AbstractThe aim of this project was to investigate the influence of the configuration and operation of wastewater treatment plants (WWTPs) on the denitrifying population in active sludge and to investigate how NosZ-genes can be used as molecular markers in the identification of these denitrifiers. The influence of the operation of WWTPs was investigated by studying the effect of adding different types of substrate to the active sludge, and monitoring the denitrification rate and the population of denitrifying bacteria in the active sludge. The substrates used were acetate, casaminoacid, and a combination of these substrates. The active sludge tested was from three wastewater treatment plants located in the north of Jutland: Aalborg WWTP-east (AA), Aalborg WWTP-west (AAV) and Aabybro WWTP (Aabybro). The results of these experiments indicated that with the addition of acetate, denitrification was faster. It was also noted that the combination of substrates resulted in the denitrification rate in the three WWTPs being similar or higher than with acetate, indicating that the denitrifiers have different substrate preferences. In the case of casaminoacid a low denitrification rate for the three WWTPs was found. The configuration of the WWTPs seemed to have a great influence on the denitrification-rate. In AA and AAV the configuration of the plants includes a sidestream-hydolysis which gives a longer adaption-time and also by means of hydrolysis and fermentation provide the denitrifiers with easily accessible organic matter. To identify the NosZ-carrying denitrifiers, experiments were carried out using PCR and computerized analysis of the NosZ-carrying sequences with alignments of known sequences in GenBank. The alignments resulted in a sequence-library that was converted into a phylogenetic tree, which showed great similarity to phylogenetic trees based on 16S rRNA and NosZ from previous investigations. Also, it was observed that -protobacteria is dominant in the activated sludge of the three WWTPs. Moreover the results confirm that there was a difference between bacteria grown in the laboratory and bacteria that live in the active sludge. The investigation also indicated that the choice of primers and length of sequences have a significant influence on the reliability of the results, and that identification using the NosZ-gene is possible, but should be supplemented with other analyses, like quantitative FISH analysis. . .

1

ForordNrvrende rapport er afgangsprojekt for diplomingeniruddannelsen i miljteknik ved Aalborg Universitet, institut for kemi, milj og bioteknologi. Rapportens ml er at bidrage med viden om denitrifikanters identitet in situ og deres effektivitet i denitrifikationsrater, ved tilstning af ekstern single substrat i form af acetat og casaminosyre, samt en kombination af disse. I projektet er der taget udgangspunkt i det aktive slam fra tre forskellige renseanlg: Aalborg Vest, Aalborg st og Aabybro renseanlg. Tabeller og figurer er nummereret fortlbende i henhold til det kapitel, hvori de er placeret. Kildehenvisninger er lavet i henhold til Harvard metoden, hvor (forfatter, rstal) er angivet. I forbindelse med denne rapport vil jeg gerne rette en tak til Aalborg renseanlg Vest og st samt renseanlg Aabybro for hjlp med oplysninger til rapporten og sidst men ikke mindst en tak til hovedvejleder Lektor Ph.d Jeppe Lund Nielsen og bivejleder Cand. Scient. Ph.d. Aviaja A. Hansen fra Aalborg Universitet, institut for kemi, milj og bioteknologi. Projektet er udarbejdet af:

Ricardo Israel De La Calle Arambur

Forsidefoto: Haeckels fylogenetiske tr fra 1866.

2

IndholdAbstract --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------1 Forord ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------2 Indhold ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------3 1.0 Indledning ------------------------------------------------------------------------------------------------------------51.1 Omstningen af kvlstofforbindelser i spildevand---------------------------------------------------------------- 7 1.2 Denitrifikation ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 9 1.3 Denitrificerende bakterier.---------------------------------------------------------------------------------------------- 10 1.4 Denitrifikations enzymer------------------------------------------------------------------------------------------------- 111.4.1 Nitrat reduktase (Nar) ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------12 1.4.2 Nitrit reduktase (Nir) -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------14 1.4.3 Kvlstofmonooxid reduktase (Nor)----------------------------------------------------------------------------------------------14 1.4.4 Lattergas reduktase (Nos) ----------------------------------------------------------------------------------------------------------14

1.5 Forhold der har betydning for denitrifikationen i renseanlgget. ------------------------------------------- 151.5.1 Fri ilt. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------15 1.5.3 Temperaturen--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------18 1.5.4 Kulstof-kilde ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------18

1.6 Metoder til identifikation af denitrificerende bakterier. ------------------------------------------------------- 18

2.0 Projektets forml ------------------------------------------------------------------------------------------------- 202.1 Problemformulering------------------------------------------------------------------------------------------------------- 21

3.0 Beskrivelse af renseanlg-------------------------------------------------------------------------------------- 213.1 Aalborg renseanlg st (AA)----------------------------------------------------------------------------------------- 22 3.2 Aalborg renseanlg Vest (AAV)---------------------------------------------------------------------------------------- 23 3.3 Aabybro renseanlg (Aabybro)---------------------------------------------------------------------------------------- 24

4.0 Metoder. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 264.1 Mlinger af denitrifikationsrater. ------------------------------------------------------------------------------------- 26 4.2 Identifikation af NosZ-brende denitrifikanter ------------------------------------------------------------------- 264.2.1 Polymerase Chain Reaction --------------------------------------------------------------------------------------------------------27 4.2.2 Gel elektroforese----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------27 4.2.3 Identifikation ved hjlp af fylogenetisk analyse.-----------------------------------------------------------------------------28

5.0 Resultater----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 295.1 Denitrifikationsrater ved substrattilfrsel. ------------------------------------------------------------------------- 29 5.2 Identifikation af denitrifikanter bakterier--------------------------------------------------------------------------- 30

6.0 Diskussion ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 37 3

6.1 Diskussion denitrifikationsrater ved substrattilfrsel. -------------------------------------------------------- 37 6.2 Diskussion identifikation vha. fylogenetisk analyse ----------------------------------------------------------- 38

7.0 Konklusion---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 43 8.0 Perspektivering---------------------------------------------------------------------------------------------------- 44 9.0 Litteratur liste.----------------------------------------------------------------------------------------------------- 46 10.0 Appendix ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 5110.1 Polymerase chain reaction--------------------------------------------------------------------------------------------- 51 10.2 Protokol: Polymerase Chain Reaction PCR ------------------------------------------------------------------------ 55 10.3 Protokol: Agarose gel to evaluate size and quantity of PCR Amplificates -------------------------------- 57 10.4 Protokol: PCR clean-up Gel extraction ----------------------------------------------------------------------------- 58 10.5 Protokol: Denitrifikationsrater --------------------------------------------------------------------------------------- 59

11.0 Bilag ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 6011.1 Identifikation af denitrifikanter ------------------------------------------------------------------------------------- 60 11.2 Susbstrater ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 61

4

1.0 IndledningI midten af 1980erne kunne det konstateres, at vandmiljet i Danmark var prget af iltsvind og fiskedd. rsagen var udvaskning af kvlstof og fosfor fra bl.a. renseanlg. Indsatsen p renseanlggene har, indenfor de sidste 10 r, resulteret i en reduktion af kvlstof- og fosforudledning til vandmiljet p et godt stykke under rensekravene 1, idet det er lykkedes at reducere udledningen med omkring 90 % (mst, 2005). Et fortsat fokus p fosfor- og kvlstofudledningen er dog stadig ndvendig, idet selv mindre udledninger i vandmiljet, kan fre til eutrofiering, hvor der, pga. tilfrslen af nringssalte, sker en strre algevkst. Algevksten bevirker drligere lysforhold i vandet, uklart vand og lugtgener og bevirker ogs, at der skal nedbrydes en strre mngde alger i vandbunden, hvilket krver en strre mngde ilt, hvorved der sker iltsvind i vandet (Maier, 2000). Fra midten af 1980rne og frem til midten af 1990rne skete der en udbygning og modernisering af renseanlggene, isr i forhold til biologisk rensning, som bevirkede at rensningen for kvlstof og fosfor blev mere effektiv og udledningen til vandmiljet dermed mindre (mst, 2005). En optimering af den biologiske rensning er at foretrkke, frem for f.eks. kemisk rensning, fordi der i den biologiske rensning produceres mindre mngde slam end ved kemisk rensning, og minimering af forbruget af kemiske tilstninger i form af bl.a. jern- og aluminiumioner giver tilsammen en konomisk og miljmssig fordel (Sedlak, 1991) (Vollertsen, 2006). I 1997 blev der indfrt spildevandsafgift p udledning af fosfor og kvlstof fra renseanlggene (mst, 2005), hvilket yderligere er en motiverende faktor for at optimere kvlstof-rensningen p renseanlggene. P renseanlg hvor spildevandets indhold af bl.a. kvlstof reduceres vha. biologisk rensning, udnyttes slammets naturlige indhold af bakterier til nedbrydning af kvlstof-forbindelserne (ammonium, nitrit og nitrat). Dette sker ved en vekslen mellem nitrifikation og denitrifikation. Begge processer er signifikante, idet kvlstof, som fres med spildevandet til renseanlgget, findes i flere forskellige former (ammonium, nitrit og nitrat), som igennem flere trin skal transformeres til frit kvlstof, der kan frigives til atmosfren. Denitrifikationen er isr interessant, fordi det netop er i denne proces, at kvlstof transformeres fra de miljbelastende og skadelige former nitrat og nitrit, til atmosfrisk kvlstof, hvor det igen kan indg i kvlstof cyklus i det globale kosystem (Tchobanoglous, 2004). For at denitrifikationsprocessen kan foreg, krves det frst og fremmest,

1

Rensekrav for kvlstofudledning fra eksisterende anlg >15.000 PE og nye renseanlg > 5.000 PE: 8 mg N/l. Dog er der regionale forskelle hvor rensekravet er p 3 mg/l (mst, 2005)

5

at der er anaerobe forhold, at der er denitrificerende bakterier, kvlstof (NO3- og NO2-) og tilstrkkelig kulstof kilde tilstede i slammet. Ofte vil slammets naturlige indhold af organisk stof vre tilstrkkeligt som kulstof- og energikilde, men mngden af denne og i hvilken fraktion den er tilgngelig, har betydning for den hastighed hvor denitrifikationsprocessen kan foreg, idet oplst biologisk let nedbrydeligt stof2

, hurtigere omsttes end partikulrt biologisk langsomt

nedbrydeligt organisk stof 3. I forbindelse med optimering af fosforfjernelse p renseanlg er der flere steder indfrt sidestrmshydrolyse, som udover den gede fosforfjernelse ogs har vist sig at vre en fordel for denitrifikationsprocessen. Ved sidestrmshydrolysen bliver returslam og evt. rejektvand og sm mngder primrslam ledt ind i en anaerob hydrolysetank, hvorved opholdstiden forlnges og der kan dermed ske en strre hydrolyse og fermentering af partikulrt langsomt nedbrydeligt organisk stof til oplst let nedbrydeligt organisk stof. Udover at dette bevirker at fosforakkumulerende bakterier bedre kan udnytte det organiske stof, betyder det ogs, at de denitrificerende bakterier fr adgang til en strre mngde af den foretrukne let nedbrydelige organiske stof, hvorved denitrifikationenshastigheden kan ges (Vollertsen, 2006). I tilflde af at der ikke er nok kulstof- og energikilde tilstede for at optimere denitrifikationsprocessen, er det muligt at tilstte det fra en ekstern kilde i form af f.eks. metanol og eddikesyre (Hagmann, 2007). Udover viden om substraters indflydelse p denitrifikationen vil det, for at kunne optimere den biologiske fjernelse af skadelige kvlstofforbindelser, vre ndvendigt med viden om denitrificernde bakterier. Et grundigt kendskab til bakteriernes rolle i og krav til det omgivende mikro-milj kunne bidrage til, at det nemmere kan forudsiges, hvilke tiltag der skal ivrksttes p renseanlgget ved f.eks. ndret kvlstof tilfrsel og ndrede belastninger af organiske materialer. En forudstning for bedre at kunne forst de denitrificerende bakteriers rolle og funktioner i det aktive slam er, at det er muligt at identificere dem, og det har vist sig at vre srdeles vanskeligt, fordi denitrificerende bakterier ikke er vsentligt morfologisk forskellige og derfor ikke kan klassificeres vha. traditionel mikroskopering. En anden rsag til at mikroorganismerne er vanskelige at identificere er, at strstedelen ikke kan isoleres i rene kulturer, og derfor ikke kan grupperes ud fra fysiologiske og biokemiske funktioner (Muyzer, 1999). Der m alts tnkes i alternative metoder til, at identificere denitrifikanterne og for at forst deres indbyrdes fllesskab. Nogle af de

2

oplst biologisk let nedbrydeligt stof er flygtige, kortkdede fede syrer (VFA), som f.eks. laktat, acetat, propionat, n-butyrat og iso-butyrat, der er produkter af stivelse-nedbrydningen (Madigan, 2003).3

partikulrt biologisk langsomt nedbrydeligt organisk stof er f.eks. cellulose (Madigan, 2003).

6

nyeste metoder, der bliver benyttet til at forsge at identificere mikroorganismer, er baseret p molekylre teknikker, hvor slgtsforholdet mellem mikroorganismerne sges pvist ud fra fylogenetiske analyser baseret p sammenligning af gensekvenser (Amann, 1995).

I de flgende afsnit vil jeg kort beskrive noget af den viden, der i dag eksisterer om de denitrificerende bakterier og deres rolle i transformationen af kvlstofforbindelser, for derefter, i afsnittet om projektets forml, at vende tilbage til problematikken vedrrende identifikationen af denitrificerende bakterier samt substraters betydning for denitrifikanternes aktivitet i det aktive slam.

Da det er vanskeligt, at forst denitrifikationen uden at nvne nitrifikationen, og da de to processer p renseanlgget foregr simultant, eller i umiddelbar forlngelse af hinanden, vil der i det flgende, indledningsvist kort blive beskrevet, den generelle omstning af kvlstof i renseanlgget, for derefter at stte fokus p den anaerobe proces, som involverer de denitrificerende bakterier.

1.1 Omstningen af kvlstofforbindelser i spildevandKvlstof findes i mange former med forskellige oxidationstrin. I spildevand tilfres kvlstof i fire forskellige former: Organisk bundet kvlstof (R-NH2), Ammonium (NH4+), Nitrit (NO2-) og Nitrat (NO3-). Strstedelen af kvlstof fra husholdnings-spildevandet kommer fra de to frstnvnte kvlstofformer (Sedlak, 1991). I det flgende beskrives de transformationer der sker af kvlstof i spildevandet. En skitsering af processerne kan se i fig. 1.0. Det organiske kvlstof i spildevandet er primrt bundet til proteiner, hvor kvlstoffet indgr i aminosyrerne. Proteinerne bliver nedbrudt af fermenterende bakterier ved hjlp af enzymet protease. Karakteristisk for disse bakterier er, at de er Gram-positive og primrt kommer fra slgten Clostridia. Nedbrydningen resulterer i, at det organiske kvlstof transformeres til ammoniumform (Sedlak, 1991). Udover at ammonium er et nedbrydningsprodukt fra protein hydrolysen i spildevandet, tilfres det ogs renseanlgget, som et nedbrydningsprodukt af urin. Urin bestr blandt andet af den organiske kvlstofforbindelse urea (NH2)2CO, som nedbrydes til ammonium af bakterier som Klebsiella,

7

Proteus og Yersinia (tarmbakterier) ved hjlp af enzymet urease. Human urin udgr ca. 90 % af den kvlstofmngde der tilfres renseanlgget fra husholdninger (mst, 2000). En mindre del af spildevandets ammonium vil blive optaget, som en del af byggestenene i mikroorganismers vkst, mens strstedelen omdannes til nitrit (NO2-) og nitrat (NO3-) ved nitrifikationsprocessen (Sedlak, 1991). Nitrifikation er en aerob proces hvor ammonium frst omdannes til nitrit, af f.eks. den autotrofe bakterieart Nitrosomonas sp, ved hjlp af enzymet ammonium monooxygenase. Under forudstning af, at der er tilstrkkeligt ilt tilstede (> ca. 4mg ilt/l), at pH er strre end ca. 7 og at temperaturen er over ca. 5 oC (Vandforsyning, 2002), vil nitrit omdannes til nitrat af bakterier af f.eks. arten Nitrobacter sp. ved hjlp af enzymet nitritoxidase. Nitritfikationen af ammonium kan ogs varetages af andre mikroorganismer, som f.eks. heterotrofe bakterier eller svampe (Maier, 2000). Reduktionen af Nitrat og tilbagevrende Nitrit gennemgs i det flgende kapitel om denitrifikation.

Fig. 1.0 Transformation af kvlstof i den biologiske renseproces (frit efter Sedlak, 1991).

8

1.2 DenitrifikationBiologisk denitrifikation kan defineres, som en respiratorisk proces hvor der sker en enzymatisk, trinvis reduktion af nitrat og nitrit til gasformerne kvlstofoxider 4 (NOx) eller molekylr kvlstof (N2). Reduktionsprocessen involverer elektron transport fosforylation (Hallin, 1999). At denitrifikationen er en respiratorisk proces, som involverer elektron transport fosforylation, refererer til, at den energi, som denitrifikanten har brug for (til cellens syntese), produceres ved en kemisk oxidation-reduktions reaktion, hvor nitrat og nitrit fungerer som elektron acceptor og det organiske stof som elektrondonor. Overfrslen af elektroner mellem molekylerne finder sted i elektron transportkden (Naidoo, 1999). Elektron transportkden har, udover overfrslen af elektroner mellem donor og acceptor, til funktion, at konservere en del af den energi, der bliver frigjort i forbindelse med elektronoverfrslen, i form af Andenosine TriPhosphate (ATP), (Tchobanoglous, 2004). Denitrifikationsprocessen i det aktive slam, kan simplificeret udtrykkes ved flgende formel, hvor der ved nitratreduktionen er brugt formaldehyd, som eksempel p organisk stof: NO3- + CH2O + H+ N2 + CO2 + H2O frit kvlstof + kulstofdioxid + vand.

Nitrat (elektron acceptor) + organisk stof (elektron donor)

P flgende formel ses den trinvise reduktion af nitrat og nitrit, hvor det organiske stof er methanol: 1) 6NO3- + 2CH3OH 2) 6NO2- + 3CH3OH 6NO2- + 2CO2 + 4H2O 3N2 + 3CO2 + 3H2O + 6OH(Wiesmann, 2007 ) Netto afleveringen af elektroner fra ilt til kvlstof hvorved frit kvlstof (N2) kan dannes kan ses p en samlet formel af 1) + 2): 6NO3- + 5CH3OH 3N2 + 5CO2 + 7H2O + 6OH(Wiesmann, 2007 )

4

Kvlstofoxiderne NOx er her fllesbetegnelse for kvlstofilte NO og kvlstofdioxid NO2 (Madigan, 2003).

9

I det flgende afsnit beskrives kort nogle af de slgter og arter, der har denitrificerende bakterier. Derefter gennemgs de denitrificerende bakteriers funktionelle gener, som er involveret i denitrifikationsprocessen.

1.3 Denitrificerende bakterier.Denitrificerende bakterier er en samling af bakterier der biokemisk og taxonomisk er meget forskellige. I aktivt slam vil typisk omkring 80 % af bakterierne vre fakultative anaerobe og i stand til at denitrificere. De fleste denitrifikanter er heterotrofe 5, mens en mindre del af dem er autotrofe6

bakterier, der lever af brint (H2) og kuldioxid (CO2) eller reducerede svovl (S)

forbindelser. De bakterieslgter der har de fleste kendte denitrificerende bakterier og som ofte findes i aktivt slam, er Pseudomanas sp., Alcaligenes sp. og Bacillus sp. (Gerardi, 2002) (se tabel 1.0). Flles for denitrifikanterne er, at de indeholder et eller flere reduktase-enzymer som katalyserer forskellige trin i denitrifikationsprocessen (Nor, Nir, Nar og Nos) (Knowles, 2008). I tabel 1.0 ses klassifikation p slgts- og artniveau p nogle af de foskellige denitrificerende bakterier. Bakterierne reprsenterer denitrifikanter der kan katalysere et eller flere trin i denitrifikationsprocessen.5

Organisme, der krver organisk kulstof fra andre organismer, som nring (knowles, 1982). Organismer som opbygger organisk stof ved fotosyntese eller i nogle tilflde kemosyntese, autotrofe

6

organismer er: alle grnne planter med fotosyntese, cyanobakterier med fotosyntese og bakterier med fotosyntese eller kemosyntese (Tchobanoglous, 2004).

10

Tabel 1.0 Klassifikation af nogle af de kendte denitrifikanter p slgts- og arts niveau samt deres andel i denitrificationsprocessen Frit fra (Knowles, 2008).

Slgter med Eksempler p arter denitrificerende med denitrifikanter. bakterier Alcaligenes Achromobacter Alcaligenes A. faecalis A. eutrophus A. denitrificans A. odorans B. subtilis

Nogle af Forekomst arterne kan denitrificere : NO2NO3Signifikant gruppe af denitrifikanter i aktivt slam.

Bacillus

NO2NO3NO3NO3N2O NO3NO2NO2NO3NO2NO N2O N2 N2 N2 N2O N2O N2O

Signifikant gruppe af denitrifikanter i aktivt slam.

Chromobacterium C. violaceum C. lividum Kingella Moraxella

Paracoccus (Micrococcus) Pseudomonas

P. halodenitrificans P. aerogenes P. aurefaciens P. caryophylli P. chlororaphis P. flourescens P. mallei P. mendocina

Almindelig i aktivt slam Signifikant gruppe af denitrifikanter i aktivt slam.

1.4 Denitrifikations enzymerDenitrifikationsprocessen foregr vha. 4 forskellige enzymer (A,B,C,D) som hver igangstter et trin i processen hvor nitratmolekyler omdannes til kvlstofgas (se fig.1.1). De 4 enzymer er: Nitrat reduktase, Nitrit reduktase, kvlstofmonooxid reduktase og lattergas reduktase (Tavares, 2006).

11

(A) nitrat reduktase NO3-

(B) nitrit reduktase NO2-

(C) Kvlstof monooxid reduktase NO

(D) Lattergas reduktase N2O N2

( E) Nitrit reduktase (som medvirker ved omdannelse af nitrit til ammonium) (NH4) Fig. 1.1. Figuren viser de fire enzymer (A, B, C, D), som medvirker i omdannelsen af nitrat NO3- til kvlstofgas N2. Figuren viser udover denitrifikationen, at der ogs sker en dissimilations proces hvor nitrit omdannes til ammonium vha. et andet nitrit reduktase enzym.

Fig 1.2 Illustration af de 4 forskellige denitrificerende enzymers placering i gram negative bakteriers cellemembran (Throbck, 2006). I det flgende gives en kort beskrivelse af opbygningen og funktionen af hvert enkelt af de fire enzymer, som medvirker i denitrifikationsprocessen.

1.4.1 Nitrat reduktase (Nar)Dette enzym har som funktion at katalysere nitrat til nitrit: NO3funktion hmmes, nr der er ilt tilstede (Naidoo, 1999). Nitrat reduktase er et molybdenum-jern-sulfur protein, der er opbygget af to til tre subunits kaldet , og . -unit, som menes at vre involveret i enzymets katalyserende funktion (Meier, 2000). NO2- og dens katalyserende

12

unit har angiveligt en funktion i forhold til enzymets binding til membranen, mens -uniten har en coenzymatisk funktion og medierer overfrslen af elektroner til (Naidoo, 1999). Enzymet kan ud fra placeringen i cellen inddeles i forskellige typer. To af typerne er placeret i cytoplasma i henholdsvis eukaryoter og bakterier. En anden type (NAR) er bundet til bakteriel membran (fig. 1.2). Den sidste type er placeret i periplasma (NAP) (Moura, 2001) (Se tabel 1.1) Placeringen af enzymet i den cytoplasmatiske membran medfrer, at nitrat skal transporteres gennem membranen. Der er forskellige teorier om hvordan denne transport foregr hos forskellige denitrificerende bakterier. En mulighed er en facilliteret diffusion (Naidoo, 1999), det vil alts sige en transport hvor transportprotein i cellemembranen hjlper med transporten over membranen. En anden transport mekanisme er aktiv transport via en symport og antiport (Naidoo, 1999). Ved symport og antiport transporteres 2 molekyler fra omrde med hj stofkoncentration til et omrde med lav koncentration (symport) ved hjlp af transportprotein og dette igangstter samtidig en transport i modsat retning af molekyler, som bevger sig fra lav til hj stofkoncentration (antiport). I forbindelse med nitrat reduktase sker der typisk indledningsvist en transport af H+ og nitrat (NO3) ind i cellen, s lnge cellen har en lav koncentration af nitrit, vha. symport-transporten. Nr cellen efterflgende har opnet en hj koncentration af nitrit, transporteres en del af nitrit, som er toxisk for cellen, ud af cellen og en del transporteres til nitrite reduktase enzymet, som katalyserer det til nitrit oxid (se fig. 1.3)

Fig 1.3 Symport og antiport transport af nitrate og nitrit (Naidoo, 1999).

13

1.4.2 Nitrit reduktase (Nir)Nir har som funktion, at katalysere Nitrit til kvlstofmonooxid NO2NO, og er et enzym som kun findes hos denitrificerende organismer (Naidoo, 1999) (Meier, 2000). Som nvnt er Nitrit blevet transporteret til nitrite reduktase enzymet og skal her katalyseres til kvlstofmonooxid. Der findes 2 typer af nitrit reduktaser, som findes i forskellige denitrificerende bakterier. Den ene type er et metalloprotein (nirK) der indholder 2 slags kobber protein. Det ene kobberprotein er involveret i transport af elektroner, mens det andet menes at fungere som elektron acceptor. Den anden type nitrit reduktase er et hm-protein (nirS) der indeholder c- og d- type cytochromer (Naidoo, 1999) (se tabel 1.1). Cytochrom c medvirker ved den intramolekylre elektron overfrsel (Tavares, 2006). Placeringen af nitrit reduktase har der vret flere bud p, bl.a. at det er placeret i cytoplasma eller periplasma (Naidoo, 1999). Det har vist sig at Nir udover denitrificerende funktion ogs har supplerende eller alternative funktioner i form af afgiftning (Rhizobium) samt ilt- og Fe(II)NO2 oxido reduktion (Roseobacter denitrificans og Magnetospirillum) (Jones m.fl., 2008).

1.4.3 Kvlstofmonooxid reduktase (Nor)Nor har som funktion at katalysere kvlstofmonooxid til lattergas (nitrous oxid) (NO N2O ). Kvlstofmonooxid reduktases katalyserende funktion hmmes ved tilstedevrelsen af ilt og fremmes ved tilstedevrelsen af kvlstofmonooxid former (Meier, 2000). Da der sjldent kan observeres nitrit oxid i forbindelse med denitrifiktationsprocessen, er viden i dag om enzymets placering i forhold til memebranen begrnset (Naidoo, 1999) (Se tabel 1.1). Nor har, i Bacillus azotoformans, vist sig, at have en anden funktion, idet genet her har en afgiftende funktion (Jones m.fl., 2008).

1.4.4 Lattergas reduktase (Nos)Nos har som funktion at katalysere lattergas til kvlstof ( N2O led i denitrifikationsprocessen. N2O + 2H+ + 2e2

N2). Dette trin er alts det sidste

+H2O (Moura, 2001)

14

Lattergas reduktase er placeret i membranens periplasmatiske side. Enzymet er opbygget af 2 identiske subunits, som hver indeholder en dobbeltkerne indeholdende kobber (se tabel 1.1). De to subunits har hver sin funktion. CuA har samme funktion som cytochrom c oxidase, det medvirker alts ved den intramolekylre elektron overfrsel og bidrager p den mde ogs til ATP syntese. Den anden subunit CuZ er ansvarlig for selve katalysen (Tavares, 2006).

Tabel 1.1. Oversigt over de vigtigste karakteristika for de fire enzym-reduktaser i denitrifikationsprocessen. Enzym Reaktion Lokation Composition Nitrat reduktase NO3 NO2 Nitrit reduktase NO2 NO Nitric reduktase Nitrous redukatse NO N2O N2O N2

Cytoplasma Mo,Fe,S

periplasma Protein + Cu Hemeprotein + cyt c-d

periplasma Cytochrome b+c < 55

periplasma Soluble + Cu

Molekylr Masse (kd)

100 to 200

70 to 150

80 to 145

(Mo - molybdenum; Fe - jern; S - sulfur ; Cu - kobber; kd - kilodaltons) (Naidoo, 1999)

1.5 Forhold der har betydning for denitrifikationen i renseanlgget.I dette afsnit vil der kort blive beskrevet nogle af de forhold (fri ilt, pH, temperatur og kultofkilde), der har betydning for en normal dentrifikations proces i renseanlgget.

1.5.1 Fri ilt.Iltkoncentrationen har betydning for denitrifikationen. Tilstedevrelsen af fri ilt, selv i meget sm koncentrationer (0,8). Iflg. Naidoo kan det ud fra forsg med denitrifikanten Pseudomonas denitrificans pvises, at den optimale reduktion af nitrat og nitrit sker ved forskellig pH. Ved pH >7,3 kunne frit kvlstof gas (N2) ses som slutproduktet af kvlstof-reduktionen, mens pH< 7,3 resulterede i lattergas (N2O). Hvor nitrat-reduktionen har et optima ved pH 7,4-7,6 har nitrit optima ved pH 7,27,3 (Naidoo, 1999). Undersgelser har vist, at forskellige denitrifikanter kan have forskellig pH optima hvilket der kan ses eksempler p i tabel 1.2. P bybro renseanlg ligger pH vrdien i slam mellem 7,2-7,7 (Personlig kommunikation Per Guldvang). P Aalborg renseanlg vest ligger pH mellem 7,1-8,3 og p Aalborg Renseanlg st ligger pH mellem 7,3 8,9. (Personlig kommunikation Jesper Sams).

16

Figur 1.4. Denitrifikations-processen som funktion af pH (Naidoo, 1999).

Tabel 1.2 pH optima for forskellige denitrifikanter (Naidoo, 1999). Gram Denitrificerende bakterie farvning pH optima 6,8 til 7,4 7 7,5 til 7,9

Thiobacillus denitrificans Negative Thiobacillus novellus Thiobacillus versutus Bradyrhizobium japonicum Negative Negative Negative

6 til 7

Dentrifikations processen vil i sig selv pvirke pH-vrdien. Hvor nitrifikationen bevirker et fald i alkaliniteten ger denitrifikationen alkaliniteten med pga. nedbrydningen til kvlstof, kuldioxid, vand og hydroxid, hvor hydroxiden er basisk (se ligning s. 8). Dog vil der netto vre sket et fald i alkaliniteten ved nitritfikationen/denitrifikationen, hvorfor det kan vre ndvendigt at regulere pH ved tilfrsel af kemikalier (Grady, 1999).

17

1.5.3 TemperaturenDentrifikationen er en biologisk proces og temperaturen har en stor betydning for denitrifikationen. Processen kan foreg ved temperaturer mellem 2oC og 50o C, men optima temperatur ligger mellem 25 og 35o C (Rivett, 2008). P AAV, AA og bybro renseanlg ligger temperaturen i slammmet mellem 7oC (om vinteren) og 20oC (om sommeren) (Personlig kommunikation Per Guldvang).

1.5.4 Kulstof-kildeFor at kunne fungere og reproducere sig, har de heterotrofe denitrifikanter brug for kulstof i form af organisk stof. Mngden og sammenstningen af organisk stof, som er tilgngeligt for denitrifikanterne, afhnger af det organiske materiale, der tilledes renseanlgget via henholdsvis husholdnings- og industrispildevand. Er denne interne kulstof-kilde ikke tilstrkkelig, kan der tilsttes substrat som ekstern kilde, hvilket AAV og AA har valgt at gre i form af Melasse. Den tilgngelige substrat har i undersgelser vist sig, at have betydning for bde denitrifikationsraten og denitrifikant-populationen i aktivt slam. I undersgelserne viste det sig, at forskellige denitrifikanter har forskellige prferencer i forhold til substrat, og at denitrifikationsraten generelt steg ved tilstning af kombinations-substrater, frem for at tilstte single-substrat. Undersgelserne viste tillige, at kompositionen af denitrifikant populationen i det aktive slam, afhnger af hvilket substrat, der er tilgngeligt i det aktuelle aktive slam (Hagman, 2007) (Morgan-Sagastume, 2008).

1.6 Metoder til identifikation af denitrificerende bakterier.I dette afsnit vil der kort blive beskrevet forskellige metoder, der har vret brugt i andre studier til identifikation af denitrificerende bakterier, herunder problemer i forbindelse med kultivering, manglende monofylogeni, valg af funktionelle gener og sammenhold af disse. Der er i dag begrnset hvad vi ved om denitrifikanternes (og bakterier generelt) levevilkr i deres naturlige milj, hvorfor det er vanskeligt, at isolere dem i rene kulturer med henblik p at klassificere og identificere dem ud fra deres fysiologiske og biokemiske funktioner. Omkring 99 % af alle naturens mikroorganismer kan sledes ikke isoleres (Amann, 1995). Ligeledes er en

18

identifikation ved hjlp af mikroskopering heller ikke velegnet, idet denitrifikanterne morfologisk er for simple til at kunne klassificeres ud fra forskelle og ligheder i deres karaktertrk. (Muyzer, 1999). Inden for de senere r har bakteriernes gensekvenser vret genstand for identifikation og fylogenetisk klassifikation. Ved at sammenholde nogle flles konserverede og variable genomrder hos bakterierne kan slgtsforholdet bestemmes ved en fylogenetisk analyse. Dette er dog ikke uden problemer ved identifikation og bestemmelse af slgtsforhold mellem denitrificerende bakterier. Bakterierne er ikke en monofyletisk gruppe, der indeholder alle efterkommerne af en stamform og ingen andre, men derimod en polyfyletisk gruppe, der har flere stamformer og ikke indeholder alle efterkommerne. Et krav til anvendelse af gener i evolutionre studier er, udover de frnvnte konserverede og variable genomrder, at der ikke m vre sket en overfrsel af genet mellem forskellige arter (Heylen, 2006). Bakterier kan optage fremmede gener vha. Horizontal Gene Transfer (HGT). I forbindelse med identifikation af bakterier er forekomsten af HGT et problem, idet nrt beslgtede bakterier kan vise sig at have vidt forskellige gener, mens fjernt beslgtede kan vise sig at have mange af de samme gener (Jones m.fl., 2008). 16S rRNA er en gensekvens, som anses for at have et flles fylogenetisk omrde for bakterier og det er et gen, som meget sjldent udsttes for HGT hvorfor 16S rRNA har vret anvendt til at forsge at identificere denitrificerende bakterier (Heylen, 2006). 16S rRNA er et stor polynukleotid p ca. 1500 nukleotider, som findes i alle prokaryote bakterier, og som er et af de gener der er ndvendige for at cellen kan syntetisere protein, idet 16S rRNA koder for ribosom (Madigan, 2003).

Ved at analysere sekvenserne, eller dele af dem, vil der hos de forskellige bakterier kunne findes adskillige konserverende regioner, mens andre dele er variable og ved sammenligning af sekvenserne kan der pvises hvor tt slgtskabet er mellem bakterierne (Madigan, 2003) (Maier, 2000). Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) er en gel- elektoforese metode til at identificere bakterier efter opformering af PCR-sekvenser indeholdende f.eks. 16SrRNA. Ved DGGE separeres gener med den samme strrelse ud fra forskellen i disse geners base-sekvenser. Gelen har en konstant temperatur og indeholder DNA denaturant, som en stigenende graduant. Nr DNA-fragmenterne migrerer gennem gelen, vil fragmenterne begynde at denaturere ved kontakten med DNA denaturanterne og vil til slut stoppe migrationen, nr smelte-punktet er net, alts hvor

19

den dobbeltstrengede DNA er blevet til to enkeltstrenge. Det som giver forskellen i hvor langt DNA fragmentet migrerer, er forskellen i sekvensernes komposition (Maier, 2000). En ulempe ved at bruge DGGE er, at selv om molekyler har forskellige sekvenser, kan de alligevel vise sig, at have samme smeltepunkt, hvorfor det ikke vil vre muligt, at identificere dem som vrende forskellige molekyler (Throbck, 2004). En anden mde at identificere bakterier p er, vha. Flourescent in situ hybridization (FISH), hvor identificeringen af specifikke in situ bakterier, sker vha. flourescering af f.eks. en specifik fylogenetisk probe, der vil kunne genkendes efter hybridizering. FISH-metoden kan dog have begrnsninger i forbindelse med at identificere denitrificerende bakterier, idet den krver, at der er et flles konserverende omrde p 16S rRNA for alle denitrificerende bakterier. Det har imidlertid vist sig, at 16S rRNA analysen ikke er egnet, til at identificere lige netop denitrificerende bakterier, idet der mellem de denitrificerende bakterier ikke findes flles konserverende regioner (Jones, 2008). Det vil alts ikke vre muligt, at inddele denitrificerende bakterier ud fra den traditionelle taxonomiske orden. Der er lavet flere undersgelser hvor denitrificerende bakterier isoleres og kultiveres, men undersgelserne viser kun noget om de specifikke bakterier, som netop disse forsg er baseret p (Heylen, 2007). Til gengld er der noget der tyder p, at et fllestrk ved denitrificerende bakterier er, at de indeholder et eller flere af 4 specifikke funktionelle gener: Nir, Nar, Nor Nos, som koder for enzym-reduktaser, der er involveret i denitrifikationen (Heylen, 2006). Genet NosZ (lattergas reduktase) har vist sig, at vre det funktionelle gen, som har den strste overensstemmelse med den taksonomiske klassifikation, der baseres p 16S rRNA (Enwall, 2008).

2.0 Projektets formlI nrvrende rapport er mlet, at undersge sammenstningen af denitrificerende bakterier i aktivt slam. I de indledende kapitler er der kort blevet beskrevet hovedtrkkende i noget af den viden, der i dag er tilgngelig om denitrificerende bakterier og deres funktioner i aktivt slam. En af de nglefaktorer, der har betydning for hvilke denitrificerende bakterier, der findes i aktivt slam og deres aktivitet i denitrifikationsprocessen, er den tilgngelige substrat. Ny viden har vist, at denitrificerende bakterier er specialiseret i forhold til tilgngeligt substrat (Morgan-Sagastume m.fl., 2008). Det m derfor forventes, at populationen af denitrifikanter afhnger af rensningsanlggets opbygning og drift. Viden om denitrifikanterne i rensningsanlg og identifikation af de denitrificerende bakterier, vil p sigt kunne fre til en strre forstelse og et

20

bredere perspektiv p denitrifikanternes rolle i deres mikromilj i det aktive slam, og p den mde bidrage til en viden, der vil have betydning for en optimeret drift af renseanlggenes denitrifikations processer og ultimativt til gavn for miljet. Til trods for denitrifikanternes signifikante betydning, har der hidtil vret overraskende begrnset forskning i disse bakterier, hvilket sandsynligvis, kan begrundes med manglende egnede metoder til at identificere dem. Udviklingen indenfor molekylre teknikker gennem de sidste par rtier, samt tilfjelsen af et stort datamateriale af denitrifikanter fra andre miljer, har vist sig, at bne nye veje til identifikation og bestemmelse af slgtskaber mellem mikroorganismer. I nrvrende projekt vil jeg identificere NosZ-brende denitrificerende bakterier fra Aalborg renseanlg vest og st samt Aabybro renseanlg. Vha. databaseret sekvenserings-behandling og alignment med tidligere publicerede NosZ sekvenser forventer jeg, at kunne bestemme diversiteten mellem de aktuelle denitrificerende bakterier.

2.1 ProblemformuleringI nrvrende projekt nskes derfor flgende sprgsml besvaret: Hvilken betydning har konfigurationen og driften af rensningsanlgget p sammenstningen af denitrifikanter i aktivt slam? Hvordan og i hvilket omfang kan molekylr teknik med NosZ-gen, som molekylr markr, bidrage til identifikation af denitrificerende bakterier i aktivt slam?

3.0 Beskrivelse af renseanlgI dette projekt bliver der lavet undersgelser af dentrificerende bakterier i aktivt slam fra tre forskellige renseanlg i Nordjylland. I det flgende vil disse tre renseanlg kort blive beskrevet.

21

3.1 Aalborg renseanlg st (AA)AA modtager spildevand fra den stlige del af det centrale Aalborg og fra en rkke mindre byer beliggende nord og syd for Limfjorden i Aalborg kommune. Udover disse modtager AA ogs spildevand fra Skrping og Sejlflod kommune. Dimensioneringsgrundlaget for AA er 100.000 PE og det rensede spildevand udledes til Limfjorden (se tabel 3.0). Efter spildevandet har vret igennem en mekanisk renseproces bliver spildevandet blandet med returslam og rejektvand (sidestrmshydrolyse) og ledt over i hydrolysetanken (fig. 3.0) hvor der tilsttes melasse som ekstern substratkilde (202 m3 i 2007), primrt til fosfor akkumulerende bakterier, men ogs til de denitrificerende bakterier i anaerobtanken (Personlig kommunikation Sams Pedersen). Melasse er et biprodukt fra produktionen af sukker som bestr af et vandindhold p 17-25 %, et sukkerindhold (sucrose, glukose, fructose) p 45-50 % og et indhold af polysakkarider (dextrin, pentosans, polyuronic syre) p 2-5 % (Karlby, 2002). I hydrolysetanken sker der en hydrolyse og fermentering af nringsstoffer, hvorved langsomt omstteligt organisk stof nedbrydes til let omsttelig organisk stof, og fosfor optages i fosfor akkumulerende bakterier (Grady, 1999). Spildevandet fra anaerobtank og vandet fra hydrolysetanken ledes over i 4 luftningstankene, der indbyrdes er forbundet 2 og 2 og fungerer som skiftevis denitrifikaitons- og nitrifikations-tanke med og uden beluftning. Fra luftningstankene fres spildevandet til 3 efterklaringstanke, hvor slam og vand adskilles gennem bundfldning. Det meste af slammet ledes tilbage til anaerobtanken som returslam, mens resten afvandes og ledes til rdnetank. Slammngden efter slutafvandning er p 10-14 tons/dgn. Det rensede spildevand ledes ud i 4 meters dybde i Limfjorden Mngden af kvlstof i det rensede spildevand der udledes er 3,7mgN/l (rensekravet er 8mgN/l). Der er alts en rensegrad p 88 %. (Kloakforsyningen, 2006). I 2007 var mngden af udledt Nitrit (NO2-N) 258 kg/r, Nitrat (NO3-N) er 13.280 kg/r, ammonium (NH4-N) er 2.710 kg/r og det totale kvlstof-udledning (Ntot) er 25.660 kg/r7 (Personlig kommunikation Sams Pedersen).

7

Der findes desuden fraktioner af kvlstof ( proteiner og aminosyrer ) som oplst og suspenderet stof, der ikke indgr i mlingerne af nitrat, nitrat og ammonium (Personlig kommunikation Sams Pedersen).

22

Figur 3.0. Illustration af renseprocessen p AA, hvor den mekaniske rensning er illustreret ved (1) og (2), den biologiske rensning hydrolyse, fermenterting, fosforakkumulation sker i tanke (3) og (4), nitrifikation og denitrifikation i tanke (5).

3.2 Aalborg renseanlg Vest (AAV)AAV modtager spildevand fra de centrale byomrder i Aalborg og Nrresundby. Derudover modtages spildevand fra en rkke af de syd-vestlige byer i Aalborg kommune, fra Stvring og Skrping kommune. Dimensioneringsgrundlaget for AAV er 330.000 PE og det rensede spildevand udledes til Limfjorden (Se tabel 3.0). AAV har den samme mekaniske rensnings proces, som p AA, men har desuden 4 forklaringstanke (Kloakforsyningen, 2006) (fig. 3.1). Fordelen ved at have disse 4 tanke er, at det primre slam (bundfldelige organiske og uorganiske stoffer) og flydeslam fjernes direkte til rdnetankene. P den mde fjernes ca. 30 % af den organiske belastning p luftningstankene. Selve den biologisk renseproces p AAV foregr p samme mde som p AA. Der tilsttes ogs her melasse (635m3 i 2007). Det rensede spildevand ledes ud i 11-12 meters dybde i Limfjorden. Mngden af kvlstof i det rensede spildevand der udledes er 4,9mgN/l (rensekravet er 8mgN/l) (Personlig kommunikation Sams Pedersen). Der er alts en rensegrad p 85 %. (Kloakforsyningen, 2006). I 2007 var mngden af udledt Nitrat (NO3-N)er 64.500 kg/r, ammonium (NH4-N) er 6.940 kg/r og det totale kvlstof-udledning (Ntot) er 109.500 kg/r8 (Personlig kommunikation Sams Pedersen).

8

Der findes desuden fraktioner af kvlstof ( proteiner og aminosyrer ) som oplst og suspenderet stof, der ikke indgr i mlingerne af nitrat, nitrat og ammonium (Personlig kommunikation Sams Pedersen).

23

Figur 3.1 Illustration af renseprocessen p AAV hvor den mekaniske rensning er illustreret ved (1) og (2), forklaringstanke (3) hvor primr- og flydeslam fjernes, den biologiske rensning hydrolyse, fermenterting, fosforakkumulation sker i tanke (4) og nitrifikation og denitrifikation i tanke (5).

3.3 Aabybro renseanlg (Aabybro)Aabybro modtager spildevand fra bybro by, Biersted og Nrhalne, Birkelse og Knsgrd. Dimensioneringsgrundlaget for Aabybro er 10.000 PE. Det rensede spildevand ledes via Ry til Limfjorden. Derudover modtages spildevand fra en rkke af de syd-vestlige byer i Aalborg kommune, fra Stvring og Skrping kommune (Kloakforsyningen, 2006). Den mekaniske renseproces p Aabybro foregr p samme mde som p AAV og AA (se fig. 3.2). Forskellen mellem den biologiske rensningsproces p AAV, AA og Aabybro er at Aabybro ikke har anaerobtanke (tabel 3.0). P Aabybro benyttes ikke eksterne substratkilder. Mngden af kvlstof i det rensede spildevand der udledes er 4,9mgN/l (rensekravet er 8mgN/l) (Personlig kommunikation Guldvang). Der er alts en rensegrad p 85 %. (Kloakforsyningen, 2006). Mngden af den totale kvlstof-udledning (Ntot) er 180 kg N/d (65.700 kg N/r) (Aabybro kommune).

24

Figur 3.2 illustration af renseprocessen p bybro renseanlg hvor den mekaniske rensning er illustreret ved (1) og (2) mens den biologiske nitrifikation og denitrifikation sker i tanke (3) og (4). Tabel 3.0 Oversigt over AA, AAV og Aabybro renseanlg i forhold til kapacitet, anlgsspecifikationer og aflbskrav. Tallene i parentes angiver antallet af den pgldende tank. I parentes er angivet antal af den pgldende funktionelle enhed.

Aalborg renseanlg st (AA) Person equivalent (PE) 100000

Aalborg renseanlg Aabybro renseanlg vest (AAV) (Aabybro) 330000 10000

Anlgsspecifikationer: 3 centrifugalpumper Indlb Ristehus Sand og fedt fang Anaerobtank Hydrolysetank 800 4500 m3/t (2) 2250 m3/t Kapacitet: 3200 m3 (1) 1800 m3 (1) 1800 m3 4 sneglepumper 1500 4500 m3/t (3) 5000 m3/t Kapacitet: 15000 m3 Har ikke (7) 830 m3 3 dykkepumper 200 540 m3/t (2) 300 m3/t Kapacitet: 58 m3 Har ikke Har ikke Denitrifikationtanken: (3) 580 m3 Nitrifikationtanken: (3) 630 m3 (2) 2600 m3 Efterklaringstanke (1) 2100 m3

Luftningstanke

(4) 5250 m3

(6) 6580 m3

(21) 920m3

(2) 1300 m3

Aflbskrav: Total Kvlstof Fosfor 3,7 mgN/l 0,3 mgP/l 4,9 mgN/l 0,4 mgP/l 4 mg N /l 1,2 mg P/l

25

4.0 Metoder.I det flgende afsnit vil de metoderne, der er anvendt i dette projekt blive beskrevet.

4.1 Mlinger af denitrifikationsrater.Med henblik p at bestemme omstningen af nitrat og nitrit ved ekstern tilfrsel af substrater, blev der benyttet en ufortyndet slamprve p 500ml fra hvert af de tre renseanlg. I forsget blev der tilfrt tre forskellige substrater: casaminosyre og acetat og en blanding af casaminosyre og acetat. 500ml slam blev tilsat i en reaktor og der blev gennemboblet med kvlstofgas i 15 min. for at skabe et anoxisk milj i reaktoren. 2mM Acetat og 2mM nitrat blev tilsat reaktoren. For hver af de 3 substrat-kombinationer blev der taget 7 delprver ud med ca. 10 min mellemrum. Hver prve blev centrifugeret i 5 min ved 3894 xg ved 4oC. Herefter blev prverne (supernatant) filtreret gennem 0,22 m polycarbonat filter. De 7 prver fra hver af de 3 substrat-blandinger, blev mlt for indhold af nitrit og nitrat i TRAACS (Technicon TRAACS 800TM). Mlingerne fra TRAACS-maskinen blev plottet med henholdsvis nitrat og nitrit, som funktion af tid, herudfra blev en rate beregnet (se billag). Tre prver p 20ml fra hvert renseanlg, blev filtreret ned p filtreringespapir (0,45 m) trret 24 timer ved 105 oC og den suspenderede masse (SS) bestemt, som er et ml p det uoplste stof i spildevand. Volatile suspended solids (VSS), som er et ml for den organiske del, beregnes ved forskellen mellem drnet og trret vgt fr og efter 1 times forbrnding ved 550oC.

4.2 Identifikation af NosZ-brende denitrifikanterMetoden der er anvendt i nrvrende projekt til at identificere denitrifikanterne bliver beskrevet i tre overordnede trin: PCR, Gelelektroforese og fylogenetisk tr.

26

4.2.1 Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction (PCR) er en in vitro metode til at opformere specifikke dele af DNAsekvenser (Steffan, 1991). I nrvrende projekt anvendes PCR til amplificering af talrige DNA sekvenser indeholdende nosZ genet. Mastermix bestende af 92 l DEPC dH2O, 13 l Buffer (100 mM Tris-HCl), 3 l (10mol) NosZ Forward primer: NosZ-F-1181 (5-CGCTGTTCITCGACAGYCAG-3), 3 l (mol) NosZ Revers primer: NosZ-R-1880 (5-ATGTGCAKIGCRTGGCAGAA-3) 1,5 l (5 units/l) Taq polymerase. 24 l mastermix blev tilsat i 5 PCR-rr og i 3 af rrene blev 1 l ekstraheret DNA fra aktivt slam fra de 3 renseanlg tilsat (DNA blev ekstraheret med Power Soil DNA isolation kit). PCR blev udfrt i PCR-maskinen (MWGAG Biotech Primus 96 plus) med programmet TouchDown 60-52 indstillet til at kre 40 cykler. Programmet udfrer denatuering ved 95oC i 5min (1 cyklus), efterfulgt 94 oC i 45 sek., herefter annealing 52 oC i 1 minut, 72 oC i 1 minut og sluttede ved at holde temperaturen p 72 oC i 10 min. og herefter 8 oC til opsamling.

4.2.2 Gel elektroforeseTil verifikation af hvorvidt pcr-produkterne indeholder sekvenser med NosZ blev PCR produkter testet ved gel-elektroforese. Til dette blev der lavet en 1 % agarose gel bestende af 0,4g agarose og 40ml Tris-acetate-EDTA (TAE). Gelen blev hldt i et elektroforese kammer, hvorefter der blev lavet 7 brnde, hvori der blev tilsat 0,3 g markr i den frste brnd, 5 l af PCR-produkterne fra hvert renseanlg samt 5 l af en positiv og 5 l af en negativ kontrolprve. En strmforsyning blev indstillet til at give en spnding p 120 V over gelen i en time, hvorefter gelen blev taget ud og placeret i en oplsning af TAE + 5 l (5 % v/v) Sybr gold i 40 min, hvorved den farves i mrke. Gelen sttes herefter i en kasse med UV-lys hvorved amplificeret DNA kunne ses og dets strrelse kunne bekrftes ud fra markren. Alle tre prver indholdt sekvenser med 700-800 bp, indikerende tilstedevrelsen af amplificeret NosZ gener. I henhold til PCR clean up manual Gel extraction (Macherey-Nagel) blev DNA trukket ud af gelen og renset. Herefter blev DNA igen renset ved hjlp af de samme to buffere og centrifugering.

27

De rensede PCR-produkter fra hvert renseanlg blev klonet vha. TOPO cloning reaktionskit (Invitrogen), ved at tilstte TOPO-vector, vand og salt i henhold til protokol TOPO TA Cloning Kit for sequencing (Invitrogen). TOPO cloning reaktion blev klonet ind i E.coli bakterier, som herefter blev udspredt og inkuberet p agarplader med henblik p opformering natten over. Dagen efter blev kolonier af E.coli overfrt til LB medium indeholdende 50 l/ml kanamycin og prverne blev inkuberet natten over. Ved hjlp af lysis blev plasmiderne frigjort fra E.coli cellerne i henhold til protokol Fast Plasmid mini (Eppendorf). Plasmiderne (20 hrende til hvert af de 3 renseanlg) blev herefter placeret i PCR-rr og der blev tilsat master-mix tilsvarende beskrivelsen tidligere beskrevet dog blev der tilsat M13-forward og revers primer i stedet for NosZ primere. Der blev valgt PCR programmet GAK 57 denatuering ved 94 oC i 10 min (1cyklus), efterfulgt af 30 cykler of 94 oC i 30 sek herefter annealing ved 57 oC i 1 min, 72 oC i 45 sek. og ekstension ved 72 oC i 5 min og 4 oC til opsamling og der blev ligeledes lavet gel-elektroforese af PCR-produkterne, som beskrevet tidligere.

4.2.3 Identifikation ved hjlp af fylogenetisk analyse.PCR-prver fra hvert af de tre renseanlg blev sendt til firmaet Macrogen i Korea, hvor prverne blev sekventeret. Sekvenserne blev derefter downloadet via Macrogens hjemmeside med tilhrende sekvens chromatografer. Sekvenserne blev efter trimning importeret til software programmet MEGA4. Ud fra kendskabet til nukleotidsammenstningen for NosZ primerne (forward og revers) blev den del af sekvenserne, der ligger fr og efter, samt nukleotider identificeret ud fra lav-kvalitet kromatogram, trimmet fra. De trimmede prvesekvenser blev alignet, hvorved sekvensrkkerne blev placeret i forhold til hinanden, s der var strst lighed i rkkeflgen af nukleotiderne mellem alle sekvenserne. I MEGA4 blev hver af de importerede sekvenser ved hjlp af BLAST sammenlignet med kendte bakteriesekvenser/genomer fra GenBank, hvorved der for hver enkelt prvesekvens fremkom et antal mulige match. Der blev for hver af prvesekvenserne valgt en bakteriesekvens/genom ud fra kriteriet om maximal similaritet og med minimum 80 % similaritet. De valgte

bakteriesekvenser/genomer blev herefter omsat til nukleotid-rkker i MEGA4 og der blev enkeltvis trimmet efter samme kriterium som prvesekvenserne (den del af nukleotiderne, der ligger fr forward primer og den del, der ligger efter revers-primer, blev trimmet fra).

28

Sekvenserne blev herefter ved hjlp af MEGA4 omsat til et neighbor-joining fylogenetisk tr. Der blev valgt et tr af typen phylogram, hvor grenlngden er omvendt proportionel med ligheden mellem arterne, dvs. jo lngere grene horisontalt des mere forskellig. I tret er der inkluderet en mlstok, der viser graden af lighed, der er reprsenteret ved en vis grenlngde. For at opn en passende afstand i tret, blev der fra en tidligere undersgelse af denitrificerende bakterier tilfjet yderligere 7 NosZ gener fra forskellige denitrificerende bakterier: Bordetella Petrii, Azoarcus sp, Achromobacter sp, Ralstonia eutropha, Azospirillium sp, Comamonas sp.

5.0 ResultaterI det flgende vil resultaterne af eksperimenterne blive fremlagt. Resultaterne er inddelt i to afsnit i henhold til de to sprgsml i problemformuleringen.

5.1 Denitrifikationsrater ved substrattilfrsel.I projektet blev mngden af oplst stof (SS) og organisk stof (VSS) i slamprverne beregnet. I tabel 5.0 ses resultaterne fra AAV, AA og Aabybro.

Tabel 5.0. Resultater over SS og VSS for de tre forskellige renseanlg. Aabybro AA AAV Suspended solids (g/L) 3,090 3,725 3,910 2,190 1,605

Volatile suspended solids (g/L) 2,275

Tabel 5.1 Oversigt over denitrifikationsraterne ved tre forskellige substrat kombinationer for henholdsvis AAV, AA og Aabybro renseanlg. Substrat Renseanlg Aalborg Vest Acetat (mmol/gSSt) Nitrat Nitrit 0,110 0,048 Casaminosyre (mmol/gSSt) Nitrat Nitrit 0,036 0,016 Acetat + casaminosyre (mmol/gSSt) Nitrat Nitrit 0,099 0,044

29

Aalborg st

0,075

0,022

0,062

0,038

0,140

0,032

Aabybro

0,059

0,055

0,020

0,026

0,048

0,049

I forsgene med denitrifikationsrater, blev der undersgt rater ved tre forskellige substrater: Acetat, casaminosyre og en kombination af disse to. I tabel 5.1 er anfrt de forskellige denitrifikationsrater Resultaterne viser at acetat generelt giver den hjeste nitrat reduktionsrate i forhold til casaminosyre ved alle tre renseanlg. Med f undtagelser giver kombinationen af acetat og casaminosyre hjere nitrat nitrit- fjernelsesrater i forhold til casaminosyre alene. Omvendt ses nogenlunde ens nitrit fjenelses rater for kombinationen af casaminosyre + acetat, som ved acetat alene. Ved forsgene med slam fra AAV viste resultaterne for denitrifikationsraterne for nitrat, at raten er hjst ved tilstning af acetat (0,11 mmol/gSS/t), lidt lavere ved kombinationen af acetat og casaminosyre (0,099 mmol/gSS/t). Det samme mnster ses ved denitrifikationsraterne for nitrit dog er raterne for nitrit generelt lavere end ved nitrat. Resultaterne for AA viste at denitrifikationsraterne for nitrat, var hjst ved kombinationen af acetat og casaminosyre (0,140 mmol/gSS/t), mens acetat alene gav en ca. 46 % lavere rate (0,075 mmol/gSS/t) i forhold til frstnvnte. Casaminosyre gav den laveste denitrifikationsrate (0,062 mmol/gSS/t). I slammet fra Aabybro viste resultaterne at denitrifikationsraterne for nitrat var hjst ved substratet acetat (0,059 mmol/gSS/t), lidt lavere ved substratkombinationen (0,048 mmol/gSS/t). Generelt viste resultaterne at Aabybro havde lavere denitrifikationsrater for nitrat end de to andre renseanlg.

5.2 Identifikation af denitrifikanter bakterier

30

I det fylogenetiske tr (fig. 5.0) er der i alt 52 sekvenser hvoraf 9 er prve-sekvenser fra Aalborg vest renseanlg (AAV), 11 fra Aalborg st renseanlg (AA) og 9 fra Aabybro renseanlg (Aabybro). I det fylogenetiske tr er Aalborg st renseanlg benvnt som AAO og nr der henvises til specifikke prvesekvenser i tret er det derfor denne benvnelse der bruges. Der er i tret medtaget sekvenser fra denitrificerende bakterier fra en tidligere undersgelse. 12 sekvenser har mellem 222 og 688 bp: Achromobacter sp (522 bp), Azospirillium sp (446 bp), ikke-kultiveret klon (FJ227261) (578 bp), Paracoccus denitrificans (AY345245) (222 bp), Comamonas sp (259 bp), AAV V19 (618 bp), AAO 07 (688 bp), Aabybro A10, A12, A15 og A16 (470 bp). De vrige 40 sekvenser bestr af 711 bp.

31

32

Fig. 5.0 NosZ-gen baseret neighbor-joining fylogenetisk tr, der viser denitrificerende bakterier fra aktivt slam fra AAV, AA og Aabybro renseanlg. Mlstokken under tret viser graden af lighed, der er reprsenteret ved en vis grenlngde. Tret er inddelt i 5 grupper ud fra slgtskab. Prvesekvenser fra de tre renseanlg er angivet med henholdsvis AAV, AAO og Aabybro samt prvenummer. De vrige sekvenser i tret er fundet som tttest beslgtede sekvenser ved BLASTsgning i GenBank.

Det fylogenetiske tr er inddelt i 5 grupper ud fra slgtsforhold vist i tret. Ved denne inddeling afgrnses en gruppe som vrende forholdsvis nrmere beslgtede, og dermed bliver det lettere, at sammenholde udbredelsen af denitrifikanter i de forskellige renseanlg. Ud fra denne deling fremkommer der 5 grupper: I gruppe 1 (fig. 5.0) ses, at flgende bakterier er beslgtede med prvesekvenser fra de tre renseanlg: Acidovorax sp., Azoarcus sp. Comamonas sp, Ralstonia pickettii, Ralstonia eutropha, Ralstonia solanacearum, Ralstonia metallidurans. Samtlige bakterier er denitrificerende betaproteobakterier. Resultaterne viser en subgruppe af prvesekvenser fra Aabybro renseanlg (A5, A12, A15) og AAO O1, som er indentificerede som Ralstonia eutropha med 82-85 % (se appendix). Ralstonia slgten viser similaritet med prvesekvenserne AAV V5, AAV V13 og AAO O2. En subgruppe af sekvenserne fra slamprverne Aabybro A 18, AAO O15, AAV V1 og AAV V3, som alle er identificeret som Ralstonia eutropha med 81-82 % (se appendix), ser ud til at vre beslgtede med AAO O2, som ikke umiddelbart kan identificeres, som vrende Ralstonia eutropha, idet similariteten ligger under kriteriet p minimum 80 % (se appendix). Prvesekvenserne AAO O6 og AAO O12 er begge indentificeret som Ralstonia eutropha med 84 % similaritet (se appendix) og de deler en distanceret relateret organisme med resten af gruppen. I resultaterne ses at prvesekvens AAO O16 (Ralstonia pickett 85 % - se appendix) danner sstergruppe med Comamonas sp. og at AAO O1, som er indentificerede som Ralstonia eutropha med 82-85 % (se appendix) ligeledes er beslgtede med Comamonas sp. Prvesekvensen AAV V14, som blev identificeret (84 %) som Ralstonia picketti (se appendix), er beslgtet med Acidovorax sp. Prvesekvensen AAO O14 divergerer lidt fra den Azoarcus sp. der kommer fra GenBank og sekvensen er identificeret med 81 % som Azoarcus (se appendix). AAO

33

O8 danner en sstergruppe med en ikke kultiveret prvesekvens (Unc. Klon, EU053061), som stammer fra en jordprve (Stief m.fl., 2007). En opsummering af resultaterne fra gruppe 1 viser, at alle prvesekvenserne danner gruppe med sekvenser fra betaproteobakterier (tabel 5.3). De fleste sekvenser er indentificeret indenfor ordenen Burkholderiales, hvor det overvejende er bakterier af arten Ralstonia eutropha, der er dominerende i de tre renseanlg, mens der er en enkelt sekvens fra AAV og AA af Ralstonia picketti arten (se tabel 5.2). I AAV og AA er der en enkelt sekvens reprsenteret af arten Azoarcus sp. som tilhrer ordenen Rhodocyclales (tabel 5.2). Prverne fra Aabybro viste den mindste variation i bakteriearter, idet der kun kunne identificeres 3 sekvenser, der alle kunne identificeres, som Ralstonia eutropha (se appendix). Prvesekvenserne viser slgtskab med forskellige kendte Ralstonia-arter, og Acidovorax, der begge ligesom Ralstonia sp. tilhrer ordenen Burkholderiales. I gruppe 2 (fig. 5.0) viser resultaterne en rkke af prvesekvenser fra alle tre renseanlg, dog primrt fra AAV og Aabybro. To af sekvenserne viste sig at vre ikke-kultiverede kloner fra Aabybro. AAV V6, der blev identificeret som Azoarcus sp. (Tabel 5.2), er nrt beslgtede med AAV V12 og AAV V19, som begge ikke kunne identificeres indenfor kriteriet om minimum 80 % similaritet (hjeste similaritet var med Thiobacilla sp. med henholdsvis 75 % og 79 %). Den anden undergruppe af sekvenser i gruppe 2 bestr af tre sekvenser fra Aabybro, en fra AAV og en fra AA, som alle kunne identificeres som Rhodoferax ferrireducens (se appendix). I gruppe 2 indgr der to ikke kultiverede kloner fra GenBank (FJ209533 og FJ209507), som begge stammer fra jordprver (Chen, m.fl., 2008). Prverne AAV V12, V19 og V6 viser stor similaritet med hinanden, og ligeledes er der stor similaritet mellem Aabybro A3, A8, A10 og AAV V2. Gruppe 3 (fig. 5.0) bestr udelukkende af sekvenser hentet fra GenBank. Sekvenserne tilhrer alle gruppen af pseudomonas arter, der er Gammaproteobakterier og velkendte denitrifikanter, men som ikke blev identificeret i dette studie (Tabel 5.2). I gruppe 4 (fig. 5.0) viste resultaterne for Aabybro at den ttteste beslgtede til A16 er en ikke kultiveret klon (FJ227261) (Yin, 2008), som er fundet i et marint system (se appendix). Ved BLAST viste resultatet for A16, at sekvensen kunne vre Pseudomonas stuzeri, og sekvensen indgr i en sstergruppe med Aabybro A17, der er identificeret som Pseudomonas stuzeri ved BLAST (tabel 5.2).

34

I gruppe 5 ses kun en enkelt prvesekvens (AAO 07) (fig. 5.0 og tabel 5.2), der er identificeret som en Alfaproteobakterie Rhodobacter spaeroides med 80 % (se appendix). Sekvensprven danner gruppe med alfaproteobakterierne: Paracoccus denitrificans, Rhodobacter sphaeroides og Azospirillum sp, samt Betaproteobakterierne Bordetella petrii og Achromobacter sp. (fig. 5.0). I tabellen (tabel 5.2) ses hvordan bakterierne er placeret i det fylogenetiske trs 5 grupper (grupperne som blev valgt p baggrund af afstand i similaritet). Tabellen viser for hvert af de tre renseanlg de identificerede prvesekvenser, samt hvor mange af de pgldende identificerede prvesekvenser, der er medtaget i tret. I tabellen er der ikke medtaget prvesekvenser, der ikke kunne identificeres ud fra kriteriet om minimum 80 % similaritet. I parentes er angivet i hvilken gruppe i det fylogenetiske tr prvesekvensen er placeret, i de tilflde hvor placeringen ikke stemmer overens med GenBank bakteriernes placering.

35

Tabel 5.2. Oversigt over bakterier identificeret vha. den fylogenetiske analyse. Bakterierne er inddelt efter taxonomisk klasse, orden, familie og arter.

Bakterier Alfaproteobakterier Orden: Rhodobacterales Familie: Rhodobacteraceae Art: Rhodobacter sphaeroides Paracoccus denitrificans Azospirillum sp Achromobacter sp Bordetella petrii Ralstonia eutropha Ralstonia metallidurans Ralstonia pickettii Ralstonia solanacearum Acidovorax sp. Comamonas spRhodoferax ferrireducens

Gruppe i tret

Antal sekvenser AAV AA Aaby bro

5 5 5 5 5 1 1 1 1 1 1 2 1 1 3 1

1

Rhodospirillales Betaproteobakterier

Rhodospirillaceae Alcaligenaceae

4 1

3

Burkholderiales

Burkholderiaceae

Comamonadaceae

11 (placeret i gruppe 2)

1 1

1

Azoarcus sp. Rhodocyclales Rhodocyclaceae

Gammaproteobakterier Pseudomonas aeruginosa PAO1 Pseudomonas aeruginosa PA7 Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14 Pseudomonas sp. 3 3 3 3 1 Pseudomonas stutzeri 3(placer et i gruppe 4)

Pseudomonadales

Pseudomonadaceae

Ukendte Ikke kultiveret klon (EU053061) fra jordprve Ikke kultiveret klon (FJ209533) fra jordprve Ikke kultiveret klon (FJ209507) fra jordprve Ikke kultiveret klon (FJ227261) fra marint system

1 2 2 4

1 1 1 1

36

6.0 DiskussionDiskussionen af nrvrende projekts resultater, vil i det flgende blive inddelt i to underafsnit svarende til inddelingen i problemformformuleringen og resultatafsnittet.

6.1 Diskussion denitrifikationsrater ved substrattilfrsel.For at opn en effektiv denitrifikation krver det tilstedevrelse af passende kulstofs-kilde og i nogle tilflde ogs i form af en ekstern kilde. I dette projekt blev der lavet forsg med tilfrsel af acetat, casaminosyre og en kombination af disse to. Resultaterne viser, at denitrifikationsraten varierer bde fra anlg til anlg men ogs fra substrat til substrat, hvilket tidligere undersgelser ligeledes har pvist (Hagman, 2008) (Morgan-Sagastume, 2008). Denitrifikationsraten for nitrat ved tilstning af casaminosyre, er i alle tre rensesanlg lavere i forhold til acetat og kombinationen, hvilket stemmer overens med undersgelse af Morgan-Sagastume. Den hjeste rate i AAV og Aabybro var for Acetat (henholdsvis 10 % og 19 % strre, end raten for kombination). rsagen til dette kunne vre, at populationen af denitrificerende bakterier i AAV og Aabybro er domineret af bakterier, der primrt har acetat som foretrukne kulstofskilde. I AA var der ligeledes en hj rate for acetat (hjere end i Aabybro), men det er kombinations-substratet, der viste den hjeste rate (46 % strre for kombinationssubstrat sammenlignet med acetat alene), hvilket indikerer, at denitrifikant-populationen er domineret af to grupper acetat og casaminosyre-metaboliserende denitrifikanter. At det lige netop er acetat, denitrifikanterne har som substrat-prference, som resultaterne viste for AAV og Aabybro og til dels AA, kan hnge sammen med, at acetat naturligt findes i det aktive slam som et af fermentationsprodukterne fra organisk materiale, hvorfor denitrifikanterne efterhnden har vnnet sig til acetat. Tidligere undersgelser har vist, at denitrificerende bakterier i forskellig grad krver en adaptions-periode, hvilket kan betyde, at en acetat-prfererende denitrifikant-population ikke ndvendigvis er en stationr acetat-

metaboliserende gruppe, men derimod kan tilvnnes et andet substrat over tid (Hagman, 2007). I Aabybro tilsttes der ikke eksternt substrat, mens der i AA og AAV tilsttes melasse, dog primrt for at tilgodese de fosforakkumulerende bakterier. Et af nedbrydningsprodukterne fra melasse under fermenterende forhold er acetat, hvorfor denitrifikanterne i AA og AAV i hjere

37

grad m vre adapteret til acetat, hvilket resultaterne ogs tyder p, idet raten ved acetat i AA og AAV begge er hjere en raten ved Aabybro. Denitrifikationsraterne for alle substrater er generelt lavere i Aabybro end i AA og AAV. I de to sidst nvnte renseanlg benyttes der sidestrmshydrolyse, hvilket kan have betydning for bakteriernes adaption til renseanlggets specifikke kulstofkilder, idet det aktive slam genanvendes som returslam, og desuden ledes spildevandet og returslammet desuden til en hydrolysetank, hvor der sker en fermentation og hydrolyse. Derfor vil en strre del af kulstof-kilden, som let nedbrydeligt organisk stof, vre tilgngeligt for bakterierne i AA og AAV end det er tilfldet i Aabybro, hvilket kan vre en grund til, at raterne i AA og AAV er hjere end i Aabybro. Tidligere undersgelser viser at raten for kombinations-substrat er nogenlunde lig med summen af raterne for de enkelte substrater der indgr i kombinationen (Hagman, 2007) (Morgan-Sagastume, 2008). Dette er tilfldet i resultatet for AA og resultatet kan forklares ved, som det beskrives i Morgan-Sagastume, at bakteriepopulationen enten bestr af to grupper, hvor den ene har prefrence for acetat, mens den anden gruppe har prference for casaminosyre, eller bestr af n denitrifikant-gruppe som simultant metaboliserer bde acetat og casaminosyre. I AAV og Aabybro viser resultatet imidlertid, at summen af raterne for substraterne alene, er strre en raten for kombinationen af selvsamme substrater. En gennemgang af tidligere undersgelser har ikke umiddelbart et lignende resultat. En mulig forklaring er, at der i disse to renseanlg er n denitrifikant-population, som kan metabolisere begge substrater, men som har prference for acetat og metaboliserer denne frst, for derefter, at metabolisere casaminosyre nr acetat- kilden er udtmt. Hvis dette er tilfldet ville resultaterne af det samme forsg over lngere tid angiveligt kunne vise at denitrifikationsraten for kombinationssubstratet ville blive ca. lig med summen af acetat og casaminosyre alene.

6.2 Diskussion identifikation vha. fylogenetisk analyseDer blev, i nrvrende projekt, fremstillet et fylogenetisk tr ud fra alignment af sekvenser fra GenBank med NosZ sekvenser fra aktivt slam i AAV, AA og Aabybro. Kriteriet for identifikation i dette projekt af NosZ-brende bakterier blev sat til minimum 80 % similaritet, og det kan diskuteres, om det har vret en hensigtsmssig grnse, der kan sikre identifikation med tilstrkkelig validitet. Horn og kollegaer har lavet en undersgelse, hvor similaritets-kriterier mellem NosZ sekvenser og 16S rRNA blev sammenlignet. I undersgelsen var konklusionen, at i

38

tilflde af hvor 2 denitrifikanter deler mere end 97 % 16S rRNA sekvens similaritet, vil 90 % af disse bakterier dele en NosZ similaritet p mere end 65 % (Horn, 2006) og da et sekvens-par, med16S rRNA similaritet p minimum 97 %, anses for at vre identiske (Kjeldsen m. fl, 2007), m det derfor vurderes, at nrvrende projekts similaritets-kriterie, ikke har vret sat for lavt, hvorfor identifikationen af sekvenserne m anses for valide, dog med forbehold for eventuelle fejl der kan vre aktuelle i forbindelse med processerne der ligger forud for aligment. Det fylogenetiske tr blev inddelt i 5 grupper ud fra slgtskab (fig. 5.0), hvor gruppen afgrnses ved en gruppe sekvensers deling af tt beslgtede ved udelukkelse af alle de vrige sekvenser i tret. Ved nrmere inspektion af hver af de 5 gruppers sekvenser viser det sig, at bakterieprverne med NosZ sekvenser, er en gruppe af denitrificerende bakterier, som tilhrer forskellige taksonomiske klasser indenfor alfa-, beta- og gammaproteobakterier, og at den valgte gruppeinddeling af tret i forholdsvis hj grad flger disse taksonomiske klasser. Gruppe 1 bestr udelukkende af betaproteobakterier (Ralstonia picketti, Ralstonia eutropha og Azorarcus sp.), mens gruppe 2 alle er prvesekvenser som er fjernt beslgtede med gruppe 1. Gruppe 3 bestr udelukkende af gammaproteobakterier (Pseudomonas stutzeri og Pseudomonas aeruginosa). Gruppe 4 bestr af to prveskvenser samt en ikke-kultiveret klon der har gruppe 5 som nrmeste beslgtede. Gruppe 5 bestr af sekvenser fra bde alfa- og betaproteobakterier (Alfaproteobakterier: Rhodobacter sphaeroides, Azospirillium sp. og Paracoccus denitrificans. Betaproteobakterier: Bordetella petrii og Achromobacter sp.). At NosZ-brende denitrifikanter hrer til henholdsvis alfa- beta- og gammaproterobakterier, og at bakteriesekvenserne placerer sig i grupper, der (bortset fra gruppe 2 og 4, der ikke inkluderer kendte sekvenser fra GenBank), overvejende flger de taksonomiske grupper, stemmer overens med tidligere undersgelser baseret p NosZ og 16S rRNA (Sakano, 2002), (Nielsen, 2008), (Etchebehere, 2001). I gruppe 5 ses, at en enkelt prvesekvens, som er identificeret som en alfaproteobakterie (AAO O7), er placeret, som nrt beslgtet og med forholdsvis lille afstand i similaritet, til andre sekvenser af bde alfa-type og beta-type proterobakterier. Dette kunne vre et udtryk for, at bakterier af de to forskellige klasser kunne have vret udsat for Horisontal Gene Transfer (HGT), hvorved de vil have konserverende NosZ regioner tilflles, men da undersgelser har vist, at hvis HGT er sket i evolutionen af NosZ, vil det sandsynligvis vre sket mellem mere nrt beslgtede organismer (Jones m.fl., 2008), hvorfor det er mere sandsynligt, at der kan vre en problematik i analysen af sekvenserne. Sekvenserne i gruppen, udover prvesekvensen, er alle fra GenBank, hvoraf flere af

39

dem er forholdsvise korte sekvenser, hvilket muligvis kan have forrsaget fejl i alignment, idet en kortere sekvens kan vre misvisende i den parvise sammenligning mellem konserverende og variable nulkeotid-regioner pga. det mindre (nukleotidantal) sammenligningsgrundlag (Head, 1997). Gruppe 3 bestr begge udelukkende af gammaproteobakterier af pseudomonas slgten. (gruppe 3 GenBank: P. stutzeri og P. aeruginosa). I nrvrende projekt blev der ikke fundet prvesekvenser tt beslgtede med denne gruppe af Pseudomonas sp. fra GenBank, hvilket er i uoverensstemmelse med tidligere undersgelser af isolerede denitrifikanter. Da de anvendte primere i nrvrende projekt, skulle vre i stand til at binde Pseudomonas sp. (Rich, m.fl. 2003) og da det ellers er en slgt af bakterier, der normalt vil findes i det aktive slam, kunne manglen p prvesekvenser i tret muligvis skyldes, at der i forsget er udtaget for f sekvenser til sekvenserings-databehandling. GenBankens Pseudomonas sp. sekvenser i nrvrende projekt er topologisk placeret i tret i overensstemmelse med andre undersgelser baseret p 16S rRNA (Nielsen, 2008) (Enwall, 2008) (Etchebehere, 2001). I trets gruppe 4 ses to prvesekvenser (Aabybro A16 og A17), som ikke er tt beslgtede med sekvenser fra GenBank, men derimod en ikke kultiveret klon (FJ227261). I tret ses, at gruppe 4 er nrmere beslgtet (deler flere forfdre) med gruppe 5, end med gruppe 3. Men afstandsmssigt er sekvenserne i gruppe 4 i flere tilflde mere similar (i grenlngde), med sekvenser i gruppe 3, end med sekvenser i gruppe 5. Den ikke kultiverede klon (FJ227261), som de to prvesekvenser i gruppe 4 er nrmest beslgtede med, stammer fra marine sedimenter, hvilket er tilsvarende resultater fra en tidligere undersgelse baseret p 16S rRNA (Sakano, 2002). rsagen til, at der ikke umiddelbart er nogle tt beslgtede sekvenser fra GenBank i gruppe 4 kan vre at langt de fleste bakterier er vanskelige at isolere og opformere in vitro, fordi det er vanskeligt at skabe prcis de samme forhold for bakterien i et laboratorium, som de habituelt lever under i det aktive slam. Det kan derfor ikke sikres, at identifikation baseret p kultiverede arter, rent faktisk svarer overens med de arter, som aktuelt findes i de specifikke slamprver. Noget lignende ses i trets gruppe 1, hvor alle prvesekvenserne blev identificeret som forskellige Ralstonia arter (Ralstonia eutropha mest dominante). Prvesekvenserne er placeret i gruppe med GenBankens R. eutropha, hvilket viser, at det aktive slams Ralstonia-bakterier er beslgtede med den kultiverede Ralstonia sp., dog er prvesekvenserne placeret i forskellige afstande (grenlngde) fra de kendte isolater indenfor

40

slgten Ralstonia hvilket kan indikere, at de kultiverede Ralstonia arter ikke er reprsentative for Ralstonia sp. fra in situ prver. I tidligere undersgelser er der fundet NosZ-brende bakteriearter, som ikke er identificeret i nrvrende projekt. Dette drejer sig bl.a. om Alcaligenes denitrificans, Alcaligenes fecalis, Blastobacter denitrificans, Bradyrhizobium japonicus og Rizhobium mellioti (Throbck, 2004), Sinorhizobium mellioti, Bradyrhizobium japonicus (Sakano, 2002), Thiobacillus denitrificans (Hole, 1995) og Brucella sp. (Jones, 2008). I dette projekt viste det ved alignment, at AAV V12, V19 og V6 er identiske og kunne identificeres som Azoarcus sp. og Thiobacillus denitrificans lignende sekvenser ud fra kriterier om minimum 80 % similaritet. De to vrige sekvenser viste en henholdsvis 75 % og 79 % similaritet med Thiobacillus denitrificans. Det er muligt at kriteriet med minimum 80 % similaritet har vret sat lidt for hjt, og at der derfor er blevet frasorteret for mange sekvenser, som kunne have vret relevante at medtage i tret. Udover at manglen p bakterier i tret, som ellers er fundet i tidligere undersgelser, kan bero p, at de pgldende bakterier simpelthen ikke er tilstedet, i det aktuelle aktive slam fra de tre renseanlg samt at anvendelsen af de specifikke primere i eksperimentet ogs have en betydning, for hvilke bakterier det er muligt at identificere. I nrvrende projekt er primerne NosZ-F-1181 og NosZ-R-1880 blevet benyttet. Primerne i dette projekt har vret brugt i tidligere undersgelse af denitrifikanter i jord-prver, hvor det har vist sig ved positive og negative kontrol-tests at de specifikke primere binder sig til udvalgte kendte sekvenser med NosZ og ikke binder sig til sekvenser uden NosZ (Rich, 2003). I tidligere undersgelser har det vist sig, at ikke alle primere kan binde sig til alle de forskellige NosZ-brende sekvenser, hvorfor valget af primere samtidig indebrer et fravalg af nogle prvesekvenser (Throbck, 2006) (Scala, 1998). En strre gruppe af sekvenser, som det endnu ikke er lykkedes at udvikle passende primere for, er hele gruppen af gram-positive bakteriesekvenser. Der kan alts udmrket vre langt flere sekvenser af NosZ-brende bakterier tilstede i det aktive slam, end der vil kunne detekteres med de primere, der er valgt i dette projekt. I gruppe 3 og 4 er prve-sekvenserne, som n gruppe adskilt fra GenBankens gruppe af samme bakterie, men i gruppe 1 er prvesekvenserne med R. eutropha-lignende sekvenser, placeret spredt i hele gruppe 1, og med varierende afstande til hinanden og til GenBankens R. eutropha. Denne spredning viser, at der er variationer i NosZ sekvenserne mellem de forskellige prver, men at der samtidig er nok flles konserverende omrder til, at de alle identificeres indenfor samme art. I andre undersgelser, baseret p 16S rRNA (Nielsen, 2008) (Etchebehere, 2001), ses der ikke en

41

tilsvarende differensering af R.eutropha. Placeringen af R. eutropha i forhold til de vrige sekvenser i gruppe 1 viser, at R. eutropha, i nogle af sekvenserne, er tttere beslgtede og har strre similaritet med sekvenser af en anden bakterie-familie, end med bakterier indenfor samme familie, slgt og endda art. Dette ses f.eks. i prvesekvens AAO O6 og AAO O12 (R. eutropha), som afstandsmssigt er mere similir med AAO O14, der er identificeret som Azoarcus sp, end med R. eutropha H16 eller AAO O15 R. eutropha. Et andet eksempel er AAV V14 (R. picketti) som er nrmere beslgtet med Acidovorax sp, end den er beslgtet med R. picketti fra GenBank. De mange forekomster af R. eutropha med NosZ sekvenser, der varierer indenfor arten, kan muligvis forklares ved variationer opstet ved tilpasning til miljet. Tidligere undersgelser af Heylen, har vist en tilsvarende observation i en analyse af det funktionelle gen NirK (Heylen, 2006). Sekvenserne fra alle tre renseanlg placerer sig mest dominant i den taxonomiske gruppe af Betaproteobakterier, hvilket er i overensstemmelse med andre dyrknings-uafhngige undersgelser (Throbck, 2004) (Sakano, 2002) og heraf ses den strste diversitet blandt Ralsonia-bakterierne. En sammenligning af diversiteten af bakterier i de tre renseanlg viser, at AA har en lidt strre diversitet end AAV, mens der i AAV og AA ses en strre spredning, bde ved R. eutropha specifikt, men ogs mere generelt end der ses ved sekvenserne fra Aabybro. R. eutropha fra Aabybro findes i 4 prvesekvenser, hvoraf kun den ene (Aabybro A18) viser stor afstand i similaritet og slgtsforhold med de vrige (Aabybro A15, A5 og A12), som alle tre er meget nrt beslgtede og similre. I gruppe 2 er der identificeret en prvesekvens som Rhodoferax ferrireducens, der er identisk med to ikke kultiverede sekvenser, alle tre fra Aabybro. De mere konserverende sekvenser fra Aabybro, kan muligvis vre et udtryk for bakteriernes tilpasning til et milj, som favoriserer enkle bakterie-grupper, mens de mere variable sekvenser fra AAV og AA kan vre udtryk for et milj, der favoriserer diversitet i bakterie populationen. Eftersom der vides meget lidt om de interaktioner, der er i spil mellem bakterierne og forholdene i det aktive slam, er det vanskeligt, at kortlgge alle de forhold, som kan gre sig gldende i forbindelse med bakteriers adaption til et specifikt milj. Nogle af de parametre som har betydning for diversiteten indenfor denitrifikanter i det aktive slam, er substrattilstningen og konfigurationen af renseanlgget. Anlgsdesign med sidestrmshydrolyse giver strre diversitet i substrat, som er tilgngeligt for bakterierne. Der hvor der er forskellige substrattyper tilstede i det aktive slam, ses ogs den strste diversitet blandt denitrifikanter, og hvor der er den mindste variation, ses mindre diversitet i bakteriearterne. Der er forskel i det tilgngelige substrat i de tre renseanlg. I AAV og AA bliver der, udover den interne kulstofkilde, ogs tilfrt eksternt substrat i form af melasse. I Aabybro er

42

der udelukkende intern kulstofkilde. Udover dette sker der i AAV og AA en fermentering og hydrolyse af organisk materiale i hydrolysetanke, hvorved en del af det organiske materiale fragmenteres til let omstteligt organisk materiale. P den mde vil substrat-variationen vre betydelig strre i AAV og AA end i Aabybro, og AAV og AA vil derfor favorisere en strre diversitet i bakterie-populationen. Omvendt vil Aabybro favorisere en mindre diversitet, som det er reflekteret i det fylogenetiske tr i nrvrende projekt.

7.0 KonklusionUd fra eksperimenterne med forskellige eksterne substrat kilder tilfrt det aktive slam, fra henholdsvis Aalborg renseanlg Vest, Aalborg renseanlg st og Aabybro renseanlg, kan det konkluderes, at denitrifikationsraterne pvirkes af det tilfrte substrat. De denitrificerende bakterier, som aktuelt findes i de tre forskellige prver fra renseanlggene, havde den laveste aktivitet ved tilstning af casaminosyre og en strre aktivitet ved tilstning af acetat alene eller ved kombinationen af casaminosyre og acetat. Det kan konkluderes, at tilstning af ekstern substrat i form af kombinations-substrat, sandsynligvis vil kunne bidrage til strre denitrifikationsrate, fordi det giver en strre diversitet i denitrifikant-populationen. Nrvrende projekt og tidligere undersgelser tyder p, at denitrificerende bakterier har forskellige prferencer i forhold til substrat, og at de over tid, har evnen til at tilvnne sig andre substrater. Konfigurationen af renseanlgget, har betydning for denitrifikationsraterne, idet resultaterne tyder p, at renseanlg med sidestrmshydrolyse (AAV og AA), har en fordel i forhold til denitrifikations-aktiviteten, sandsynligvis fordi det giver en lngere adaptionstid for denitrifikanterne men ogs fordi hydrolysen/fermentationen gr let nedbrydeligt organisk stof tilgngeligt, hvilket tilfredsstiller en bakterie-population af strre diversitet. Der er i dette projekt, ved hjlp af molekylr teknik med NosZ, som molekylr markr, blevet identificeret denitrificerende bakterier i aktivt slam fra renseanlg i Aalborg vest og st samt Aabybro. Der blev i projektet brugt et similaritets-kriterie p 80 %, hvilket p den ene side har sikret en validitet i forhold til identifikationen, men som p den anden side muligvis har frasorteret sekvenser, der ville have vret relevante at medtage. De identificerede denitrifikanter tilhrer alfa-, beta- og gammaproterobakterier hvoraf de relativt mest dominerende tilhrer betaproteobakterierne. Placeringen af sekvenserne i similaritet og slgtskab med andre kendte sekvenser svarer i hj grad

43

overens med tidligere undersgelser med NosZ og 16S rRNA, dog med undtagelse af enkelte grupper af prvesekvenser, der ikke kunne identificeres ud fra de kendte sekvenser i GenBank. Dette projekt bekrfter, at det er vanskeligt at sammenligne in situ prver med kultiverede sekvenser og det kan ikke udelukkes, at NosZ-sekvenser kan have vret udsat for horizontal gene transfer (HGT), hvorfor det kan vre problematisk at benytte NosZ til identifikation af denitrifikanterne, dog ses der i nrvrende projekt ikke entydige tegn p, at der skulle vre sket HGT. Undersgelsen viste, at de korte sekvenser, der blev medtaget i tret, kan have medfrt fejl i grupperingen (identificeringen) af sekvenser, og at de, for en bedre validitet, med fordel kunne have vret ekskluderet fra forsget. I tidligere undersgelser er der fundet flere denitrifikantarter end i nrvrende projekt, hvorfor det kan konkluderes, at antallet af sekvenser, der udtages til sekvensering i nrvrende projekt, sandsynligvis har vret for lille til, at kunne vise en mere realistisk billede af diversiteten blandt denitrifikanterne i det aktive slam. Det kan ligeledes konkluderes, at de valgte primere, har stor betydning for resultaterne, hvorfor en undersgelse med kun et enkelt st primere, som i nrvrende projekt, ikke kan give et fuldstndigt billede af diversiteten af denitrifikant-populationen. Det kan samlet konkluderes at molekylre undersgelser med NosZ-gen bidrager til viden om diversiteten i denitrifikant-populationen, men at undersgelsen med fordel kan udvides med et strre antal sekvenser, flere primere og lngere sekvenser og kan suppleres med undersgelser baseret p 16S rRNA.

8.0 PerspektiveringI forbindelse med dette projekts undersgelse af denitrifikations-rater ved tilstning af forskellige substrater blev der konkluderet, at denitrificerende bakterier har forskellige prferencer i forhold til substrat og at de kan tilvnnes substrater over tid. Det kunne vre relevant at supplere dette projekt med undersgelser af andre substrater og at lave undersgelser af hvor lang tilvnningstid denitrifikanterne behver for at opn en optimal denitrifikations-rate. Det ville ligeledes vre interessant i undersgelserne, at inddrage analyser af den interne substratkilde, som kan variere f.eks. i forbindelse med forskelle i kompositionen af organisk stof i spildevand fra industrien, eller i forbindelse med belastninger af renseanlgget, hvor det kan vre ndvendigt at regulere driften uden samtidig at risikere reduktion i denitrifikations-aktiviteten.

44

I forbindelse med identifikationen af NosZ-brende denitrifikanter vil det vre relevant, at lave nye undersgelser med flere og mske lngere sekvenser for at bidrage til mere viden om diversiteten af denitrifikanterne. I nrvrende undersgelse er anvendt et enkelt st primere og da det kunne konkluderes, at valget af primere, samtidig er et fravalg af muligheden for, at identificere sekvenser, der binder sig til andre primere, vil det vre interessant at supplere undersgelsen med identifikation vha. andre primere, for at opn et mere nuanceret resultat. Nrvrende undersgelse kan give informationer om tilstedevrelsen af forskellige denitrifikanter og give en id om hvilke bakteriegrupper der relativt er mest dominerende, men undersgelsen giver ikke kvantitative informationer om de denitrificerende bakterier, der aktuelt er tilstedet i det aktive slam. Hvis viden om denitrifikant-populationen skal kunne bidrage til en optimeret denitrifikation p

renseanlggene, ved f.eks. at tilrettelgge driften ud fra den denitrifikant-population, der eksisterer, eller som nskes fremelsket, vil det vre srdeles relevant at supplere med kvantificerende undersgelser ved f.eks. at lave analyser med FISH.

45

9.0 Litteratur liste.Aabybro kommune, Aabybro renseanlg, Aabybro kommune, Nellemann, Rdgivende ingenirer Aalborg. Amman, I., Ludwig, W., Schleifer, K. 1995, Phylogenetic Identification and In Situ Detection of Individual Microbial Cells without Cultivation. Microbiologcal Review: 143-169. Chen, Z., m.fl., 2008, Submitted (12-SEP-2008) Soil Molecular Ecology Section, Institute of Subtropical Agriculture, The Chinese Academy of Sciences. Enwall, K, Hallin, S. 2008, Comparision of T-RFLP and DGEE techniques to asses denitrifier community in Soil. Letters in Applied Microbiology: 145-148. Etchebehere, C., m.fl. 2001, Evaluation of the Denitrifying Microbiota of Anoxic Reactors. Microbiology Ecology: 259-265. Eppendorf 2004, Fast Plasmid Mini Manual. Geets, J., m.fl. 2007, Real time PCR assay for simultaneous quantification of nitrifying bacteria in activated sludge. Enviroment Biotechnology: 211-221. Gerardi, M. H. 2002, Nitrification and Denitrification in the Activated Sludge Process. John Wiley & Sons Inc. Publications. Ghent uni, 2004, Principle of the PCR. Opdateret 08-11-1999. Available: http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html Besgt 12/11-2008. Ginige, M. P, m.fl. 2006, Eco-physiological characterization of fluorescence in situ hybridization probe-targeted denitrifiers in activaed sludge using culture independent methods. Lettes in Applied Microbiology: 399-405 Ginige, M. P., Keller, J., Blackall, L., 2005, Investigation of an Acetate-Fed Denitrifying Community by Stable Isotope Probing, Full Cycle r RNA Analysis and Fluorescent in situ Hybridization- Microautoradiography. Applied and Environmental Microbiology: 8683-8691 Grady C.P., Daigger G.T., Lim H. C., 1999, Biological Wastewater Treatment. 2 Udgave. Marcel Dekker, Inc. Hagman, M., m.fl. 2008, Mixed Carbon Sources for Nitrate in Activated Sludge-identification of Bacteria and Process activity Studies. Water Research: 1539-1546. Hallin, S., Lindgren, P. E.