Il laboratorio nella valutazione della Il laboratorio nella valutazione della funzionalità epatica e renalefunzionalità epatica e renale

The multiple functions of the liver are exceeded only by the biochemical methods

designed to test them...

Dame Sheila SherlockDame Sheila Sherlock

Diseases of the Liver and Biliary System

Perchè vengono richiesti i test di funzionalità epatica? - 1Perchè vengono richiesti i test di funzionalità epatica? - 1

• Diagnosi– Questo paziente ha una malattia epatica?

• Prognosi– Stima probabile della sopravvivenza nelle

malattie croniche ed acute del fegato• Screening– Gruppi selezionati – Individuale • Progressione della malattia• Risposta alla terapia• Guarigione dopo chirurgia o altri interventi

• Differenziazione del tipo di epatopatia– Ittero da colestasi, ostruttivo– Epatite - infettiva, autoimmune, alcolica

• Guida per ulteriori indagini– Sierologia virale– Autoanticorpi– Imaging (radiologia, TAC, Ecografia)– ERCP (“Endoscopic retrograde colangio-

pancreatoscopy”)

Perchè vengono richiesti i test di funzionalità epatica? - 2Perchè vengono richiesti i test di funzionalità epatica? - 2

Test di primo livello attualmente più utilizzati Test di primo livello attualmente più utilizzati (Liver Function Tests - LFTs)(Liver Function Tests - LFTs)

• Transaminasi o Aminotransferasi, AST, ALT– danno parenchimale

• Bilirubina– colestasi

• Fosfatasi alcalina,-glutamiltranspeptidasi (GGT)– danno epitelio biliare ed ostruzione biliare (alcol)

• Albumina– sintesi epatica

• Tempo di protrombina (INR)– coagulazione (indicatore dinamico)

Aminotransferasi (transaminasi)

• Aspartato aminotransferasi (AST) presente in:– Fegato, muscolo cardiaco e scheletrico, rene, cervello,

pancreas, polmone, WBC e RBC– Isoforme mitocondriale e citoplasmatica

(immunosottrazione)– mAST (mitocondriale) proposta come marcatore per

differenziare epatite alcolica vs non-alcolica• Alanina transaminasi (ALT) presente in:– Come AST ma in misura minore nei tessuti non-epatici– Enzima citoplasmatico

Cause di aumento AST/ALT• ?Origine epatica o non epatica– dosaggio CK (muscolo scheletrico), cTnI

(cuore), amilasi (pancreas), etc.

• Se di origine epatica, un'aumento della AST indica un danno degli epatociti:– epatite : virale, autoimmune, alcolica, da

farmaci

• Se non di origine epatica, possibile danno muscolare:–Miosite, ipotiroidismo, droghe, IM (infarto

miocardico)

Cause di un aumento di AST / ALT

>10x ULN (“upper limit of normality”)Epatite acuta, ipossiemia tessutale (shock)

5-10x ULN infarto miocardico, Trauma, malattie del muscolo scheletrico, Colestasi, Epatiti croniche, epatite autoimmune

< 5x ULNCondizioni fisiologiche (neonati), altre malattie epatiche (Wilson, emocromatosi, deficit di alfa1-antitripsina), pancreatite, emolisi in vivo e in vitro, abuso alcolico.

Aumento di AST/ALT di origine epatica

• Associato a lieve incremento di altri test indica un'epatite:– Infettiva – A/B/C, CMV, EBV ed altri

• ALT meglio di AST per il monitoraggio dell'epatite cronica B/C– Autoimmune – autoanticorpi– Tossine

• Epatite alcolica non comune (bevitori occasionali)• Farmaci – paracetamolo ed altri (spesso idiosincrasia)• Metalli – rame (malattia di Wilson), ferro (emocromatosi)• Veleni – funghi etc.• Rigetto post-trapianto

Bilirubina

• Vero ‘liver function’ test• Viene coniugata a livello epatico ed escreta nella bile• Differenziazione tra bilirubina coniugata e non

coniugata:– Malattia epatica ostruttiva, iperbilirubinemia

coniugata – Insufficienza epatica, quadro misto (pochi epatociti

e alterata escrezione)– Iperbilirubinemia non coniugata nel neonato

(immaturità degli epatociti)

Cause non-epatiche di aumento della bilirubina

• Bilirubina viene prodotta dalla distruzione dei globuli rossi (emolisi eccessiva o distruzione cellulare – di solito non coniugata)– Emoglobinopatie – sickle cell disease, sferocitosi, etc– Emolisi intravascolare da altre cause• Tossine – rame (Wilson) può causare distruzione

RBC (anemia normocitica)• Infezioni – malaria • Altro – CBP (cirrosi biliare primitiva), epatite

autoimmune e alcolica

Sindrome di Gilbert

• Coniugazione della bilirubina è mediata da UDP-glucoronosil transferasi 1A

• Condizione benigna autosomica dominante con lieve iperbilirubinemia non coniugata

• Inserzione TA nel TATA repeat box del gene promoter. L'omozigosi riduce la capacità di espressione genica– In condizioni normali non vi sono conseguenze ma

in situazioni di aumentata richiesta (malattie, infezioni, digiuno) si può verificare un marcato aumento della bilirubina

Alkaline phosphatase (ALP)• Gruppo di enzimi che idrolizzano esteri di fosfato in

soluzioni alcaline• Geni differenti codificano per isoenzimi non-tessuto

specifici e isoenzimi tessuto-specifici (placenta, intestino, cellule germinali)

• Modificazioni post-traslazionali (glicosilazione) producono diverse isoforme (epatica, renale, ossea)

• La differenziazione delle isoforme può assumere importanza e può essere ottenuta mediante elettroforesi con PAGE o mediante dosaggi immunometrici specifici (per esempio, BAP bone alkaline phosphatase)

Aumento della ALP sierica

• Di origine epatica per ostruzione delle vie biliari intraepatiche:– Meccanica – calcoli, neoplasie (pancreatiche/biliari)– Restringimenti – cirrosi biliare primitiva (PBC), colangite

sclerosante (PSC), cirrosi criptogenetica– Ipertensione portale

• Di origine non-epatica:– Isoforma ossea (osteoblasti)– Fisiologico – gravidanza– Iperfosfatasemia transitoria

Iperfosfatasemia transitoria

• Originariamente descritta nei bambini, si può verificare anche negli adulti ed in gravidanza

• Incremento marcato della ALP fino a parecchie migliaia di IU/L

• Transitoria con ritorno alla normalità in 4-6 settimane• Associata con infezioni, soprattutto del tratto

gastroenterico

• Si pensa sia dovuta a modificazione delle catene laterali glicidiche che provocherebbero una ridotta eliminazione con aumento dell'emivita

Cause di aumento della fosfatasi alcalina

FisiologicheGravidanza (terzo trimestre), infanzia

Patologiche > 5x ULNMorbo di Paget (osteoblasti), Osteomalacia, Colestasi, Cirrosi

< 5x ULNTumori ossei, iperparatiroidismo primario, fratture ossee, tumori epatici, epatiti, malattia infiammatoria intestinale

Gamma-glutamil transpeptidasi o gamma-glutamil transferasi (GGT)

• Prodotta negli epatociti e nelle cellule dell'epitelio biliare

• Enzima microsomiale (induzione da parte di farmaci che agiscono sul citocromo P450) responsabile del trasferimento di gruppi glutamici tra peptidi

• Presente anche in altri organi:– Cuore, reni, polmoni, pancreas, vescicole seminali– Nel plasma la forma predominante è l'isoenzima epatico

Aumento di GGT - 1

• Farmaci– Induzione - alcol, anti-epilettici etc.– Meccanismi diversi

• antibiotici • statine• FANS• Erbe e altri prodotti omeopatici• Methotrexate

Aumento di GGT - 2

• Steatosi (accumulo di grasso)– Correlata all'alcol, obesità, diabete mellito, NASH (non-

alcoholic steatohepatitis)• Fibrosi/cirrosi (accumulo di matrice extracellulare e

collagene)– Cirrosi alcolica, PBC, PSC, emocromatosi, deficit di alfa-1-

antitripsina, malattia di Wilson (accumulo di rame) etc.

• Lesioni occupanti spazio– Tumori (carcinoma epatocellulare o metastasi)– Malattie granulomatose (sarcoidosi, tubercolosi)

Cause di aumento di GGT

>10x ULNColestasi, malattia epatica alcolica

5-10x ULNEpatiti, Cirrosi, pancreatiti

<5x ULNalcol, farmaci induttori

Proteine plasmatiche

• La maggior parte delle proteine (eccetto le immunoglobuline) sono prodotte dal fegato

• La più significativa è rappresentata dalla ALBUMINA che contribuisce alla regolazione dell'osmolarità plasmatica

• Le proteine di fase acuta sono prodotte a livello epatico

• Proteine di trasporto di metalli e vitamine (transferrina, ceruloplasmina, Vitamin D binding protein) sono sintetizzate e immagazzinate nel fegato

Albumina

• Per mantenere concentrazioni ottimali di albumina è sufficiente che vi siano solo il 10% degli epatociti funzionanti

• Una bassa concentrazione plasmatica di albumina deve far pensare ad una malattia epatica dopo aver escluso una ridotta ingestione e/o una aumentata perdita renale o gastrointestinale

INR

• “International normalised ratio”

• E' un reale ‘liver function’ test dinamico

• INR aumentato indica deficit di fatori II, VII, IX o X o di Vitamina K

• Un INR > 3.0 costituisce una controindicazione per la biopsia epatica ed altre manovre invasive (rischio di sanguinamento)

Altri test biochimici

• AFP (alfa-fetoproteina) per tumori primitivi del fegato– Aumenta anche nel fegato in rigenerazione come nella

cirrosi• CA19-9 per tumori delle vie biliari

– Aumenta anche in tumori del colon-retto e del pancreas• Ferritina per l'emocromatosi (accumulo di ferro)

• Urea e colesterolo– La produzione risulta molto ridotta nell'insufficienza epatica

LFTs: i LFTs: i propro e i contro e i contro

• VANTAGGI– Poco costosi, ampiamente disponibili e conosciuti da tutti– Possono guidare indagini successive

• SVANTAGGI– Vecchi marcatori (vi sono molte malattie di recente riconoscimento per le

quali essi non hanno un valore diagnostico) – Scarso valore prognostico– Scarsa efficacia nella valutazione della risposta al trattamento – Non danno una valutazione funzionale quantitativa o dinamica

Cosa c'è di nuovo tra i marcatori biochimici di funzionalità epatica?

Nuove aree di interesse

• Biologia molecolare– Malattie ereditarie o genetiche – (deficit di alfa-1-antitripsina, malattia di

Wilson)• Test per valutare l'assunzione di alcol

– Carbohydrate deficient transferrin (CDT)• Biomarcatori di fibrosi

– PIIINP

Carbohydrate deficienct transferrinCarbohydrate deficienct transferrin

• Transferrina : glicoproteina con p.m. 80,000• Singola catena polipeptidica di 679 aminoacidi• Due siti di legame per il Ferro, emivita 6-12 giorni• Due unità di catene laterali oligosaccaridiche con 3-4

residui di acido sialico (funzione di stabilizzazione della molecola e di regolazione dell'affinità per il recettore)

• Eliminazione per via epatica (degradazione lisosomiale)• L'alcol interfersice direttamente con l'enzima che

aggiunge o rimuove i residui di acido sialico e provoca un aumento delle forme asialo, mono- e di-sialo

Senbilità e specificità di nuovi marcatori di Senbilità e specificità di nuovi marcatori di danno epatico da alcoldanno epatico da alcol

Test Sensibilità Specificità Cut-off

CDT 65-95 90-100 6 %mAST 79 93 5 U/LGST* 60-90 55-100 55 IU/LAST/ALT 20-50 10-30 50 IU/L

*Glutatione-S-transferasi

Confronto tra GammaGT e CDTConfronto tra GammaGT e CDT

CDT GGT CDT+GGTSensibilità

Mediana 68.5% 61% 92%Range 20-91 17-100 35-98

SpecificitàMediana 95.5% 77.5% 83%Range 71-100 9-100 17-93

Litten et al Alcohol Clin Exp Res 1995

Biomarcatori di fibrosi epatica - 1

Collagene/procollagene 

Tipo % nel fegato normale % nel cirrotico 

I 40 – 50 60 – 70  III 40 – 50 20 – 30  IV 1 1 – 2  V 2.5 5 – 10  VI 0.1 0.2 

Componenti della matrice extracellulare 

Fibronectina (molecola di adesione) 

Vitronectina (molecola di adesione) 

Laminina (componente principale delle membrane basali cellulari) 

Acido ialuronico

Biomarcatori di fibrosi epatica - 2

Collagene di tipo I e IIICollagene di tipo I e III

• Collageni a struttura fibrillare con tripla elica (300 nm).• Sintetizzati sotto forma di propeptidi ad entrambe le

estremità delle fibrille (larghezza di 40-50 nm).• La timozione dei propeptidi promuove la crescita delle

fibrille.• I propeptidi possono essere trattenuti nella matrice

extracellulare (tipo I) o rilasciati in circolo (III).• Sono disponibili immunodosaggi di PICP (propeptide C-

terminale di tipo I), PINP (N-terminale), PIIINP (N-terminale di tipo III).

• PIIINP appare il migliore nell'individuazione della fibrogenesi epatica.

PIIINPPIIINP

• Concentrazioni circolanti aumentate si riscontrano in numerose malattie epatiche:

– Cirrosi alcolica, carcinoma epatocellulare, cirrosi biliare primitiva, epatite virale cronica da HCV

• Possono aumentare anche in malattie non-epatiche con alterazioni del metabolismo del collagene:

– Mielofibrosi, sclerosi sistemica, metastasi ossee da carcinoma mammario, ipertiroidismo

Anatomia renale

Corteccia

Midollare

Pelvi

Verso la vescica

Capsula

Uretere

Arteria e vene renali

Piramide midollare

11cm

6 cm3cm

Quali sono le funzioni dei reni?

• Regolazione del volume e dell'osmolarità dei liquidi corporei

• Regolazione del bilancio elettrolitico• Regolazione dell'equilibrio acido-base• Escrezione di prodotti del metabolismo (urea,

creatinina) e di sostanze esogene (farmaci)• Sintesi ed escrezione di ormoni• Gluconeogenesi

Arteria renale

Glomerulo

Capsula di Bowman

Tubulo prossimale

Tubulo distale

Dotto collettore

Ansa di Henle

Arteriola afferente

Vasa Recta

– L'unità funzionale è il NEFRONE

– 106 nefroni/rene

Filtrazione glomerulareMembrana

capillare glomerulare

Spazio vascolare Spazio di Bowman

Pressione media a livello dei capillari di sangue

Pressione spazio di Bowman

Pressione oncotica

Pressione idrostatica netta

2,000 Litrial giorno

(25% della gettata cardiaca)

200 Litrial giorno

GFR 110 mL/min

Fattori che influenzano la filtrazione

• Dimensioni e forma delle molecole (<7 KDa facile, >70 KDa improbabile)

• Carica negativa. La membrana basale ha una carica negativa

• Pressione effettiva di filtrazione: -– Un aumento della resistenza nei vasi efferenti determina un

incremento della pressione nei vasi afferenti– Contro-pressione è rappresentata dalla pressione oncotica

(dovuta principalmente alle proteine plasmatiche) – Il passaggio di sangue attraverso i glomeruli fa aumentare la

pressione oncotica e così riduce la pressione di filtrazione

Processo dinamico

• 200 litri di filtrato passano nei nefroni ogni giorno,ma solo 1-2 litri di urina vengono prodotti, per cui oltre il 99% del filtrato viene riassorbito.

• Riassorbimento – attivo o passivo– avviene praticamente a tuttti i livelli o segmenti funzionali

del nefrone.

Cosa passa nel filtrato glomerulare?• Liberamente

filtrati– H2O– Na+, K+, Cl-,

HCO3-, Ca++,

Mg+, PO4, etc.– Glucosio– Urea– Creatinina– Insulina

• Meno facilmente filtrati* 2-microglobulina#– RBP (retinol-

binding protein) 1-microglobulin– Albumina

*proteine di basso PM# talora usato come indicatore di

funzionalità renale

• Di solito non filtrati*– Immunoglobuline– Ferritina– Cellule

*dimensioni più grandi

Quindi, le funzioni dei tubuli renali sono:

• Riassorbimento selettivo o escrezione di acqua e ioni al fine di mantenere costante la composizione idro-elettrolitica dell’organismo.

• Riassorbimento attivo di composti filtrati, quali glucosio ed aminoacidi.

RIASSORBIMENTO DAL FILTRATO GLOMERULARE

% riassorbimentoAcqua 99.2

Sodio 99.6Potassio 92.9Cloruri 99.5

Bicarbonato 99.9Glucosio 100Albumina 95-99

Urea 50-60Creatinina 0 (o negativo)

Riassorbimento tubulare e secrezione di sostanze organiche

• Attivo– Glucosio– Aminoacidi– Proteine (pinocitosi)– 3 sistemi secretori finora identificati:

• per acidi organici (per es. Penicilline) • per basi organiche forti • (per EDTA)

• Passivo– Urea: segue l’acqua e, perciò, segue Na+ & Cl-

• lenta diffusione attraverso la membrana, per cui vi è una escrezione netta.

• Flusso più rapido causa una maggiore escrezione.

– Acidi e basi deboli: • Diffusione non-ionica attraverso i lipidi della membrana.

Riassorbimento tubulare e secrezione di sostanze organiche

Regolazione dell’equilibrio acido-base

• Secrezione attiva di ioni idrogeno– Asse renina-aldosterone

• Riassorbimento di bicarbonato.• Generazione di bicarbonato.• Generazione di ammoniaca.

Recupero di Bicarbonato

• Carbonico Deidratasi o Anidrasi è l’enzima chiave*

• H+ scambiati con Na+

• H+ + HCO3- = H2CO3

• H2CO3 * H2O +CO2

• CO2 per diffusione rientra nelle cellule dove si forma più bicarbonato

Generazione di HCO3-

• Idrogenioni scambiati con sodio ma intrappolati per interazione con sistemi tampone presenti nel filtrato (B-)

• Perdita netta di H+

Generazione di ammoniaca

• Glutamina diretta verso la Gluconeogenesi• NH3 intrappolata nel filtrato dalla reazione con

idrogenioni

Funzioni endocrine del rene

• Ormoni prodotti a livello renale– Renina (apparato iuxta-glomerulare)– Callikreina– Prostaglandine– Medullolipina (azione anti-ipertensiva, “renal medullary

vasodepressor”)– 1,25 di-idrossi-colecalciferolo (vitamina D3)– eritropoietina

Perchè valutare la funzionalità renale?

• Per identificare una disfunzione renale.• Per diagnosticare una malattia renale.• Per monitorare la progressione della malattia.• Per monitorare la risposta al trattamento.• Per valutare alterazioni della funzionalità che possono

influenzare alcune terapie (per es., digossina, chemioterapia).

Segni e sintomi di insufficienza renale• Sintomi dell’uremia (accumulo di prodotti tossici) (nausea,

vomito, letargia)• Disordini della minzione (frequenza, nocturia, ritenzione,

disuria)• Disordini del volume di urine (poliuria, oliguria, anuria)• Alterazioni della composizione delle urine (ematuria,

proteinuria, bacteriuria, leucocituria, calcoli)• Dolore• Edema (ipoalbuminemia, ritenzione di acqua e sali)

Indagini biochimiche di funzionalità renale

• Esame delle urine– Aspetto e colore (sangue, torbidità) – Osmolalità e peso specifico– pH (di solito acido)– Glucosio / Corpi chetonici– Proteine– Analisi del sedimento (cellule, batteri, cristalli, cilindri*)*particelle che si formano come “stampo” mucoproteico dei tubuli del

nefrone• Misurazione del filtrato glomerulare (GFR glomerular filtration rate):

capacità del rene di rimuovere prodotti del catabolismo dal sangue– Test di clearance– Creatinina (insieme con urea e altri nitro-composti costituisce

l'azotemia) • Test di funzionalità tubulare

Analisi delle urine • Glucosio

– Aumento del glucosio plasmatico – Bassa soglia renale o altri disordini dei tubuli

• Proteinuria– Normale < 200 mg/24h. Sticks positività = >300mg/L– Cause: -

• Iperafflusso (aumento di proteine a basso PM nel plasma)

• Perdita glomerulare• Ridotto riassorbimento tubulare• Proteine di origine renale

Determinazione della velocità di filtrazione glomerulare (GFR)

• Analisi più frequentemente utilizzata per valutare la funzionalità renale.

• La misurazione è basata sul concetto di clearance:

“determinazione del volume di plasma dal quale una sostanza viene rimossa attraverso la filtrazione glomerulare”

Determinazione della Clearance

• Clearance = (U xV)/P ove U è la concentrazione urinaria della sostanza x

V è la velocità di formazione delle urine (mL/min)

P è la concentrazione plasmatica della sostanza x

• Unità di misura = volume/unità di tempo (mL/min)

• Clearance = GFR, allora la sostanza x deve possedere le seguenti proprietà: - – viene filtrata liberamente dal glomerulo– il glomerulo rappresenta l’unica via di escrezione dal

corpo (no secrezione o riassorbimento tubulare) – non è tossica ed è facilmente misurabile

• 1-2% della creatina muscolare viene convertita a creatinina ogni giorno

• La quantità prodotta è correlata alla massa muscolare• Viene liberamente filtrata a livello glomerulare• Lieve escrezione tubulare

Clearance della creatinina

• Raccolta temporizzata delle urine per la determinazione della creatininuria (di solito 24h)

• Un campione di sangue prelevato entro il periodo di raccolta delle urine

Problemi: -• problemi pratici di un’accurata raccolta delle urine• Variabilità intra-soggetto = 11%, Differenza critica =

33% • Interferenze sulla misurazione della creatinina

(reazione di Jaffè: bilirubina, Hb, sostanze ossido-riducenti)

Clearance della creatinina

Concentrazione plasmatica della Creatinina

Difficoltà: -• La concentrazione dipende dal bilancio tra entrate ed

uscite.• La produzione è determinata dalla massa muscolare,

correlata a età, sesso e peso corporeo.• Elevata variabilità inter-individuale nella popolazione a

fronte di una minore variabilità intra-soggetto.• La concentrazione è inversamente proporzionale al GFR.

– Piccole variazioni della creatinina portano a grandi variazioni del GFR.

Cistatina-CNewman et al Kidney Int 1995;47:312-318

• Inibitore della cisteina-proteinasi C (PM 13000)• Liberamente filtrato dal glomerulo• Produzione costante da parte di tutte le cellule

nucleate• Non note vie di escrezione extra-renali• Non influenzata dalla massa muscolare, dalla dieta

o dal sesso• La concentrazione sierica ha una forte correlazione

negativa con il GFR

Il marcatore endogeno ideale di GFR

Tasso di produzione costante (creatinina dipende da massa muscolare, sesso, dieta, esercizio fisico,…)

Rimosso dal circolo solo per filtrazione glomerulare (la creatinina viene eliminata anche per via intestinale e cutanea)

Liberamente filtrato a livello glomerulare (è l’unico criterio soddisfatto dalla creatinina)

Non riassorbito nè secreto dai tubuli renali (la creatinina ha un certo grado di riassorbimento e secrezione tubulare)

La cistatina C soddisfa tutti i 4 criteri, richiede solo un prelievo di sangue, ma è un test più costoso ed ancora poco conosciuto …

Test di funzionalità tubulare (poco usati)• N-acetyl- -D-glucosaminidase (NAG)• Tubulo prossimale

– Riassorbimento di fosfati– Aminoaciduria– Glicosuria– Escrezionale frazionale di HCO3

-

• Tubulo distale– Acidificazione (carico con cloruro d’ammonio)– Concentrazione

•Microalbuminuria– rapporto albumina:creatinina (ACR) 2.5 mg/mmol (uomo) or 3.5 mg/mmol (donna)

oalbumina 20 mg/l

•Proteinuria– rapporto albumina:creatinina 30 mg/mmolo- albumina 200 mg/l

Insufficienza renale acuta

• Ritenzione di: -– Urea & creatinina– Na & acqua– Potassio (iperkaliemia)– Acidi (acidosi

metabolica)

Cause:• Pre-renali

– Ridotta perfusione• Intrinsiche renali

– vascolari– infiammatorie– infiltrative– tossicità

• Post-renali– ostruzione

Definizione di insufficienza renale cronica

Insufficienza renale cronica: Cause

• Glomerulonefrite• Diabete mellito• Ipertensione• Pielonefrite cronica• Rene policistico• Etc.

Alterazioni degli esami di laboratorio nell’insufficienza renale cronica

• Aumento di creatinina• Iperkaliemia• Acidosi metabolica• Ipocalcemia • Iperfosfatemia• Osteodistrofia (aumento della fosfatasi

alcalina)• Anemia normocromica normocitica