28,41 69,57 7,54 46,12 96,45

12,10 20,83 87,30 9,14 32,22 76,93 9,14 44,33 87,98

Média 92,43 Média 87,10 Média 96,53Desv Pad 9,13 Desv Pad 9,80 Desv Pad 7,05

CV (%) 9,87 CV (%) 11,25 CV (%) 7,31

50

Tabela 20- Recuperação do analito em função da concentração[33]

Concentração de analito (%) Intervalo de recuperação aceite (%)

≥ 10 98-102

≥ 1 97-103

≥ 0,1 95-105

≥ 0,01 90-107

≥ 0,001- ≥ 0,00001 80-110

≥ 0,000001 60-115

≥ 0,0000001 40-120

As concentrações das amostras fortificadas encontram-se entre 20 µg/L e 50 µg/L o que

corresponde á penúltima linha da Tabela 20. Como tal, para que o método seja considerado exato a

percentagem de recuperação deve encontrar-se entre 60 e 115%. Tal é verificado nas diferentes

amostras.

Os resultados de recuperação não aparentam ter nenhuma tendência com o aumento de

concentração ao longo da gama de trabalho, adicionalmente, apenas se estudou a exatidão em

concentrações que se encontram a cerca de meio da gama de trabalho ou superiores. Teria sido

interessante estudar a exatidão em concentrações próximas do limite inferior da curva de calibração,

porém não foi encontrada uma amostra adequada e utilizar padrões nesta determinação não seria

muito relevante devido á ausência total de efeito de matriz.

5.9 Incertezas

As incertezas associadas ao método devem ser calculadas na fase de validação e reavaliadas

anualmente. O cálculo da incerteza é baseado na incerteza expandida após combinação das

componentes de incerteza associadas à precisão e exatidão.

Inicialmente são calculadas incertezas associadas á precisão (Sprec) através do desvio padrão,

de resultados de Padrões de Controlo em condições de precisão intermédia e da análise de duplicados.

51

Calcula-se também a incerteza associada á exatidão, idealmente com recurso a ensaios inter-

laboratoriais. Como tal não foi possível, a incerteza associada á exatidão é calculada com base nos

resultados dos ensaios de recuperação como sendo a razão entre o desvio padrão e a raiz do número

de amostras utilizadas nos ensaios de recuperação. A exatidão tem uma incerteza associada de 3,95%.

As incertezas referidas são utilizadas no cálculo da incerteza combinada que considera a

incerteza associada á precisão e a incerteza associada á exatidão[34]. A incerteza combinada é

calculada como:

𝑢𝑐𝑜𝑚𝑏 = √𝑃𝑖2 + 𝐸𝑥𝑎𝑐𝑡2 (10)

Em que PI corresponde á incerteza da precisão e Exat corresponde á incerteza da exatidão.

Os cálculos preliminares apresentam-se na Tabela 21.

Tabela 21- cálculo da incerteza combinada no LQ e na gama de trabalho com passe no desvio padrão dos padrões de controlo de duplicados

No LQ Através de

Na gama de trabalho Através de

Na gama de trabalho

Através

de

Sprec 4,30 padrão controlo 10

ppb Sprec 4,47 Padrão controlo 50

ppb Sprec 3,44 Dups

uexact 3,95 uexact 3,95 uexact 3,95

ucomb 5,84 ucomb 5,27 ucomb 5,33

Finalmente calcula-se a incerteza expandida, duplicando o valor da incerteza combinada.

Calculando a incerteza expandida no LQ com base no padrão de controlo de 10 ppb obteve-se o

resultado de 11,7%. Calculando a incerteza expandida na gama de trabalho com base no padrão de

controlo de 50 ppb obteve-se o resultado de 10,5%. Calculando a incerteza expandida na gama de

trabalho com base na análise de duplicados obteve-se o resultado de 10,5%.

Observa-se valores de incerteza na ordem dos 10%. O valor superior de incerteza está associado

ao LQ e foi calculado com base na análise do menor padrão de controlo. À semelhança dos critérios

de aceitação usados pelo laboratório, escolhe-se a maior incerteza, assim sendo, podemos considerar

uma incerteza de 11,7% para o método implementado.

52

6 Trabalho futuro

Deverão ser aplicadas melhorias em diferentes partes do método. Será necessário diminuir as

interferências de matriz, que são notórias em algumas amostras, o que até à ao momento não foi

possível pois, simplesmente diminuir a toma ou aumentar o volume final levaria a uma subida dos

limites de deteção e quantificação.

Um dos fatores que poderá ser responsável por resultados inconsistentes e deve ser melhor

estudado no futuro reside no programa de temperatura no espetrofotómetro de absorção atómica que

deve ser alterada de modo a minimizar o ruído observado no espectro de absorção, porém, supõem-

se que a principal melhoria reside em recorrer a outro tipo de lâmpada (EDL), substituindo a lâmpada

de cátodo oco, para aumentar a intensidade do sinal. Lâmpadas de descarga sem elétrodo fornecem

intensidade superior e linhas de emissão mais estreitas, o que produz uma maior razão entre o sinal e

ruido do que as lâmpadas de cátodo oco. As vantagens de lâmpadas EDL são observadas

principalmente na análise de elementos voláteis como As, Sb, Bi, Cd, Hg, Rb, Sn, Te, etc. As elevadas

intensidades de emissão atingidas por lâmpadas EDL permitem alcançar limites de deteção menores

relativamente às lâmpadas de cátodo oco[35].

Caso seja possível atingir menores limites de deteção e quantificação, seria importante

implementar também um método de extração de arsénio inorgânico pois, este possui também limites

estipulados por lei para além do arsénio total que foi tratado nesta tese. Além disso seria de interesse

para a população que se realizasse um estudo em que se analisa e compara os níveis de arsénio em

diferentes tipos de alimentos, diferentes espécies de pescado, diferentes órgãos e diferentes produtos

vegetais, visto que o objetivo principal deste trabalho residiu na implementação de um método analítico

sendo o estudo da concentração de arsénio em diferentes tipos de amostra um objetivo secundário que

não se realizou.

53

7 Conclusão

Após cinco meses de investigação conseguiu implementar-se um método adequado á

determinação de arsénio em pescado. Com alguns ajustes, o método deve ser validado e ser utilizado

no laboratório como método acreditado terminando a necessidade de sub-contratar as análises de

arsénio a outras empresas.

O método desenvolvido tinha como objetivo analisar amostras de pescado, no entanto, em

Portugal não existe legislação que limite a concentração de arsénio em pescado. Existem, no entanto,

diretivas que limitam a concentração de arsénio noutro géneros alimentícios. Uma das referidas

diretivas é a diretiva 2009/141/CE que estabelece limites de arsénio total em vários tipos de alimentos,

principalmente alimentos para animais, em que os limites se encontram entre 2 e 100 mg/kg. Tendo em

conta os limites estabelecidos na diretiva 2009/141/CE, o método implementado seria adequado pois

possui um LQ de 0,7 mg/kg que é inferior a todos os limites tabelados na referida diretiva.

No regulamento (UE) 2015/1006 ficou estipulado o limite de arsénio na forma inorgânica em

vários tipos de arroz e produtos feitos á base de arroz. Estes limites variam entre 0,10 e 0,30 mg/kg, o

que torna o método implementado inadequado para analisar este tipo de amostras visto que o LQ é

superior a todos os limites tabelados neste regulamento. Adicionalmente, será necessário adicionar ao

método um passo que permita extrair arsénio na forma inorgânica.

Para que no futuro, o método se torne mais abrangente, em termos do tipo de mostras possíveis

de analisar, é imperativo que os limites de deteção e quantificação atinjam valores inferiores ao valor

atual que se situa em 0,7mg/kg. Observando os limites tabelados no regulamento (UE) 2015/1006 e de

modo a poder garantir que são respeitados os limites de arsénio na maioria dos géneros alimentícios,

o limite de quantificação deveria ser inferior a 0,1 mg/kg.

54

8 Referências Bibliográficas

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35- Beaty RD, Kerber JD. Concepts, Instrumentation and Techniques in atomic absorption

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56

9 Anexos

9.1 Resultados preliminares

Neste capítulo são descritos detalhadamente os resultados e condições utilizadas até se fixarem as

condições de trabalho finais.

A 09/05/2018 realizou-se um ensaio em que os volumes de reagentes utilizados foram 5 ml de

HNO3 e 3 ml H2O2. As amostras foram digeridas em forno micro-ondas segundo o seguinte programa

de potência: 3 min a 300 W, 1 min de repouso, 4 min a 500 W, 3 min a 650 W e 3 min a 900 W. O

volume final foi 50 ml.

TabelaA 1- resultados do ensaio realizado a 09/05/2018 com o objetivo de calcular a recuperação de arsénio e a precisão em que a toma foi de 0,25 g e o volume final 50 ml

Amostra Toma (g) As 105µg/L (µl) Concentração (µg/L) Concentração

esperada (µg/L)

Recuperação %

1 0,2602 --- 121,7 --- ---

1R 0,2500 10 128,7 141,7 35,1

1RD 0,2587 10 130,6 141,7 44,6

2 0,2543 --- 9,39 --- ---

2R 0,2549 20 43,69 49,39 85,8

2RD 0,2548 20 48,09 49,39 96,8

Como se observa na TabelaA 1, a recuperação deste método cumpriu o critérios de aceitação,

estabelecido no laboratório para métodos semelhantes, que dita que esta seja entre 80 e 120% no

entanto, e apesar de não estarem estabelecidos limites de concentração de arsénio no pescado

decidiu-se alterar os parâmetros operatórios para se obter um limite de quantificação inferior para que

o método seja adequado a outro tipo de amostras que possam ter limites estipulados por lei como o

arroz.


HNO3 e 3 ml H2O2. As amostras foram digeridas em forno micro-ondas segundo o seguinte programa


volume final foi 20 ml. Os pontos da curva de calibração foram: 5, 10, 25, 50 e 100 µg/L. Os balões de

57

50 ml foram substituídos por balões volumétricos de 20 ml de modo a que o limite de quantificação

decrescesse para 0,4 µg/g de amostra. Foi também feita uma fortificação do ensaio em branco, que

consiste nos reagentes utilizados na digestão na ausência de amostra, para se poder averiguar se a

presença ou ausência da matriz da amostra teria influência nos resultados, que se observam na

TabelaA 2.

TabelaA 2- resultados do ensaio realizado a 10/05/2018 com o objetivo de calcular a recuperação de arsénio e a precisão em que a toma foi 0,25 g e o volume final 20 ml

Amostra Toma (g) As 500 µg/L (µl) Concentração (µg/L) Concentração

esperada (µg/L)

Recuperação %

1 0,2602 --- 0 --- ---

1D 0,2500 --- 0 --- ---

1R 0,2587 500 7,33 12,5 58,6

1RD 0,2543 500 9,99 12,5 79,9

1R 0,2549 1000 18,31 25 73,2

1RD 0,2548 1000 17,74 25 70,9

Branco --- --- 0 --- ---

Branco R --- 250 2,29 6,25 36,6

Neste método utilizou-se uma solução de fortificação com menor concentração, para que os

volumes utilizados fossem maiores, de forma a evitar erros derivados de se pipetar volumes muito

pequenos. Neste caso, apesar de se ter empregue os mesmos volumes de reagentes, a mesma toma

e o mesmo programa de potências que no método descrito anteriormente, as recuperações foram

insatisfatórias para todos os volumes, de solução de fortificação, utilizados. Observou-se ainda que a

menor recuperação foi conseguida no ensaio em branco, o que não permite tirar conclusões sobre a

influência da presença da matriz. Estes resultados sugerem que ocorreu um erro experimental.

A 14/5/2018 os volumes de reagentes utilizados foram 5 ml de HNO3 e 3 ml de H2O2. As

amostras foram digeridas em forno micro-ondas segundo o seguinte programa de potência: 5 min de

potência crescente até 500 W, 6 min a 500 W. O volume final foi 20 ml. Os pontos da curva de calibração

foram: 10, 25, 50, 75 e 100 µg/L. O limite de quantificação seria 0,2 µg/g de amostra. Os resultados

apresentam-se na TabelaA 3.

58

TabelaA 3- resultados do primeiro ensaio realizado a 14/05/2018 com o objetivo de calcular a recuperação de arsénio e a precisão em que a toma foi 1 g e o volume final 20 ml

Amostra Toma (g) As 500 µg/L

(µl)

Concentração (µg/L) Concentração

esperada (µg/L)

Recuperação %

1 1,0339 --- 0 --- ---

1R 1,0718 1000 12,72 25 50,9

1RD 1,0033 1000 12,95 25 51,8

No mesmo dia foi realizada uma digestão segundo o seguinte programa de potência: 5 min de

potência crescente até 450 W, 15 min a 450 W. Estas amostras foram lidas nas mesmas condições das

anteriores e os resultados podem ser consultados na TabelaA 4.

TabelaA 4- resultados do segundo ensaio realizado a 14/05/2018 com o objetivo de calcular a recuperação de arsénio e a precisão em que a toma foi 1 g e o volume final 20 ml


(µg/L)

Concentração

esperada (µg/L)

Recuperação %

2 1,0144 --- 0 --- ---

2D 1,0957 --- 0 --- ---

2R 1,0700 1000 3,09 25 12,4

2RD 1,0268 1000 5,53 25 22,1

Foram testados os métodos de digestão, com as curvas de potência referidas, para se realizar

uma comparação dos resultados dos ensaios de recuperação com os do método utilizado nos dias

anteriores. Os métodos utilizados neste dia, não expõem as amostras a potências e temperaturas tão

elevadas que podem ser responsáveis por perdas do analito. No entanto, os resultados também não

se mostraram satisfatórios. Tal pode acontecer por continuar a ocorrer perda do analito ou por a matéria

orgânica não ter sido completamente degradada e esta interferir nas leituras levando a uma subestima

do valor devido a interferências causadas pelo efeito de matriz.


HNO3 e 2 ml de H2O2. As amostras foram digeridas em forno micro-ondas segundo o seguinte programa

de potência: 5 min a 900 W. O volume final foi 10 ml. Os pontos da curva de calibração foram: 5, 10,

25, 50 e 75 µg/L. O limite de quantificação seria 0,05 µg/g de amostra. Como a leitura do padrão 5 µg/L

59

apresenta um desvio padrão elevado não será correto fazer a curva de calibração com concentrações

nesta gama o que torna inviável obter este limite de quantificação.

TabelaA 5- resultados do ensaio realizado a 22/05/2018 com o objetivo de calcular a recuperação de arsénio e a precisão em que a toma foi 1 g e o volume final 10 ml


(µl)


esperada (µg/L)

Recuperação %

1 1,0030 --- 0 --- ---

1R 0,9981 250 7,70 25 30,8

1RD 1,0097 250 8,23 25 32,9

Da mesma forma que nos ensaios anteriores realizados em condições diferentes, os resultados

dos ensaios de recuperação, expressos na TabelaA 5, não satisfizeram os critérios de aceitação e

coloca-se a hipótese de o método de digestão aplicado ser demasiado agressivo e provocar perdas do

analito.




50, 75 e 100 µg/L. O limite de quantificação seria 0,1 µg/g de amostra. Os resultados apresentam-se

na TabelaA 6.

TabelaA 6- resultados do primeiro ensaio realizado a 24/05/2018 com o objetivo de calcular a recuperação de arsénio e a precisão em que a toma foi 1 g e o volume final 10 ml


(µl)


esperada (µg/L)

Recuperação %

1 1,0121 --- 0 --- ---

1R 1,0006 250 0 25 0

1RD 0,9981 250 0 25 0

As amostras aparentavam-se mal digeridas e supôs-se que a presença de matéria orgânica

fizesse com que a medição estivesse a ser subestimada. Para testar esta teoria, no mesmo dia, repetiu-

se o processo realizando a digestão em forno de micro-ondas a 1400 W durante 5 min. Estas amostras

foram lidas na mesma curva de calibração que as anteriores.

60

TabelaA 7- resultados do segundo ensaio realizado a 24/05/2018 com o objetivo de calcular a recuperação de arsénio e a precisão em que a toma foi 1 g e o volume final 10 ml


(µl)

Concentração

(µg/L)

Concentração

esperada (µg/L)

Recuperação %

2 0,9991 --- 0 --- ---

2R 1,0016 250 0 25 0

2RD 1,0025 250 0 25 0

Observa-se na TabelaA 7 que continuou a perder-se ou não se detetar o arsénio que deveria

estar presente no ensaio de recuperação supôs-se que a matriz desta amostra em particular, miolo de

camarão, fosse problemática por motivos desconhecidos, ou que a solução final simplesmente tivesse

uma concentração muito elevada.



de potência: 3 min a 300 W, 1 min de repouso, 4 min a 500 W, 3 min a 650 W e 3 min a 900 W. Voltou

a utilizar-se este programa de potência pois foi que apresentou melhores resultados até ao momento.

O volume final foi 10 ml. Os pontos da curva de calibração foram: 10, 20, 30, 40 e 50 µg/L. O limite de

quantificação seria 0,1 µg/g de amostra.

TabelaA 8- resultados do ensaio realizado a 07/06/2018 com o objetivo de calcular a recuperação de arsénio e a precisão em que a toma foi 1 g e o volume final 10 ml


(µl)

Concentração

(µg/L)

Concentração esperada

(µg/L)

Recuperação %

1 1,0485 --- 3,84 --- ---

1R 1,0232 125 0 12,5 0

1RD 1,0438 125 0 12,5 0

1R2 1,0457 250 0 25 0

1R2D 1,0418 250 0 25 0

Branco --- --- 0 --- ---

61

A recuperação nula observada na TabelaA 8, recorrendo a um programa de digestão utilizado

anteriormente com alguma recuperação, embora insuficiente, sugere que o efeito de matriz, provocado

por esta amostra ou por a sua concentração ser muito elevada, impede a deteção do analito e a

concentração de amostra terá de ser diminuída, aumentando o volume final e/ou diminuindo a massa

da toma.




volume final foi 10 ml. Os pontos da curva de calibração foram: 10, 20, 30, 40 e 50 µg/L. O limite de


TabelaA 9- resultados do ensaio realizado a 11/06/2018 com o objetivo de calcular a recuperação de arsénio e a precisão em que a toma foi 0,25 g e o volume final 10 ml


(µl)

Concentração

(µg/L)

Concentração

esperada (µg/L)

Recuperação %

1 0,2564 --- 19,95 --- ---

1R 0,2523 250 30,43 55,43 41,9

1RD 0,2589 250 30,34 55,34 41,6

Branco --- --- 11,96 --- ---

TabelaA 10- concentrações obtidas na leitura dos padrões de controlo a 11/06/2018

Padrão (µg/L) Concentração (µg/L)

10 18,85

50 116,8

Os resultados dos ensaios de fortificação permanecem insatisfatórios, como observado na

TabelaA 9. Os padrões que correspondem aos pontos de menor e maior concentração da curva de

calibração não apresentaram concentrações adequadas, como se observa na TabelaA 10. Os padrões

de concentrações 10 µg/L e 50 µg/L foram preparados no próprio dia partindo de soluções intermédias

de arsénio de 105e 103ppb respetivamente. Visto que a fortificação das amostras também recorre á

solução de 103ppb decidiu-se que os resultados são inconclusivos e que a experiência deveria ser

repetida após refazer os padrões e soluções intermédias.

62





quantificação seria 2 µg/g de amostra.

TabelaA 11- resultados do primeiro ensaio realizado a 12/06/2018 com o objetivo de calcular a recuperação de arsénio e a precisão em que a toma foi 0,25 g e o volume final 50 ml

Amostra Toma (g) Fortificada (µl) Concentração (µg/L) Concentração

esperada (µg/L)

Recuperação %

1 0,2967 --- 13,39 --- ---

1R 0,3063 1250 30,11 38,39 66,9

1RD 0,3067 1250 38,18 38,39 99,2

Branco --- --- 30,36 --- ---


Padrão (µg/L) Concentração (µg/L)

10 44,23

50 57,71

Consultando a TabelaA 11 verifica-se que com as condições utilizadas conseguiu-se que um

dos duplicados do ensaio de recuperação cumprisse os critérios de aceitação, no entanto, o mesmo

não ocorreu com o outro duplicado. Decidiu-se repetir o ensaio devido ao elevado valor do branco e

aos valores incoerentes dos padrões, que se observam na TabelaA 12.

63

TabelaA 13- resultados do segundo ensaio realizado a 12/06/2018 com o objetivo de calcular a recuperação de

arsénio e a precisão em que a toma foi 0,25 g e o volume final 50 ml

Amostra Toma (g) Fortificada (µl) Concentração

(µg/L)

Concentração

esperada (µg/L)

Recuperação %

1 0,2938 --- 22,45 --- ---

1R 0,2942 1250 46,16 47,45 95,6

1RD 0,2940 1250 46,06 47,45 95,2

Branco --- --- 14,30 --- ---


Padrão µg/L Concentração µg/L

10 28,67

50 71,36

Após a repetição do ensaio, ambos os duplicados do ensaio de recuperação produziram

resultados que cumprem os critérios, como se observa na TabelaA 13. As concentrações determinadas

para o ensaio em branco e para os padrões continuam a ser elevadas, como se observa na TabelaA

14. Nos próximos ensaios, será fixo o volume final e será alterada a massa da toma para descobrir a

combinação que permite obter ensaios de recuperação com resultados aceitáveis e o limite de

quantificação inferior.






64

TabelaA 15- resultados do primeiro ensaio realizado a 14/06/2018 com o objetivo de calcular a recuperação de arsénio e a precisão em que a toma foi de 1 g e o volume final 50 ml


(µl)

Concentração

(µg/L)

Concentração

esperada (µg/L)

Recuperação %

1 1,0186 --- 7,26 ---

1R 1,0035 500 11,20 17,26 40,5

1RD 1,0135 500 10,71 17,26 35,6

Branco --- --- 0 --- ---

Observando a TabelaA 15, conclui-se que a combinação de toma de 1g e volume final de 50

ml produziu resultados insatisfatórios nas amostras fortificadas pelo que, nos ensaios seguintes a

massa da toma será reduzida até que se obtenha o resultado desejado.

A 14/06/2018 realizou-se um ensaio em que os volumes de reagentes utilizados foram 5 ml de HNO3 e

3 ml de H2O2. As amostras foram digeridas em forno micro-ondas segundo o seguinte programa de

potência: 3 min a 300 W, 1 min de repouso, 4 min a 500 W, 3 min a 650 W e 3 min a 900 W. O volume

final foi 50 ml.

TabelaA 16- resultados do ensaio realizado a 14/06/2018 com o objetivo de calcular a recuperação de arsénio e a precisão em que a toma foi de 0,5 g e o volume final 50 ml


(µl)

Concentração

(µg/L)

Concentração

esperada (µg/L)

Recuperação %

1 0,4975 --- 15,91 --- ---

1R 0,5067 500 20,98 25,91 50,7

1RD 0,5009 500 19,80 25,91 38,9

Branco --- --- 3,05 --- ---

Apesar de a toma de 0,5 g ter produzido resultados inadequados expressos na TabelaA 16,

neste dia, decidiu-se aumentar a toma e observar o resultado pois já se tinham obtido resultados

satisfatórios anteriormente com esta toma.

65

9.2 Análise de “farinha de peixe” e

método de adição padrão

A 28/05/2018, realizou-se um ensaio em que os volumes de reagentes utilizados foram 3 ml de



30, 40 e 50 µg/L visto que até à data todas as amostras se encontravam nesta gama. O limite de

quantificação seria 0,1 µg/g de amostra. Os resultados podem ser observados na TabelaA 17.

TabelaA 17- resultados do ensaio realizado a 28/05/2018 com o objetivo de calcular a recuperação de arsénio e a

precisão em que a toma foi 1 g e o volume final 10 ml

Amostra Toma (g) Fortificada (µl) Concentração (µg/L) Concentração

esperada (µg/L)

Recuperação %

1 0,9947 --- 103,01 --- ---

1R 1,001 250 103,2 128,01 0,76

1RD 1,0047 250 108,7 128,01 22,8

Branco --- --- 9,81 --- ---

BrancoR --- 250 27,22 34,81 69,6

Sendo que a amostra se trata de uma farinha de feixe, que contém mais matéria orgânica do

que as amostras de pescado, em geral, deverá ter interferências de matriz mais consideráveis. As

amostras analisadas neste dia apresentaram concentrações superiores á do ponto da reta de

calibração de concentração superior, no entanto, tal é solucionado pela diluição automática que permite

enquadrar a amostra na gama de trabalho sem se efetuar nenhuma extrapolação. Como a amostra

utilizada neste dia também possui caraterísticas particulares, não possível retirar conclusões sobre a

eficácia do método de digestão.

A 04/06/2018, para averiguar a veracidade deste pressuposto, de farinha de peixe provocar um

efeito de matriz e impedir a determinação correta da concentração do analito, recorreu-se ao método

da adição padrão. Como no ensaio anterior a toma foi de 1 g e volume final foi 10 ml, digeriu-se 10 g

de farinha de peixe, dividida por oito vasos, que foram reunidas num balão volumétrico de 100 ml de

forma a se obter a mesma concentração que se tinha no final do método de extração aplicado

anteriormente.

66

Utilizou-se uma abordagem que recorre á diluição automática realizada pelo sistema “Furnace

autosampler As 900” em que se utiliza a solução preparada de farinha de peixe digerida e esta

adicionada como se da solução de diluição se tratasse. Os volumes em µl de solução de arsénio 103

ppb e de solução de farinha de peixe 0,1g/ml utilizados na preparação de cada padrão podem ser

observados na TabelaA 18.

TabelaA 18- volumes em µl de solução de arsénio 103ppb e de solução de farinha de peixe 0,1g/ml utilizados para obtenção de cada padrão de calibração utilizado na obtenção da reta de calibração no espetrofotómetro de absorção atómica

Concentração µg/l As 103 µg/l (µl) Farinha de peixe (µl)

0 0 20

10 2 18

20 4 16

30 6 14

40 8 12

50 10 10

TabelaA 19- concentração definida para cada padrão de calibração e respetivas concentrações obtidas, com a primeira abordagem de adição padrão, por leitura no espetrofotómetro de absorção atómica

Concentração definida (µg/l) Concentração calculada (µg/l)

0 25,29

10 -9,57

20 0,17

30 35,43

40 40,47

50 58,21

67

As concentrações obtidas para cada padrão são expressas na TabelaA 19. O coeficiente de

correlação obtido foi 0,732361 e o declive da reta foi 0,00132. A abordagem referida não foi bem

concebida pois existe uma diminuição do volume pipetado da solução de farinha de peixe o que leva

uma menor concentração desta o que teoricamente levaria a uma diminuição do efeito de matriz com

o aumento da concentração dos padrões.

Utilizou-se outro método, recorrendo á diluição automática, porém desta vez o a concentração

de solução de farinha de peixe foi mantida constante em todos os padrões de modo a que o feito de

matriz também não se alterasse nos ao longo dos pontos da curva de calibração. Os volumes utilizados

podem observar-se na TabelaA 20.

TabelaA 20- volumes em µl de solução de arsénio 103ppb, solução de diluição e de solução de farinha de peixe 0,1g/ml utilizados para obtenção de cada padrão de calibração utilizado na obtenção da reta de calibração no espetrofotómetro de absorção atómica

Concentração (µg/l) As 103 µg/l (µl) diluente (µl) Farinha de peixe (µl)

0 0 20 10

10 2 18 10

20 4 16 10

30 6 14 10

40 8 12 10

50 10 10 10

TabelaA 21- concentração definida para cada padrão de calibração e respetivas concentrações obtidas, com a segunda abordagem de adição padrão, por leitura no espetrofotómetro de absorção atómica

Concentração definida µg/l Concentração calculada µg/l

0 -0,46

10 -19,45

20 63,12

30 18,38

40 53,97

50 34,44

68

As concentrações obtidas para cada padrão são expressas na TabelaA 21. O coeficiente de

correlação obtido foi 0,588712 e o declive da reta foi 0,00025. Após, as duas abordagens do método

de adição padrão com recurso ao sistema de diluição automática terem produzido resultados que não

permitiram obter uma reta de calibração que satisfizesse, ou estivesse perto de satisfazer, o critério que

dita que o coeficiente de correlação de ser igual ou superior a 0,995 recorreu-se a diluição manual na

preparação dos padrões, como demonstrado na TabelaA 22, como tentativa de verificação dos

resultados, embora esta se previsse redundante.

TabelaA 22- volumes em µl de solução de arsénio 103ppb e volumes em ml de água e de solução de farinha de peixe 0,1g/ml utilizados para obtenção de cada padrão de calibração utilizado na obtenção da reta de calibração

no espetrofotómetro de absorção atómica

Concentração (µg/l) Volume final (ml) As 103 µg/l (µl) Farinha de peixe

(ml)

Água (ml)

0 10 0 9 1

10 10 100 9 0,9

20 10 200 9 0,8

30 10 300 9 0,7

40 10 400 9 0,6

50 10 500 9 0,5

Como esperado, não foi possível atingir um coeficiente de correlação igual ou superior a 0,995 sendo

os resultados obtidos apresentados na TabelaA 23.

69

TabelaA 23- concentração definida para cada padrão de calibração e respetivas concentrações obtidas, com a

abordagem de diluição manual de adição padrão, por leitura no espetrofotómetro de absorção atómica

Concentração definida (µg/l) Concentração calculada (µg/l)

0 -39,28

10 20,20

20 58,60

30 54,76

40 30,28

50 25,44

Nas tabelas anteriores podem observar-se pontos resultados de concentrações negativas que

não podem ser considerados. Estes pontos deveriam ser desprezados, apesar de se terem observado

resultados de concentrações negativas nas diferentes abordagens de método de adição padrão. Assim

sendo, os testes anteriores deveriam ter sido repetidos, contudo, não foi possível ter acesso a mais

amostras deste tipo ao longo do estágio. Visto que o método da adição padrão foi inconclusivo, leram-

se os padrões segundo a reta de calibração com os pontos: 10, 25, 50, 75 e 100 µg/L, declive 0,00273

e coeficiente de correlação 0,997966. As concentrações obtidas observam-se na TabelaA 24.

TabelaA 24- concentração definida para cada padrão de calibração e respetivas concentrações obtidas, com a abordagem de diluição manual de adição padrão, por leitura no espetrofotómetro de absorção atómica segundo a reta de calibração com os pontos: 10, 25, 50, 75 e 100 µg/L, declive 0,00273 e coeficiente de correlação 0,997966

Concentração definida µg/l Concentração calculada µg/l

0 51,26

10 55,86

20 71,36

30 57,41

40 60,50

50 68,18

70

Constatou-se que este tipo de matriz, na concentração utilizada, produz interferências

consideráveis e que afetam fortemente a quantificação do analito em questão. Não foi possível a

obtenção de uma reta de calibração com o método de adição padrão para comparação do declive desta

com o das retas de calibração obtidas anteriormente para averiguar se existem efeito de matriz, porém,

com os resultados obtidos pode concluir-se que esse efeito está de fato presente. Como tal, alguns

dos parâmetros devem ser alterados para que este possa ser aplicado a este tipo de matriz.

A 03/7/2018 realizou-se mais um ensaio com as mesmas condições dos anteriores, com o

objetivo de confirmar o resultado dos ensaios de recuperação de forma redundante. É de referir que foi

efetuada a fortificação de amostras com 500 µl e 1000 µl de uma solução de arsénio de concentração

1000 µg/L. Os resultados são apresentados na TabelaA 25.

TabelaA 25- resultados do ensaio realizado a 03/07/2018 com o objetivo de calcular a recuperação de arsénio e a precisão em que a toma foi de 0,75g e o volume final 50 ml


(µl)

Concentração

(µg/L)

Concentração

(mg/kg)

Concentração

esperada

(µg/L)

Recuperação

%

Branco --- 0,00 --- --- ---

1 0,7454 --- 41,36 2,77 --- ---

1R 0,7479 500 39,28 2,63 51,36 0

1RD 0,7504 500 42,75 2,85 51,36 0

1* 0,7493 --- 52,15 3,48 --- ---

1*R 0,7549 1000 39,51 5,23 62,15 0

1*RD 0,7541 1000 44,35 5,88 62,15 0

2 0,7496 --- 50,99 3,40 --- ---

2D 0,7497 --- 51,70 3,45 --- ---

3 0,7494 --- 32,89 4,39 --- ---

3D 0,7438 --- 33,29 4,48 --- ---

As amostras analisadas correspondem a farinhas de peixe. Em ensaios anteriores, este tipo de

matriz tinha mostrado ser problemático o que se verificou mais uma vez através dos resultados

71

insatisfatórios nos ensaios de recuperação. O motivo mais provável para os resultados nulos de

recuperação será o efeito de matriz considerável que está associado a este tipo de amostras que

possuem uma grande quantidade de matéria orgânica. Nos anexos podem ser encontrados mais

resultados, embora que não tenham sido realizados com as condições finais definidas para o método,

no capítulo “análise de farinhas de peixe e método de adição padrão”.

9.3 Análise pontual de “farinha de

bebé”

A 11/05/2018 realizou-se um ensaio, em que a toma foi de 1 ± 0,01g, com uma amostra de

“farinha de bebé”. Os volumes de reagentes utilizados foram 5 ml de HNO3 e 3 ml H2O2. As amostras

foram digeridas em forno micro-ondas segundo o seguinte programa de potência: 3 min a 300 W, 4 min

a 500 W, 6 min a 650 W. O volume final foi 20 ml. Os pontos da curva de calibração foram: 10, 25, 50,

75 e 100 µg/L. A toma foi aumentada para 1g, de modo a que o limite de quantificação fosse 0,2 µg/g

de amostra.

TabelaA 26- resultados do ensaio realizado a 11/05/2018 com o objetivo de calcular a recuperação de arsénio e a precisão numa amostra de “farinha de bebé”

Amostra Toma (g) As 1000 µg/L (µl) Concentração (µg/L) Concentração

esperada (µg/L)

Recuperação %

1 1,0044 --- 0 --- ---

1D 1,0039 --- 0 --- ---

1R 1,0182 500 8,85 12,5 70,8

1RD 1,0285 500 13,59 12,5 108,7

Observando a TabelaA 26, verifica-se alguma diferença nas leituras entre o ensaio e

recuperação e o seu duplicado, o que sugere que tenha ocorrido algum erro durante o procedimento

ou que a matriz em questão deverá ser tratada de um modo diferente.

A 17/05/2018 realizou-se um ensaio, com uma amostra de farinha bebé, em que a toma foi

cerca de 1 g. Neste caso, devido à reatividade da amostra e para evitar que a pressão dentro dos vasos

do forno de micro-ondas fosse excedida esta toma foi dividida por quatro vasos. Os volumes de

reagentes utilizados foram 2 ml de HNO3 e 2 ml de H2O2 por vaso. As amostras foram digeridas em

forno micro-ondas segundo o seguinte programa de potência: 5 min a 900 W. O volume final foi 20 ml.

72

Os pontos da curva de calibração foram: 10, 25, 50, 75 e 100 µg/L. O limite de quantificação seria 0,2

µg/g de amostra. Os resultados são apresentados na TabelaA 27.

TabelaA 27- resultados do ensaio realizado a 17/05/2018 com o objetivo de calcular a recuperação de arsénio numa amostra de “farinha de bebé”


(µg/L)

Concentração

esperada (µg/L)

Recuperação %

1.1 0,2518 125 --- --- ---

1.2 0,2526 125 --- --- ---

1.3 0,2441 125 --- --- ---

1.4 0,2439 125 --- --- ---

1 0,9924 500 0 --- ---

1R.1 0,2438 125 --- --- ---

1R.2 0,2554 125 --- --- ---

1R.3 0,2526 125 --- --- ---

1R.4 0,2462 125 --- --- ---

1R 0,998 500 14,66 25 58,6

O método aplicado a esta amostra não será necessário em amostras de pescado, por estas

não serem tão reativas, fazer uma toma de um grama por vaso não criará problemas de excesso de

pressão. Ao separar a toma por vários vasos, as perdas no passo de transferência das amostras para

os vasos e do conteúdo dos vasos para balões volumétricos serão superiores, pelo que esta abordagem

deve reservar-se a amostras com caraterísticas particulares. O resultado do ensaio de recuperação

continuou insatisfatório com o método utilizado.

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