IL PROBLEMA DEL CONTROLLODELL’OCRATOSSINA A

NELLA FILIERA DEL VINO

IL PROBLEMA DELLE MICOTOSSINE NEL VINO:CONTAMINAZIONE DA OCRATOSSINA A

E ASPETTI NORMATIVI

Certe muffe possono dare origine a tossine. Queste micotossine sono metabolitisecondari, spesso prodotti in piccole quantità, tossiche per l’uomo e che possono contaminare un gran numero di derrate alimentari.(1)Le muffe si trovano nel terreno, sul materiale vegetale e nei locali di stoccaggio.Sulle uve si possono sviluppare parecchi tipi di muffe. Oltre a Botrytis cinerea,responsabile della muffa grigia, si trovano normalmente muffe appartenenti ai generiAlternaria, Clasdosporium, Fusarium, Aspergillus e Penicillium. (2)La presenza della micotossina Ocratossina A è stata messa in evidenza nel vino, neisucchi d’uva e nell’uva passa a metà degli anni 90. Alcune analisi effettuate in Danimarca ed in Finlandia hanno mostrato che il vino poteva contenerne quantitàsignificative.(2) Da allora numerosi lavori, tra cui quelli svolti dall’ICV (Istituto cooperativo di viticoltura e del vino Montpellier Francia), hanno permesso di megliocomprendere l’importanza dell’OTA, i fattori di sviluppo e le possibilità di prevenzione.L’ONIVINS (Office National Interprofessional Des Vins) ha realizzato due indaginiper valutare l’importanza dell’Ocratossina A nei vini francesi.(2) Una, nel 1998,riguardava 265 vini, l’altra nel 2001 982 vini. Ne è emerso quanto segue:- il 75% dei vini non presentavano livelli rilevabili di OTA e nel 17% dei casi era aldi sotto di 0,5 µg/l;- l’Ocratossina A si può trovare in tutti i tipi di vino: DOC, IGT, vini da tavola, rossi, bianchi, rosati e passiti;- normalmente c’è più OTA nei vini rossi che nei bianchi e nei rosati;- nelle regioni mediterranee si ritrovano più vini con contenuti elevati di OTA. (3-4)Secondo le analisi realizzate in Europa dal 1996, si possono trovare concentrazionifino a 10 µg/l in certi vini, succhi d’uva o vini da dessert.Tutte le indagini compiute a partire dal 1999 mostrano che i vini mediterranei sonoquelli più soggetti alla contaminazione da OTA; tuttavia, anche se in misura diversa,anche i vini di altre regioni possono contenere OTA.La analisi realizzate dalla società Foulon-Sopagly (2) sui mosti destinati allaproduzione di succo d’uva mostrano che esiste un rischio medio in Provenza(Francia), Veneto e Mancha (Spagna).L’Ocratossina A è stata segnalata anche in altri paesi produttori d’oltreoceano (Australia, American, Africa del Sud) (5-6).In Italia meridionale il problema è più rilevante come è possibile verificare dallamappa delle zone viticole a rischio OTA riportata a pagina seguente.A conferma di quanto affermato illustriamo uno dei lavori pubblicati in letteraturascientifica che attesta queste considerazioni (C Brera, J.M. Soriano, F. Debegnach,M. Miraglia, Microchemical Journal 79 (2005) 109-113).

RAPPRESENTAZIONE GRAFICA DEL RISCHIO OTAIN DIVERSE ZONE VITICOLE

Il suddetto studio include l’analisi di 267 campioni di vino provenienti dall’Italiameridionale (Sicilia-Puglia) e dall’Ungheria, di cui 19 vini da dessert, 186 vini rossi, 11 vini rosati e 51 vini bianchi prodotti nelle annate dal 1997 al 2002. I risultatihanno rilevato che nessun campione dei vini Ungheresi era contaminato, mentre lasituazione era ben diversa per i vini Italiani:

TIPOLOGIA VINO CAMPIONI POSITIVI % RANGE RILEVATOng/mL

Vino rosso 84 0.01-4,00Vino da dessert 63 0,01-1,64Vino bianco 56 0,01-0,21Vino rosato 19 0,01-1,04

La normativa europea che regolamentava i limiti delle micotossine è stata emanata inritardo rispetto alle ricerche sperimentali, con il Regolamento CE n. 1525/98 del 16luglio 1998 che stabiliva i tenori massimi ammissibili di alcuni contaminanti deiprodotti alimentari. In questo regolamento non venivano riportati i limiti per l’uva e prodotti derivati, per cui il Ministero della Sanità con la circolare n. 10 del 9settembre 1999 intervenne stabilendo il contenuto massimo di OTA ammissibile in

matrici alimentari sopperendo parzialmente all’incompletezza del suddetto Regolamento.La Comunità Europea nel 2001 con il Regolamento CE n. 466/2001 nell’allegato II al punto 2 specifica il tenore di OTA in diverse matrici alimentari, anche in questanormativa non c’è un limite per il vino ma solo per le uve (vedi allegato estratto dallalegge).

Prodotto Tenore massimo ammissibile(µg/kg o ppb)

Metodo di campionamento Metodo d'analisi diriferimento

2.2. OCRATOSSINA A

2.2.1. Cereali (compreso riso egrano saraceno) e prodotti abase di cereali

2.2.1.1. Cereali non lavorati(compreso riso non lavorato egrano saraceno)

5 Direttiva 2002/26/CE dellaCommissione (*)

Direttiva 2002/26/CE

2.2.1.2. Tutti i prodotti derivatidai cereali (compresi i prodottilavorati a base di cereali ed icereali destinati al consumoumano diretto)

3 Direttiva 2002/26/CE Direttiva 2002/26/CE

2.2.2. Frutti essiccati della vite(uva passa di Corinto, uvapassa, uva sultanina)

10 Direttiva 2002/26/CE Direttiva 2002/26/CE

2.2.3. Caffé crudo e torrefatto eprodotti a base di caffé, vino,birra, succo d'uva, cacao,prodotti a base di cacao espezie

-

(*) GU L 75 del 16.3.2002, pag. 38.

Il Regolamento CE n. 466/2001 successivamente modificato, stabilisce che il metododi campionamento e la metodica di analisi devono essere conformi alla Direttiva2002/26/CE. In seguito quando verrà affrontata la problematica della determinazionedell’OTA verranno indicati i contenuti di tale direttiva.Recentemente il Regolamento CE n. 123/2005 modifica l’allegato II del Regolamento CE n. 466/2001 indicando il contenuto di OTA in diversi alimentifissando la concentrazione di 2 μg/Kgcome valore massimo accettabile per i vini ebevande a base di mosto d’uva. Per vini si intendono i bianchi, rossi, rosati, inclusi ivini frizzanti ma esclusi i vini liquorosi e i vini con un tenore alcolico pari o superioreal 15% volume.Nell’ultimo anno la Direttiva 2005/5/CE modifica la Direttiva 2002/26/CE perquanto riguarda il metodo di prelievo dei campioni per il controllo ufficialedell’OTA.

SINTESI, STRUTTURA CHIMICA ED EFFETTI DI TOSSICITÁDELL’OCRATOSSINA A:

L’OTA è sintetizzata dalle muffe dei generi Aspergillus e Penicillium. Aspergilluscarbonarius è il principale agente di contaminazione da OTA. Le prime osservazioniavevano mostrato che gli Aspergillus erano maggiormente diffusi nelle regionimeridionali, mentre i Penicillium sono predominanti nelle regioni settentrionali.Alcuni recenti lavori hanno permesso di identificare i principali funghi produttori diOTA sull’uva: si tratta di Aspergillus carbonarius, che è di gran lunga la specie conla maggiore capacità di sintesi, e di Aspergillus niger, la cui attività è tuttavia piùdebole. Sull’uva passa sipuò trovare anche Aspergillus ochraceus e Aspergillusfoetidus.(2)

Nel 2001 è stato effettuato un lavoro sperimentale che prevedeva 373 prelievi nellefasi di chiusura del grappolo, d’invaiatura e di vendemmia, su uve Carignan, Syrah,Sauvignon blanc e Moscato. La frequenza di comparsa dei funghi aumenta con losviluppo del grappolo. Tra le muffe riscontrate, quelle in grado di sintetizzare OTAerano il 10% circa all’invaiatura, ma ben il 47% alla maturità. Nel 96% dei casiqueste muffe appartenevano al genere Aspergillus (95% A. carbonarius e 1% A.niger), solo il 4% erano Penicillium (2).Si è anche evidenziato che nel Nord Europa il P.verrucosum rappresenta il principaleproduttore di OTA, in particolare a valori di bassa attività dell’acqua libera e a temperature intorno a 15 °C.Gli Aspergillus colonizzano molto precocemente l’uva, spesso prima dell’invaiatura, non sono capaci di perforare la buccia e non riescono quindi a penetrare all’interno

Aspergillus carbonarius

Aspergillus niger

dell’acino se non attraverso le ferite (scoppio degli acini, colpi, punture d’insetto). Una volta in contatto con la polpa o il succo d’uva, essi iniziano a produrre OTA.Lo sviluppo di questi funghi è possibile in condizioni di umidità dell’aria compresetra il 72 ed il 90%, ed a temperature tra 12 e 39°C (temperatura ottimale a 28°C)inoltre sono in grado di svilupparsi in una serie di substrati largamentediversificati (7). Tra gli altri fattori che influenzano lo sviluppo ricordiamo lacomposizione gassosa (atmosfera) e lo stress della pianta (es. siccità).L’OTA è una molecola che associa nella propria struttura un amminoacido (la fenil-alanina) alla cumarina, abbastanza stabile nel tempo ed al calore. Si può degradare inocratossina B (OTB) (derivato non clorato), in ocratossina C (OTC) (estere etilicodell’OTA) o in OTα..

In letteratura sono riportati molti lavori che attestano gli effetti negativi dell’OTA sulla salute umana essendo neurotossica, nefrocangerogena infatti provoca alterazioniirreversibili ai reni, alcuni lavori la classificano anche teratogena, inoltre manifestaproprietà immunodepressive (8).Nel 1993 il Centro Internazionale della Ricerca contro il cancro ha classificato l’OTA come classe cancerogena 2B (pericolosa per gli animali e con buona probabilità perl’uomo).Nel 1998 il Codex Alimentarius Commission ha effettuato una ricerca sul diversocontenuto di OTA nei cibi, è emerso che con il vino si assume il 15% della quantitàtotale (Codex Alimentarius Commission, 1998).Delle nove Ocratossine descritte in letteratura, solo l'Ocratossina A rivesteimportanza micotossicologica. In qualche circostanza, in alcuni prodotti fortementecolonizzati dal fungo, è stata trovata anche l'Ocratossina B (Visconti e Bottalico,1983).Particolarmente sensibili sono gli animali monogastrici (suini e specie aviare), doveinduce patologie renali, mentre la maggiore resistenza degli animali poligastrici(bovini e ovini) è dovuta al fatto che l'OTA viene inattivata dalla flora ruminale (9).

Negli animali testati la sintomatologia è caratterizzata da maggior consumo di acqua,aumento del volume urinario ed uremia ed il quadro anatomia patologica è ilseguente: reni pallidi e ipertrofici con evidente fibrosi corticale. A dosi di 200 ppb, siosservano solo sintomi generali con diarrea, anoressia e disidratazione, mentre a 1ppm, polidipsia, poliuria, diminuzione dell'incremento ponderale e aumentodell'indice di conversione. Nelle forme protratte invece si ha ulcera gastrica e gravialterazione dello sviluppo.Le Ocratossine sono coinvolte in una Nefropatia micotossica dell'uomo (Nefropatiabalcanica endemica dell'uomo) (8) che si manifesta nel 3-8% della popolazionebalcanica femminile rurale compresa tra i 30 e i 50 anni.L'ingestione di 0,1 mg di Ocratossina per kg al giorno provoca danni al sistemaimmunitario con diminuzione delle lgG e delle lgM e modifica dell'attività delcomplemento c. In particolare vengono a ridursi le attività fagocitarie, la mobilità deimacrofagi, la sintesi della interleuchina-2 e le naturali attività "killer" delle cellule percui sono spiegate alcune patologie tumorali correlate alla presenza della Ocratossina.Numerosi sono i paesi coinvolti nelle Ocratossicosi; ad esempio in Giappone il 95%dei nefropatici risulta positivo per i livelli serici di Ocratossina (90 ng/ml) mentre inAlgeria, i livelli di Ocratossina sono più simili a quelli europei di 0,1 ng/ml (10).

I FATTORI DI SVILUPPO DELL’OCRATOSSINA A NEL VIGNETO

E GLI INTERVENTI PER IL CONTROLLO.

Numerosi lavori mostrano che gli Aspergillus responsabili della produzione diOcratossina A sono presenti sull’uva dall’invaiatura, ed a volte possono svilupparsi già dall’allegagione. Nel periodo compreso tra l’invaiatura e la maturazione, losviluppo dei funghi subisceun’accelerazione importante.La presenza dei funghi non è necessariamente correlata a quella di OTA. La tossinapuò essere rilevata anche in grappoli privi di muffe nere visibili, ma in acinidanneggiati e con muffe nere evidenti il contenuto è normalmente maggiore (11).L’ICV ha condotto uno studio sui tenori in OTA di 84 vini delle propria cantina sperimentale, nelle annate dal 1998 al 2001. Si tratta di vini elaborati a partire da uveprelevate a diversi stadi di maturità sugli stessi vigneti.Il contenuto in Ocratossina A tende ad aumentare con lo stadio di maturità,come è rilevabile dal grafico che segue.

TENORE IN OTA IN FUNZIONE DELLO STADIO DI MATURAZIONE (analisi condotte su 84campioni di vino prodotto nelle annate comprese dal 1998 al 2001, dati ICV) (2)

0

50

100

150

200

250

1 2 3

STADIO DI MATURAZIONE

CO

NC

EN

TR

AZ

ION

EO

TA

ng

/L

STADIO 1: Raccolta n° 1 quando il mosto aveva una gradazione zuccherina tale da ottenereun vino con un potenziale grado alcolico del 12% volume.STADIO 2: Raccolta 7 giorni successivi alla prima.STADIO 3: Raccolta 14 giorni successivi alla prima.

Oltre all’epoca di maturazione un altro fattore importante che determina lo sviluppodi queste muffe è dato dalle caratteristiche climatiche, ed in particolar modo lapluviometria in Agosto e Settembre.Da uno studio realizzato da Foulon-Sopagly tra il 1999 ed il 2002 su mosti diCarignan (2) si evidenzia che la frequenza e l’entità della contaminazione dei mosti sono molto più elevate nel 1999 e nel 2002 che sono state annate in cui si è registrataelevata piovosità.I danni meccanici agli acini o le perforazioni provocate da insetti come la tignolasono un vettore per trasportare le spore di Aspergillus mettendole in contatto con lapolpa. Numerose pubblicazioni rilevano che il contenuto di OTA aumenta nei viniprodotti da uve colpite da tignola rispetto ai vini provenienti da uve del campione dicontrollo in cui non si èverificato l’attacco. (2)L’OTA può raggiungere livelli molto elevati in caso di cattivo stato sanitario delleuve e in uno stadio di maturità molto avanzata. Invece su uve con buon statosanitario, la ricerca della maturità fenolica piena non è all’origine di un aumentosignificativo della contaminazione dei vini.La selezione delle uve permette di ridurre significativamente il rischio di comparsa diOcratossina A.Una sperimentazione condotta dal Dipartimento R&S ICV su Chardonnay nel2000 ha chiaramente mostrato che le uve selezionate hanno portato ad un vino concontenuto molto scarso di OTA, contrariamente a quanto accaduto con le uve nonselezionate. Le selezioni parcellari e, ove possibile, una vendemmia mirata in vignae/o una selezione delle uve al momento del conferimento in cantina per scartare oisolare le uve in cattivo stato sanitario, sono mezzi molto efficaci per impedire lacomparsa di tenori significativi di OTA. (2)Un altro fattore importante è la scelta varietale (12). Uno studio condottodall’Università Cattolica del Sacro Cuore (Piacenza) su alcune cultivar di vitis vinifera (includendo uve bianche e rosse) nel territorio Pugliese ha rilevato la diversasuscettibilità delle diverse cultivar all’infezione di Aspergillus carbonaris econtaminazione di OTA. Lo studio è consistito nell’inoculo artificiale di Aspergilluscarbonaris nelle diverse cultivar analizzate ponendole nelle stesse situazioniambientali, su frutti intatti e perforati a 20°C e 25°C. Dalla sperimentazione èrisultato che le cultivar Cabernet Sauvignon, Montepulciano e Trebbiano sono levarietà più suscettibili all’attacco in cui si registra il più alto contenuto di OTA, a seguire includiamo Verdeca, Malvasia Nera e Primitivo che valori nonsignificatamene diversi. Le cultivar Pampauto e Uva di Troia presentano scarsasuscettibilità all’attacco fungino.Passiamo ora a considerare gli interventi che si possono attuare al fine dicontrollare la contaminazione di OTA. Sperimentazioni intraprese nel 2001 e 2002dall’ICV (2) mostrano chiaramente che una buona gestione delle tignole puòpermettere una riduzione dell80% nella contaminazione in Ocratossina A. Nel 2002sono state messe a confronto, nello stesso campo sperimentale, diverse strategieinsetticide, ed in particolare:- Trattamento ovicida e larvicida a base di fenoxycarb + flufenoxuron e deltametrina;

- Trattamenti esclusivamente larvicidi (deltametrina);- Trattamento con Bacillus thuringiensis, un insetticida larvicida biologico.La strategia ovicida ha permesso di ottenere riduzioni nelle contaminazioni da OTAcomparabili a quelle misurate nel 2001 (- 80%). Con le altre strategie si sono avuteriduzioni della contaminazione molto meno importanti: sembrerebbe che i danniprovocati dalle larve prima del trattamento siano già sufficienti a provocare aumentiin OTA.Un altro metodo di controllo prevede l’utilizzo di fungicidi antiperonosporici comeil fosetyl-Al, per le proprie azioni secondarie su certe muffe come la Botrytis. La suaazione sull’Ocratossina A è stata valutata nel corso delle prove 2001 e 2002 dell’ICV, parallelamente alle prove sugli insetticidi. Nel 2002 sono state messe a confronto 3strategie di applicazione del fosetyl-Al, ognuna con 3 trattamenti a 12 giorni didistanza l’uno dall’altro:- prima della fioritura- tra la fioritura e la chiusura del grappolo- dopo la chiusura del grappoloLa maggiore riduzione nella contaminazione in OTA dei vini è stata ottenutatrattando tra l’allegagione e la chiusura del grappolo. I trattamenti effettuati primadella fioritura hanno un effetto molto meno importante.Questi risultati confermano le osservazione del 2001, quando i trattamenti confosetyl-Al effettuati dopo l’allegagione portavano ad una riduzione del 50% nella contaminazione in OTA dei vini ottenuti nel 2001 (annata di forte presenza diOcratossina A) e dell’80% nel 2002, annata di scarsa contaminazione.L’aerazione delle uve tramite defogliazioneriduce leggermente il tenore in OTA,ma non in modo sufficiente in casi di forte contaminazione.Nelle ultime fasi della filiera produttiva, nel vigneto si deve fare attenzione al rispettodell’integrità dell’uva, si devono limitare i ritardi nei conferimenti ed evitare di compattare le uve nei carri. Infine è buona norma applicare le buone pratiche diigiene e sanitizzazione delle attrezzature: le vendemmiatrici meccaniche, i rimorchi,le tramogge di ricezione, i nastri e le tubature di trasporto del pigiato, le pompe ecc.

GESTIONE DEL RISCHIO OTANELLE FASI DI VINIFICAZIONE

Seguendo la filiera produttiva passiamo a considerare il problema dellacontaminazione e sviluppo dell’OTA nelle fasi di ammostamento e vinificazione. Partendo dal presupposto che l’OTA è presente nel vino solamente quando l’uva è contaminata e che spesso gli interventi di buona pratica viticola non sono sufficientiad evitare il problema, perlomeno in certe zone ad alto rischio, attualmente risultaimportante verificare quale influenza possa avere la pratica enologica sul livello diOTA nel vino e quali strategie tecnologiche possono essere attuate per limitare lapresenza di tale micotossina. Da uno studio condotto presso l’ Istituto di Enologia e Ingegneria Alimentare, dell’Università Cattolica del Sacro Cuore (12), coordinatodalla Prof.ssa A. Silva rivolto allo studio del destino dell’OTA durante le principali fasi del processo di vinificazione, al fine di individuare i punti critici di controllo(CCP), emerge che l’OTA non è prodotta durante la vinificazione ma proviene dalla contaminazione del fungo in vigna, ma ogni operazione tecnologica può modificarneil contenuto: la macerazione causa un aumento (20-30%), mentre le fermentazionialcolica e malolattica provocano una riduzione di tale micotossina. (12).Lo studio evidenzia che il monitoraggio durante la vinificazione è indispensabile sel’OTA è presente alla raccolta e che nel processo di vinificazione in rosso i CCPsono: le fasi di separazione solido-liquido; la fermentazioni alcolica e malolattica utilizzando starter selezionati.

Tutti gli studi concordano nell’affermare che la vinificazione in rosso conmacerazione delle bucce comporta un aumento della concentrazione OTA dei vini inquanto si aumenta il periodo di tempo di contatto tra succo d’uva e esocarpo dove si trovano i funghi.Nel corso di diverse esperienze si è riscontrato che, il processo fermentativo ditrasformazione ad opera dei lieviti del mosto in vino, determina una significativariduzione del contenuto di OTA (13).L’azione decontaminante dei lievitiappare ingran parte attribuibile a fenomeni di assorbimento sulla parete cellulare con lasuccessiva separazione delle fecce al termine della fermentazione. La riduzionemedia, registrata nei vari campioni, è compresa in un intervallo tra il 40 e il 70%.Recentemente alcune indagini hanno messo in evidenza che anche la fermentazionemalo-lattica può comportare una riduzione di Ocratossina A nei vini (14).La fermentazione malo-lattica, rientra in particolare nella tecnologia dipreparazione dei vini rossi in quanto la metabolizzazione dell’acido malico ad acidolattico consente di ridurre l’acidità dei vini con un conseguente miglioramento delle caratteristiche qusto-olfattive del prodotto.La fermentazione malolattica, avviene al termine della fermentazione alcolica adopera dei batteri lattici naturalmente presenti nei vini, ma l’impiego di starters

selezionati per una migliore gestione del processo è una pratica enologica sempre piùutilizzata.Nella ricerca (14) condotta presso l’ Istituto di Enologia e Ingegneria Alimentare, dell’Università Cattolica del Sacro Cuore, condotta dalla Dott.ssa M.D. Fumi, è statoposto l’obiettivo di selezionare batteri lattici in grado non solo di metabolizzarel’acido malico, ma anche di ridurre biologicamente l’Ocratossina A presente nei vini. Lo studio ha messo in evidenza che alcuni ceppi di Lactobacillus plantarum riesconoa diminuire il tenore di OTA nel vino sempre in relazione a una certaconcentrazione.Nella vinificazione in bianco sembra che una solfitazione precoce sulle uve, riduceleggermente il livello di contaminazione di OTA nei vini bianchi e rosati (2).I coadiuvanti enologici autorizzati hanno un effetto abbastanza scarso sui vini rossi ebianchi contaminati dall’Ocratossina A: la gelatina, la bentonite, il gel di silice ed itannini eliminano, soli o in associazione tra di loro, solamente il 7-14% dell’OTA presente nel vino. La filtrazione migliora leggermente questo effetto correttivo, masenza superare il 20%. Questi trattamenti non permettono quindi di riportare a tenoribassi i vini fortemente contaminati.I carboni enologici, il cui impiego non è autorizzato sui vini rossi, rappresentanol’unico trattamento che permette di ridurre fortemente i contenuti in OTA dei vini.Utilizzato a 20 g/hl in laboratorio, il trattamento con carbone enologico è moltoefficace rispetto al contenuto in OTA, ma comporta effetti collaterali disastrosi per laqualità dei vini: perdita del 25-30% del colore nei vini rossi, deprezzamentoaromatico e gustativo molto evidente (2).

CAMPIONAMENTO E DETERMINAZIONE ANALITICADELL’OTA MEDIANTE HPLC.

Per quanto riguarda il campionamento per l’analisi dei vini e delle uve, ci si deve riferire alla Direttiva 2002/26/CE e la Direttiva 2005/5/CE che modifica la precedentein alcuni articoli. La normativa stabilisce che nel caso dell’uva il campione globale deve pesare almeno 5 kg. Per quanto riguarda le bottiglie per ogni partita diproduzione si devono prelevare un numero stabilito di campioni elementari riportatonella tabella seguente:

FORMA DICOMMERCIALIZZAZIONE

PESO DELLAPARTITA (IN LITRI)

NUMERO MINIMO DICAMPIONI ELEMENTARIDA PRELEVARE

Sfuso (succo d’uva, vino) -- 3Bottiglie/confezioni di succo d’uva ≤ 50 3Bottiglie/confezioni di succo d’uva 50-500 5Bottiglie/confezioni di succo d’uva > 500 10Bottiglie/confezioni di vino ≤ 50 1Bottiglie/confezioni di vino 50-500 2Bottiglie/confezioni di vino > 500 3

L’allegato II della Direttiva 2002/26/CE, afferma che i metodi di analisi utilizzati aifini del controllo alimentare devono per quanto possibile essere conformi alledisposizioni di cui ai punti 1 e 2 dell'allegato alla direttiva 85/591/CEE concernentel'istituzione di modalità di prelievo dei campioni e dei metodi di analisi comunitariper il controllo dei prodotti destinati all'alimentazione umana. Quest’ultima normativa è generale e comunque accetta qualsiasi metodo che sia stato validato, tracui quello che descriveremo nel dettaglio.La Direttiva 2002/26/CE definisce i due parametri importanti che permettono dimisurare la bontà del dato analitico:

1. r = ripetibilità: valore al di sotto del quale ci si aspetta che la differenzaassoluta tra i risultati di due prove singole ottenute in condizioni di ripetibilità(ovvero stesso campione, stesso operatore, stessa apparecchiatura, stessolaboratorio e intervallo breve) si situi nei limiti della probabilità specifica (inlinea di massima 95 %); per cui r = 2,8 × sr (ove sr è lo scarto tipo calcolato apartire dai risultati ottenuti in condizioni di ripetibilità).

2. R= riproducibilità: valore al di sotto del quale ci si aspetta che la differenzaassoluta tra i risultati di prove singole ottenute in condizioni di riproducibilità(ovvero per un prodotto identico ottenuto dagli operatori in diversi laboratoriche usano lo stesso metodo di prova validato) si situi entro un certo limite diprobabilità (in linea di massima 95 %); R = 2.8 × sR (ove sR è lo scarto tipocalcolato a partire dai risultati ottenuti in condizioni di riproducibilità).

Le diverse metodiche analitiche per la determinazione dell’OTA nelle uve e nei vini prevedono generalmente una fase preliminare di estrazione e concentrazione seguitada identificazione mediante HPLC con rivelatore fluorimetrico o con spettrometria dimassa tandem (15).Le metodiche si differenziano per la tecnica estrazione, da realizzarsi essenzialmenteper estrazione con solvente e/o mediante impiego di colonna IAC(ImmunoAffinity Column) per operazione di clean-up dell’estratto.Il metodo Visconti (15) consiste nel diluire 10 mL di campione con 10 mL di unasoluzione polietilenglicole/carbonato di sodio (soluzione formata dall’1% di PEG, 5% di NaHCO3 in acqua). Si prelevano 10 ml di campione finale che si fa passarenella colonna IAC. Dopo che il campione è stato caricato nella colonna, vieneeffettuato un lavaggio con 5 mL di una soluzione NaCl/ NaHCO3 (soluzione formatadal 2,5% di NaCl e 0,5% di NaHCO3 in acqua) a seguire 5mL di acqua. L’eluizione con 2 ml di solvente viene leggermente modificata aggiungendo acido acetico al 2%in metanolo. L’eluente viene evaporato con azoto e ridisciolto in 250 μL di fase mobile utilizzata per l’analisi mediante HPLC a fasi inverse con rivelatorefluorimetrico. Schematicamente elenchiamo le caratteristiche cromatografiche: Colonna Supelco 250 mm x 4,6 mm (colonna in silice C18) con precolonna; Fase mobile: mix CH3CN/H2O/CH3COOH 49,5/49,5/1 v/v/v; Flusso: 1mL min-1;Rivelatore a Fluorescenza: λec= 333 nm; λem= 460 nm: Limite di rilevabilità: 0,01μg L-1;Limite di quantificazione: 0,03 μg L-1;

CROMATOGRAMMA DI UNO STANDARD DI OTA

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