I H E M Q ? G L G H E ? C D B G : 36 B A M D H O ... - spbu.ru · N _ ^ _ j Z = h k m ^ Z j k l \ _...

$: I H E M Q ? G L G H E ? C D B G : 36 B A M D H O ... - spbu.ru · N _ ^ _ j Z = h k m ^ Z j k l \ _ g ; x ^ ` _ l H [ j Z a h \ Z l _ e v g h _ M q j _ ` ^ u k r a h \ Z g b y «$
Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное

Учреждение Высшего Образования

«Санкт-Петербургский Государственный Университет»

На правах рукописи

КОЛОБОВ АЛЕКСЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТАГОНИСТА

РЕЦЕПТОРА ИНТЕРЛЕЙКИНА 36 ЧЕЛОВЕКА И

ИЗУЧЕНИЕ ЕГО ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И

БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

03.01.04 – биохимия

Диссертация

на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент

Василий Евгеньевич Стефанов

Санкт-Петербург

2017

2

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. Введение ............................................................................................................................ 7

1.1. Актуальность темы исследования............................................................................... 7

1.2. Степень разработанности темы ................................................................................... 8

1.3. Цель ................................................................................................................................ 8

1.4. Методология и методы исследования ........................................................................ 9

1.5. Научная новизна ........................................................................................................... 9

1.6. Теоретическая и практическая значимость работы .................................................. 9

1.7. Положения, выносимые на защиту ........................................................................... 10

1.8. Апробация результатов .............................................................................................. 10

1.9. Личное участие автора в получении результатов ................................................... 11

1.10. Структура и объём диссертации ............................................................................ 11

2. Обзор литературы .......................................................................................................... 12

2.1. Структура и функции цитокинов группы ИЛ-36 .................................................... 12

2.1.1. ИЛ-36 как члены семейства ИЛ-1 ....................................................................... 12

2.1.2. Структура генов ИЛ-36 ........................................................................................ 13

2.1.3. Профиль экспрессии генов ИЛ-36 ...................................................................... 14

2.1.4. Структура белков семейства ИЛ-36 и их рецепторов ....................................... 15

2.1.5. Секреция ИЛ-36 .................................................................................................... 17

2.1.6. Пост-трансляционные модификации и процессинг ИЛ-36 .............................. 18

2.1.7. Сигналлинг белков семейства ИЛ-1 ................................................................... 20

2.1.8. Биологические функции ИЛ-36 .......................................................................... 21

2.2. Псориаз и цитокины группы ИЛ-36 ......................................................................... 22

2.2.1. Клинико-демографическая характеристика псориаза ...................................... 22

2.2.2. Современные представления о патогенезе псориаза ........................................ 23

2.2.3. Роль ИЛ-36 в патогенезе псориаза ...................................................................... 25

3

2.2.4. Лечение псориаза и антицитокиновая терапия ................................................. 27

3. Материалы и методы исследования ............................................................................. 30

3.1. Получение штаммов-продуцентов безметионинового ИЛ-36РА .......................... 30

3.1.1. Штаммы бактерий ................................................................................................ 30

3.1.2. Получение компетентных клеток E.coli для электротрансформации ............. 30

3.1.3. Электротрансформация клеток E. coli ................................................................ 31

3.1.4. Отбор трансформированных клонов .................................................................. 31

3.1.5. Создание экспрессионных плазмид, несущих ген метиониаминопептидазы E.

coli 31

3.2. Культивирование штаммов-продуцентов ИЛ-36РА ............................................... 34

3.2.1. Криоконсервация культур штаммов-продуцентов ИЛ-36РА........................... 35

3.2.2. Культивирование штаммов-продуцентов ИЛ-36РА в колбах ......................... 35

3.2.3. Культивирование штаммов-продуцентов ИЛ-36РА в биореакторе

(ферментере) 36

3.3. Лизис биомассы клеток штаммов-продуцентов ИЛ-36РА ..................................... 37

3.4. Осветление лизата биомассы клеток штамма-продуцента ИЛ-36РА .................... 38

3.4.1. Флоккуляция ......................................................................................................... 38

3.4.2. Кислотное фракционирование ............................................................................ 38

3.5. Хроматографическая очистка ИЛ-36РА ................................................................... 39

3.5.1. Анионообменная хроматография на сорбенте Q Sepharose Fast Flow ............ 39

3.5.2. Катионообменная хроматография на сорбенте SP Sepharose Fast Flow ......... 40

3.5.3. Гидрофобная хроматография на сорбенте Toyopearl Butyl-650S .................... 41

3.5.4. Аффинная хроматография на сорбенте с иммобилизованными антителами к

ИЛ-36РА 41

3.5.4.1. Иммобилизация антител на сорбенте .............................................................. 41

3.5.4.2. Аффинная хроматография ................................................................................ 42

3.6. Ультрафильтрационное концентрирование раствора ИЛ-36РА ............................ 43

4

3.7. Диск-электрофорез белков в присутствии додецилсульфата натрия .................... 44

3.8. Вестерн блот для определения ИЛ-36РА ................................................................. 44

3.9. Очистка растворов от ЛПС с помощью обработки Triton X-114 ........................... 45

3.10. Очистка растворов от Triton X-114 с помощью диализа .................................... 45

3.11. Количественное определение ЛПС ....................................................................... 46

3.12. Количественное определение содержания ИЛ-36РА в растворах ..................... 46

3.12.1. Спектрофотометрическое определение ........................................................... 46

3.12.2. Биуретовый метод с бицинхонициновой кислотой ........................................ 46

3.12.3. Определение концентрации ИЛ-36РА методом ИФА .................................... 47

3.13. Оценка биологической активности ИЛ-36РА in vitro с использованием тест-

системы на основе клеточной линии А549 .................................................................................... 48

3.13.1. Культивирование клеток А549+36 ................................................................... 48

3.13.2. Оценка биологической активности ИЛ-36РА ................................................. 48

3.13.3. Определение концентрации ИЛ-8 методом ИФА ........................................... 49

3.13.4. Расчет активности образцов ИЛ-36РА ............................................................. 49

3.14. Искусственное окисление ИЛ-36РА ..................................................................... 49

3.15. Искусственное дезамидирование ИЛ-36РА ......................................................... 50

3.16. ВЭЖХ анализ чистоты и гомогенности ИЛ-36РА............................................... 50

3.16.1. ОФ-ВЭЖХ для определения чистоты ИЛ-36РА ............................................. 50

3.16.2. ОФ-ВЭЖХ для определения примеси непроцессированной и окисленной

форм ИЛ-36РА 51

3.16.3. ОФ-ВЭЖХ для определения примеси Triton X-114 ........................................ 51

3.16.4. ГП-ВЭЖХ для определения агрегатов ИЛ-36РА ............................................ 51

3.17. Определение примеси дезамидированной формы ИЛ-36РА с помощью

капиллярного изоэлектрофокусирования ...................................................................................... 51

3.18. Динамическое светорассеяние ............................................................................... 52

3.19. Статистическая обработка результатов ................................................................ 53

5

4. Результаты и обсуждение .............................................................................................. 54

4.1. Получение штамма-продуцента ИЛ-36РА, исследование биологических свойств

ИЛ-36РА 54

4.1.1. Получение штаммов-продуцентов безметионинового ИЛ-36РА на основе E.

coli BL21[DE3] .............................................................................................................................. 54

4.1.2. Оптимизация условий индукции экспрессии гена ИЛ-36РА штаммами-

продуцентами безметионинового ИЛ-36РА............................................................................... 61

4.1.3. Выбор наиболее продуктивного штамма-продуцента безметионинового ИЛ-

36РА 66

4.1.4. Изучение биологической активности ИЛ-36РА ................................................ 70

4.1.4.1. Сравнение биологической активности ИЛ-36РА от различных штаммов-

продуцентов 70

4.1.4.2. Биологическая активность ИЛ-36РА в модели псориазоподобного

дерматита на мышах ..................................................................................................................... 72

4.1.5. Масштабирование культивирования штамма-продуцента безметионинового

ИЛ-36РА 75

4.2. Разработка методики хроматографической очистки ИЛ-36РА, исследование

физико-химических свойств ИЛ-36РА ........................................................................................... 79

4.2.1. Хроматографическая очистка ИЛ-36РА в исследовательском масштабе,

исследование физико-химических свойств ИЛ-36РА ............................................................... 79

4.2.1.1. Отработка условий лизиса биомассы штамма-продуцента в лабораторном

масштабе 79

4.2.1.2. Хроматографическая очистка ИЛ-36РА в лабораторном масштабе ............ 80

4.2.1.3. Изучение гетерогенности ИЛ-36РА ................................................................ 84

4.2.1.4. Оптимизация условий хранения ИЛ-36РА ..................................................... 93

4.2.2. Разработка технологии получения фармацевтической субстанции ИЛ-36РА в

масштабе лабораторного производства ...................................................................................... 97

4.2.2.1. Оптимизация метода лизиса биомассы штамма-продуцента и осветление

лизатов методом флоккуляции .................................................................................................... 97

6

4.2.2.2. Масштабирование метода очистки ИЛ-36РА с применением

анионообменной хроматографии .............................................................................................. 101

4.2.2.3. Очистка ИЛ-36РА от ЛПС с помощью разделения фаз с Triton X-114 ..... 104

4.2.2.4. Метод очистки ИЛ-36РА с применением анионообменной хроматографии:

материальный баланс.................................................................................................................. 109


масштабе пилотного промышленного производства .............................................................. 113

4.2.3.1. Оптимизация метода кислотного фракционирования лизата биомассы

штамма-продуцента ИЛ-36РА ................................................................................................... 113

4.2.3.2. Оптимизация метода очистки ИЛ-36РА с применением катионообменной

хроматографии 115

4.2.3.3. Метод очистки ИЛ-36РА с применением катионообменной хроматографии:

материальный баланс.................................................................................................................. 119

5. Заключение ................................................................................................................... 122

6. Выводы .......................................................................................................................... 123

7. Список сокращений ..................................................................................................... 124

8. Список литературы ...................................................................................................... 126

9. Приложение .................................................................................................................. 146

7

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность темы исследования

Работа проводилась в рамках проекта по разработке перспективных подходов к терапии

псориаза.

Псориаз является многофакторным заболеванием, поражающим до 5% населения в

экономически развитых странах. Псориатический артрит развивается у 5-25% больных

псориазом, проявляется симметричными деструктивными изменениями суставов [17]. В России

проживает более 300 тысяч больных псориазом [2]. Помимо вульгарного псориаза выделяют

более тяжёлые формы заболевания, характеризующиеся обширными болезненными

высыпаниями, их особенной локализацией, образованием пустул, поражением суставов и

системными расстройствами. Наиболее тяжёлой формой псориаза является генерализованный

пустулёзный псориаз (ГПП).

Для лечения среднетяжелых и тяжелых форм псориаза, наряду со средствами местного

лечения и системными иммунодепрессантами [64] в последние год широкое применение

получили фармацевтические препараты с антицитокиновой активностью. Высокую

клиническую эффективность демонстрируют препараты, нейтрализующие биологическую

активность фактора некроза опухолей-альфа [113], блокаторы рецептора интерлейкина (ИЛ)-12

и ИЛ-23 [101], терапевтические антитела против ИЛ-17А [112].

Важную роль в активации и поддержании воспаления в коже, пораженной псориазом,

играют цитокины семейства ИЛ-36. Это семейство включает три провоспалительных цитокина

- ИЛ-36α, ИЛ-36β и ИЛ-36γ - и специфический антагонист рецептора ИЛ-36 (ИЛ-36РА). Ряд

мутаций в гене IL36RN, кодирующем ИЛ-36РА, способен вызывать развитие генерализованного

пустулёзного псориаза.

Предполагается, что блокада активации рецептора ИЛ-36 с помощью введения

рекомбинантного ИЛ-36РА человека может быть высокоэффективным подходом к терапии

данного дерматоза. В связи с этим разработка новых лекарственных средств на основе ИЛ-36РА

для лечения псориаза является актуальной задачей.

Настоящее исследование посвящено разработке методик получения рекомбинантного

ИЛ-36РА человека в бактериальном продуценте и его очистки, а также изучению физико-

химических свойств и биологической активности полученного цитокина. Результаты

8

проведенных исследований легли в основу лабораторного и опытно-промышленного

регламентов получения фармацевтической субстанции ИЛ-36РА.

1.2. Степень разработанности темы

Наиболее тяжёлые формы псориаза, такие как генерализованный пустулёзный псориаз,

не отвечают на обычную терапию. Для их лечения активно применяют различные

антицитокиновые иммуносупрессивные препараты. Это этанерцепт (внеклеточный домен

рецептора ФНОα, сшитый с Fc-фрагментом IgG1 человека), инфликсимаб и адалимумаб

(моноклональные антитела к ФНОα) [113], секукинумаб (моноклональные антитела к ИЛ-17А)

[112], устекинумаб (моноклональные антитела к общей для ИЛ-12 и ИЛ-23 субъединице p40)

[101] и др. Однако, эти препараты обладают системными побочными эффектами [45, 84, 112]. В

связи с этим разработка препаратов, селективно действующих на уровне наружных кожных

покровов, например, ингибирующих активность ИЛ-36, является актуальной практической

задачей [32].

В настоящее время разрабатывается несколько таких препаратов. Моноклональные

антитела к рецептору ИЛ-36 независимо получены компаниями Boehringer Ingelheim

(Германия) [44] и Anaptys Bio (США) [156]. Оба препарата находятся на первой стадии

клинических испытаний. Преимущество разрабатываемого препарата на основе

рекомбинантного ИЛ-36РА человека в использовании при его производстве прокариотического

продуцента и неаффинных методов очистки, что обуславливает меньшую стоимость его

производства. Получение ИЛ-36РА с отщеплённым N-концевым остатком метионина

(безметионинового) позволяет добиться максимальной биологической активности препарата.

1.3. Цель

Цель данной работы - получение рекомбинантного безметионинового антагониста

рецептора интерлейкина 36 человека и изучение его физико-химических и биологических

свойств

Задачи:

1. Создать бактериальный штамм-продуцент рекомбинантного безметионинового

ИЛ-36РА человека

2. Разработать технологию получения фармацевтической субстанции ИЛ-36РА

3. Изучить физико-химические свойства полученного ИЛ-36РА

4. Изучить биологические свойства полученного ИЛ-36РА

9

1.4. Методология и методы исследования

В ходе работы создан штамм-продуцент на основе E. coli BL21[DE3], синтезирующий

растворимый биологически активный рекомбинантный ИЛ-36РА человека с отщепленным N-

концевым остатком метионина. Для этого штамм трансформирован плазмидой, несущей ген,

кодирующий ИЛ-36РА человека, и плазмидой, несущей ген метионинаминопептидазы E. coli.

Разработана схема двухстадийной хроматографической очистки ИЛ-36РА, включающей

катионообменную и гидрофобную хроматографию. Изучены пост-трансляционные

модификации полученного препарата ИЛ-36РА, показана способность ИЛ-36РА к спонтанному

дезамидированию при значениях рН среды выше 7, показана зависимость биологической

активности ИЛ-36РА от отщепления N-концевого инициаторного остатка метионина.

Биологическая активность полученного препарата ИЛ-36РА подтверждена in vitro в модельной

системе на основе клеточной линии А549. Также показана способность полученного препарата

ИЛ-36РА купировать индуцированный псориазоподобный фенотип у мышей при подкожном

введении.

1.5. Научная новизна

Технология получения безметиониновых белков, состоящая в создании штамма,

несущего плазмиду с геном интереса и плазмиду с геном метионинаминопептидазы, применена

по отношению к ИЛ-36РА впервые. Кроме того, впервые исследованы пост-трансляционные

модификации ИЛ-36РА, изучено их влияние на его биологическую активность, подобраны

условия выделения и очистки ИЛ-36РА, минимизирующие эти изменения.

Впервые разработана технология получения биологически активного ИЛ-36РА,

позволяющая получать до 10 г высокоочищенного ИЛ-36РА из 160 л культуры в течение

трехнедельного производственного цикла.

1.6. Теоретическая и практическая значимость работы

Проведенное исследование физико-химических свойств ИЛ-36РА, позволяющее более

полно понимать механизм действия этого цитокина в организме млекопитающих, определяет

теоретическую значимость работы. Тот факт, что ИЛ-36РА человека способен купировать

псориазоподобный фенотип у мышей, является прямым доказательством структурной схожести

ИЛ-36РА человека и мыши, и косвенным доказательством относительно недавнего

возникновения семейства ИЛ-36 в эволюции.

10

Практическая ценность работы состоит в разработке промышленной технологии

получения фармацевтической субстанции ИЛ-36РА человека с доказанной биологической

активностью, на основе которой изготавливается готовая лекарственная форма ИЛ-36РА в виде

раствора для подкожного введения, 5 мг/мл. Успешно завершены доклинические испытания

эффективности и безопасности препарата в качестве кандидатного лекарственного средства для

терапии тяжёлых форм псориаза.

1.7. Положения, выносимые на защиту

1. Создана серия штаммов-продуцентов безметионинового рекомбинантного ИЛ-

36РА человека на основе E. coli BL21[DE3]. Установлено, что штамм E. coli

BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) наиболее продуктивен и обеспечивает

получение ИЛ-36РА с содержанием непроцессированной формы менее 5%.

2. Биологическая активность получаемого ИЛ-36РА соответствует биологической

активности коммерческого стандартного препарата.

3. Установлено, что в процессе выделения и хранения при рН > 7,0 препарат ИЛ-

36РА подвергается дезамидированию.

4. Подобраны условия выделения и хранения ИЛ-36РА, минимизирующие его

дезамидирование.

5. Впервые разработан метод получения ИЛ-36РА, позволяющий получать 8-10 г

высокоочищенного ИЛ-36РА за один производственный цикл (заявка на патент

РФ № 2017103888 от 06.02.2017).

1.8. Апробация результатов

Основные результаты работы изложены в статьях:

Колобов А.А., Кондратьева Е.В., Кудлинг Т.В., Карасев М. М., Калинин Р.С., Хижина

А.А., Нимирицкий П.П., Стефанов В.Е., Петров А.В. 2017. Получение ИЛ-36РА человека в

Escherichia coli при коэкспресии с метионинаминопептидазой E. coli. I. Сравнение продукции

ИЛ-36РА различными штаммами. Цитология. 59 (7): 482-488

Колобов А.А., Кондратьева Е.В., Шарафутдинова Т.А., Калинин Р.С., Нимирицкий П.П.,

Стефанов В.Е., Петров А.В. 2017 Получение ИЛ-36РА человека в Escherichia coli при

коэкспресии с метионинаминопептидазой E. coli. II. Сравнение биологической активности ИЛ-

36РА от различных штаммов. Цитология. 59 (8): 534-538

11

Также результаты работы представлены на ряде конференций: в виде постерных

докладов на конференции «Фундаментальная наука и клиническая медицина – человек и его

здоровье» (Санкт-Петербург 2015, 2016, 2017) и в виде устного доклада на всероссийском

научном форуме «Дни Иммунологии» (Санкт-Петербург, 2017).

Всего по теме диссертации опубликовано 2 статьи, 5 тезисов докладов и подана 1 заявка

на патент РФ (№ 2017103888 от 06.02.2017).

Работа прошла практическую апробацию. Препарат ИЛ-36РА, полученный по

разработанной методике, успешно прошёл доклинические испытания в качестве кандидатного

лекарственного средства для терапии тяжёлых форм псориаза.

1.9. Личное участие автора в получении результатов

Личный вклад автора состоит в личном участии в проведении всех этапов работ: в

организации и проведении экспериментов, планировании работ, подборе и оптимизации

производственных и аналитических методик, теоретическом обобщении и статистической

обработке результатов, подготовке к публикации статей, патентов и отчётов по теме, а также в

руководстве научной группой. Экспериментальная часть работы выполнена на базе ФГУП

«Гос.НИИ ОЧБ» ФМБА России.

Ряд исследований проведён совместно с сотрудниками ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ»

Кондратьевой Е.В., Кудлинг Т.В. (генная инженерия) и к.м.н. Петровым А.В. (тестирование

биологической активности ИЛ-36РА). Работы по культивированию штамма-продуцента ИЛ-

36РА в пилотном биореакторе проводились на базе ИБФМ РАН под руководством к.б.н.

Самойленко В.А..

Все полученные совместно результаты опубликованы или в настоящее время по ним

готовятся совместные публикации. Соискатель приносит соавторам и коллегам свою

искреннюю благодарность.

1.10. Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов,

результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на

169 страницах машинописного текста, иллюстрирована 58 рисунками, 5 таблицами и 1

приложением. Список литературы содержит 178 литературных источников.

12

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Структура и функции цитокинов группы ИЛ-36

2.1.1. ИЛ-36 как члены семейства ИЛ-1

Cемейство ИЛ-1 включает 12 членов (Таблица 1). Группа интерлейкинов 36 (ИЛ-36)

входит в него и включает три провоспалительных цитокина ИЛ-36 α, β, γ и один

противовоспалительный – рецепторный антагонист интерлейкинов 36 (ИЛ-36РА) [48]. Все они

были открыты в 1999-2000 годах [11, 71, 123, 167] и фигурируют в литературе под рядом

различных названий. Современная номенклатура белков семейства ИЛ-1 была утверждена в

2010 году [33] (Таблица 1).

Таблица 1. Цитокины семейства ИЛ-1, их рецепторы и функции [121, 152].

Название Синонимы Рецептор Корецептор Основная функция

ИЛ-1α IL-1F1 IL-1RI IL-1RAcP Провоспалительная

ИЛ-1β IL-1F2 IL-1RI IL-1RAcP Провоспалительная

ИЛ-1РА IL-1F3 IL-1RI – Рецепторный антагонист

ИЛ-18 IL-1F4 IL-18Rα IL-18Rβ Провоспалительная

ИЛ-33 IL-1F11 IL-1RL1 IL-1RAcР Провоспалительная

ИЛ-36α IL-1F6, IL-1ε IL-36R IL-1RAcP Провоспалительная

ИЛ-36β IL-1F8, IL-1H2, IL-1η IL-36R IL-1RAcP Провоспалительная

ИЛ-36γ IL-1F9, IL-1H1, IL-1ε,

IL-1RP2

IL-36R IL-1RAcP Провоспалительная

ИЛ-36РА IL-1F5, IL-1δ, IL-1RP3,

IL-1HY1, IL-1L1

IL-36R – Рецепторный антагонист

ИЛ-37 IL-1F7, IL-1RP1, IL-1H,

IL-1H4, IL-1ζ

IL-18Rα IL-1R8 (TIR8,

IL-1RAPL-1,

SIGIRR)

Противовоспалительная

ИЛ-38 IL-1F10, IL-1θ, IL-1HY2 IL-36R – Противовоспалительная

13

В настоящее время ИЛ-36 рассматриваются как часть суперсемейства ИЛ-1 [121], т.к.

они имеют ряд общих свойств. В первую очередь это структурная близость самих молекул [53]

и их рецепторов [150]. Так, хотя рецепторной субъединицей ИЛ-1 (ИЛ-1 α, β и ИЛ-1РА)

является IL-1R1 [142], а рецепторной субъединицей ИЛ-36 (ИЛ-36 α, β, γ и ИЛ-36РА) является

IL-36R, корецепторная субъединица у обеих групп общая – IL-1RAcP [48].

Для ИЛ-36, как и для ИЛ-1, характерна регуляция воспаления по принципу обратной

связи с помощью рецепторных антагонистов соответствующих цитокинов (ИЛ-1РА, ИЛ-36РА).

Они способны связывать рецептор, не активируя его, т.к. их связывание делает невозможной

димеризацию рецептора с корецептором [53]. Причиной ряда хронических воспалительных

заболеваний являются мутации в генах рецепторных антагонистов ИЛ-1 [158] и ИЛ-36 [118].

Большая часть белков семейства ИЛ-1 синтезируется в виде биологически неактивных

предшественников, для активации которых необходим протеолиз [4].

2.1.2. Структура генов ИЛ-36

Высокая схожесть свойств различных членов семейства ИЛ-1 может указывать на их

эволюционное родство [34]. В пользу этого также говорит близкое расположение генов всех

членов семейства ИЛ-1 кроме ИЛ-18 [97] и ИЛ-33 [116] на длинном плече второй хромосомы

(2q13) [96]. Гены цитокинов ИЛ-1α, ИЛ-1β и ИЛ-1РА находятся в интервале 430 т.п.н. Между

генами, кодирующими ИЛ-1β и ИЛ-1РА, в интервале 300 т.п.н. находятся гены, кодирующие

ИЛ-37, ИЛ-36γ, ИЛ-36α, ИЛ-36β, ИЛ-36РА и ИЛ-38 [96] (Рисунок 1).

Рисунок 1. Схема расположения генов цитокинов семейства ИЛ-1 на длинном плече

второй хромосомы человека (2q13) [174].

14

Близость генов семейства ИЛ-1 на хромосоме может определять возможность их

совместной транскрипции одним комплексом транскрипционных факторов [119]. Вероятно, это

является одним из механизмов регуляции функции этих генов.

В генах большинства членов семейства ИЛ-1 присутствуют три т.н. общих экзона

(common exons, CE). Они кодируют последовательность центральной части молекулы белка,

состоящей из двенадцати β-складок (S1-S12) с одиннадцатью петлями. Экзон CE1 кодирует

мотивы S1-S3, CE2 кодирует S4-S6 и большую часть S7, а CE3 кодирует остаток S7 и S8-S12

[35, 96].

Часть представителей группы ИЛ-36 имеет иное строение генов. Гены ИЛ-36α и ИЛ-

36РА устроены типично [21]. Ген ИЛ-36α содержит четыре экзона, из них экзон 1 кодирует 5’

нетранслируемую область, а экзоны 2-4 соответствуют общим экзонам CE1-CE3 [21]. Ген ИЛ-

36β имеет 6 экзонов, из них экзон 1 кодирует 5’ нетранслируемую область, а остальные

кодируют последовательность белка.

2.1.3. Профиль экспрессии генов ИЛ-36

Экспрессия генов ИЛ-36 происходит в норме в ряде тканей, преимущественно

эпителиальных, и активируется при развитии воспаления. В коже наиболее активно

экспрессируется ген IL36G, кодирующий ИЛ-36γ. Его экспрессия фиксируется в кератиноцитах

дифференцирующихся слоев эпидермиса, но не в меланоцитах, фибробластах или

эндотелиоцитах [123]. Слабая экспрессия генов ИЛ-36α, β, γ показана также в миндалинах,

легких, кишечнике, пищеводе [34], мозге [48] и в клетках иммунной системы: дендритных

клетках [132], моноцитах/макрофагах, Т-лимфоцитах [103] и нейтрофилах [18].

Наибольшую роль в развитии воспаления в коже играет ИЛ-36γ, т.к. среди всех

провоспалительных ИЛ-36 только он конститутивно продуцируется в коже [32] и его уровень

сильнее всего повышается при псориатическом воспалении [163]. Увеличение экспрессии гена

IL36G в коже обнаруживается также на фоне реакции гиперчувствительности [34]. В клетках

эпителия трахеи и бронхов повышенная экспрессия гена IL36G наблюдался у пациентов с

астмой в ответ на контакт с антигеном [133, 163].

Изучение промоторной области IL36G показало, что одним из транскрипционных

факторов, активирующих его экспрессию в клетках миелоидного ряда, является T-bet [155].

Этот фактор играет ключевую роль в развитии Тх-1 иммунного ответа и выработке ИФНγ [74].

Однако, этот фактор не продуцируется кератиноцитами, и поэтому не важен для продукции

15

основной массы ИЛ-36γ. В кератиноцитах одним из активаторов экспрессии IL36G является

фактор Nrf2, стимулирующий также пролиферацию кератиноцитов [72]. При этом обработка

ИЛ-36γ также стимулирует пролиферацию кератиноцитов, формируя таким образом петлю

положительной обратной связи, вероятно, играющую ключевую роль в хронических

воспалительных заболеваниях кожи [72].

Экспрессия IL36G в клетках эпителия бронхов [27] и кератиноцитах [22, 79]

стимулируется фактором некроза опухоли α (ФНОα), ИЛ-17, ИЛ-1β и интерфероном γ (ИФНγ).

Наиболее сильно экспрессия гена IL36G повышалась в ответ на совместную обработку парой

ИЛ-1β и ФНОα или ИЛ-17A и ИЛ-22, однако ИЛ-22 сам по себе такого эффекта не давал [163].

Экспрессия IL36G активируется также лигандами Toll-like рецепторов (TLR), такими как

двуцепочечная РНК или её синтетический аналог полиинозин-полицитидиловая кислота (pI:C)

и флагеллин [79]. Кератиноциты ротовой полости человека отвечали повышением экспрессии

IL36G, но не секрецией ИЛ-36γ на обработку лизофосфатидной кислотой, обычно применяемой

как активатор ранозаживления [129].

Конститутивная экспрессия гена IL36RN, кодирующего ИЛ-36РА, наблюдается прежде

всего в кератиноцитах, приэтом уровень ее повышается в псориатических бляшках [15]. IL36RN

также экспрессируется в почках, мозге и тимусе, преимущественно в эпителиальных клетках,

либо клетках макрофагального ряда [11, 96, 163].

Ген IL1RL2, кодирующий специфический рецептор ИЛ-36, экспрессируется в коже,

лёгких, яичках и глиальных клетках мозга [13, 85] в следующих типах клеток: в кератиноцитах

и клетках эпителия почечных канальцев, эпителиоцитах бронхов и альвеол, фибробластах

дермы, бронхов и легких [27, 133], синовиальных фибробластах и суставных хондроцитах [88],

адипоцитах [9], моноцитах и макрофагах [138], а также в зрелых дендритных клетках (ДК)

моноцитарного происхождения и плазмоцитоидных ДК, но не миелоидных ДК [95], микроглии

ЦНС [6]. Экспрессия гена этого рецептора характерна также для CD4+ T-лимфоцитов мышей,

особенно Th1 и Th2 [22, 138].

2.1.4. Структура белков семейства ИЛ-36 и их рецепторов

Методом рентгеноструктурного анализа было показано, что ИЛ-36РА и ИЛ-36γ имеют

типичную для белков семейства ИЛ-1 структуру β-трилистника [35, 53] (Рисунок 2). Учитывая

высокую гомологичность аминокислотных последовательностей ИЛ-36α и ИЛ-36β по

16

сравнению с ИЛ-36γ и их способность взаимодействовать с общим рецептором, предполагается,

что их структура похожа на описанную [34].

Рисунок 2. Схема третичной структуры молекулы ИЛ-36РА мыши [35].

Рецептор ИЛ-36 устроен подобно рецептору ИЛ-1. Он состоит из внеклеточного домена,

спирального трансмембранного домена, единожды принизывающего мембрану, и

внутриклеточного Toll/IL-1 receptor (TIR) домена [46, 133]. Внеклеточный домен содержит три

Ig-подобных домена, связанных дисульфидными связями [150], что характерно для рецептов

цитокинов семейства ИЛ-1 [136, 142]. Гликозилизование по Asn41, Asn234 и Asn250

критически важно для экстернализации рецептора, но не для связывания лиганда [150]. После

присоединения к комплексу рецептор-лиганд корецептора внутриклеточные TIR-домены

рецептора и корецептора взаимодействуют и активируют содержащие TIR-домен белки внутри

клетки, такие как MyD88, IRAK1 или IRAK2, активируя NF-κΒ сигнальный каскад [42].

Несмотря на схожесть самих цитокинов групп ИЛ-36 и ИЛ-1 и их рецепторов,

существуют различия в их механизмах рецепции. И в случае цитокинов группы ИЛ-1, и в

случае цитокинов группы ИЛ-36 при связывании рецептора с лигандом образовавшийся

комплекс привлекает корецепторную субъединицу IL-1AcP (IL-1 Accessory protein), общую для

обеих групп [53]. При этом, если в случае ИЛ-1 рекрутирующее IL-1AcP взаимодействие

17

происходит при участии молекулярной поверхности лиганда и конформационно изменившегося

рецептора, то в случае ИЛ-36 боковые цепи лигандов не играют такой роли.

Области ИЛ-1, взаимодействующие с IL-1RAcP – это петли β4/5 и β11/12 (петля между 4

и 5 или 11 и 12 β-складками, соответственно). Остатки Asp54 в β4/5 и Asp145 в β11/12 образуют

водородные связи с Arg286 и Ser185, соответственно, в составе корецепторной субъединицы. В

молекуле ИЛ-1РА петля β4/5 слишком коротка для взаимодействия с корецептором, а на

соответвующей позиции в петле β11/12 находится положительно-заряженный Lys145, что

делает невозможным прикрепление корецептора к лиганду [127, 142].

В молекуле в ИЛ-36γ аминокислотные остатки на соответвующих позициях иные. Arg71

в β4/5 занят созданием связи внутри молекулы ИЛ-36γ, а на изгибе петли β11/12 находятся

незаряженная аминокислота Ala162. А ИЛ-36РА больше структурно похож на ИЛ-1, т.к. имеет

отрицательно заряженный Asp148 в β11/12, из-за чего у него изначально предполагали

способность активировать рецептор [35]. Вероятно, при формирования комплекса ИЛ-36-

рецептор-корецептор эти петли не играют той роли, что в случае ИЛ-1 [53]. По этой причине

потерпели неудачу попытки создать химерную молекулу с повышенной деактивирующей

рецептор ИЛ-36 активностью при замене этих петель в молекулах ИЛ-36γ и ИЛ-36РА [53].

2.1.5. Секреция ИЛ-36

Несмотря на увеличение экспрессии генов ИЛ-36 при воспалении, секреция белков

наблюдается не всегда [27, 163]. Причиной этого может быть то, что ИЛ-36 не содержат

секреторного пептида, отщепляемого сигнальной пептидазой, их секреция происходит по

неканоническому пути [123]. Это характерно и для прочих представителей семейства ИЛ-1,

кроме ИЛ-1РА [135].

ИЛ-36γ секретируется различными видами клеток в ответ на различные маркеры

повреждения или инфекции. ИЛ-36γ секретируется кератиноцитами в ответ на обработку

кателицидином, антимикробным пептидом, уровень которого значительно повышен в коже при

псориатическом воспалении [77]. Однако кератиноциты секретируют ИЛ-36γ только в

присутствии в среде АТФ, который считается маркером тканевого повреждения [163]. АТФ в

среде также необходим для секреции ИЛ-1β [54]. Кератиноциты или эпителиоциты бронхов

секретируют ИЛ-36γ в ответ на обработку двуцепочечной РНК или её синтетическим аналогом

полиинозин-полицитидиновой кислотой (pI:C). ИЛ-36γ при этом выходит через разрывы в

мембране, образованные под действием протеаз каспазы-3 и каспазы-7 - в результате пироптоза

18

[27, 79]. Пироптоз отличается от апоптоза доминирующей активностью каспазы-1 и наличием

активных инфламмасом. В случае апоптоза содержимое клетки, способное вызвать воспаление,

изолируется в апоптотических тельцах. В случае пироптоза активные провоспалительных

цитокины и другие маркеры тканевого повреждения выходят в межклеточное пространство,

начинается воспаление [61]. Таким образом, ИЛ-36γ может функционировать, в том числе, как

алармин при вирусных инфекциях эпителиев [79].

Другие типы клеток способны секретировать ИЛ-36γ иначе. Так, в ответ на

бактериальную инфекцию ИЛ-36γ секретируется макрофагами лёгких по Гольджи-

независимому пути в составе микрочастиц и экзосом [69].

2.1.6. Пост-трансляционные модификации и процессинг ИЛ-36

Помимо того, что было показано отсутствие сайтов гликозилирования у ИЛ-36РА [11],

исследование пост-трансляционных модификаций ИЛ-36 до сих пор сводится, в основном, к

вопросам их процессинга. Для получения полной биологической активности всем членам

группы ИЛ-36 необходимо отщепление части аминокислот с N-конца молекулы [134].

Предположили, что процессинг ИЛ-36 происходит, как у прочих членов семейства ИЛ-1. В

результате такого процессинга N-терминальным а.о. в последовательности остаётся а.о.,

расположенный на удалении в 9 а.о. от мотива A-X-Asp (где А – а.о. с алифатическим боковым

радикалом) [4, 46, 134]. Экспериментально доказали, что биологическая активность

процессированных таким образом ИЛ-36 возросла в 103-104 раз [134] (Рисунок 3).

Рисунок 3. Выравнивание аминокислотных последовательностей N-концов

непроцессированных молекул ИЛ-36 относительно консенсусной последовательности A-X-Asp

[134]. Стрелкой и красным цветом обозначен аминокислотный остаток, который должен

остаться N-концевым в результате процессинга молекул интерлейкинов согласно гипотезе.

19

В случае ИЛ-36РА для подобного процессинга достаточно внутриклеточной

метионинаминопептидазы. В случае ИЛ-36α, β, γ процессинг происходит уже вне клетки с

помощью катепсина G, эластазы и протеиназы 3, которые являются протеазами гранул

нейтрофилов, поэтому процессинг и активация ИЛ-36 возможны только при дегрануляции

нейтрофилов [56]. Однако, при таком процессинге ИЛ-36 отщепляется меньше а.о., чем было

предсказано ранее (Рисунок 4). Биологическая активность ИЛ-36 при таком процессинге ниже,

чем при отщеплении а.о. вплоть до 9 а.о. от мотива A-X-Asp [56, 134]. Протеазы, которые могли

бы осуществлять такой процессинг ИЛ-36, пока не выявлены.

Рисунок 4. Сайты расщепления молекул ИЛ-36 протеазами гранул нейтрофилов.

Контакт ИЛ-36 во внеклеточном пространстве с ферментами эластазой и катепсином G

происходит не только в свободном межклеточном пространстве, но также в хроматиновых

сетях, образующихся в результате нетоза нейтрофилов [28]. Нетоз (NETosis) – это процесс

программируемой смерти нейтрофилов, при котором во внешнюю среду выходит хроматин

нейтрофилов в виде сети с впутанными в неё молекулами антимикробных белков и протеаз.

Этот процесс играет важную роль в иммунном ответе на бактериальную инфекцию [60] и

развитии аутоиммунных заболеваний [20].

Процессинг с помощью протеаз нейтрофилов показан и для других членов семейства

ИЛ-1. Так, ИЛ-1β и ИЛ-18 могут быть активированы вне клетки протеазами нейтрофилов, либо

внутри клетки в инфламмасоме с помощью каспазы-1 [91]. ИЛ-37 процессируется каспазой-1

[70].

20

2.1.7. Сигналлинг белков семейства ИЛ-1

Рецепторы всех цитокинов семейства ИЛ-1, кроме IL-18BP (IL-18 binding protein) и IL-

1R8, устроены похожим образом. Они состоят из внеклеточного домена, трансмембранного

домена и внутриклеточного Toll/IL-1 receptor (TIR) домена [46]. После связывания лиганда с

рецептором образовавшийся комплекс связывает корецептор. Внутриклеточные TIR-домены

рецептора и корецептора взаимодействуют и активируют содержащие TIR-домен белки внутри

клетки, активируя NF-κΒ сигнальный каскад [42].При этом используемые сигнальные пути

общие для всех представителей семейства ИЛ-1 [122]. Такое дублирование эффектов

обеспечивает амплификацию сигнала от патогенов без их диссеминации и генерализации

местных эффектов воспаления [122].

При активации гетеродимерный рецепторный комплекс присоединяет к себе белок

MyD88 и киназы IRAK, которые взаимодействуют с Е3 убиквитин-лигазой TRAF-6.

Олигомеризация TRAF-6 активирует 2 альтернативных сигнальных пути, в которых участвуют

различные MAPK киназы. В первом пути передача сигнала ведет к активации

транскрипционного фактора NF-κB [149]. Другой путь ведет к активации киназ JNK и p38 и

транскрипционного фактора AP-1 [38]. В результате активации любого из путей запускается

транскрипция генов различных медиаторов воспаления: ИЛ-6, ИЛ-8 и др. [29, 145].

ИЛ-1РА и ИЛ-36РА связываются с рецепторами IL-1R1 и IL-36R соответственно, но

блокируют рекрутинг корецептора IL-1RAcP и передачу сигнала [122]. ИЛ-38 подобно ИЛ-

36РА связывается с IL-36R и блокирует связывание рецептора с активатором ИЛ-36γ [137].

Блокада действия ИЛ-1 также может происходить за счет действия рецепторов-ловушек

[46]. Рецептор-ловушка IL-1R2 отличаются от обычного рецептора IL-1R1 укороченным TIR-

доменом, что позволяет ему связывать лиганды, но не позволяет передавать сигнал. Он также

существует в растворимой форме, что позволяет ему связывать лиганды и рекрутировать IL-

1RAcP в растворе, таким образом не давая лигандам взаимодействовать с IL-1R1. При этом IL-

1R2 взаимодействует с ИЛ-1α и ИЛ-1β, но не с ИЛ-1РА [46].

Описан механизм блокирования сигнала ИЛ-18 с помощью ИЛ-37. ИЛ-37 способен

связывать специфический для ИЛ-18 рецептор IL-18Rα [70, 100] и привлекать в качестве

корецептора белок IL-1R8, который функционирует как характерный рецептор-ловушка,

неспособный к передаче сигнала [164, 166]. Также ИЛ-37 способен связывать растворимый

белок IL-18BP, образующийся комплекс связывает корецептор ИЛ-18 – IL-18Rβ – и таким

образом блокирует передачу сигнала ИЛ-18 [157]. Рецепторы-ловушки ИЛ-36 пока неизвестны.

21

2.1.8. Биологические функции ИЛ-36

ИЛ-36 активируют те же сигнальные пути, что и ИЛ-1. Функциональные различия ИЛ-36

и ИЛ-1 определяются, прежде всего, преимущественной экспрессией генов ИЛ-36 и их

рецептора в эпителиальных тканях [145].

ИЛ-36γ стимулирует выработку ФНОα и ИЛ-1β синовиальными фибробластами и

хондроцитами [88], выработку ФНО-α, ИЛ-1β и ИЛ-6 фибробластами бронхов [27], ФНО-α,

ИЛ-1β, ИЛ-36γ и NOS2 кератиноцитами и фибробластами кожи [155, 163]. Клетки эндотелия

человека в ответ на обработку ИЛ-36γ вырабатывают провоспалительные цитокины IL-8, CCL2

и CCL20, что способствует привлечению Т-клеток (72).

ИЛ-36 способствуют созреванию ДК макрофагального и плазмоцитоидного

происхождения, активируя экспрессию генов цитокинов и хемокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, CCL1,

CXCL1, ИЛ-1α, ФНОα, GM-CSF, ИЛ-23, ИЛ-12), а также молекул, необходимых для

презентации антигенов: HLA-D, B7.1 и B7.2 [95]. ДК, культивированные в присутствии ИЛ-36,

стимулировал Тh1-поляризацию Т-клеток [95]. Кроме того, Тh1-поляризацию Т-клеток

напрямую стимулировало совместное действие ИЛ-36β с ИЛ-12 [138, 139].

ИЛ-36 участвуют в ответе организма на вирусные инфекции. В модели гриппа на мышах

после инфекции наблюдалось резкое повышение продукции ИЛ-36α, но не ИЛ-36γ [8]. Кроме

того, намного меньшая смертность наблюдалась в группе мышей, нокаутных по гену рецептора

ИЛ-36, т.к. у них не развивалось столь острого воспаления [8]. В ответ на инфекцию вирусом

простого герпеса 1 кожа мыши отвечала повышением экспрессии генов, кодирующих ИЛ-36α и

ИЛ-36β, но не ИЛ-36γ, а культура кератиноцитов человека повышением экспрессии только гена

ИЛ-36α [94]. Кроме того, мыши, нокаутные по гену il36b, кодирующему ИЛ-36β, чаще умирали

от герпесвирусной инфекции, чем мыши дикого типа [94]. ИЛ-36γ также вовлечён в развитие

иммунного ответа на бактериальную инфекцию в лёгких [68, 69].

ИЛ-36 также участвуют в процессах репарации тканей. Мыши, нокаутные по гену

рецептора ИЛ-36, имели пониженную способность к восстановлению токсических повреждений

в кишечнике [92]. Пониженная экспрессия гена рецептора ИЛ-36 наблюдается у человека при

болезни Гиршпрунга, характеризующейся хроническими запорами [130]. Введение ИЛ-36РА

увеличивает тяжесть экспериментального токсического поражения печени у мышей [115]. ИЛ-

36γ стимулирует выработку кератиноцитами белка REG3A (regenerating islet-derived protein 3-

alpha), который обеспечивает пролиферацию и дифференциацию кератиноцитов, необходимую

для заживления ран [59].

22

В то же время ИЛ-36γ провоцирует нейтрофильную инфильтрацию бронхов, с которой

связывают развитие хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ). В сыворотке больных

ХОБЛ было зафиксировано повышение уровня ИЛ-36γ [25]. Способность нейтрофилов самим

синтезировать ИЛ-36γ [18], вероятно, вносит вклад в хронизацию процесса.

Таким образом, ИЛ-36α, β, γ – это провоспалительные цитокины, функционирующие в

барьерных эпителиях, участвующие в рекрутинге и активации клеток врожденного и

приобретенного иммунитета, а также инициации Тh1-опосредованного иммунного ответа.

Нарушение баланса активности ИЛ-36α, β, γ и ИЛ-36РА ассоциировано с хроническими

воспалительными процессами, в частности, с псориазом.

2.2. Псориаз и цитокины группы ИЛ-36

2.2.1. Клинико-демографическая характеристика псориаза

Псориаз (чешуйчатый лишай) это хроническое воспалительное заболевание кожи,

которое характеризуется гиперпролиферацией и нарушением дифференцировки кератиноцитов,

а также инфильтрацией активированными Т-клетками эпидермиса и сосочкового слоя дермы.

Псориаз характеризуется повторяющимися эпизодами появления на коже эритематозных

чешуйчатых бляшек с четкими границами, покрытых серебряно-белыми чешуйками, которые

преимущественно появляются на локтях, коленях, коже головы, в области пупка и поясницы.

Псориаз можно разделить на два типа. Псориаз 1 типа характеризуется отягощенным

семейным анамнезом по этому заболеванию, демонстрирует связь с человеческим

лейкоцитарным антигеном CW6 (HLA-CW6) и обычно начинается в возрасте до 40 лет. Псориаз

2 типа не является семейным заболеванием, не имеет связи с HLA-CW6 и обычно проявляется

после 40 лет [17, 75].

Псориаз поражает от 2% до 5% населения в экономически развитых странах.

Псориатический артрит развивается у 5-25% больных псориазом, проявляется симметричными

деструктивными изменениями суставов [17]. В России проживает более 300 тысяч больных

псориазом [2]. Болеют в основном подростки 15-17 лет (более 100 новых случаев на 100 тыс. в

год) [1].

Помимо вульгарного псориаза выделяют более специфические и зачастую тяжёлые его

формы, характеризующиеся более обширными или более болезненными высыпаниями, их

особенной локализацией, образованием пустул, поражением суставов, системными

23

расстройствами [17]. Для оценки тяжести симптомов применяют шкалу PASI (Psoriasis Area and

Severity Index).

Наиболее тяжёлой формой псориаза является генерализованный пустулёзный псориаз

(ГПП). ГПП – потенциально летальная форма псориаза, которая характеризуется

формированием стерильных пустул на коже, инфильтрацией нейтрофилов в кожу, лихорадкой

и в 30% случаев также поражениями кожи по типу вульгарного псориаза [49, 153]. Для ГПП

характерно развитие системного воспаления [98], характеризующегося гиперлейкоцитозом и

повышением уровня С-реактивного белка в крови [49, 153]. ГПП может развиваться, как в

младенчестве [111], так и у взрослых людей [126]. Болезнь может иметь периодический

характер с рецидивами раз в несколько лет [62].

2.2.2. Современные представления о патогенезе псориаза

Гистологические изменения в пораженной псориазом коже таковы: утолщенный

эпидермис из-за гиперпролиферации кератиноцитов и нарушения их дифференцировки;

уменьшение или отсутствие зернистого слоя; расширение кровеносных сосудов в дерме;

плотные скопления воспалительных клеток, состоящие из Т-клеток и дендритных клеток в

дерме, и CD8+ Т-клеток и нейтрофилов в эпидермисе [17] (Рисунок 5).

Симптомы псориаза являются результатом хронического воспаления в коже. До сих пор

не ясно, что именно запускает это воспаление, однако, понятно, как оно протекает.

Воздействие некого фактора, вероятно, одного из факторов окружающей среды,

травмирующего воздействия, лигандов TLR или провоспалительных цитокинов, приводит к

тому, что кератиноциты начинают секретировать ряд факторов воспаления: цитокины,

хемокины и противомикробные белки. Одним из этих белков является кателицидин (LL-37). Он

образует комплекс с собственной ДНК кератиноцитов, появляющейся в межклеточном

веществе в результате нарушения целостности клеток. Этот комплекс фагоцитируется ДК.

Далее ДК, секретирующие провоспалительные цитокины, в том числе ИЛ-12 и ИЛ-23,

осуществляют антиген-зависимую дифференцировку Т-хелперных клеток в Th1 и Th17. Клетки

Th1 и Th17 мигрируют в кожу в ответ на выделение хемокинов активированными

кератиноцитами. Там Th1 и Th17 секретируют провоспалительные цитокины, прежде всего,

ИФН-γ, ИЛ-17 и ИЛ-23 [16, 168]. Собственно кожные высыпания при псориазе возникают

после инфильтрации соответствующих участков кожи Т-клетками, а терапевтический эффект

24

фототерапии при псориазе сопровождается исчезновением Т-лимфоцитов, инфильтрирующих

кожу, особенно, эпидермис [114].

А

Б

Рисунок 5. Микрофотографии окрашивания срезов кожи больного псориазом (А) и

здорового человека (Б), окрашенных гематоксилином и эозином [55]. В коже больного

псориазом наблюдается увеличение эпидермальных гребней (1), утончение рогового слоя

эпидермиса (2), инфильтрация иммунных клеток в дерму и эпидермис (3).

Т-хелперы в псориатических поражениях обычно обнаруживаются в более глубоких

слоях кожи, тогда как CD8+ Т-клетки инфильтрируют преимущественно эпидермис и,

возможно, также играют важную патогенетическую роль. Анализ репертуара Т-клеточных

рецепторов CD8+ клеток из псориатических бляшек показал их олигоклональную природу,

1

2

3

25

причем клетки с идентичными рецепторами обнаруживаются как в коже, так и в суставах, что

подтверждает патогенетическую взаимосвязь поражений разных тканей [23].

Хронизация патологического воспаления при псориазе происходит благодаря наличию

нескольких петель положительной обратной связи, поддерживающих активацию дендритных

клеток, лимфоцитов, нейтрофилов, фибробластов и кератиноцитов. Основными изменениями

биологии кератиноцитов при псориазе считаются ускорение пролиферации и замедление

апоптоза, приводящие к нарушениям дифференцировки и структурным аномалиям

многослойного эпителия, описанным выше [108]. В результате всех этих процессов возникают

типичные для псориаза кожные поражения.

Активация клеток иммунной системы и нарушения дифференцировки кератиноцитов

обусловлены в первую очередь действием различных цитокинов. В патогенез кожных и

суставных поражений при псориазе вовлечены цитокины семейства ИЛ-1, а также ИЛ-12, ИЛ-

17, ИЛ-23, ИФНγ и ФНОα. ИФНγ секретируется CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитами и является

одним из центральных медиаторов в патогенезе псориаза, появление бляшек может быть

индуцировано у больных интрадермальным введением этого цитокина [52]. ФНОα

секретируется активированными Т-хелперами, ДК и макрофагами и стимулирует продукцию

иммунокомпетентными клетками ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-36, колониестимулирующих факторов,

хемокинов (ИЛ-8), а также матриксных металлопротеиназ, участвующих в деградации костного

матрикса при псориатическом артрите [160].

Помимо клеток иммунной системы, важными продуцентами цитокинов при псориазе

являются кератиноциты, которые под действием ИФНγ и ФНОα способны секретировать ИЛ-1,

ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-18, ИЛ-36, ФНОα и множество других цитокинов и факторов

роста. Многие из перечисленных цитокинов также способны стимулировать пролиферацию и

активацию фибробластов в синовиальной оболочке и коже [16, 160].

2.2.3. Роль ИЛ-36 в патогенезе псориаза

ИЛ-36 напрямую вовлечены в патогенез псориаза. В псориатических бляшках повышен

уровень продукции ИЛ-36γ и ИЛ-36РА, а также других цитокинов, в свою очередь способных

индуцировать экспрессию ИЛ-36 [22, 32, 63]. При этом повышенный уровень экспрессии IL36G

и повышенные уровни ИЛ-36γ в коже и сыворотке крови являются отличительной чертой

именно псориатического воспаления, отличая его от атопического дерматита или экземы. Эти

26

уровни кореллируют с тяжестью заболевания, их можно использовать как биохимические

маркеры псориаза [32].

Роль ИЛ-36 в развитии псориатического воспаления сводится к индукции продукции

кератиноцитами самих ИЛ-36, а также β-дефенсинов 2 и 3, кателецидина (LL-37), псориазина

(S100A7) и других провоспалительных цитокинов [22, 163]. Также ИЛ-36 стимулируют

продукцию кератиноцитами и фибробластами хемокинов для нейтрофилов, ДК и T-лимфоцитов

[132], стимулирует созревание ДК [95] и направляет дифференцировку T-лимфоцитов по Th1- и

Th17-пути [138, 139]. В воспаленной коже при гидрадените наблюдается повышение

экспрессии генов ИЛ-36α, β, γ, но не ИЛ-36РА [128].

Роль ИЛ-36 в патогенезе псориаза продемонстрирована также на модели

псориазоподобного дерматита на мышах.

Мыши, трансгенные по гену, кодирующему ИЛ-36α, имели фенотип кожи

близкий к псориатическому: локальные язвы с повышенной инфильтрацией

иммунных клеток, нарушениями дифференцировки кератиноцитов, а также

гиперэкспрессей генов многих белков, ассоциированных с воспалением. Однако к

третьей неделе кожа мышат имела нормальный фенотип, то есть хронизации

воспалительного процесса не происходило.

Потомство от скрещивания этих мышей с мышами, нокаутными по гену,

кодирующему ИЛ-36РА, было настолько маложизнеспособно, что из 109 мышат

выжил только один.

Потомство от скрещивания с мышами, нокаутными по гену, кодирующему

рецептор ИЛ-36, имело нормальный фенотип.

Потомство от скрещивания этих мышей с мышами, нокаутными по генам,

кодирующим рецептор ИЛ-1 или рецептор ФНОα, имело такой же

псориазоподобный фенотип.

Потомство от скрещивания этих мышей с мышами, нокаутными по гену,

кодирующим белок RAG-2, необходимому для V(D)J-реарранжировки, и поэтому

неспособных к рекомбинации генов Т-клеточного рецептора в процессе

созревания T-лимфоцитов, имело псориазоподобный фенотип кожи.

Таким образом, развитие этого псориазоподобного фенотипа у мышей опосредовано

самими ИЛ-36, а ИЛ-1β и ФНОα и Т-лимфоциты не играют при этом критической роли [15, 22].

27

У человека при наличии мутаций в гене IL36RN, кодирующем ИЛ-36РА, может

развиваться так называемый синдром недостаточности ИЛ-36РА (DITRA - deficiency of the IL-

36 receptor antagonist, OMIM 614204) [10, 158]. Для него характерны клинические проявления в

виде таких заболеваний как географический язык [80], герпетиформное импетиго [125],

пальмоплантарный пустулез, акродерматит хронический Аллопо [3, 118] и генерализованный

пустулёзный псориаз (ГПП), который является его наиболее частым и наиболее тяжёлым

клиническим проявлением [118]. У носителей гетерозиготных мутаций болезнь как правило

развивается позже и протекает легче [58].

Описан ряд мутаций, вызывающих это заболевание, наиболее распространённых в

различных популяциях: нонсенс мутация 28C>T (Arg10X) выявлена в японской и арабской

популяциях [110, 126], миссенс мутация 368C>T (Thr123Met) выявлена в японской популяции

[37, 62], миссенс мутации 338C>T (Ser113Leu) и 142C>T (Arg48Trp), выявлены в

Великобритании [98], миссенс мутация 80T>C (Leu27Pro) выявлена в тунисской популяции

[90], мутация 115+6T>C, приводящая к пропусканию экзона 3, сдвигу рамки считывания и

преждевременной терминации транскрипции, выявлена в японской популяции [37]. Для ИЛ-

36РА с аминокислотными заменами Thr123Met [37] и Leu27Pro [90] была экспериментально

доказана потеря функциональной активности. Носителями мутантной аллели 80T>C (Leu27Pro)

оказалось 0,52% тунисской популяции [90].

2.2.4. Лечение псориаза и антицитокиновая терапия

Лечение псориаза носит только симптоматический характер и выбирается в зависимости

от тяжести заболевания. Лёгкие формы вульгарного псориаза поддаются эффективному

лечению с помощью топического применения препаратов растительного происхождения [36],

кальцитриола или кальципотриола [102], бетаметазона дипропионата [148], кортикостероидов

[131], антралина [117] и облучения ультрафиолетом В (длина волны 280–315 нм) [93]. В более

тяжёлых случаях, когда наблюдаются также системные расстройства или поражения суставов,

вызванные псориазом, применяется ретиноидная терапия или метотрексат [64]. Наиболее

тяжёлые формы псориаза, такие как ГПП, не отвечают на подобную терапию.

В настоящее время в терапии ГПП наиболее широко применяются такие

антицитокиновые иммуносупрессивные препараты, как этанерцепт (внеклеточный домен

рецептора ФНОα, сшитый с Fc-фрагментом IgG1 человека), инфликсимаб и адалимумаб (оба –

моноклональные антитела к ФНОα) [113]. Лечение ГПП этими препаратами нередко приводит к

28

развитию системных осложнений и инфекций, особенно у детей [113]. Так, при терапии ГПП с

помощью этанерцепта у ряда пациентов развивался синдром раздражённого кишечника и увеит

[45, 67]. Введение адалимумаба часто приводило к развитию различных инфекций [45, 66]. В

единичных случаях при введении инфликсимаба показано развитие тяжёлых заболеваний,

таких как дисфункция печени [143]. Зарегистрирован случай, когда при лечении

инфликсимабом у пациента развилась пневмоцистная пневмония – угрожающее жизни

заболевание обычно наблюдаемое у ВИЧ-инфицированных пациентов [105].

В клинической практике распространены случаи успешного лечения ГПП / DITRA с

помощью введения рекомбинантного рецепторного антагониста ИЛ-1 (анакинра) [111].

Анакинра также показал высокую эффективность в лечении пациента с делецией 175 т.п.н. на

хромосоме 2q13, включающей гены, кодирующие ИЛ-1РА, ИЛ-36α, ИЛ-36β, ИЛ-36γ, ИЛ-36РА

и ИЛ-38 [19]. Тем не менее, при лечении анакинрой у многих пациентов также наблюдаются

тяжёлые побочные эффекты, в первую очередь инфекции и токсическое поражение печени

[172].

Высокую эффективность в терапии ГПП показали также моноклональные антитела к

ИЛ-17А (секукинумаб) [112] и моноклональные антитела к общей для ИЛ-12 и ИЛ-23

субъединице p40 (устекинумаб) [101]. Однако и в случае этих препаратов наблюдались частые

побочные эффекты в виде инфекций дыхательных путей и расстройств пищеварительной

системы, особенно при длительном лечении [84, 112].

Описано также применение моноклональных антител к рецептору ИЛ-6 (тоцилизумаб)

для лечения псориатического артрита, не отвечающего на лечение блокаторами ФНОα [30].

Однако, лечение тоцилизумабом также имеет тяжёлые побочные эффекты, опосредованные

развитием нейтропении [87].

Таким образом, учитывая тяжесть побочных эффектов имеющейся антицитокиновой

терапии ГПП / DITRA, существует необходимость разработки препаратов, действие которых

ограничивалось бы кожей.

Перспективным вариантом представляется целенаправленное подавление активности

ИЛ-36 [32]. В настоящее время разрабатывается несколько таких препаратов. Моноклональные

антитела к рецептору ИЛ-36 независимо получены компаниями Boehringer Ingelheim

(Германия) [44] и Anaptys Bio (США) [156]. Сейчас они оба находятся на первой стадии

клинических испытаний.

29

Разработка технологии получения фармацевтической субстанции рекомбинантного ИЛ-

36РА и готовой лекарственной формы на ее основе, являющейся кандидатным лекарственным

средством для лечения псориаза, разрабатываемым ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» ФМБА РФ (Россия),

описана в данной работе.

30

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Получение штаммов-продуцентов безметионинового ИЛ-36РА

В создании штаммов-продуцентов ИЛ-36РА принимали участие Кондратьева Е.В. и

Кудлинг Т.В., за что автор приносит им свою искреннюю благодарность. При этом участие

автора заключалось в постановке задач, разработке плана работ и предоставлении образцов.

3.1.1. Штаммы бактерий

В ходе работ по созданию плазмид использовались клетки E.coli DH10B/R (Invitrogen,

США) с генотипом F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80dlacZΔM 15 ΔlacX74 deoR recA1 endA1

araD139 Δ(ara,leu)769 galU galKλ- rpsL nupG. Клетки этого штамма обладают высокой

компетентностью при трансформации и малой склонностью к модификации или потере

плазмид.

В качестве штамма-продуцента использовали E.coli BL21 Star [DE3] (Invitrogen, США) с

генотипом F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm rne131 [DE3], содержащий в геноме λDe3 лизоген и

мутацию rne131. Мутация rne131 в гене rne приводит к наработке усеченной формы РНКазы-Е,

что замедляет деградацию мРНК внутри клетки. Использование этого штамма позволяет

увеличивать продукцию белка.

3.1.2. Получение компетентных клеток E.coli для электротрансформации

Для получения клеток обоих описанных выше штаммов, компетентных к последующей

трансформации методом электропорации, клетки переводили в деионизованную воду и

замораживали. Для этого штамм рассеивали на чашку Петри с с агаризованной средой LB.

Чашку инкубировали в термостате при +37 °С в течение ночи. На следующий день брали с

чашки отдельную колонию и помещали в 5 мл 1-кратной жидкой среды LB. Культуру растили в

течение 16-18 часов при +37 °С и скорости перемешивания 250 об/мин. 2 мл полученной

ночной культуры вносили в 200 мл 1-кратной среды LB в 2 л колбе. Полученную культуру

растили при +37 °С и скорости перемешивания 250 об/мин до достижения OD600 = 0,6. Затем

клетки осаждали центрифугированием при 4000 g в течение 10 минут при +4 °С. После этого

клетки отмывали 200 мл деионизованной воды и осаждали центрифурированием при тех же

условиях. Процедуру отмывки повторяли трижды. После отмывки осадок клеток

ресуспендировали в 50 мл деионизованной воды, разливали по 500 мкл в микроцентрифужные

31

пробирки и центрифугировали 30 секунд при 6000 g на микроцентрифуге. Осадок клеток

ресуспендировали в 35 мкл 15% глицерина, сразу после этого пробирку быстро замораживали в

жидком азоте. Готовые к трансформации клетки хранили при -70 °С.

3.1.3. Электротрансформация клеток E. coli

Трансформацию компетентных клеток проводили методом электропорации. Для этого

один микролитр деионизованной лигазной смеси добавляли к 40 мкл компетентных клеток,

перемешивали и проводили электропорацию на электропораторе MicroPulser (Bio-Rad, США) в

стерильных ячейках. После трансформации клетки помещали в 300 мкл cреды SОС (2%

триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4, 20

мМ глюкозы) и инкубировали в течение 40 минут при + 37 °С. После инкубации 10–100 мкл

клеточной суспензии высеивали на чашку Петри с агаризованной средой LB, содержащей 100

мкг/мл ампициллина и/или 25 мкг/мл хлорамфеникола для отбора трансформированных

клонов.

3.1.4. Отбор трансформированных клонов

Отбор трансформированных клонов проводили с помощью ПЦР с колоний. Для этого

фрагмент биомассы бактериальной колонии с помощью стерилизованной деревянной

зубочистки переносили с поверхности чашки Петри в 200 мкл пробирку с 15 мкл реакционной

смеси для ПЦР, содержащей в том числе необходимую для определения требуемого гена пару

праймеров. Зубочисткой с остатками биомассы бактерий наносили штрих на чистую чашку

Петри с 1-кратной агаризованной средой LB, содержащей соответствующий антибиотик.

Чашки помещали на ночь в термостат при температуре + 37 °С. ПЦР проводили по программе,

соответствующей конкретной паре праймеров. Результат ПЦР визуализировали с помощью

электрофореза в 2% агарозном геле. В случае положительного результата ПЦР

соответствующую колонию использовали в дальнейшей работе.

3.1.5. Создание экспрессионных плазмид, несущих ген метиониаминопептидазы E.

coli

Конструирование плазмиды pBAD22

32

На первом этапе модифицировали плазмиду pBAD (Thermo Scientific, США): удаляли

участок плазмиды, содержащий сайт рестрикции NdeI и заменяли исходный полилинкер на

полилинкер плазмиды pET22b(+) (Novagen, США). С этой целью проводили амплификацию

фрагмента плазмиды pBAD с помощью пары 5’-фосфорилированных праймеров (длина

продукта 3885 п.н.): 5’-GCTGCATGTGTCAGAGGTT-3’ и 5’-GCACAGATGCGTAAGGAGAA-

3’.

Амплифицированный фрагмент обрабатывали 1 ед. лигазы фага Т4 (Thermo Scientific,

США), что привело к его замыканию в кольцо. Полученную плазмиду использовали в качестве

матрицы во второй ПЦР со следующей парой праймеров (длина продукта 3793 п.н.): 5’-

ATGCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTT-3’ и 5’-TAAGACGTCTCCAGCTTGGCTGT-3’.

Параллельно проводили ПЦР участка полилинкера на матрице pET22b(+) с помощью

следующей пары праймеров (длина продукта 256 п.н.): 5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’ и

5’-AGCGACGTCTTATCAGTGGTGGTGGTGGT-3’.

Концы амплифицированных фрагментов ДНК обрабатывали рестриктазами NdeI и AatII

и лигировали друг с другом. В результате была получена плазмида pBAD22, несущая ген бета-

лактамазы, ориджин репликации pBR322, а также регулирующие элементы и промотор оперона

araBAD. Здесь и далее правильность последовательности плазмиды подтверждали

секвенированием с использованием форвард-праймера для клонирования.

Конструирование плазмиды pRhD(-)

Для создания плазмиды pRhD(-) амплифицировали последовательность полилинкера на

матрице плазмиды pET22b(+) (Novagen, США) с помощью праймеров: 5’-

ATACATATGAAATACCTGCTGCCGA-3’ и 5’-

TTTGCTAGCATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCA-3’.

Амплифицированный фрагмент длиной 305 п.н. и плазмиду pET302/NT-His (Thermo

Fisher Scientific, США) обрабатывали рестриктазами NdeI и NheI, затем лигировали с помощью

лигазы фага Т4. Так была получена плазмида pET322.

Затем на матрице генома E. coli штамма DH10B (Invitrogen, США) амплифицировали

фрагмент (длина продукта 2030 п.н.), содержащий регуляторную часть оперона rhaBAD. Для

этого использовали праймеры 5’-

TTTGTATACAATTAATCTTTCTGCGAATTGAGATGACGCC-3’ и 5’-

TTATCTAGATTCATTACGACCAGTCTAAAAAGCGCCT-3’.

33

Амплифицированный фрагмент длиной 2030 п.н. и плазмиду pET322 обрабатывали

рестриктазами AccI и XbaI (Thermo Fisher Scientific, США), затем лигировали с помощью

лигазы фага Т4 (Thermo Fisher Scientific, США). Так была получена плазмида pRhD(-), которая

несёт ген бета-лактамазы и регулирующие элементы и промотер оперона rhaBAD.

Конструирование экспрессионных векторов pRhD(-)/MAP, pET302/MAP и pBAD22/MAP

Последовательность гена метионинаминопептидазы (map) E. coli амплифицировали с

геномной ДНК клеток E. coli штамма BL21[DE3] с помощью праймеров 5’-

GAACATATGGCTATCTCAATCAAGACCCCA-3’ и 5’-

GAACTCGAGTTATTATTCGTCGTGCGAGATTA-3’.

Амплифицированный фрагмент длиной 800 п.н. и плазмиды pRhD(-) и pBAD22

обрабатывали рестриктазами NdeI и XhoI, затем лигировали с помощью лигазы фага Т4. Так

были получены плазмиды pRhD(-)/MAP и pBAD22/MAP, несущие ген map под контролем

промотора rhaBAD или araBAD соответственно, ген бета-лактамазы и ориджин репликации

pBR322.

Для клонирования гена метионинаминопептидазы в плазмиду pET302/NT-His

последовательность гена метионинаминопептидазы (map) E. coli амплифицировали с геномной

ДНК клеток E. coli штамма BL21[DE3] с помощью праймеров 5’-

GAATTCAGCTATCTCAATCAAGACCCCA-3’ и 5’-

GGATCCTTATTATTCGTCGTGCGAGATTA-3’.

Амплифицированный фрагмент длиной 800 п.н. и плазмиду pET302/NT-His

обрабатывали рестриктазами EcoRI и BamHI, затем лигировали с помощью лигазы фага Т4. Так

была получена плазмида pET302/MAP.

Конструирование плазмиды pRh15A

Фрагмент последовательности ДНК, содержащий ген метионинаминопептидазы и

регулирующие его экспрессию последовательности, амплифицировали с плазмиды pRhD(-

)/MAP с помощью праймеров 5’-GCTAAGCTTCGCCTGATGCGGTATTTTCTC-3’ и 5’-

GGAGTCGACATCCGGATATAGTTCCTCCTTTC-3’.

Амплифицированный фрагмент длиной 3146 п.н. и плазмиду pACYC184 обрабатывали

рестриктазами HindIII и SalI, затем лигировали с помощью лигазы фага Т4. Так была получена

34

плазмида pRh15A, несущая ген map под контролем промотора rhaBAD, ген бета-лактамазы и

ориджин репликации p15A.

Конструирование плазмиды pBAD15A

Фрагмент последовательности ДНК, содержащий ген МАП и регулирующие его

экспрессию последовательности, амплифицировали с плазмиды pBAD22/MAP с помощью

праймеров 5’- GATAAGCTTCTGTGCGCTGCATGTGTCAGAG-3’ и 5’-

GAAGTCGACGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCAC-3’.



плазмида pBAD15A, несущая ген map под контролем промотора araBAD, ген бета-лактамазы и


Конструирование плазмиды pET15A

Фрагмент последовательности ДНК, содержащий ген метионинаминопептидазы и

регулирующие его экспрессию последовательности, амплифицировали с плазмиды

pET302/MAP с помощью праймеров 5’-GTTAAGCTTCGGGTTACTGATGATGAACATG-3’ и

5’-GGAGTCGACATCCGGATATAGTTCCTCCTTTC-3’.



плазмида pET15A, несущая ген map под контролем промотора T7/lac, ген бета-лактамазы и


3.2. Культивирование штаммов-продуцентов ИЛ-36РА

В работах по культивированию созданных штаммов-продуцентов ИЛ-36РА принимали

участие сотрудники ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» Кондратьева Е.В., Лисицкая В.И., Батарин В.И. и

Демьянова Е.В., за что автор приносит им свою искреннюю благодарность. Участие автора

заключалось в планировании работ, подготовке и анализе исходных и получаемых образцов,

проведении экспериментов, разработке методик, обобщении, систематизации и интерпретации

результатов работ.

35

Работы по культивированию штамма-продуцента ИЛ-36РА в пилотном биореакторе

проводились на базе ИБФМ РАН под руководством к.б.н. Самойленко В.А..

3.2.1. Криоконсервация культур штаммов-продуцентов ИЛ-36РА

После завершения создания штамма и перед началом его серийных культивирований

был создан криоконсервированный эталон каждого штамма-продуцента ИЛ-36РА. Штамм,

выращенный в ночной культуре в 1-кратной среде LB, рассевали штрихом на чашку Петри,

содержащую 25 мл питательной среды 1-кратной среды LB с агаром. Чашку выдерживали в

термостате при температуре +37 °С в течение 18 часов, после чего просматривали, выделяли 10

типичных изолированных колоний (гладкие, слабовыпуклые, с ровным краем). Выбранные

колонии суспендировали в стерильной пробирке, содержащей 1 мл 0,15 М хлористого натрия,

до получения равномерной суспензии и переносили в коническую колбу с 30 мл 1-кратной

среды LB. Колбу помещали в термостатированную качалку при скорости перемешивания 250

об/мин и температуре +37 °С на 18 часов. Из полученной культуральной жидкости стерильно

отбирали 10 мл для контроля чистоты и стабильности культуры, а также качества плазмиды.

К оставшейся культуральной жидкости добавляли 10 мл 45% глицерина и перемешивали

до получения гомогенной суспензии, которую затем разливали стерильной пипеткой по 1,5 мл

в 20 стерильных пробирок и замораживали при -70 °С.

3.2.2. Культивирование штаммов-продуцентов ИЛ-36РА в колбах

На первом этапе работ созданные штаммы-продуценты ИЛ-36РА культивировали в

колбах. Культивирование бактерий осуществляли в 1,5-кратной среде LB. В качестве

селектирующего агента применяли ампициллин в концентрации 100 мкг/л. При

культивировании штаммов, несущих две плазмиды, добавляли хлорамфеникол в концентрации

25 мкг/л. Культуру объёмом 10 мл в колбе объёмом 100 мл засевали, используя аликвоту

криоконсервированной культуры, до плотности 0,1 ОЕ, растили 16 часов при +37 °С при

скорости перемешивания 250 об/мин. Затем культуру инокулировали в 200 мл 1,5-кратной

среды LB, до плотности 0,3 OE и растили в колбе объёмом 2 л при +37 °C до плотности 3

ОЕ/мл. После этого температуру понижали до +30 °С и вносили индукторы: во все колбы –

ИПТГ в концентрации 0,5 мМ, а при культивировании штаммов, несущих плазмиды pRh15A и

pBAD15A, также рамнозу в концентрации 0,02% или арабинозу в концентрации 0,2%,

соответственно. Длительность индукции составляла 3 часа. Биомассу бактерий собирали

центрифугированием со скоростью 10000 g при +4 °C в течение 30 минут и замораживали при

температуре -70 °С.

36

3.2.3. Культивирование штаммов-продуцентов ИЛ-36РА в биореакторе

(ферментере)

В дальнейшем при увеличении масштабов культивирования штамма Escherichia coli

BL21Star[DE3](pET-IL36Raf, pBAD15A) стали использовать биореактор BIOFLO-110

(NewBrunswick, США) с ёмкостями 1 и 10 литров. Эти ёмкости специально сконструированы

для масштабирования культивирования, они обладают аналогичными параметрами

массообмена, отличающимися только количествами используемых материалов в 10 раз. В связи

этим ниже описано только культивирование в ёмкости 10 л, как наиболее важной для работы.

Пробирку c криоконсервированной культурой штамма-продуцента ИЛ-36РА

размораживали в термостате при +37 °С в течение 5 минут. Затем содержимое пробирки в

стерильных условиях вносили поровну в четыре колбы вместимостью 2,0 л, содержащую 0,2 л

1,5-кратной среды LB, дополненной 1-кратной средой M9. Культуры растили в

термостатируемой качалке в течение 18 часов при +37 °С и скорости перемешивания 250

об/мин.

Ферментер BIOFLO-110 (NewBrunswick, США) подготавливали согласно инструкции по

эксплуатации. В сосуд помещали 6,5 л дистиллированной воды и 2 мл пеногасителя,

герметизровали сосуд ватно-марлевыми пробками и фольгой. Сосуд ферментера стерилизовали

в автоклаве в течение 30 минут при температуре +121 °С и давлении 1 кг/см2. Вносимые далее

растворы, кроме растворов антибиотиков, автоклавировали заранее в тех же условиях, что и

ферментер. Растворы антибиотиков готовили в асептических условиях в стерильной посуде.

Автоклавированный сосуд ферментера помещали на станину и подключали к

контрольному блоку. После запуска мешалки в асептических условиях в ферментер вносили 0,5

л 20-кратного раствора солей M9, 1,5 л концентрированной питательной среды, содержащей

247,5 г гидролизата казеина и 105 г дрожжевого экстракта, 5 мл 10% раствора магния

сернокислого, 25 мл 0,4% раствора кальция хлористого, 10 мл 10% раствора ампициллина, 10

мл 2,5% раствора хлорамфеникола. Затем в сосуд ферментера вводили датчики рН и рО2,

плотно герметизировали их втулками.

Через 5-10 минут доводили рН до 7,0±0,1 с помощью 25% раствора натрия гидроокиси

или 20% раствора ортофосфорной кислоты. После этого включали подачу воздуха с расходом 4

л/мин, мешалку на скорости 200 об/мин и добивались установления стабильных показаний

датчика рО2. После достижения заданной температуры и стабилизации показаний датчика

37

принимали текущий уровень рО2 за 100%. В дальнейшем поддержание рН и аэрации

проводилось автоматически в период всего процесса культивирования.

Затем в ферментер вводили посевную культуральную жидкость объемом 0,8 л через

стерильную воронку в пламени спиртового факела при отключенной подаче воздуха. По

окончании посева технологическое отверстие заглушали и подачу воздуха возобновляли в

прежнем режиме. Через 1 час после начала культивирования, с интервалом в 1 час, отбирали

пробы объемом 3,5 мл для измерения оптической плотности культуральной жидкости на

спектрофотометре (длина волны 600 нм, толщина слоя в кювете 1 см).

По исчерпанию в среде глюкозы, что фиксируется защелачиванием среды

культивирования и резким снижением потребления кислорода, вводили питательную добавку,

содержащую 82,5 г гидролизата казеина и 35 г дрожжевого экстракта, объемом 0,5 л.

При достижении биореактором температуры +30 °С вносили 5,0 мл раствора

пеногасителя, 25 мл 1М раствора изопропил β-D-тиогалактозида (ИПТГ) и 20 мл 20% раствора

L-арабинозы. Все остальные параметры культивирования поддерживали на прежнем уровне. С

периодичностью в 0,5 или 1 час контролировали динамику изменения оптической плотности.

Через час и через 2 часа после введения ИПТГ в среду вводили по 8 мл 20% раствора L-

арабинозы. Отсчет времени индукции начинали с момента ввода индуктора.

После истечения запланированного времени индукции биомассу штамма-продуцента

ИЛ-36РА собирали с помощью проточной центрифуги Z-41 (СЕРА, Германия) на скорости 5000

об/мин при скорости подачи раствора 1 л/мин. Культуральная жидкость подавалась через

стерильный шланг сливного штуцера ферментера при сохранении избыточного давления.

Полученную биомассу замораживали при -70 °С в чашках Петри. Вес получаемой биомассы

составлял 270-300 г.

3.3. Лизис биомассы клеток штаммов-продуцентов ИЛ-36РА

На этапе культивирования штаммов-продуцентов ИЛ-36РА в колбах биомассу

лизировали путем трехкратного последовательного замораживания при -20 °С и

размораживания при комнатной температуре. Лизированную биомассу разводили в

сорбционном буферном растворе для анионообменной хроматографии на сорбенте Q Sepharose

Fast Flow (50 мМ трис-HCl, pH 7,0) из расчёта 20 мл буфера на 1 г биомассы. После этого лизат

перемешивали на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем

38

удаляли клеточный дебрис центрифугированием при 13500 g в течение 30 минут. Перед

нанесением на сорбент полученный лизат фильтровали через фильтр с размером пор 0,45 мкм.

Для лизиса биомассы штамма-продуцента ИЛ-36РА Escherichia coli BL21Star[DE3](pET-

IL36Raf, pBAD15A), получаемой в ферментере количествах порядка 300 г использовали

оптимизированный метод. Замороженную биомассу клеток штамма-продуцента ИЛ-36РА

помещали в эмалированный поддон и размораживали при комнатной температуре в течение 30-

40 минут до частичного размягчения. При помощи ножа из нержавеющей стали биомассу

измельчали на куски размером 2-3 см. Измельчённую биомассу помещали в стакан емкостью 5

л и добавляли буферный раствор (50 мМ трис-HCl, pH 7,0) из расчёта 10 мл буфера на 1 г

биомассы. Биомассу перемешивали блендером MS 5000/01 FD1 (Bosch, Германия) в течение 2-3

минут до получения однородной суспензии. Емкость с суспензией помещали под погружную

мешалку и перемешивали в течение 30-60 минут при комнатной температуре. Затем удаляли

клеточный дебрис центрифугированием при 9500-10000 g в течение 60 минут.

3.4. Осветление лизата биомассы клеток штамма-продуцента ИЛ-36РА

В работе использованы следующие методы осветления лизатов.

3.4.1. Флоккуляция

В случаях, когда получаемый лизат планировали нанести на анионообменный сорбент Q

Sepharose Fast Flow (GE, США), применяли метод флоккуляции. Для этого полученный после

центрифугирования полуосветлённый лизат сливали в стакан, который помещали под

погружную мешалку. Затем добавляли 1 М раствор однозамещенного калия фосфата до 20 мМ

и 3 М раствор кальция хлористого до 30 мМ, перемешивали лизат в течение 2 минут при

комнатной температуре и инкубировали 1 час при комнатной температуре без перемешивания.

Образовавшийся осадок удаляли центрифугированием при 9500-10000 g в течение 60 минут.

3.4.2. Кислотное фракционирование

В случаях, когда получаемый лизат планировали нанести на катионообменный сорбент

SP Sepharose Fast Flow (GE, США), применяли метод кислотного фракционирования. Для этого

полученный после центрифугирования полуосветлённый лизат сливали в стакан, который

помещали под погружную мешалку. В лизат погружали электрод рН-метра и добавляли 50%

уксусную кислоту до достижения значения рН 4,0. Затем удаляли образовавшийся осадок

центрифугированием при 9500-10000 g в течение 60 минут.

39

3.5. Хроматографическая очистка ИЛ-36РА

Освоение методов хроматографической очистки белков и первые шаги в интерпретации

результатов и оптимизации методик были сделаны под руководством Протасова Е.А.. Также в

проведении экспериментов по оптимизации методик хроматографической очистки ИЛ-36РА

принимали участие Антипова Т.О. и Атанесян В.А.. Автор приносит свою глубочайшую

благодарность за эту помощь.

В ходе работы применяли три схемы выделения ИЛ-36РА из биомассы штамма-

продуцента в зависимости от масштабов культивирования.

Для выделения ИЛ-36РА из культуры штамма-продуцента, наращиваемой в колбах,

использовали сорбционную анионообменную хроматографию на сорбенте Q Sepharose Fast

Flow (GE, США) и гидрофобную хроматографию на сорбенте Toyopearl Butyl-650 (Tosoh,

Япония). В этом случае работы проводили при комнатной температуре с использованием

хроматографа ActaPrime Plus (GE, США) и преднабитых колонок HiTrap (GE, США), а также

стеклянных колонок Eco (YMC, Германия) с внутренним диаметром 25 мм.

Для выделения ИЛ-36РА из культуры штамма-продуцента, наращиваемой в 10 л

биореакторах, использовали негативную анионообменную хроматографию на сорбенте Q

Sepharose Fast Flow (GE, США) и гидрофобную хроматографию на сорбенте Toyopearl Butyl-

650 (Tosoh, Япония). В этом случае работы проводили при комнатной температуре с

использованием хроматографа ActaPrime Plus (GE, США) и стеклянных колонок Eco (YMC,

Германия) с внутренним диаметром 50 и 70 мм.

Для выделения ИЛ-36РА из культуры штамма-продуцента, наращиваемой в 250 л

биореакторе, использовали катионообменную хроматографию на сорбенте SP Sepharose Fast

Flow (GE, США) и гидрофобную хроматографию на сорбенте Toyopearl Butyl-650 (Tosoh,

Япония). В этом случае работы проводили при +4°С в холодильном шкафу Combicold (LKB,

Швеция) с использованием перистальтического насоса Multiperpex (LKB, Швеция) и

стеклянных колонок Eco (YMC, Германия) с внутренним диаметром 50 мм, а также стеклянной

колонки (Pharmacia, Швеция) с внутренним диаметром 150 мм.

3.5.1. Анионообменная хроматография на сорбенте Q Sepharose Fast Flow

Сорбент Q Sepharose Fast Flow (GE, США) в количестве 20 мл помещали в стеклянную

колонку 25*200 мм (YMC, Германия) или в количестве 300 мл в колонку 70*200 мм (YMC,

Германия). Перед работой проводили регенерацию сорбента, последовательно промывая его

пятью объёмами регенерирующего раствора (50 мМ трис-HCl, 2M NaCl, pH 7,0), и пятью

40

объёмами 20% этанола со скоростью 10 мл/мин в случае малой колонки и 25 мл/мин в случае

большой колонки. Затем для уравновешивания сорбент промывали тремя объёмами

сорбционного буферного раствора (50 мМ трис-HCl, pH 7,0).

В случае сорбционной хроматографии ИЛ-36РА сорбировали, пропуская через колонку

осветленный лизат биомассы штамма-продуцента, в сорбционном буферном растворе (50 мМ

трис-HCl, pH 7,0). Затем колонку промывали отмывочным буферным раствором (50 мМ трис-

HCl, 15мM NaCl, pH 7,0). ИЛ-36РА элюировали 50 мМ трис-HCl, 50 мM NaCl, pH 7,0. Колонку

регенерировали, как описано выше.

В случае негативной хроматографии сорбцию примесных белков, нуклеиновых кислот и

липополисахаридов проводили, пропуская через колонку осветленный лизат биомассы штамма-

продуцента, в сорбционном буферном растворе (50 мМ трис-HCl, pH 7,0). Затем смывали

остаточные количества слабо сорбировавшегося на колонку ИЛ-36РА отмывочным буферным

раствором (50 мМ трис-HCl, 15мM NaCl, pH 7,0), соединяли несвязавшуюся фракцию с

промывочной и использовали для дальнейшей очистки ИЛ-36РА. Колонку регенерировали, как

описано выше.

3.5.2. Катионообменная хроматография на сорбенте SP Sepharose Fast Flow

Сорбент SP Sepharose Fast Flow (GE, США) в количестве 20 мл помещали в стеклянную

колонку 25х200 мм (YMC, Германия) или в количестве 500 мл в колонку 150*200 мм

(Pharmacia, Швеция). Перед работой проводили регенерацию сорбента, последовательно

промывая его пятью объёмами регенерирующего раствора (50 мМ трис-ацетат, pH 9,0), пятью

объёмами 0,2M NaOH и пятью объёмами 20% этанола со скоростью 5 мл/мин. Затем для

уравновешивания сорбент промывали тремя объёмами сорбционного буферного раствора (50

мМ трис-ацетат, pH 4,0).

Сорбцию ИЛ-36РА проводили, пропуская через колонку осветленный лизат биомассы

штамма-продуцента, в сорбционном буферном растворе (50 мМ трис-ацетат, pH 4,0). Отмывку

несвязавшихся веществ проводили, пропуская через колонку десять объёмов сорбционного

буферного раствора (50 мМ трис-ацетат, pH 4,0). Отмывку от ЛПС проводили сначала 10

объёмами 1% раствором Triton X-114 в 50 мМ трис-ацетатном буфере, pH 4,0, затем отмывку от

остаточных количеств Triton X-114 проводили 10 объёмами 1% раствора Tween-80 в 50 мМ

трис-ацетатном буфере, pH 4,0, затем отмывку от остаточных количеств Tween-80 проводили

10 объёмами обычного отмывочного раствора (50 мМ трис-ацетат, pH 4,0). Элюцию ИЛ-36РА

проводили элюирующим буферным раствором (50 мМ трис-ацетат, pH 5,5). Получаемую при

41

этом фракцию использовали для дальнейшей очистки ИЛ-36РА. Колонку регенерировали, как

описано выше.

3.5.3. Гидрофобная хроматография на сорбенте Toyopearl Butyl-650S

Сорбент Toyopearl Butyl-650S (Tosoh, Япония) в количестве 20 мл помещали в

стеклянную колонку 25*200 мм (YMC, Германия) или в количестве 100 мл в колонку 50х200

мм (YMC, Германия). Перед работой проводили регенерацию сорбента, последовательно

промывая его пятью объёмами 20% этанола со скоростью 10 мл/мин в случае малой колонки и

20 мл/мин в случае большой колонки. Затем для уравновешивания сорбент промывали тремя

объёмами отмывочного буферного раствора (50 мМ фосфат натрия, 150 мМ сульфата аммония,

pH 6,0).

К пробе, полученной на предыдущем этапе очистки, будь то анионообменная

хроматография на сорбенте Q Sepharose Fast Flow (GE, США) или катионообменная

хроматография на сорбенте SP Sepharose Fast Flow (GE, США), добавляли сульфат аммония до

150 мМ, перемешивали на магнитной мешалке до растворения сульфата аммония.

Сорбцию ИЛ-36РА проводили, пропуская через колонку полученный раствор. Отмывку

несвязавшихся веществ проводили, пропуская через колонку десять объёмов отмывочного

буферного раствора (50 мМ фосфат натрия, 150 мМ сульфата аммония, pH 6,0). В случае малой

колонки элюцию ИЛ-36РА проводили апирогенной водой, отсекая концы выходящего пика. К

полученному таким образом образцу добавляли одну десятую объёма стабилизирующего

буферного раствора (0,5М цитрат натрия, рН 6,0). В случае большой колонки элюцию ИЛ-36РА

проводили элюирующим буферным раствором (50 мМ фосфат натрия, pH 6,0), отсекая концы

выходящего пика.

3.5.4. Аффинная хроматография на сорбенте с иммобилизованными антителами к

ИЛ-36РА

Методы аффинной хроматографии были освоены под руководством Родина С.В.,

антитела к ИЛ-36РА были получены к.б.н. Синевой С.А. с использованием предоставленных

автором образцов, за что автор приносит свою искреннюю благодарность.

3.5.4.1. Иммобилизация антител на сорбенте

Моноклональные антитела к ИЛ-36РА человека были получены в лаборатории ранее.

Образец антител для сорбции диализовали против сорбционного буфера (0,1 М NaHCO3, 0,5 M

42

NaCl pH 8,3). Сорбент заливали холодным отмывочным буфером (1 мМ HCl) и взбалтывали в

пробирке, пока он не обводнится. Затем сорбент помещали в воронку с фильтром,

подключенную к вакуумному насосу. Отмывали сорбент в воронке 10 объёмами отмывочного

буфера и 10 объёмами сорбционного буфера. Затем сорбент переносили из воронки в пробирку

с образцом, перемешивали взбалтыванием и дегазировали. После этого пробирку оставляли

мешаться на ночь на ротационной качалке при комнатной температуре. На следующий день

оценивали эффективность сорбции по концентрации белка в жидкости в пробирке с сорбентом.

Если эффективность сорбции была достаточна, то блокировали сорбент добавлением раствора

трис-HCl рН 8,0 до 0,1 М и оставляли перемешиваться на 2 часа на ротационнай качалке. Перед

первым применением сорбент отмывали 2 раза поочередно 5 объёмами 100 мМ глициново-

солянокислого буфера рН 2,5 и 100 мМ трис-HCl буфера рН 9,0 с 0,5 М NaCl. После этого

сорбент считали готовым к работе.

3.5.4.2. Аффинная хроматография

Созданный, как описано выше, сорбент в количестве 5 мл помещали в пластиковую

колонку 10х100 мм (Bio-Rad, США). Перед работой проводили регенерацию сорбента,

последовательно промывая его пятью объёмами 100 мМ глициново-солянокислого буфера рН

2,5 со скоростью 4 мл/мин. Затем для уравновешивания сорбент промывали пятью объёмами

фосфатно-солевого буфера рН 7,2-7,4.

Для выделения ИЛ-36РА этим способом 0,25-0,5 г биомассы штамма-продуцента

лизировали однократным замораживанием и размораживанием, затем ресуспендировали в 10

мл фосфатно-солевого буфера рН 7,2-7,4, перемешивали в течение 30 минут, затем осветляли

центрифугированием при 20000 g в течение 30 минут. Перед нанесением на сорбент раствор

фильтровали через шприцевой фильтр с пористостью 0,22 мкм Millex (Merck-Millipore, США).

Сорбцию ИЛ-36РА проводили, пропуская через колонку полученный раствор. Отмывку

несвязавшихся веществ проводили, пропуская через колонку десять объёмов фосфатно-

солевого буфера рН 7,2-7,4. Элюцию ИЛ-36РА проводили 100 мМ глициново-солянокислым

буфером рН 2,5. К полученному таким образом образцу добавляли одну десятую объёма

нейтрализующего буферного раствора (2 М трис-HCl, рН 8,0).

43

3.6. Ультрафильтрационное концентрирование раствора ИЛ-36РА

Использованный в настоящей работе метод ультрафильтрационного концентрирования

белков был освоен под руководством Полоцкого Е.А., за что автор приносит свою

благодарность.

Перед работой ультрафильтрационную ячейку Amicon 8200 (Merck-Millipore, США) с

установленной мембраной Ultracel PL-10 (Merck-Millipore, США) отмывали водой для

инъекций дважды. Затем в ячейку для ультрафильтрации наливали 50 мл буферного раствора

(50 мМ фосфат натрия, pH 6,0 или 50 мМ цитрат натрия, pH 6,0). Ячейку устанавливали на

магнитную мешалку, включали перемешивание на скорости 200 об/мин, затем ячейку

подключают к баллону со сжатым азотом через редуктор и подавали газ до давления 3

атмосферы. Таким образом, через ячейку прокачивали 30 мл буферного раствора (50 мМ

фосфат натрия, pH 6,0 или 50 мМ цитрат натрия, pH 6,0) для уравновешивания мембраны.

Остатки буферного раствора сливали.

Раствор ИЛ-36РА, полученный в результате элюции с колонки с сорбентом Toyopearl

Butyl-650S (Tosoh, Япония), вносили в ультрафильтрационную ячейку Amicon 8200 (Merck-

Millipore, США), подключали её, как описано выше и выдерживали таким образом, пока объём

раствора в ячейке не достигнет расчётного. Расчётный объём определяли по пропорции таком

образом, чтобы сконцентрировать образец до концентрации ИЛ-36РА не менее, чем 10 мг/мл,

но не более, чем до 15 мг/мл. После этого отключали подачу газа, выравнивали давление в

ячейке с атмосферным и оставляли ячейку на магнитной мешалке на 10 минут. Затем

полученный раствор, содержащий ИЛ-36РА, отбирали из ячейки.

После произведённых работ ячейку для ультрафильтрации дважды промывали водой,

затем в неё вносили 50 мл 0,1 М раствора NaOH в воде и прокачивали через неё 25 мл этого

раствора для регенерации мембраны. Ячейку оставляли залитой этим раствором на ночь. С утра

остатки регенерирующего раствора сливали и мыли ячейку водой для инъекций 2 раза, затем

прокачивали через ячейку 30 мл воды для инъекций. Затем вносили в ячейку 50 мл 20%

раствора этанола в воде для инъекций и прокачивали через неё 25 мл этого раствора для

консервации мембраны для хранения. Хранили ячейку наполненной 20% раствором этанола в

воде при +4 °С.

44

3.7. Диск-электрофорез белков в присутствии додецилсульфата натрия

В проведении экспериментов по анализу образцов, предоставленных автором, методом

диск-электрофореза принимали техническое участие Калинин Р.С. и Ёлшин Н.В., за что автор

приносит свою благодарность.

Электрофорез белков проводили системе из концентрирующего 4% полиакриламидного

геля (ПААГ) и 12% разделяющего в аппарате Mini-PROTEAN IV (Bio-Rad, США) с

использованием электродного буфера (0,25 M трис pH 8,3, 0,192 М глицин, 0,1%

додецилсульфат натрия). Для приготовления концентрирующег геля использовался буфер 0,5 M

трис-HCl pH 6,8, для разделяющего 1,5 M трис-HCl pH 8,8.

Перед внесением образцов в гель к ним добавлялась ¼ объёма буфера для внесения

образцов (0,2% бромфенолового синего, 8% SDS, 20% глицерина, 240 мМ трис-HCl pH 6,8, 10%

β-меркаптоэтанола или без него). Затем образцы нагревали до +95 °С в течение 5 минут, затем

вносили в гель. Электрофорез белков проводили при напряжении 180 В, силе тока 130 мА до

выхода красителя из геля.

3.8. Вестерн блот для определения ИЛ-36РА

В проведении экспериментов по методу вестерн-блоттинга с использованием образцов,

предоставленных автором, принимал участие Ёлшин Н.В., за что автор приносит свою


По завершении электрофореза проводили электроперенос белков из полиактиламидного

геля на нитроцеллюлозную мембрану с использованием аппарата Mini-TransBlot (Bio-Rad,

США). Собирали кассету для переноса. Для этого прикладывали гель и мембрану друг к другу,

помещали их между слоями плотной бумаги и губчатой подложки. Полученную конструкцию

помещали в специальную кассету, закрывали её и вставляли в камеру для электропереноса.

Перенос проводили в электродном буфере (25 мМ трис, 192 мМ глицин, pH 8,3) в течение 1

часа при напряжении 180 В. После переноса мембрану блокировали в течение 1 часа в

фосфатно-солевом буфере рН 7,2-7,4 с 2% бычьего сывороточного альбумина. После этого

мембрану отмывали и погружали в раствор моноклональных мышиных антител к ИЛ-36РА

человека (MAB1275, R&D Systems, США) с концентрацией 5 мкг/мл в фосфатно-солевом

буфере с 0,05% Tween-20 и инкубировали 1 час. Затем мембрану отмывали 5 раз фосфатно-

солевым буфером рН 7,2-7,4 с 0,05% Tween-20. Затем мембрану помещали в раствор

45

поликлональных козьих антител, специфичных к Fc-фрагментам антител мышей, меченых

пероксидазой хрена (A4416, Sigma-Aldrich, Германия) в концентрации 5 мкг/мл, в фосфатно-

солевом буфере рН 7,2-7,4 с 0,05% Tween-20, инкубировали 1 час. После инкубации отмывку

повторяли. Окрашивание производили в фосфатно-солевом буфере с 0,01% диаминобензидина

гидрохлорида (Sigma-Aldrich, Германия) и 0,3% перекиси водорода до появления окраски

белковых бендов.

3.9. Очистка растворов от ЛПС с помощью обработки Triton X-114

Для очистки получаемого раствора ИЛ-36РА от примеси ЛПС применяли

модифицированный метод разделения раствора на несмешиваемые фазы с использованием

детергента Triton X-114. К образцу ИЛ36-РА в апирогенной пробирке добавляли стоковый 10%

раствор Triton X-114 из расчёта 25 мкл раствора на 1 мл образца и перемешивали

пипетированием или аккуратным взбалтыванием в закрытой пробирке. Затем образец

инкубировали 30 минут на ледяной бане, 5-15 минут в водном термостате при температуре +30

°С до помутнения раствора. Фракцию мицелл Triton X-114, содержащую ЛПС, отделяли

центрифугированием при 3000 g в течение 10 минут. Верхнюю водную фазу переносили в

чистую апирогенную емкость. Протокол повторяли 2 раза.

После обработки примесь Triton X-114 остаётся в верхней водной фазе в концентрации

ниже или примерной равной его критической концентрации мицеллообразования - 0,2 мМ

(~165 мкг/мл). Эта остаточная примесь Triton X-114 может быть удалена с помощью диализа по

методике, описанной ниже.

3.10. Очистка растворов от Triton X-114 с помощью диализа

Очистку растворов ИЛ-36РА от Triton X-114 проводили с помощью диализа против

буферного раствора, содержащего 50 мМ цитрат натрия, рН 6,0. Коэффициент разбавления

составлял 500-1000х с учётом одной смены растворов, 500х принимался за минимальный

достаточный. Раствор ИЛ-36РА помещали в диализный мешок CelluSep T2 MWCO 6-8 кДа

(MFPI, США), фиксировали клипсами на обоих концах, помещали в стеклянный стакан,

заполненный количеством буфера, необходимым для достижения нужного коэффициента

разбавления. Содержимое стакана перемешивали на магнитной мешалке при +4 °С в течение

ночи, затем после смены раствора в течение 4 часов.

46

3.11. Количественное определение ЛПС

В определении концентрации ЛПС в предоставленных автором образцах принимали

участие Минаева Е.Н. и Скворцов Н.В., за что автор приносит свою искреннюю благодарность.

Количественное определение примеси ЛПС проводили с помощью набора ChromoLAL

(Cape Cod Inc., США) по протоколу производителя. В качестве стандарта использовали ЛПС из

Escherichia coli K-235 (Sigma-Aldrich, Германия). Сигнал считывали с помощью прибора Victor

2 (Wallac, США), измеряя поглощение раствором в лунках света при длине волны 405 нм.

Концентрацию ИЛ-36РА в пробах рассчитывали по калибровочной кривой с учётом

разбавления.

3.12. Количественное определение содержания ИЛ-36РА в растворах

3.12.1. Спектрофотометрическое определение

В случаях, когда не требовалось поддерживать стерильность или апирогенность

растворов ИЛ-36РА, а также позволяли объём и чистота проб, концентрацию ИЛ-36РА

определяли спектрофотометрически по поглощению раствора при длине волны 280 нм. Для

этого с помощью спектрофотометра Leki SS2109UV (ЛОИП, Россия) измеряли поглощение

пробы сравнения - буферного раствора, не содержащего белка. Затем определяли поглощение

света раствором ИЛ-36РА, вычитали из полученного значения значение, полученное при

анализе пробы сравнения. Если полученное значение не попадало в линейный диапазон

измерения поглощения для данного прибора (0,1-0,5 единиц поглощения), то пробу или

разводили, или анализировали иным методом.

На основании полученного значения рассчитывали концентрацию ИЛ-36РА в мг/мл в

исследуемом образце. Для этого полученное значение делили на коэффициент молярной

экстинкции ИЛ-36РА (1,42), рассчитанный с помощью пакета программ ProtParam [47].

3.12.2. Биуретовый метод с бицинхонициновой кислотой

В случаях, когда требовалось поддерживать стерильность или апирогенность растворов

ИЛ-36РА, а также в случаях, когда объём проб был мал, но они содержали чистый ИЛ-36РА,

концентрацию ИЛ-36РА определяли с помощью модификации биуретового метода с

использованием бицинхонициновой кислоты набором Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo

Scientific, США). Набор использовали согласно инструкции производителя.

47

3.12.3. Определение концентрации ИЛ-36РА методом ИФА

В проведении экспериментов по анализу образцов, предоставленных автором, методом

ИФА принимала участие Кондратьева Е.В., за что автор приносит свою благодарность. Участие

автора состояло в получении и подготовке образцов, постановке задач, обобщении и

интерпретации результатов.

В случаях, когда растворы ИЛ-36РА содержали много примесей, концентрацию ИЛ-

36РА определяли с помощью иммуноферментного анализа. Тест-система для количественного

определения ИЛ-36РА была разработана во ФГУП «ГосНИИ ОЧБ». В ней использованы

моноклональные антитела мыши к ИЛ-36РА человека и поликлональные антитела кролика к

ИЛ-36РА человека.

Для определения ИЛ-36РА в растворах в лунки плоскодонной платы с высокой

сорбционной способностью вносили моноклональные антитела к ИЛ-36РА (20 мкг/мл, 100

мкл/лунку) и инкубировали плату при +37 °С в течение ночи. На следующий день

анализируемые образцы и стандартные пробы ИЛ-36РА для калибровки разводили фосфатно-

солевым буфером с 1% бычьим сывороточным альбумином в требуемых разведениях. После

разведения проб плату однократно промывали фосфатно-солевым буфером. Затем в лунки

вносили по 100 мкл буфера для разведения образцов и 25 мкл разведённых проб, ставили плату

на мешалку на 1 час при комнатной температуре. После этого пять раз отмывали плату

фосфатно-солевым буфером и вносили 100 мкл раствора вторичных антител (поликлональные

антитела кролика к ИЛ-36РА) в концентрации 5 мкг/мл, ставили плату на мешалку на 1 час при

комнатной температуре. После этого пять раз отмывали плату фосфатно-солевым буфером и

вносили 100 мкл раствора конъюгата анти-кроличьих антител козла с пероксидазой хрена

(A0545, Sigma-Aldrich, Германия) в концентрации 0,5 мкг/мл, ставили плату на мешалку на 1

час при комнатной температуре. После этого пять раз отмывали плату фосфатно-солевым

буфером и три раза дистиллированной водой, вносили по 100 мкл/лунку раствора субстрата

пероксидазы хрена тетраметилбензидина (Thermo Fisher Scientific, США) и убирали плату в

тёмное место. Через 3-5 минут, ориентируясь на окраску калибровочных проб, останавливали

окрашивание добавлением 50 мкл 2 М серной кислоты. Сигнал считывали с помощью прибора

Victor 2 (Wallac, США), измеряя поглощение раствором в лунках света при 450 нм.

Концентрацию ИЛ-36РА в пробах рассчитывали по калибровочной кривой с учётом

разбавления.

48

3.13. Оценка биологической активности ИЛ-36РА in vitro с использованием тест-

системы на основе клеточной линии А549

Клетки линии А549+36 были созданы к.м.н. Петровым А.В., в дальнейшем он принимал

активное участие в совместном с автором диссертации тестировании биологической активности

ИЛ-36РА и теоретическом обобщении полученных выводов, за что автор приносит ему свою

глубочайшую благодарность.

3.13.1. Культивирование клеток А549+36

Клетки А549+36 были получены в лаборатории ранее при трансфекции клеток

эпителиоподобной карциномы легкого человека А549 плазмидой, несущей ген рецептора ИЛ-

36 человека. Клетки единственного полученного таким образом клона А549+36R нарастили и

криоконсервировали в FCS c 10% диметилсульфоксида (Sigma, США) в жидком азоте, считая

созданный банк клеток культурой нулевого пассажа. Для последующих экспериментов клетки

А549+36R размораживали и культивировали в среде DMEM/F12 с L-глутамином (Биолот,

Россия) с добавлением 0.5 мкг/мл пуромицина и 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS)

(HyClone, США), в пластиковых флаконах 25 см2 (Costar, США). Культивирование проводили в

инкубаторе при +37 °С в атмосфере 5% СО2 в условиях абсолютной влажности. Процедуру

пересева проводили раз в 3-4 сутки. Для снятия клеток с поверхности сосуда использовали

смесь 0.25% раствора трипсина с раствором Версена (1 : 1). Концентрацию клеток

подсчитывали в камере Горяева, жизнеспособность определяли по исключению трипанового

синего. Для тестирования биологической активности ИЛ-36РА клетки А549+36R использовали

на 4-10 пассажах.

3.13.2. Оценка биологической активности ИЛ-36РА

Сравнение активности образцов ИЛ-36РА, полученных из различных штаммов-

продуцентов, проводили по их способности блокировать действие ИЛ-36g на рецептор ИЛ-36

на поверхности клеток А549+36. Клетки А549+36R рассевали в 96-луночную плату по 40000

клеток на лунку в 100 мкл DMEM/F12 c 10% FCS. Через 24 часа среду заменяли на свежую (100

мкл) и в 50 мкл свежей среды с 1% FCS вносили различные полученные нами рекомбинантные

ИЛ-36РА человека или коммерческий ИЛ-36РА человека в качестве стандартного образца в

последовательных троекратных разведениях в диапазоне конечных концентраций от 3000 нг/мл

до 4.1 нг/мл. Каждое разведение было выполнено в 3 повторениях. Затем добавляли 50 мкл

49

свежей среды с 1% FCS ИЛ-36g до конечной концентрации ИЛ-36g в среде 10 нг/мл. Через 24

часа отбирали супернатант, в котором методом ИФА определяли концентрацию ИЛ-8.

3.13.3. Определение концентрации ИЛ-8 методом ИФА

Иммуноферментный анализ для определения количества интерлейкина-8 проводили с

помощью иммуноферментной тест-системы для количественного определения интерлейкина-8

человека (Цитокин, Россия) по инструкции изготовителя. Супернатанты предварительно

разводили в 5—50 раз для того, чтобы полученные оптические плотности попадали в линейный

участок калибровочной кривой. Значения, полученные для супернатантов от образцов

параллелях, усредняли. Измерение оптической плотности проводилось на планшетном

фотометре Victor2 (Wallac, США) при длине волны 450 нм.

3.13.4. Расчет активности образцов ИЛ-36РА

Метод расчёта биологической активности образцов ИЛ-36РА был разработан к.ф.-м.н.

Вахрушевым А.В., за что автор приносит свою благодарность.

Для каждого образца экспериментальные точки (di,ci), где ci – усредненное значение

концентраций ИЛ-8, измеренных при заданной концентрации di ИЛ-36РА, аппроксимировались

экспоненциальной функцией вида c(d)=A0+A1exp(a1d), такой, что сумма квадратов отклонений

всех экспериментальных значений ci от значений аппроксимирующей функции c(di)

минимальна. Аппроксимацию признавали удовлетворительной, если коэффициент её

детерминированности (r2) был больше 0.95. Коэффициент A0 функции c(d) соответствует

фоновой концентрации ИЛ-8. Экспонента exp(a1d) описывает снижение концентрации ИЛ-8 на

фоне 10 нг/мл ИЛ-36g в связи с увеличением концентрации ИЛ-36РА. Активность исследуемых

образцов ИЛ-36РА определяли как отношение площади под кривой концентраций ИЛ-8 c(d)

(интеграла exp(a1d) на интервале 0 ≤ d < , равным – A1/a1) исследуемого и стандартного

образцов.

3.14. Искусственное окисление ИЛ-36РА

Для искусственного окисления к 120 мкл образца ИЛ-36РА с концентрацией 5 мг/мл в 50

мМ натрий-фосфатном буфере рН 6,0, полученному в результате хроматографической очистки

и ультрафильтрации, добавляли 480 мкл 100 мМ натрий-цитратного буфера рН 4,4 и 6 либо 0,6

мкл 30% перекиси водорода (до 0,3% либо 0,03%, соответственно). Полученный образец

инкубировали при +45 °С в течение 3 часов, затем анализировали методами ВЭЖХ или кИЭФ.

50

3.15. Искусственное дезамидирование ИЛ-36РА

Для искусственного дезамидирования к 120 мкл образца ИЛ-36РА с концентрацией 5

мг/мл в 50 мМ натрий-фосфатном буфере рН 6,0, полученному в результате

хроматографической очистки и ультрафильтрации, добавляли 480 мкл 100 мМ трис-HCl буфера

рН 9,1. Полученный образец инкубировали при +45 °С в течение 18 часов, затем анализировали

методами ВЭЖХ или кИЭФ.

3.16. ВЭЖХ анализ чистоты и гомогенности ИЛ-36РА

ВЭЖХ анализ проводился при участии Протасова Е.А., за что автор приносит свою

искреннюю благодарность. Участие автора состояло в получении и подготовке образцов для

анализа, постановке задач, подборе методик, интерпретации результатов и их теоретическом

обобщении.

Все исследования методом ВЭЖХ проводились на хроматографе НР-1050 (Hewlett-

Packard, СШA) с детектором 1290 Infinity II Diode Array Detector FS (Agilent, США),

градиентной системой подачи растворов и термостатом для колонки. Полученные результаты

обрабатывали в программе Мультихром (Амперсанд, Россия). В зависимости от цели

исследования отличались параметры, изложенные далее.

3.16.1. ОФ-ВЭЖХ для определения чистоты ИЛ-36РА

Для определения неродственных ИЛ-36РА примесей в получаемых образцах ИЛ-36РА

применяли ОФ-ВЭЖХ в градиенте ацетонитрила. Использовали колонку Jupiter С18

(Phenomenex, США) из нержавеющей стали, длиной 0,25 м и внутренним диаметром 4,6 мм,

заполненную силикагелем С18 с диаметром частиц 5 мкм, диаметром пор 300 Ао. 10 мкг ИЛ-

36РА в 20 мкл раствора наносили на колонку в 50 мМ фосфатном буфере, рН 6,0. Элюцию

проводили градиентом ацетонитрила с 30 до 70% в 0,1% трифторуксусной кислоте (ТФУ), рН

2,5, за 20 минут при скорости потока 1,5 мл/мин и температуре +35 °С. Детектирование

проводили при длине волны 220 нм.

51

3.16.2. ОФ-ВЭЖХ для определения примеси непроцессированной и

окисленной форм ИЛ-36РА

Количественный анализ примеси непроцессированной метиониновой формы ИЛ-36РА

проводили при разделении пробы ИЛ-36РА методом ОФ-ВЭЖХ. Условия анализа были

аналогичны вышеописанным, отличие было только в том, что элюцию проводили градиентом

ацетонитрила с 39,6 до 40,8% в 0,1% ТФУ.

3.16.3. ОФ-ВЭЖХ для определения примеси Triton X-114

Количественный анализ примеси Triton X-114 в образцах ИЛ-36РА проводили методом

ОФ-ВЭЖХ на колонке DeltaPak C18 (Waters, США). 10 мкг ИЛ-36РА в 25 мкл раствора

наносили на колонку в 50 мМ фосфатном буфере, рН 6,0. Элюцию проводили 70%

ацетонитрилом в 0,1% ТФУ, рН 2,5, за 5 минут при скорости потока 1 мл/мин и температуре

+35 °С. Детектирование проводили при длине волны 220 нм. В качестве стандартного образца

для сравнения использовали 25 мкл 0,001% раствора Triton X-114 в 50 мМ фосфатном буфере,

рН 6,0. Количество Triton X-114 в образцах ИЛ-36РА определяли сравнением площадей пиков,

соответствующих Triton X-114, в стандартном и исследуемом образце.

3.16.4. ГП-ВЭЖХ для определения агрегатов ИЛ-36РА

Количественный анализ агрегатов в образцах ИЛ-36РА проводили методом ГПХ-ВЭЖХ

на колонке Superdex 75 10/30 GL (GE, США). Для этого 40 мкл образца ИЛ-36РА с

концентрацией 500 мкг/мл в 50 мМ фосфате натрия рН 6,5 с 0,2 М сульфата аммония.

Подвижной фазой служил такой же раствор. Скорость потока подвижной фазы составляла 0,75

мл/мин, время детекции 30 мин, температура колонки +20 °С. Детектирование проводили при

длине волны 220 нм. Время удержания пика неагрегированного ИЛ-36РА составляло около 20

мин.

3.17. Определение примеси дезамидированной формы ИЛ-36РА с помощью

капиллярного изоэлектрофокусирования

Анализ образов полученного нами ИЛ-36РА методом капиллярного электрофореза

проводился при участии Сергеевой Д.С., за что автор приносит свою искреннюю


Анализируемый образец обессоливали с помощью ультрафильтрационных спин-колонок

Amicon Ultra-0.5 (Merck-Millipore, США). Раствор образца помещали в колонку и

52

центрифугировали при 14000 g в течение 7 минут. Затем фильтрат удаляли, в колонку

добавляли раствор 20 мМ трис-буфера рН 8,0 до конечного объема 500 мкл и повторяли

центрифугирование. Замену буфера проводили дважды. Для приготовления пробы в пробирку

объемом 1,5 мл добавляли 100 мкл геля для кИЭФ, содержащего 3 М мочевину, 6 мкл

амфолитов Pharmalyte 3-10, 10 мкл катодного стабилизатора, 1 мкл анодного стабилизатора, по

0,5 мкл каждого пептидного маркера и 5 мкл обессоленного образца субстанции. Пробу

перемешивали и центрифугировали при 5000 g в течение 5 минут.

Для кИЭФ использовали аппарат Капель 105М (Люмэкс, Россия). Перед введением

пробы капилляр промывали раствором 4,3М мочевины (4 мин, 2000 мбар), затем

деионизованной водой (4 мин, 2000 мбар). Образцы вводили при давлении 2000 мбар в течение

2 минут с последующим погружением входного и выходного электрода в воду. Фокусировка

проводили раствором анолита (200 мМ фосфорная кислота) на входном конце и католита (300

мМ гидроксид натрия) на выходном конце капилляра при напряжении 25 кВ в течение 20

минут. Затем для химической мобилизации на выходе капилляра устанавливали пробирку с

химическим мобилизатором (350 мМ уксусная кислота) и подавали напряжение 25 кВ в течение

60 минут, после чего капилляр промывали деионизованной водой (5 мин, 2000 мбар). Во время

всех этапов осуществляли термостатирование капилляра при температуре +20 °С и детекцию на

длине волны 280 нм. На полученных во время этапа мобилизации электрофореграммах

отмечали пики, соответствующие пептидным маркерам и изоформам исследуемого белка.

Интегрирование пиков производили автоматически в программе Эльфоран (Люмэкс, Россия).

Расчет изоэлектрических точек изоформ осуществляли по уравнению зависимости

изоэлектрических точек пептидных маркеров от времени их миграции, полученному методом

линейной регрессии.

3.18. Динамическое светорассеяние

Эксперименты по динамическому светорассеянию в образцах фармацевтической

субстанции (ФС) ИЛ-36РА проводились на оборудовании лаборатории бионанотехнологии (зав.

М.В. Дубина) ГБОУ «Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого

(СПбПУ)», автор приносит искреннюю благодарность за предоставленную возможность.

Образцы фармацевтической субстанции ИЛ-36РА анализировали на аппарате Zetasizer

Nano (Malvern Instruments, Великобритания) в кювете Quartz SUPRASIL Precision cell (Hellma

Analytics, Германия). Объем образца составлял 100 мкл. Анализ проводили по следующей

53

программе: образец в кювете нагревался сначала до +20 °С, потом с шагом в 5 градусов

последовательно нагревался до +70 °С. Время уравновешивания температуры образца

составляло 60 секунд. В каждой точке проводилось измерение светорассеяния, при этом

проводилось 3 последовательных измерения, каждое из которых являлось усреднением 12

независимых измерений.

3.19. Статистическая обработка результатов

Количественные данные представлены как среднее арифметическое ± стандартное

отклонение (SD). Нормальность распределения определяли тестами Д’Агостино-Пирсона и

Шапиро-Уилка. Сравнение пар групп проводили с помощью t-теста Стьюдента. Сравнение

множества групп проводили с помощью теста Даннетта. Различия считали достоверными при р

< 0,05. Все анализы проводили с помощью программы Prism 6 (GraphPad Software, США).

54

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выполненная работа проводилась в рамках проекта лаборатории иммунофармакологии

ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» по разработке лекарственного средства на основе рекомбинантного

рецепторного антагониста интерлейкина-36 (ИЛ-36РА) человека для лечения псориаза. Главная

цель проведенного исследования состояла в разработке технологии получения

фармацевтической субстанции ИЛ-36РА и исследовании биологических и физико-химических

свойств этого белка.

4.1. Получение штамма-продуцента ИЛ-36РА, исследование биологических свойств

ИЛ-36РА

4.1.1. Получение штаммов-продуцентов безметионинового ИЛ-36РА на основе E.

coli BL21[DE3]

Поскольку ИЛ-36РА не имеет сайтов гликозилирования и другие цитокины семейства

ИЛ-1, структурно схожие с ИЛ-36РА, были успешно получены в прокариотических системах

экспрессии, рекомбинантный ИЛ-36РА получали в E. coli.[11].

Ранее во ФГУП «ГосНИИ ОЧБ» ФМБА России были получены бактериальные штаммы-

продуценты белков ИЛ-36γ и ИЛ-36РА человека, содержащих С-концевые гексагистидиновые

последовательности, что существенно облегчало процедуру их выделения с помощью

аффинной металл-хелатной хроматографии. Полученные из этих штаммов белки использовали

для изучения физико-химических свойств и анализа биологической активности различных

вариантов белков группы ИЛ-36. Однако применение в клинической практике рекомбинантных

белков, содержащих гексагистидиновые метки, часто осложнено их иммуногенностью. В связи

с этим мы получили новый штамм-продуцент ИЛ-36РА человека, E. coli BL21[DE3](pET-

IL36Raf), содержащий плазмиду pET-IL36Raf, несущую последовательность нативного

цитокина под контролем промотора фага Т7, и не несущий гексагистидиновый фрагмент.

Процесс получения плазмиды pET-IL36Raf состоял из следующих этапов:

последовательность гена ИЛ-36РА человека была оптимизирована по кодонному составу для

экспрессии в клетках E. coli с помощью программы JCat [50], химически синтезирована

(Евроген, Россия) и клонирована в вектор pET22b+ (Invitrogen, США) методом рестрикции-

лигирования. Схема плазмиды pET-IL36Raf приведена на Рисунок 6.

55

Рисунок 6. Схема плазмиды pET-IL36Raf.Lac I – Ген Lac-репрессора; Lac operon –

промотор Lac-оперона;T7 promotor – промотор гена 10 фагаТ7; IL-36Raf – генIL36RNчеловека

(кодирует ИЛ-36РА); T7 terminator – терминатор транскрипции РНК-полимеразы фага

Т7;Amp(R) – ген бета-лактамазы; pBR322 origin – ориджин репликации плазмиды pBR322; NdeI

и XhoI – сайты рестрикции, ограничивающие ген IL36RN.

Идентичность последовательности гена получаемого ИЛ-36РА человека природной

последовательности (UniGene, Ref Seq NM_012275.2) установили методом секвенирования

ДНК плазмиды. Идентичность аминокислотной последовательности полученного ИЛ-36РА

последовательности сравнения (UniProt Q9UBH0 [178]) была подтверждена методом MALDI-

TOF масс-спектрометрии. Покрытие последовательности ИЛ-36РА в результате МС-анализа

составило 69% (Рисунок 7). Достаточно низкая степень покрытия объясняется наличием в

последовательности ИЛ-36РА участка, лишенного сайтов протеолиза трипсина. Пептид,

образующийся из этого фрагмента ИЛ-36РА в результате гидролиза трипсином, слишком велик

для эффективного анализа. Однако полученных данных оказалось достаточно для

подтверждения идентичности белка. В дальнейшем основными критериями идентичности

получаемого ИЛ-36РА считали совпадение времен выхода в ОФ-ВЭЖХ пика образца и

стандартного образца, исследованного методом масс-спектрометрии, а также данных теста

биологической активности (см. далее).

p

ET-

IL36Raf

56

1 MVLSGALCFR MKDSALKVLY LHNNQLLAGG LHAGKVIKGE EISVVPNRWL

51 DASLSPVILG VQGGSQCLSC GVGQEPTLTL EPVNIMELYL GAKESKSFTF

101 YRRDMGLTSS FESAAYPGWF LCTVPEADQP VRLTQLPENG GWNAPITDFY

151 FQQCD

Рисунок 7. Последовательность рекомбинантного ИЛ-36РА человека, детектированные

методом масс-спектрометрии пептиды отмечены жирным красным.

Установлено, что ИЛ-36РА, получаемый от штамма-продуцента E.coli BL21[DE3](pET-

IL36Raf), содержит примесь непроцессированной формы с неотщеплённым N-концевым

инициаторным остатком метионина (далее - метиониновая форма). Был предложен и

апробирован метод количественного определения примеси этой формы с помощью ОФ-ВЭЖХ.

То, что этим методом определяется именно метиониновая форма ИЛ-36РА, подтверждено

обработкой образца ИЛ-36РА рекомбинантной метионинаминпептидазой 2 человеа (R&D

Systems, США) (Рисунок 8). После такой обработки образец становится гомогенным.

Рисунок 8. Наложение хроматограмм ОФ-ВЭЖХ разделения образца ИЛ-36РА от

продуцента E.coli BL21[DE3](pET-IL36Raf) до и после обработки in vitro

метионинаминопептидазой 2 (МАП2) человека (R&D Systems, США).

Недостаточно эффективное отщепление инициаторного остатка формилметионина с N-

конца – распространённая проблема для рекомбинантных белков, получаемых в бактериальных

57

продуцентах [57, 106, 169, 173]. В ряде случаев такие белки обладают существенно сниженной

биологической активностью [106, 169]. Эта проблема характерна и для ИЛ-36РА. Известно, что

метиониновая форма ИЛ-36РА обладает существенно меньшей биологической активностью,

чем его процессированная форма (11). В связи с этим возникла необходимость разработки

способа получения процессированного безметионинового ИЛ-36РА.

В E. coli отщепление инициаторного N-концевого остатка формилметионина требует

работы двух ферментов: деформилазы и метионинаминопептидазы (МАП). Первый фермент

отщепляет формильную группу, второй отщепляет остаток метионина [89, 124]. Процесс

деформилирования тесно связан с процессом трансляции, т.к. деформилаза связана с рибосомой

[104]. В литературе нам не удалось найти данных о том, чтобы недостаток активности

деформилазы служил ограничением продукции экзогенных рекомбинантных белков в E. coli. В

то же время представлено множество таких данных в отношении метионинаминопептидазы [57,

106, 169, 173].

Эффективность отщепления остатка метионина от продуцируемого белка

метионинаминопептидазой напрямую зависит от следующего за метионином аминокислотного

остатка [41, 162]. Процессинг идёт тем эффективнее, чем меньше боковой радикал второй

аминокислоты в цепи, и может быть существенно замедлен в случае аминокислот с большими

боковыми радикалами, таких как триптофан [12, 31, 162].

Это определяет принципиальную невозможность применения МАП к некоторым

объектам. В таких случаях решением проблемы становится введение сайта распознавания

какой-либо протеазы с N-конца получаемого белка и последующая обработка продукта этой

протеазой in vitro [120] или in vivo [107]. Метионин в таком случае отщепляется вместе с

несколькими аминокислотами, входящими в сайт распознавания протеазы.

Однако использование МАП представляется наиболее экономичным подходом. При

этом обработка продукта выделенной и очищенной МАП in vitro нежелательна, т.к.

значительно усложняет технологический процесс. Поэтому оптимальным вариантом является

коэкспрессия рекомбинантного белка с МАП. В этом случае система коэкспрессии требует

значительной оптимизации, т.к. продукция МАП сама по себе создаёт метаболическую

нагрузку на клетку, что понижает выход целевого продукта.

В качестве штамма-продуцента был выбран штамм E.coli BL21 Star [DE3] (Invitrogen,

США), для которого характерны возможность использования промоторов генов фага Т7 для

контроля экспрессии гена рекомбинантного белка, замедленная деградация мРНК внутри

58

клетки вследствие деактивации гена РНКазы Е (rne131) [51] и меньший шанс протеолитической

деградации продукта из-за деактивации протеаз lon и OmpT.

Для выбора оптимальных условий коэкспрессии генов ИЛ-36РА и МАП в клетках E.coli

BL21 Star[DE3] была создана серия штаммов-продуцентов ИЛ-36РА, трансформированных

двумя плазмидами: ранее созданной pET-IL36Raf и плазмидой, несущей ген МАП E.coli. Схема

с двумя плазмидами сделала возможным быстрое и простое тестирование разнообразных

условий коэкспресии. Кроме того, полученные плазмиды можно применять и для работы с

иными объектами.

Для сосуществования без конкуренции за средства репликации плазмиды должны

относиться к различным группам несовместимости, т.е. иметь различные ориджины

репликации, работающие по разным механизмам. Плазмида pET-IL36Raf содержит ориджин

репликации рМВ1. Поэтому за основу для вектора, несущего ген МАП, была взята плазмида

pACYC184, несущая ориджин репликации р15А.

Создана серия плазмид, несущих ген МАП под контролем промоторов различной силы:

T7/lac, активируемого ИПТГ или лактозой; rhaBAD, активируемого рамнозой; araBAD,

активируемого арабинозой. Плазмиды получили названия pET15A, pBAD15A и pRh15A,

соответственно (Рисунок 9,10,11). Далее ими и плазмидой pET-IL36Raf были

трансформированы бактерии штамма E.coli BL21 Star [DE3]. Штаммы получили названия E.coli

BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pET15A), E.coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) и E.coli

BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pRh15A), соответственно. Процесс создания плазмид, несущих ген

МАП, и штаммов-продуцентов изложен в разделе «Материалы и методы».

59

Рисунок 9. Схемы плазмиды pET15A. MAP – последовательность гена

метионинаминопептидазы E. coli; T7 promoter – промотор гена 10 фага Т7; T7 terminator –

терминатор транскрипции генов фага Т7; lacI – последовательность гена lacI, регулирующего

экспрессию генов, находящихся под контролем промотора T7; p15A origin – сайт начала

репликации плазмид; CamR – последовательность гена хлорамфениколацетилтрансферазы,

обеспечивающей устойчивость бактерий к хлорамфениколу; EcoRI, BamHI, HindIII, SalI –

рестрикционные сайты, необходимые для объединения отдельных фрагментов в векторе.

60

Рисунок 10. Схемы плазмиды pBAD15A. MAP – ген метионинаминопептидазы E. coli;

pBADara promoter – активируемый арабинозой промотор pBADara; rrnB T1T2 terminators –

терминаторы транскрипции гена rrnB E.coli; araBAD operon – регуляторная последовательность

araBAD оперона, необходимая для регуляции экспрессии генов, находящихся под контролем

промотора pBADara; p15A origin – сайт начала репликации плазмид; CamR –

последовательность гена хлорамфениколацетилтрансферазы, обеспечивающей устойчивость

бактерий к хлорамфениколу; SalI, HindIII, XhoI, NdeI – рестрикционные сайты, необходимые

для объединения отдельных фрагментов в векторе.

61

Рисунок 11. Схемы плазмиды pRh15A. MAP – ген метионинаминопептидазы E. coli;

rhaBAD promoter – активируемый рамнозой промотор rhaBAD; T7 terminator –терминатор

транскрипции генов фага Т7; rhaBAD operon – регуляторная последовательность rhaBAD

оперона, необходимая для регуляции экспрессии генов, находящихся под контролем промотора

rhaBAD; p15A origin – сайт начала репликации плазмид; CamR – последовательность гена

хлорамфениколацетилтрансферазы, обеспечивающей устойчивость бактерий к

хлорамфениколу; SalI, HindIII, XhoI, NdeI – рестрикционные сайты, необходимые для

объединения отдельных фрагментов в векторе.

Таким образом, были получены три штамма-продуцента безметионинового ИЛ-36РА.

Следующим этапом работы стала оптимизация условий индукции совместной экспресии генов,

кодирующих МАП и ИЛ-36РА.

4.1.2. Оптимизация условий индукции экспрессии гена ИЛ-36РА штаммами-

продуцентами безметионинового ИЛ-36РА

Ранее были установлены оптимальные условия синтеза ИЛ-36РА штаммом-продуцентом

E. coli BL21 [DE3] (pET-IL36Raf), а именно – доза индуктора (0,5 мМ IPTG) и

продолжительность индукции (3 часа). Основная доля целевого белка находилась в

цитоплазматической фракции. От этих значений отталкивались при выборе оптимальных

условий индукции параллельной экспрессии генов ИЛ-36РА и МАП двухплазмидными

62

штаммами. Для каждого из штаммов сначала определили оптимальную концентрацию

индуктора экспрессии гена МАП (Рисунок 12, 13, 14).

Так, для штамма с МАП под контролем активируемого рамнозой промотора при

электрофоретическом анализе лизатов биомассы наблюдали постепенное увеличение

интенсивности полосы, соответствующей по массе МАР, в зависимости от продолжительности

индукции (от 1 до 4 часов), однако существенных различий в зависимости от использованной

концентрации рамнозы выявлено не было (Рисунок 12). Таким образом, оптимальная

концентрация рамнозы составила 0,1%, а время индукции 2,5-3 часа – при этих условиях

продукция ИЛ-36РА была максимальна.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Рисунок 12. Электрофореграмма лизатов биомассы штамма E. coli BL21[DE3](pET-

IL36Raf)(pRh15A) после индукции экспресии гена МАП в различных условиях. Тонкой черной

стрелкой отмечена полоса, соответствующая по молекулярной массе МАР (31 кДа). Толстой

синей стрелкой отмечена полоса, соответствующая по молекулярной массе ИЛ-36РА (16,8

кДа).Дорожки: 1 – лизат культуры без индукции; 2 - маркеры молекулярных весов, кДа; 3, 4, 9 –

0,1% рамнозы; 5, 6, 10 – 0,25% рамнозы; 7, 8, 11 – 0,5% рамнозы; 3, 6, 8 – 1 час; 4, 5, 7 – 2,5

часа; 9, 10, 11 – 4 часа.

При электрофоретическом анализе лизатов биомассы штамма с МАП под контролем

активируемого ИПТГ промотора наблюдали значительное увеличение интенсивности полосы,

соответствующей по массе МАР, в зависимости от концентрации ИПТГ при стандартном

63

времени индукции 3 часа (Рисунок 13). Количество вырабатываемой МАП значительно

превосходило количество ИЛ-36РА. Это вполне объяснимо, т.к. МАП – эндогенный белок E.

coli, и, вероятно, и должен более эффективно нарабатываться бактериальной клеткой по

сравнению с продуктом чужеродного гена. При этом количество МАП не прирастало при

увеличении концентрации ИПТГ свыше 0,25 мМ. Количество ИЛ-36РА не увеличивалось при

увеличении концентрации ИПТГ свыше 0,5 мМ. Таким образом, оптимальная концентрация

ИПТГ составила 0,5 мМ.

1 2 3 4 кДа 5 6 7

Рисунок 13.Электрофореграмма лизатов биомассы штамма E. coli BL21[DE3](pET-

IL36Raf)(pET15A) после индукции экспресии гена МАП в различных условиях и штамма

сравнения. Тонкой черной стрелкой отмечена полоса, соответствующая по молекулярной массе

МАР (31 кДа). Толстой синей стрелкой отмечена полоса, соответствующая по молекулярной

массе ИЛ-36РА (16,8 кДа). Дорожки: 1 – лизат биомассы нетрансформированных E. coli

BL21[DE3]; 2 – лизат биомассы E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pET15A) без индукции; 3 –

лизат биомассы E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A), индукция 0,1 мМ ИПТГ; 4 –

индукция 0,25м МИПТГ; 5 – индукция 0,5 мМ ИПТГ; 6 – индукция 0,75мМ ИПТГ;7 – индукция

1мМ ИПТГ.

При электрофоретическом анализе лизатов биомассы штамма с МАП под контролем

активируемого арабинозой промотора наблюдали очень слабое увеличение интенсивности

полосы, соответствующей по массе МАР, в зависимости от концентрации арабинозы при

стандартном времени индукции 3 часа (Рисунок 14). Заметного прироста количества МАП

64

удалось достичь только при концентрации арабинозы 0,2%. Эту концентрацию выбрали в

качестве оптимальной для дальнейшего сравнения штаммов.

1 2 3 МВ, кДа 4 5 6

Рисунок 14.Электрофореграммализатовбиомассы штамма E. coli BL21[DE3](pET-

IL36Raf)(pBAD15A) после индукции экспресии гена МАП в различных условиях и двух

штаммов сравнения. Тонкой черной стрелкой отмечена полоса, соответствующая по

молекулярной массе МАР (31 кДа). Толстой синей стрелкой отмечена полоса, соответствующая

по молекулярной массе ИЛ-36РА (16,8 кДа). Дорожки: 1 – лизат биомассы

нетрансформированных E. coli BL21[DE3], 2 – лизат биомассы E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)

без плазмиды с pBAD15A, 3 – лизат биомассы E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) без

индукции, 4 – индукция 0,002% арабинозы, 5 – индукция 0,02% арабинозы, 6 – индукция 0,2%

арабинозы.

Для определения оптимального времени индукции экспрессии ИЛ-36РА и МАП для всех

штаммов тестировали время индукции 2 и 3 часа. Установили, что в случае всех штаммов

оптимальное время индукции 3 часа (Рисунок 15).

65

1 2 3 4 5 МВ, кДа 6 7 8 9

Рисунок 15. Электрофореграмма лизатов биомассы штаммов-продуцентов ИЛ-36РА

после индукции экспрессии генов ИЛ-36РА и МАП в течение 2 и 3 часов. Тонкой черной

стрелкой отмечена полоса, соответствующая по молекулярной массе МАР (31 кДа). Толстой

синей стрелкой отмечена полоса, соответствующая по молекулярной массе ИЛ-36РА (16,8 кДа).

Дорожки: 1 – лизат биомассы нетрансформированных E. coli BL21[DE3]; 2 –лизат биомассы E.

coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A), индукция 2 часа; 3 – лизат биомассы E. coli

BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A), индукция 3 часа; 4 – лизат биомассы E. coli

BL21[DE3](pET-IL36Raf), индукция 2 часа; 5 – лизат биомассы E. coli BL21[DE3](pET-

IL36Raf), индукция 3 часа; 6 – лизат биомассы E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pET15A),

индукция 2 часа; 7 – лизат биомассы E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pET15A), индукция 3

часа; 8 – лизат биомассы E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pRh15A), индукция 2 часа; 9 – лизат

биомассы E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pRh15A), индукция 3 часа.

Таким образом, были определены оптимальные условия культивирования полученных

штаммов-продуцентов безметионинового ИЛ-36РА в колбах. Для всех штаммов время

индукции составило 3 часа. Концентрации индукторов составили 0,5 мМ ИПТГ для всех

штаммов, а также дополнительно 0,2% арабинозы для штамма E. coli BL21[DE3](pET-

IL36Raf)(pBAD15A) и 100 мМ рамнозы для штамма E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pRh15A).

66

4.1.3. Выбор наиболее продуктивного штамма-продуцента безметионинового ИЛ-

36РА

Для сравнения эффективности отщепления N-концевого метионина от ИЛ-36РА и

продукции ИЛ-36РА штаммами, несущими плазмиду с геном МАП, и штаммом E.coli

BL21[DE3](pET-IL36Raf) без плазмиды с МАП провели серию культивирований в колбах. Из

полученных культур отбирали 3 оптических единицы плотности (ОЕ) культуры для

определения количества ИЛ-36РА методом ИФА. Продукцию ИЛ-36РА рассчитывали как

количество ИЛ-36РА на 1 л среды. Из получаемой бактериальной биомассы выделяли ИЛ-36РА

хроматографически в две стадии. Первой стадией была негативная анионообменная

хроматография на сорбенте Q Sepharose Fast Flow (GE, США), второй была гидрофобная

хроматография на сорбенте Toyopearl Butyl-650 S (Tosoh, Япония). Далее для ускоренного

выделения ИЛ-36РА при определении доли его непроцессиованной формы применяли

аффинную хроматографию на сорбенте с иммобилизованными моноклональными антителами к

этому белку.

В очищенном ИЛ-36РА примесь непроцессированной метиониновой формы определяли

с помощью ОФ-ВЭЖХ. Коэкспрессия с МАП приводила к уменьшению примеси

непроцессированной формы ИЛ-36РА. Все три штамма-продуцента, коэкспрессирующие гены

ИЛ-36РА и МАП, производили ИЛ-36РА, содержащий <3% непроцессированной формы

(Рисунок 16,17). Штамм-продуцент ИЛ-36РА, не несущий плазмиды с геном МАП, производил

ИЛ-36РА, содержащий в среднем 25,6% непроцессированной формы цитокина (Рисунок 16).

Продуктивность штамма E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) составила 186 мг

ИЛ-36РА на 1 л бактериальной культуры (18,6 мкг/ОЕ) и оказалась несколько выше, чем у

штаммов E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pET15A) и E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pRh15A),

однако отличие не было статистически достоверным (Рисунок 18). Достоверно ниже продукция

ИЛ-36РА только у штамма E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pRh15A) по сравнению с E. coli

BL21[DE3](pET-IL36Raf) (Рисунок 18). Причиной таких различий в продуктивности может

служить более низкая эффективность наработки МАП под контролем промотора araBAD, чем в

случае других использованных промоторов.

67

Рисунок 16. Сравнение количества непроцесированной формы ИЛ-36РА в препаратах

ИЛ-36РА, полученных от различных штаммов-продуцентов E. coli. 36RA – штамм,

трансформированный только плазмидой, несущей ген ИЛ-36РА; 36RA/MAP-ara, 36RA/MAP-

lac, 36RA/MAP-rha – штаммы, трансформированные плазмидой, несущей ген ИЛ-36РА, и

плазмидой, несущей ген МАП под контролем различных промоторов: ara (промотор araBAD),

rha (промотор rhaBAD), lac (промотор lac/T7). Иначе: 36RA/MAP-ara – E. coli BL21[DE3](pET-

IL36Raf)(pBAD15A), 36RA/MAP-lac – E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pET15A), 36RA/MAP-

rha – E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pRh15A). Звездочкой указана достоверность отличий при

P < 0,05 (t-критерий Стьюдента)

Рисунок 17. Наложение типичных ОФ-ВЭЖХ хроматограмм образцов ИЛ-36РА,

полученных при коэкспрессии с МАП (сплошная кривая) и без коэкспрессии с МАП

(пунктирная кривая).

68

Производительность штамма-продуцента E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf), не несущего

дополнительной кодирующей МАП плазмиды, была ещё выше и составляла 216 мг ИЛ-36РА на

1 л бактериальной культуры (или 21,6 мкг/ОЕ). Однако, отличие от штаммов E. coli

BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) и E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pET15A) также не было

статистически достоверным (Рисунок 18). Вероятно, дополнительная нагрузка на

бактериальную клетку в виде необходимости поддерживать ещё одну плазмиду и

синтезировать МАП приводит к снижению продукции ИЛ-36РА.

Рисунок 18. Сравнение продукции ИЛ-36РА различными штаммами-продуцентами E.

coli.36RA – штамм, трансформированный только плазмидой, несущей ген ИЛ-36РА;

36RA/MAP-ara, 36RA/MAP-lac, 36RA/MAP-rha – штаммы, трансформированные плазмидой,

несущей ген ИЛ-36РА, и плазмидой, несущей ген МАП под контролем различных промоторов:

ara (промотор araBAD), rha (промотор rhaBAD), lac (промотор lac/T7). Иначе: 36RA/MAP-ara

– E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A), 36RA/MAP-lac – E. coli BL21[DE3](pET-

IL36Raf)(pET15A), 36RA/MAP-rha – E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pRh15A). Звездочкой

указана достоверность отличий при P < 0.05 (t-критерий Стьюдента)

Существенным преимуществом полученной системы экспрессии безметионинового ИЛ-

36РА является отсутствие дополнительных технологических этапов, связанных с обработкой

МАП получаемого ИЛ-36РА после очистки. Самым существенным усложнением процесса

являлась бы необходимость постоянной параллельной наработки высокоочищенной МАП. К

тому же МАП является достаточно термолабильным ферментом, не подлежащим хранению в

69

течение более 1 года даже при - 70 °С. Кроме того, при масштабировании производства ИЛ-

36РА потребовалось бы симметричное масштабирование производства МАП и введение

дополнительных шагов в технологический процесс, связанных со сменой буфера в образце. По

этим причинам коэкспрессия генов ИЛ36РА и МАП – и, таким образом, обработка ИЛ-36РА

МАП in vivo – является более простым и экономичным способом получения безметионинового

ИЛ-36РА, даже с учётом некоторого снижения его продукции.

Разработанная система коэкспрессии ИЛ-36РА с МАП в достаточной мере универсальна

и может быть применена для получения и других рекомбинантных белков. Однако следует

иметь в виду также и ряд ограничений этой системы, возникающих, главным образом, из-за

природы самой МАП E. coli.Так, МАП обладает выраженной субстратной специфичностью: она

может эффективно удалять N-концевой остаток метионина белковой молекулы только в том

случае, когда следующий за ним аминокислотный остаток имеет радиус вращения своей

боковой цепи не более 0,143 нм, как, например, остаток глицина или аланина[12].

Таким образом, очень неудачным объектом для МАП является, например, интерферон

α2b человека, в молекуле которого есть замкнутая дисульфидная связь с остатком цистеина,

следующим сразу за инциаторным остатком метионина [146]. Тем не менее, остаток цистеина в

принципе имеет хиральный радиус бокового радикала, равный 1,22 ангстрем [76], т.е.

процессинг молекулы с помощью МАП возможен, пока дисульфидная связь не замкнута. Эта

ситуация вполне возможна в случаях, когда ИФН-α2b производится в клетке в растворимом

виде, а количество МАП в клетке достаточно для его своевременного процессинга, и когда

рефолдинг и обработка ИФН-α2b МАП проводятся in vitro.

Для обработки подобных сложных объектов получена модифицированная МАП с

несколькими заменами в аминокислотной последовательности, способная игнорировать эти

стерические ограничения[81]. Авторы утверждают, что примерно 85-90% известных белков

могут быть процессированы этой МАП. Однако авторы также отмечают, что

модифицированная МАП может отщеплять и следующий за остатком метионина

аминокислотный остаток, если третий остаток в цепи имеет боковую цепь небольшого радиуса

[81].

Другим вариантом обхода проблемы со специфичностью МАП по отношению к

изучаемому объекту могло бы стать использование другой N-концевой аминопептидазы,

способной отщеплять остаток метионина. Например, лейцин-аминопептидазы E. coli (белок

PepA) [14]. Однако нам не удалось найти в литературе примеров такого её применения.

70

Двухплазмидная система очень удобна тем, что её можно быстро адаптировать к любому

новому объекту, избегая дополнительных усилий с клонированием. Достаточно клонировать

ген белка интереса в одну экспрессионную плазмиду и затем котрансформировать штамм-

носитель ею и одной из плазмид, несущих ген МАП. Таким образом, полученную нами серию

плазмид с геном МАП под контролем различных промоторов можно использовать для быстрого

подбора оптимальных условий работы МАП на новых объектах.

4.1.4. Изучение биологической активности ИЛ-36РА

4.1.4.1. Сравнение биологической активности ИЛ-36РА от различных

штаммов-продуцентов

Для определения биологической активности полученных образцов ИЛ-36РА была

использована модельная система, основанная на использовании клеток аденокарциномы

легочного эпителия линии А-549, стабильно трансфицированной плазмидой, несущей ген

рецептора ИЛ-36 человека. Эти клетки способны дозозависимо отвечать выработкой ИЛ-8 на

обработку ИЛ-36, концентрация ИЛ-8 оценивается методом ИФА. ИЛ-36РА способен отменять

этот эффект.

Было проведено сравнение биологической активности образцов ИЛ-36РА, полученных

от штаммов-продуцентов E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A), E. coli BL21[DE3](pET-

IL36Raf)(pET15A), E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pRh15A) и E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf).

Для всех штаммов, кроме E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf), сравнивали активность ИЛ-36РА от

последовательных культивирований. В случае же E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf) примесь

непроцессированной формы ИЛ-36РА оказалась разной в образцах от разных культивирований,

поэтому был взят один образец ИЛ-36РА с 58% непроцессированной формы. В качестве

стандартного образца использовали коммерческий препарат рекомбинантного ИЛ-36РА

человека (1275-IL-025, R&D Systems, США).

Показано, что активность образцов ИЛ-36РА, полученных от всех штаммов с

коэкспрессией МАР, составляет 100%, тогда как образец ИЛ 36РА от штамма E. coli

BL21[DE3](pET-IL36Raf), не имеющего плазмиды с геном метионинаминопептидазы E. coli,

составляет 44% от активности стандартного образца (Рисунок 19, 20). Эти данные

соответствуют литературным данным о том, что непроцессированная форма ИЛ-36РА,

имеющая неотщеплённый N-концевой остаток метионина, не обладает биологической

активностью [134].

71

Рисунок 19. Продукция ИЛ-8 клетками линии А549+36R на фоне 10 нг/мл ИЛ-36g и

различных концентраций рекомбинантных ИЛ-36РА человека от различных штаммов-

продуцентов. Использовались следующие рабочие концентрации ИЛ-36РА (округлено до

целых чисел): 3000, 1000, 333, 111, 37, 12, 4, 0. 36RA – штамм, трансформированный только

плазмидой, несущей ген ИЛ-36РА; 36RA/MAP-ara – штамм, трансформированный плазмидой,

несущей ген ИЛ-36РА, и плазмидой, несущей ген МАП под контролем промотора araBAD.

Вертикальными планками отмечены стандартные отклонения (SD).

Рисунок 20. Биологическая активность ИЛ-36РА от различных штаммов-продуцентов E.

coli. 36RA – штамм, трансформированный только плазмидой, несущей ген ИЛ-36РА;

36RA/MAP-ara, 36RA/MAP-lac, 36RA/MAP-rha – штаммы, трансформированные плазмидой,

несущей ген ИЛ-36РА, и плазмидой, несущей ген МАП под контролем различных промоторов:

ara (промотор araBAD), rha (промотор rhaBAD), lac (промотор lac/T7); стандарт – коммерческий

ИЛ-36РА (1275-IL-025, R&DSystems, США). Биологическую активность всех образцов

сравнивали со стандартом; звездочка – достоверные отличия от стандарта, р< 0.05 (t-критерий

Стьюдента). Вертикальными планками отмечены стандартные отклонения (SD).

72

Для дальнейшего масштабного культивирования был выбран штамм E. coli

BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) как наиболее продуктивный и обеспечивающий

эффективный процессинг ИЛ-36РА.

4.1.4.2. Биологическая активность ИЛ-36РА в модели псориазоподобного

дерматита на мышах

Поскольку конечной целью проекта было создание лекарства от псориаза на основе ИЛ-

36РА требовалось подтверждение активности получаемого ИЛ-36РА в релевантных модельных

системах in vivo. Биологическую активность ИЛ-36РА in vivo определяли как способность

подавлять воспаление кожи в модели псориазоподобного дерматита на мышах. Работа с

животными проводилась сотрудниками лаборатории экспериментальной фармакологии и

токсикологии ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» под руководством Г.В. Александрова.

Для работы выбрали наиболее популярную в настоящее время модель

псориазоподобного дерматита на мышах с применением агониста Толл-подобных рецепторов 7

и 8 – имихимода [39, 78]. Содержащий имихимод крем Алдара наносили на кожу правого уха

мышей в дозе 62,5 мкг на мышь/сутки в течение 7 дней. В качестве контрольной группы

использовали интактных животных.

ИЛ-36РА вводили животным параллельно с нанесением препарата Алдара ежедневно в

дозах10 мкг/мышь (50 мкг/кг) и 50 мкг/мышь (250 мкг/кг) в 200 мкл стерильного забуференного

физиологического раствора (ЗФР) подкожно в область холки. Помимо контрольной группы в

каждом эксперименте была сформирована группа животных, получавших референсный

препарат – метотрексат, одобренный для клинического применения при терапии тяжелых форм

псориаза у человека. Метотрексат использовали в дозе 20 мкг/мышь, которую вводили

ежедневно внутрижелудочно через зонд в 300 мкл физиологического раствора. Эксперимент

повторяли дважды. В обоих экспериментах ежедневно проводили морфометрическое

исследование толщины уха и визуальную оценку поражения кожи в месте нанесения препарата

с последующим расчетом индекса PASI (Psoriasis Area and Severity Index, Индекс площади и

тяжести псориатического поражения) [73].

Анализ изменения индексов PASI, рассчитанных для всех групп животных в течение

эксперимента, показал, что степень выраженности псориазоподобного дерматита была

значительно снижена в группах, получавших изучаемый препарат рекомбинантного ИЛ-36РА

человека в дозах 50 и 10 мкг/мышь, а также метотрексат в дозе 20 мкг/мышь в сутки, по

73

сравнению с таковой в контрольной группе, начиная с 3-го дня и на протяжении всего

эксперимента (Рисунок 21, 22А). Морфометрическое исследование толщины уха показало, что

в группе, получавшей исследуемый препарат в дозе 50 мкг/мышь, индекс изменения толщины

уха был достоверно ниже по сравнению с контрольной группой, начиная с 3-го дня и до конца

эксперимента. В группе животных, получавших метотрексат, этот показатель достоверно

снижался только на 6-й и 7-й дни эксперимента (Рисунок 22Б).

А Б

Рисунок 21. Уши мышей дикого типа после пяти дней обработки индуктором Toll-like

рецепторов имихимидом на фоне введения подкожно в холку физиологического раствора (А) и

ИЛ-36РА (Б).

74

А

Б

Рисунок 22. А. Изменение индекса PASI в опытных и контрольной группах (*р<0,01 по

сравнению с соответствующими значениями контрольной группы). По оси ординат – степень

выраженности признаков псориазоподобного дерматита в баллах PASI. Б. Изменение толщины

уха в месте нанесения имихимода в опытных и контрольной группах (* р < 0,05 по сравнению с

соответствующими значениями контрольной группы). По оси ординат – индекс изменения

толщины уха в месте нанесения имихимода

Таким образом, проведенное исследование биологической активности полученных

образцов рекомбинантного ИЛ-36РА в модельных системах in vitro и in vivo подтвердило, что

75

она соответствует активности референс-препарата и что ИЛ-36РА может быть использован в

качестве активного фармацевтического ингредиента при создании нового лекарственного

средства для терапии псориаза.

4.1.5. Масштабирование культивирования штамма-продуцента безметионинового

ИЛ-36РА

Основной задачей данного этапа работы стало масштабирование процесса получения

ИЛ-36РА при культивировании штамма-продуцента в условиях автоматического ферментера с

сохранением физико-химических и биологических свойств получаемого белка.

Для дальнейшего использования был выбран штамм E. coli BL21[DE3](pET-

IL36Raf)(pBAD15A), как наиболее продуктивный.

В условиях 1-литрового сосуда биореактора «BIOFLO-110» (NewBrunswick, США) был

использован разработанный протокол культивирования ИЛ-36РА в колбах, оптимизированы

важнейшие параметры культивирования, такие как время культивирования, температура и

концентрации индукторов, а затем модифицированный протокол был апробирован на 10-

литровом сосуде биореактора.

Протокол культивирования штамма-продуцента ИЛ-36РА в колбах подразумевал засев в

6 колб вместимостью 2 л по 200 мл культуры в среде 1,5х LB, культивирование в качалке при

250 об/мин и температуре +37 °C до достижения оптической плотности 3,0±0,2 ОЕ, добавление

индукторов экспрессии генов ИЛ-36РА и (МАП), понижение температуры до +30 °C и

продолжение культивирования в течение ещё 3 часов.

Для культивации в 1-литровом сосуде были внесены следующие изменения: в среду 1,5х

LB была добавлена смесь солей М9, а также в процессе культивирования в биореактор вводили

питательную добавку, состоящую из гидролизата казеина и дрожжевого экстракта, что обычно

позволяет достичь большей плотности культуры. Культивирование вели при температуре +37

°C до исчерпания в среде глюкозы, что фиксировалось защелачиванием среды и резким

снижением потребления кислорода, вводили питательную добавку, затем снижали температуру

до +30 °С. После достижения указной температуры добавляли индукторы ИЛ-36РА и МАП.

Для отработки оптимального времени культивирование проводили в течение 5 часов с отбором

проб на анализ 1 раз в 15 минут.

76

Пробное культивирование показало, что количество наработанного белка не прирастает

после 3 часов культивирования (Рисунок 23). Полученный ИЛ-36РА содержал менее 5%

непроцессированной формы с неотщепленным N-концевым остатком метионина. При этом

содержание ИЛ-36РА в культуре составило 5 мкг/ОЕ культуры.

Рисунок 23. Общее количество продуцируемого культурой ИЛ-36РА в зависимости от

времени культивирования штамма-продуцента ИЛ-36РА E. coli BL21[DE3](pET-

IL36Raf)(pBAD15A). Эксперимент по отработке времени культивированияв 1-литровом

биореакторе - культивирование в течение 5 часов после индукции.

Культивирование штамма-продуцента без понижения температуры было опробировано в

следующей серии экспериментов. Отбор проб для оценки динамики наработки ИЛ-36РА

культурой проводили один раз в полчаса или час. Установлено,что пик наработки ИЛ-36РА

приходится на 2 часа после индукции, после чего количество белка падает, вероятно, в

результате потребления его самой культурой (Рисунок 24А). Таким образом, при такой схеме

культивирования оптимальное время индукции - 2 часа. Продуцируемый ИЛ-36РА содержал

менее 5% непроцессированной формы. Однако воспроизводимость данного результата

оказалась низкой. При последующих культивированиях по этой схеме момент начала падения

концентрации ИЛ-36РА мог быть сдвинут к началу культивирования, что приводило к

закономерному снижению выхода продукта (Рисунок 24Б). Поэтому была выбрана схема с

изменением температуры, как более надежная.

77

Рисунок 24. Общее количество продуцируемого культурой ИЛ-36РА в зависимости от


IL36Raf)(pBAD15A). Эксперименты по отработке времени культивированияв 1-литровом

биореаторе без понижения температуры: А – культивирование в течение 3 часов после

индукции, Б – культивирование в течение 2 часов после индукции.

Учитывая, что прежде при отработке условий культивирования в колбах были

подобраны минимальные эффективные концентрации индукторов, а при всех

культивированиях в 1-литровом биореакторе ИЛ-36РА нарабатывался вполне эффективно и

содержал менее 5% непроцессированной формы, концентрации индукторов было решено не

менять.

Разработанный протокол культивирования штамма-продуцента ИЛ-36РА в 1-литровом

биореакторе был опробован в условиях 10-литрового биореактора. Динамика роста культуры и

наработки ИЛ-36РА в целом были аналогичны культивированию в малом сосуде биореактора.

Из-за того, что в 10-литровом сосуде удалось доращивать культуру до большей плотности,

наблюдалось увеличение продукции ИЛ-36РА (Рисунок 25). Однако продукция ИЛ-36РА

отдельной бактериальной клеткой сохранялась примерно на том же уровне и составляла в

среднем 6 мкг/ОЕ.

78

Рисунок 25.Общее количество продуцируемого культурой ИЛ-36РА в зависимости от


IL36Raf)(pBAD15A) в 10-литровом биореаторе. Средние значения от трёх последовательных

культивирований, вертикальные планки обозначают SD.

При первых культивированиях не удавалось добиться эффективной работы МАП –

получаемый ИЛ-36РА содержал 30-50% непроцессированной формы. Эффективность

наработки ИЛ-36РА не изменялась. Внесение дополнительных 0,8 г/л арабинозы 1 раз в час

позволило снизить содержание непроцессированной формы в получаемом ИЛ-36РА до 5%.

Таким образом, разработан протокол культивирования штамма-продуцента ИЛ-36РА в

условиях биореактора «BIOFLO-110» (NewBrunswick, США) и проведено масштабирование

культивирования в реакторе в 10 раз. При этом была отмечена способность культуры большего

объема метаболизировать арабинозу. Вероятно, это связано тем, что в культуре большего

объема могут быстрее отбираться клетки с такими метаболическими особенностями. При

переходе к культивированию штамма-продуцента ИЛ-36РА в биореакторах объёмом 10 л мы

получили возможность нарабатывать в 30-50 раз больше ИЛ-36РА, по сравнению с

культивированием в серии колб.

Следующим шагом было культивирование штамма-продуцента в масштабах пилотного

производства в биореакторе объёмом 250 л (рабочий объём культуры 160 л) на базе Института

Биохимии и Физиологии Микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук

(ИБФМ РАН) под руководством Самойленко В.А.. Был применен разработанный протокол

культивирования, за исключением того, что сразу была использована 2-кратная среда LB без

последующей питательной добавки. В этом случае был получен ИЛ-36РА с требуемыми

характеристиками и в 14-18 раз больших количествах, чем в 10 л биореакторе.

79

4.2. Разработка методики хроматографической очистки ИЛ-36РА, исследование

физико-химических свойств ИЛ-36РА

Хроматографическая очистка ИЛ-36РА была необходима на всех этапах работы от

начальных его этапов до конечных, где ИЛ-36РА необходимо было получать в качестве и

количестве, необходимом для проведения доклинических испытаний его активности и

токсичности как лекарственного препарата. Требования к качеству препарата, масштабы

наработки и технические ограничения по мере развития проекта нарастали последовательно.

Соответственно последовательно изменялась технология хроматографической очистки ИЛ-

36РА. Данный раздел описывает и объясняет эти последовательные изменения.

4.2.1. Хроматографическая очистка ИЛ-36РА в исследовательском масштабе,

исследование физико-химических свойств ИЛ-36РА

4.2.1.1. Отработка условий лизиса биомассы штамма-продуцента в

лабораторном масштабе

На начальном этапе проекта штамм-продуцент культивировали в нескольких колбах.

Совокупный выход биомассы от одного культивирования составлял в среднем 5,2 г. Поскольку

рекомбинантный ИЛ-36РА нарабатывается в клетках штамма-продуцента в растворимом виде,

был осуществлен подбор условий лизиса биомассы количестве 5 г, обеспечивающих

наибольший выход белка в растворимой фракции. Помимо трехкратного замораживания-

размораживания добавляли бета-меркаптоэтанол до 0,1% или обрабатывали лизат

ультразвуком, который генерировали дезинтегратором VCX500 (Sonics, США). Содержание

ИЛ-36РА в тотальном лизате, а также в его растворимой и нерастворимой фракцях оценивали с

помощью электрофореза в ПААГ.

Основная доля целевого белка с молекулярной массой около 18 кДа содержится в

растворимой фракции (Рисунок 26). Обработка ультразвуком существенно увеличивала выход

примесных белков, но не влияла на выход ИЛ-36РА.Поскольку добавление бета-

меркаптоэтанола не влияло на содержание ИЛ-36РА в лизате (Рисунок 26) и могло привести к

восстановлению дисульфидных связей в ИЛ-36РА, от его применения при лизисе биомассы

решили отказаться.

80

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 МВ, кДа

Рисунок 26. Электрофореграмма лизатов биомассы штамма-продуцента ИЛ-36РА

человека E.coli BL21[DE3](pET-IL36Raf). Дорожки: 1-4 – тотальные лизаты, 5-8 –

нерастворимая фракция, 9-12 – растворимая фракция; 2, 4, 6, 8, 10, 12 – дополнительная

обработка ультразвуком; 3, 4, 7, 8, 11, 12 – добавление 0,1% бета-меркаптоэтанола.

Таким образом, оптимальным методом лизиса биомассы штамма-продуцента на этом

этапе оказалось трехкратное замораживание-размораживание и осветление с помощью

центрифугирования.

4.2.1.2. Хроматографическая очистка ИЛ-36РА в лабораторном масштабе

Метод хроматографической очистки ИЛ-36РА подбирали, исходя из рассчитанных in

silico физико-химических свойств (Рисунок 27). В качестве первого шага очистки выбрали

анионообменную хроматографию с сорбцией белка на сорбент при рН 8,0.

81

Рисунок 27. Кривая титрования ИЛ-36РА. Рассчитана с помощьюThe Sequence Analyzer

(Proteinchemist.com, США).

Проведено сравнение двух анионообменных сорбентов – DEAE Sepharose Fast Flow (GE,

США) и Q Sepharose Fast Flow (GE, США). Колонки с сорбентами уравновешивали 10

объемами буферного раствора 50 мМ Tris-HCl, pH 8,0 (он же сорбционный, лизирующий и

отмывающий буфер), наносили образец и отмывали колонку тем же буферным раствором до

достижения базовой линии кривой поглощения ультрафиолета при длине волны 280 нм.

Элюцию ИЛ-36РА проводили градиентом NaCl от 0 до 500 мМ в том же буферном растворе за

30 объёмов колонки. Сбор пиков проводили вручную.

В обоих случаях ИЛ-36РА элюировался в ответ на 0,10-0,15 М NaCl. При этом чистота

полученного препарата составляла около 50% после очистки на DEAE (Рисунок 28) и около

60% после очистки на Q (Рисунок 29).

82

1 2 3 4 5 6 7 МВ, кДа

Рисунок 28.Электрофореграмма фракций, полученных после хроматографической

очистки ИЛ-36РА из лизата биомассы штамма-продуцента на сорбенте DEAE Sepharose Fast

Flow (GE, США). Дорожки: 1 – исходный лизат, 2 – несвязавшаяся фракция, 3 – пик 1 (0-0,2 М

NaCl), 4 – пик 2 (0,20-0,35 М NaCl), 5 – пик 3 (0,35-0,50 М NaCl), 6–регенерация 0,2 М NaOH, 7

– промывка 20% этанолом.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 МВ, кДа

Рисунок 29.Электрофореграмма фракций, полученных после хроматографической

очистки ИЛ-36РА из лизата биомассы штамма-продуцента на сорбенте Q Sepharose Fast Flow

(GE, США). Дорожки: 1 – исходный лизат, 2 – несвязавшаяся фракция, 3-7 – отмывка

отмывочным буфером, 8 – пик 1 (0-0,2 М NaCl), 9 – пик 2 (0,20-0,35 М NaCl), 10 – пик 3 (0,35-

0,50 М NaCl).

83

Для дальнейшей очистки ИЛ-36РА использовали гидрофобную хроматографию на

сорбенте Butyl-650 S. К ИЛ-36РА-содержащему элюату с Q Sepharose Fast Flow добавляли

кристаллический сульфат аммония до 300 мМ и перемешивали до растворения. Полученный

раствор наносили на колонку с Butyl-650 S, уравновешенную 50 мМ натрий-фосфатным

буфером с 300 мМ сульфата аммония, pH 6,5 и промывали колонку 50 мМ натрий-фосфатным

буфером с 50 мМ сульфата аммония, pH 6,5. Элюцию проводили градиентом отмывочного

буфера и воды. На электрофореграмме собранных фракций элюата в области, соответствующей

ИЛ-36РА, виден второй бенд (Рисунок 30).

МВ, кДа 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 13

Рисунок 30. Электрофореграмма фракций, полученных после хроматографической

очистки ИЛ-36РА на сорбенте Butyl-650S. Дорожки: 1 – исходный образец (элюат с Q

Sephararose Fast Flow), 2 – несвязавшаяся фракция, 3– отмывка отмывочным буфером, 4-13–

последовательно собранные фракции элюата.

Полученные фракции ИЛ-36А были объединены и проанализированы методом ОФ-

ВЭЖХ. Анализ показал, что образец содержит высоочищенный ИЛ-36РА (Рисунок 31). Это

позволило предположить, что второй бенд, на элетрофореграмме - это модифицированная или

подвергшейся частичному протеолизу форма ИЛ-36РА.

116

66

45

35

25

18

14

84

Рисунок 31. ОФ-ВЭЖХ хроматограмма ИЛ-36РА после хроматографической очистки на

сорбенте Butyl-650S (Tosoh, Япония).

Также был отработан процесс ультрафильтрационного концентрирования ИЛ-36РА с

использованием ячейки Amicon 8200 (Merck-Millipore, США) с мембраной Ultracel PL-10

(Merck-Millipore, США). Процесс шёл без потерь до достижения концентрации белка 15 мг/мл,

после чего начиналась агрегация ИЛ-36РА. Эта стадия технологического цикла получения ИЛ-

36РА в дальнейшем не претерпела никаких существенных изменений.

Таким образом, разработан метод неаффинной хроматографической очистки ИЛ-36РА из

лизата биомассы штамма-продуцента с применением анионообменной хроматографии на

сорбенте Q Sepharose Fast Flow (GE, США) и гидрофобной хроматографии на сорбенте Butyl-

650S (Tosoh, Япония).

4.2.1.3. Изучение гетерогенности ИЛ-36РА

Как указывалось выше, на электрофореграмме фракций, полученных при элюции ИЛ-

36РА с сорбента Butyl-650S, наблюдается наличие второго бенда в области, соответствующей

ИЛ-36РА. Для установления природы примесного продукта полученный образец ИЛ-36РА

разделили электрофоретически в полиакриламидном геле высокой плотности в

восстанавливающих и невосстанавливающих условиях (Рисунок 32), а затем анализировали

85

методом вестерн-блота с моноклональными антителами к ИЛ-36РА человека (1275-IL, R&D

Sysytems, США) (Рисунок 33).

1 2 МВ, кДа 3 4

Рисунок 32. Электрофореграмма элюата после хроматографической очистки ИЛ-36РА на

сорбенте Butyl-650 S в невосстанавливающих (дорожки 1,2) и восстанавливающих (дорожки

3,4) условиях. На дорожки 2 и 4 нанесено вдвое большее количество образца.

1 2 МВ, кДа 3 4

Рисунок 33. Вестерн-блот анализ с моноклональными антителами к ИЛ-36РА человека

(1275-IL, R&D Sysytems, США) элюата после хроматографической очистки ИЛ-36РА на

сорбенте Butyl-650 S в невосстанавливающих (дорожки 3,4) и восстанавливающих (дорожки

1,2) условиях. На дорожки 1 и 3 нанесено вдвое большее количество образца.

Обе полосы специфически реагировали с моноклональными антителами к ИЛ-36РА в

вестерн-блоттинге (Рисунок 33), что указывает на наличие общих антигенных эпитопов в

86

структуре белков и позволяет сделать вывод, что оба белка – это некие формы ИЛ-36РА.В

невосстанавливающих условиях исследованный образец представлен четкой мажорной полосой

с кажущейся молекулярной массой около 14 кДа и минорной полосой около 30 кДа (Рисунок

32). Последняя, по-видимому, представляет собой димер, образовавшийся при участии

дисульфидных связей, поскольку исчезает при добавлении меркаптоэтанола.

По данным гель-проникающей ВЭЖХ (Рисунок 34) в исследованном образце следы

димера отсутствуют. Поэтому образование димера, вероятнее всего, происходит при

пробоподготовке образца перед внесением в ПААГ. Образование таких димеров ИЛ-36РА при

нагревании весьма вероятно, поскольку в молекуле ИЛ-36РАприсутствует 5 остатков цистеина

и, значит, есть, по меньшей мере, один неспаренный.

Рисунок 34. Хроматограмма элюата после очистки ИЛ-36РА насорбентеButyl-650S,

полученная методом гель-проникающей ВЭЖХ.

Для проверки гипотезы о том, не является ли одна из полос результатом частичного

протеолиза ИЛ-36РА обе полосы были вырезаны из геля (Рисунок 35), белки из них были

экстрагированы и подвергнуты триптическому гидролизу. Затем триптические лизаты были

проанализировали с помощью ВЭЖХ-МС-МС (Рисунок 36).

МВ, кДа 1

Рисунок 35. Электрофореграмма элюата (1) после хроматографической очистки ИЛ-

36РА на сорбенте Butyl-650 S.

87

Идентификация полученных пептидов показала, что обе полосы представляют собой

ИЛ-36РА человека. Степень покрытия для обеих полос была очень высокой (93% для

«верхней» и 81% для «нижней» полосы) и в обеих полосах были четко идентифицированы N- и

C-концевые фрагменты (Рисунок 36), причем они были полноразмерными. Следовательно, ни

одна из полос не является результатом частичного протеолиза ИЛ-36РА.

1 MVLSGALCFRMKDSALKVLYLHNNQLLAGGLHAGKVIKGEEISVVPNRWL

51 DASLSPVILGVQGGSQCLSCGVGQEPTLTLEPVNIMELYLGAKESKSFTF

101 YRRDMGLTSSFESAAYPGWFLCTVPEADQPVRLTQLPENGGWNAPITDFY

151 FQQCD

Рисунок 36. Перекрытие с референсной последовательностью (UniProt Q9UBH0 [178])

аминокислотных последовательностей полученных при ВЭЖХ-МС-МС анализе триптических

лизатов образцов ИЛ-36РА человека. Желтым - последовательности, соответствующие

верхнему бенду; Голубым – нижнему; Зеленым – обоим. Подчеркнут остаток аспарагина в 139

положении.

Возможным объяснением отличия между двумя исследуемыми формами ИЛ-36РА

является наличие каких-либо пост-трансляционных модификаций входящих в их состав

аминокислотных остатков. Наиболее распространёнными модификациями первичной

структуры белков, происходящими при их выделении, являются окисление, в первую очередь,

остатков метионина и цистеина [159] и дезамидирование остатков аспарагина и глутамина [99].

Кроме того, небольшое расхождение масс полученных пептидов, соответствующих С-

концевому фрагменту молекулы ИЛ-36РА, с теоретическими значениями, наблюдаемое в ряде

случаев, позволило предположить именно дезамидирование аспарагина.

Дезамидирование аспарагина происходит через образование сукцинимидного

производного, которое в основных условиях гидролизуется с образованием аспарагиновой и

изоаспарагиновой кислот. При этом в молекуле полипептида возникает дополнительный

отрицательный заряд, что снижает его изоточку примерно на 0,2 единицы.

88

Для выяснения причин гетерогенности ИЛ-36РА были проведены эксперименты, в

которых эти модификации вызывали целенаправленно с помощью обработки раствора белка

перекисью водорода для окисления или с помощью нагревания при рН 9,0 для

дезамидирования. Полученные образцы анализировали с помощью ОФ-ВЭЖХ и капиллярного

изоэлектрофокусирования (кИЭФ).

После инкубации ИЛ-36РА с 0,03% перекисью водорода при ОФ-ВЭЖХ анализе

выявлялось исчезновение основного пика с временем удержания около 10,5 минут, появление

пика с временем удержания около 7 минут (обозначен ** на Рисунке 37), отсутствовавшего в

неокисленном исходном препарате, а также увеличение площади пика с временем удержания

чуть менее 10 минут, присутствовавшего в исходном препарате в виде минорной примеси

(обозначен * на Рисунке 37) и, вероятно, соответствующего слабо-окисленной форме белка.

При инкубации с 0,3% перекисью водорода исчезал и пик слабо-окисленной формы и весь

материал оказался представленным пиком с временем удержания около 7 минут (Рисунок 37).

Рисунок 37. Наложение ОФ-ВЭЖХ хроматограмм образцов ИЛ-36РА: необработанного

и обработанных перекисью водорода при различных условиях. * - окисленная форма ИЛ-36РА,

** - более сильно окисленная форма ИЛ-36РА.

ОФ-ВЭЖХ анализ дезамидированного ИЛ-36РА выявил отсутствие изменения времени

удерживания модифицированного белка по сравнению с исходным (Рисунок 38). По-видимому,

метод ОФ-ВЭЖХ в использованных условиях не пригоден для определения наличия

дезамидированных форм ИЛ-36РА.

89

Рисунок 38. Наложение ОФ-ВЭЖХ хроматограмм образцов ИЛ-36РА: до и после

искусственного дезамидирования.

Капиллярное изофокусирование оказалось лучшим методом анализа дезамидирования

ИЛ-36РА. Если исходный образец содержал примерно одинаковые количества изоформ с pI

5,23 и 5,05 (Рисунок 39), то после искусственного дезамидирования с помощью нагревания в

щелочных условиях доля формы с pI 5,05 резко возросла, а формы с pI 5,23 резко упала

(Рисунок 39), что однозначно позволило идентифицировать форму с pI около 5,05 как

дезамидированную. Предположительный сайт дезамидирования был выявлен при анализе

последовательности программой NGOME[165] – это остаток аспарагина в 139 положении

(Рисунок 36).

Кроме того, кИЭФ оказалось пригодным и для анализа окисленных форм ИЛ-36РА.

кИЭФ-анализ окисленного белка показал, что в образце резко увеличивается доля исходно

минорных форм с pI примерно на 0,05 единиц выше, чем у нативного и дезамидированного

белка (Рисунок 39). Таким образом, как нативный, так и дезамидированный белок могут быть

окислены, что сопровождается небольшим, но достаточно хорошо детектируемым увеличением

их изоэлектрической точки.

Проведенные эксперименты позволили, во-первых, определить причину возникновения

гетерогенности ИЛ-36РА по изоэлектрической точке (дезамидирование); во-вторых, установить

природу минорного пика на ОФ-ФЭЖХ с временем удержания примерно на 1 минуту меньше,

чем у основного пика (окисленная форма ИЛ-36РА); в третьих, определить аналитические

подходы к контролю дезамидирования и окисления ИЛ-36РА.

90

Рисунок 39. Наложение результатов капиллярного изоэлектрофокусирования образцов

ИЛ-36РА без обработки, после обработки перекисью водорода и после искусственного

дезамидирования. Пик pI 5,23 соответствует нативной форме ИЛ-36РА, пик pI 5,06 –

дезамидированной.* – пик, соответствующий окисленной форме ИЛ-36РА, ** - пик,

соответствующий окисленной и дезамидированной форме ИЛ-36РА.

Содержание дезамидированной формы существенно вырастает при хранении образца

ИЛ-36РА в фосфатно-солевом буфере (PBS), рН 7,4 при температуре 4-8 °С в течение 3 месяцев

(Рисунок 40).


ИЛ-36РА: до и после хранения в течение 3 месяцев в фосфатно-солевом буфере (PBS), рН

7,4.Пик pI 5,23 соответствует нативной форме ИЛ-36РА, пик pI 5,06 – дезамидированной.

91

Поскольку основным фактором, определяющим спонтанное дезамидирование остатков

аспарагина в составе белковой молекулы, является рН [99], для минимизации влияния

основных рН изменили схему очистки ИЛ-36РА. Ранее ИЛ-36РА сорбировали на Q Sepharose

Fast Flow (GE, США) при рН 8,0. Значение рН буфера, в котором белок наносили на колонку,

было снижено до 7,0. При этих условиях ИЛ-36РА не сорбировался и оставался в

несвязавшейся фракции (Рисунок 41). Однако, большая часть ДНК и ЛПС по прежнему сильно

связывалась с сорбентом и успешно удалялась в процессе очистки.

Параллельно была проведена очистка ИЛ-36РА на том же сорбенте при рН 9,0. В этом

случае ИЛ-36РА иммобилизовался на сорбенте. После завершения очистки в обоих полученных

образцах было определено содержание дезамидированной формы ИЛ-36РА (Рисунок 42). ИЛ-

36РА, выделенный при рН 9,0, содержал 19% дезамидированной формы, в отличие от

выделенного при рН 7,0.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 МВ, кДа


очистки ИЛ-36РА из лизата биомассы штамма-продуцента на сорбенте Q Sepharose Fast Flow

(GE, США), сорбция и элюция при рН 7,0. Дорожки: 1 – исходный лизат, 2-4 – несвязавшаяся

фракция, содержащая ИЛ-36РА, 5-7 – отмывка отмывочным буфером, 8-11 – отмывка

отмывочным буфером с 0,2 М NaCl, 12-13 – отмывка отмывочным буфером с 2 М NaCl.

92


ИЛ-36РА, выделенных с помощью сорбента Q Sepharose Fast Flow (GE, США) при рН 9,0

(пунктирная линия) и 7,0 (сплошная линия). Пик pI 5,23 соответствует нативной форме ИЛ-

36РА, а пик pI 5,06 – дезамидированной.

Таким образом, установлено, что для дезамидирования ИЛ-36РА достаточно даже

кратковременного (несколько часов) воздействия значений рН больше 7,0. Дальнейшую

очистку ИЛ-36РА проводили с использованием негативной анионообменной хроматографии на

сорбенте Q Sepharose Fast Flow (GE, США) с сорбцией при рН 7,0.

Благодаря тому, что стало возможным выделять нативный недезамидированный ИЛ-

36РА, выяснилась причина появления второго бенда при электрофоретическом разделении ИЛ-

36РА. Этот менее мобильный («верхний») бенд соответствовал дезамидированной форме ИЛ-

36РА (Рисунок 43).

1 2 3 МВ, кДа

Рисунок 43. Электрофореграмма образцов ИЛ-36РА, содержащих разное количество

примеси дезамидированной формы белка: 1 – 1,3%, 2 – 5%, 3 – 43%.

93

Таким образом, электрофорез в ПААГ может быть использован для ориентировочного

контроля содержания дезамидированной формы ИЛ-36РА на разных этапах производственного

процесса. Для количественного анализа дезамидирования этот метод непригоден, поскольку

пробоподготовка белка перед проведением электрофореза, включающая нагрев в щелочном

буфере, может индуцировать дезамидирование.

Дезамидирование ИЛ-36РА не влияло на его биологическую активность: белок,

содержащий около 1% дезамидированной формы, имел такую же активность, как ИЛ-36РА,

дезамидированный более чем на 40%. Вероятно, дезамидирование Asn-139 не влияет на

взаимодействие ИЛ-36РА с рецептором.

Несмотря на то, что дезамидированиеAsn-139 в молекуле ИЛ-36РА не влияет напрямую

на биологическую активность, оно всё же является нежелательной модификацией, которой

следует избегать. Показано, что дезамидирование остатков аспарагина, как правило,

дестабилизирует пространственную структуру белка [140] и особенно ярко это проявляется при

хранении препаратов.

4.2.1.4. Оптимизация условий хранения ИЛ-36РА

Поскольку лиофильное высушивание белков часто провоцирует окисление и агрегацию

белка, в том числе, за счет образования межмолекулярных дисульфидных связей [147],

фармацевтическую субстанцию ИЛ-36РА приготовили в виде раствора. В ходе проведенных

экспериментов были оптимизированы такие параметры, как рН раствора и концентрация

активного фармацевтического ингредиента.

При снижении рН раствора белка ниже 5,5 наблюдалась интенсивная агрегация белка,

что было ожидаемо ввиду того, что изоэлектрическая точка ИЛ-36РА составляет 5,2. Признаки

агрегации не наблюдались при хранении ИЛ-36РА в водно-солевых буферах при рН 7,4 в

концентрации менее 10 мг/мл в течение нескольких месяцев, однако при повышении

концентрации белка выше 15 мг/мл происходила интенсивная агрегация с выпадением в осадок

основной части рекомбинантного ИЛ-36РА. Также при хранении ИЛ-36РА при рН 7,4

происходило его дезамидирование.

Согласно литературным данным на процесс дезамидирования влияют рН раствора,

содержание солей и ионов двухвалентных металлов [99, 141, 147][141]. Поэтому нами был

осуществлен подбор вариантов растворов с низкими значениями рН, минимальной

концентрацией солей и ионов металлов.

94

Учитывая, что в растворах с рН близким к значениям pI растворенных в них белков

часто происходит агрегация последних, и что при рН > 7,0 ИЛ-36-РА склонен к

дезамидированию, в качестве оптимального для хранения диапазона рН был выбран 6,0 – 6,5. В

этой области рН в качестве буферов для фармацевтических композиций чаще всего

используются фосфатный и цитратный буферы. Однако, цитратный буфер более пригоден для

поддержания стабильного значения рН в этой области, чем фосфатный, поэтому в качестве

базовой буферной системы был выбран 50 мМ цитратный буфер без добавления других солей

для сохранения слабой гипоосмолярности.

В качестве второго стабилизирующего компонента для ФС рассматривался неионный

детергент полисорбат-80 (Tween-80). Наряду с полисорбатом-20 (Tween-20), это соединение

является одним из наиболее широко используемых вспомогательных веществ в композициях

биофармацевтических препаратов. Полисорбаты представляют собой смесь близких по

структуре эфиров жирных кислот полиоксиэтилен-сорбитангидрида. Основными жирными

кислотами являются лауриновая и олеиновая, составляющие до 60% остатков [65].

Главным назначение полисорбатов в растворах ФС и ГЛФ является предотвращение

адсорбции рекомбинантных белков из растворов низких концентраций на стенки первичной

упаковки. Для субстанции ИЛ-36РА, где концентрация белка составляет 10 мг/мл, эта проблема

практически неактуальна, поскольку потери из-за адсорбции могут составлять лишь доли

процента. Другое назначение полисорбата, особенно в концентрированных растворах белков –

предотвращение аггрегации белка. Механизм этого действия полисорбатов связан с блокадой

гидрофобных взаимодействий между отдельными молекулами полипептидов, а также между

белком и поверхностью первичной упаковки [147]. Это особенно важно для гидрофобных

белков, таких как ИЛ-36РА.

Однако известно, что высокие концентрации полисорбата могут провоцировать

агрегацию некоторых белков при повышенных температурах [144]. В связи с этим для ФС ИЛ-

36РА изучали стабильность при добавлении полисорбата-80 в диапазоне концентраций от

0,01% до 0,1%.

Третьим компонентом, который был введен в состав ФС ИЛ-36РА, стал ЭДТА. Являясь

хелатором ионов двухвалентных металлов, ЭДТА частично блокирует реакции окисления

рекомбинантных белков. Натриевая соль ЭДТА добавляется в состав жидких форм ФС обычно

в стандартной концентрации 1 мМ [147].

Были приготовлены растворы ИЛ-36РА трех составов:

95

1. 50 мМ цитратный буфер (рН 6,0).

2. 50 мМ цитратный буфер (рН 6,0), полисорбат-80 (0,1%)

3. 50 мМ цитратный буфер (рН 6,0), полисорбат-80 (0,1%), эдетат натрия 1 мМ.

Было изготовлено три опытных партии ФС ИЛ-36РА с концентрацией ИЛ-36РА 10 мг/мл

с вариантами состава раствора, как описано выше.

Для предварительного анализа стабильности проведено изучение термостабильности

ФС в исследуемых композициях методом динамического светорассеяния (ДСР). Метод основан

на измерении размера частиц в растворе при последовательном нагреве образца. Поскольку

наиболее критическим параметром для предотвращения агрегации ИЛ-36РА представлялось

наличие 0,1% полисорбата-80, сравнивали образцы ФС, имеющие его в своём составе и не

имеющие.

При ДСР-исследовании значимых различий между двумя образцами ФС в динамике

агрегации при нагреве не было обнаружено. В обоих образцах при нагревании от +30 °С до +35

°С наблюдалось медленное увеличение размеров частиц (Рисунок 44). При нагреве до +40 °С в

обоих образцах наблюдалось одинаковое увеличение размеров агрегатов в среднем до 5 нм

(Рисунок 44), а при дальнейшем нагреве – лавинообразная агрегация и резкое увеличение

размера частиц в обоих исследованных образцах (Рисунок 44). Таким образом,

предварительный анализ агрегационной стабильности ФС ИЛ-36РА методом ДСР не позволил

однозначно подтвердить или опровергнуть эффективность присутствия полисорбата-80 в

составе композиции.

Исследование стабильности продолжили с использованием традиционного подхода с

хранением образцов при температуре + 4-8 °С. Биологическую активность ИЛ-36РА

тестировали в модельной системе in vitro, наличие агрегатов ИЛ-36РА - методом ГП-ВЭЖХ,

окисление ИЛ-36РА - методом ОФ-ВЭЖХ, дезамидирование ИЛ-36РА - методом кИЭФ,

концентрацию ИЛ-36РА - биуретовым методом. Кроме того, определяли содержание ЛПС и рН

раствора. К настоящему моменту образцы ИЛ-36РА в растворах всех трёх составов успешно

хранятся более года без значимого изменения этих параметров.

96

А

Б

В

Рисунок 44. Распределение радиусов частиц в растворе относительно их количества при

анализе методом дифференциального светорассеяния (ДСР). А – ФС ИЛ-36РА серия 01-0216,

не содержащая полисорбат-80, при различных температурах, Б – ФС ИЛ-36РА серия 02-0216,

содержащая 0,1% полисорбата-80 при различных температурах, В – сравнение образцов двух

серий, нагрев до +40 °С.

0

5

10

15

20

25

30

1 10 100 1000 10000

До

ля

част

иц

раз

ме

ра

N (

%)

Диаметр частиц (нм)

+ 20°C + 25°C + 30°C + 35°C

+ 40°C + 45°C + 50°C

0

5

10

15

20

25

30

1 10 100До

ля

част

иц

раз

ме

ра

N (

%)

Диаметр частиц (нм)

Серия 01-0216 Серия 02-0216

97

Таким образом, этот раствор ФС (50 мМ цитратный буфер рН 6,0 с 0,1% полисорбата-80)

был принят как базовый. Далее требовалось масштабировать схему очистки ИЛ-36РА и

модифицировать ее таким образом, чтобы на выходе получать нативный недезамидированный

ИЛ-36РА в таком растворе, не превышая в процессе очистки допустимых значений рН (7,0) и

концентрации белка (15 мг/мл).


масштабе лабораторного производства

4.2.2.1. Оптимизация метода лизиса биомассы штамма-продуцента и

осветление лизатов методом флоккуляции

В лабораторных масштабах оптимальным методом лизиса биомассы являлось

трехкратное замораживание-размораживание биомассы штамма-продуцента с последующим

перемешиванием в течение 20 минут и осветлением центрифугированием. Преимуществами

этого метода являлись надежность, простота, воспроизводимость и эффективность.

При переходе к культивированию в 10-литровом биореакторе, оказалось, что

трехкратное замораживание-размораживание биомассы весом 270-300 г, получаемой с одного

цикла культивирования, является длительной процедурой и требует нескольких часов. Кроме

того, лизат имеет повышенную вязкость из-за большого количества ДНК, которая выходит в

раствор. Высокая вязкость раствора не позволяет эффективно осветлять его методом

центрифугирования и наносить на хроматографическую колонку.

В методику лизиса биомассы были внесены следующие изменения:

Для гомогенизации размороженной биомассы был использован блендер. При

дальнейшем масштабировании блендер может быть заменен промышленной

мешалкой с лезвиями;

Подобраны щадящие условия лизиса. Оказалось, что при однократном

замораживании-размораживании биомассы и 10-минутном перемешивании в

раствор переходит примерно на 30% меньше ИЛ-36РА (Рисунок 45) и заметно

меньше ДНК, чем при трехкратном. Поскольку ИЛ-36РА растворим и находится в

цитоплазме клеток, а клетки уже повреждены, предположили, что более

длительное перемешивание лизированной биомассы позволит достичь большего

98

выхода белка. Из стакана с лизированной биомассой, содержимое которого

интенсивно перемешивалось, отбирали пробы раствора через каждые полчаса

после начала перемешивания. Установлено, что после 30 минут перемешивания

концентрация ИЛ-36РА в растворе не увеличивается и достоверно не отличается

от получаемой при более жестких методах лизиса (Рисунок 45, 46).

Для 250 г биомассы оправданным оказалось соотношение 1 л лизирующего

буферного раствора (сорбционный буферный раствор для первой стадии

хроматографической очистки) на 100 г биомассы. Увеличение объёма раствора не

делало лизис более эффективным.

МВ, кДа 1 2 3 4 5 6

Рисунок 45. Электрофореграммализатов биомассы штамма-продуцента ИЛ-36РА,

полученных при различной обработке биомассы: 1 – однократное размораживание,

перемешивание 10 минут, 2 – однократное размораживание, перемешивание 30 минут, 3 –

однократное размораживание, обработка ультразвуком, 4 – однократное размораживание,

перемешивание 30 минут, 5 – двукратное размораживание, перемешивание 30 минут, 6 –

трехкратное размораживание, перемешивание 30 минут.

99

Рисунок 46. Концентрация ИЛ-36РА в лизате после лизиса биомассы различным

количеством размораживаний и перемешивания 30 минут. Приведено среднее от трёх

экспериментов. Концентрация ИЛ-36РА определена методом ИФА. Планки отмечают

стандартное отклонение (SD).

Для осветления лизата был использован метод флоккуляции, основанный на добавлении

в раствор двух солей, образующих при смешивании нерастворимый осадок. Частицы,

взвешенные в растворе, становятся очагами кристаллизации, обрастают кристаллами соли,

увеличиваются в размере и могут быть легко удалены центрифугированием. Метод обычно

применяется для осветления культуральной жидкости суспензионных эукариотических

клеточных культур [82]. Наиболее часто применяемая смесь - фосфат калия и хлорид кальция,

которые образуют нерастворимый в воде фосфат кальция [82].

Клизату биомассы штамма-продуцента ИЛ-36РА добавляли при перемешивании фосфат

калия до 20 мМ, хлорид кальция до 30 мМ, оставляли для формирования осадка на 1 час, осадок

удаляли центрифугированием при 10000 g в течение 1 часа (Рисунок 47). Уменьшение времени

инкубации раствора после добавления солей до 30 минут или увеличение до 12 часов

уменьшило эффективность флоккуляции – лизат хуже осветлялся. При этом при флоккуляции

всё же теряется в среднем около 15% ИЛ-36РА (Рисунок 48).

100

А Б

В Г

Рисунок 47. Фотографии лизатов биомассы штамма-продуцента ИЛ-36РА на

последовательных стадиях обработки. А – лизат до осветления, Б – лизат после осветления

центрифугированием при 10000 g 1 час, В – осветлённый лизат при флоккуляции, Г – лизат

после флоккуляции и повторного осветления центрифугированием при 10000 g 1 час.

1 2 3 4 5 МВ, кДа

Рисунок 48. Электрофореграммализатов биомассы штамма-продуцента ИЛ-36РА,

полученных на различных этапах процесса флоккуляции: 1 – биомасса штамма-продуцента; 2 –

лизат рН 7,0, растворимая фракция; 3 – лизат рН 7,0, осадок; 4 – лизат после флоккуляции,

растворимая фракция; 5 – лизат после флоккуляции, осадок.

101

Таким образом, разработан метод лизиса биомассы штамма-продуцента ИЛ-36РА и

осветления лизата методом флоккуляции, позволяющий обрабатывать за один прием биомассу

от одного культивирования в 10 л биореакторе с потерями в среднем 27%. Получаемый лизат

пригоден для дальнейшей хроматографической очистки ИЛ-36РА.

4.2.2.2. Масштабирование метода очистки ИЛ-36РА с применением

анионообменной хроматографии

Процедура хроматографической очистки была масштабирована для обработки 2,5-3

литров лизата, полученного из 270-300 г биомассы штамма-продуцента за один цикл.

Были внесены изменения в первую стадию хроматографической очистки ИЛ-36РА -

негативную анионообменную хроматографию на сорбенте Q Sepharose Fast Flow (GE, США).

До этого на колонку с 20 мл сорбента наносили осветленный лизат в 50 мМ буферном растворе

трис-HCl, рН 7,0 и собирали несвязавшуюся фракцию. Назначение этой стадии - очистка

раствора ИЛ-36РА от ряда примесных белков, ДНК и ЛПС, которые при рН 7,0 заряжены

сильнее ИЛ-36РА и, в отличие от него, связываются сорбентом. Примеси затем смывали 2М

NaCl в том же буферном растворе.

Объем сорбента был увеличен с 20 мл до 300 мл. Для отмывки колонки сорбционный

буферный раствор 50 мМ трис-HCl, рН 7,0 был дополнен 15 мМ NaCl. За счет этого

достигалось меньшее размывание проходящей фракции, поскольку устранялось даже самое

слабое взаимодействие ИЛ-36РА с сорбентом (Рисунок 49). После этой стадии хроматографии

объем получаемого образца увеличивается на 30-40% по сравнению с исходным, а потери ИЛ-

36РА составляют менее 5%.

102

А

Б

Рисунок 49. Хроматограммы очистки ИЛ-36РА из лизата биомассы штамма-продуцента

на сорбенте Q Sepharose Fast Flow (GE, США). А – нанесение образца и отмывка раствором без

NaCl, контрольная элюция 100 мМNaCl, регенерация 2 М NaCl; Б – нанесение образца и

отмывка раствором с 15 мМ NaCl, регенерация 2 М NaCl.

Вторая стадия хроматографической очистки ИЛ-36РА на гидрофобном сорбенте

Toyopearl Butyl-650 S (Tosoh, Япония) также подверглась изменениям. Ранее она включала

добавление к содержащему ИЛ-36РА элюату с Q Sepharose Fast Flow (GE, США)

кристаллического сульфата аммония до 0,3 М и нанесение его на колонку с Butyl-650 S (Tosoh,

Япония), уравновешенную 50 мМ натрий-фосфатным буфером с 0,3 М сульфата аммония, pH

103

6,5, затем промывку 50 мМ натрий-фосфатным буфером с 50 мМ сульфата аммония, pH 6,5 и

элюцию градиентом отмывочного буфера и воды.

Объем сорбента был увеличен с 20 мл до 200 мл. Методика пробоподготовки и

нанесения проб осталась без изменений. Однако изменение параметров колонки сделано

неэффективной градиентную элюцию ИЛ-36РА: не удавалось достичь разрешения между

пиками примесей и ИЛ-36РА, достаточного для получения ИЛ-36РА с чистотой более 95% по

ОФ-ВЭЖХ. Поэтому примеси и ИЛ-36РА стали элюировать ступенчато. Примеси удаляли

промывкой 50 мМ натрий-фосфатным буферным раствором, рН 6,0 с 50 мМ сульфата аммония.

Элюцию ИЛ-36РА затем проводили 50 мМ натрий-фосфатным буферным раствором, рН 6,0 без

сульфата аммония. Регенерацию сорбента проводили водой. При этом, если при работе в

меньшем масштабе удавалось и при регенерации сорбента водой получить некоторое

количество высокоочищенного ИЛ-36РА, то теперь эта фракция содержала много примесей, и

её стали отбрасывать (Рисунок 50).

1 2 3 4 5 6 МВ, кДа


очистки ИЛ-36РА насорбенте Butyl-650 S (Tosoh, Япония). Дорожки: 1 – исходный образец

(несвязавшаяся фракция с Q Sepharose Fast Flow), 2 – несвязавшаяся фракция, 3– отмывка

отмывочным буфером, 4 –элюат,5 – хвост пика элюата,6 – регенерация сорбента.

Негативным эффектом масштабирования процесса стало резкое увеличение содержания

ЛПС в образцах, полученных после второго этапа очистки. Это, по-видимому, связано со

снижением эффективности первого шага очистки из-за большего насыщения ёмкости сорбента

по сравнению с очисткой в меньшем масштабе. Разрешение на второй стадии очистки также

снизилось, что сделало невозможным эффективное разделение ЛПС и ИЛ-36РА на

104

гидрофобном сорбенте. Таким образом, возникла необходимость введения дополнительного

этапа очистки, связанного с удалением ЛПС из образцов ИЛ-36РА.

4.2.2.3. Очистка ИЛ-36РА от ЛПС с помощью разделения фаз с Triton X-114

Все методики, применяемые для удаления ЛПС из растворов, используют физико-

химические свойства ЛПС – отрицательный заряд углеводного компонента или гидрофобность

липидного компонента. Используются, в основном, хроматографические методики:

анионообменная хроматография [26], хроматография на гидроксиапатитных сорбентах [43],

гидрофобная хроматография [175], отмывка связанного с сорбентом белка раствором

детергента [86, 109, 154] или органического растворителя [40], а также аффинная

хроматография на сорбентах, на которых иммобилизованы селективно связывающие ЛПС

лиганды, например, полимиксин[7].

Нами были опробованы все вышеперечисленные методы, кроме отмывания раствором

детергента связанного с сорбентом белка, т.к. ИЛ-36РА невозможно сорбировать на

анионообменные сорбенты без дезамидирования. Сорбция ИЛ-36РА на катионообменные

сорбенты приводила к потерям более 50% белка. ИЛ-36РА высокогидрофобен, поэтому очистка

его от ЛПС с помощью гидрофобных и аффинных сорбентов также приводит к большим

потерям. Так, при пропускании образца ИЛ-36РА через колонку с С8-целлюлозой, потери белка

составили почти 95%, а после сорбции на бутил-сефарозу (GE, США) белок элюировался

вместе с детергентом. Подобные случаи описаны и для других белков [5]. Таким образом, ни

один из опробованных хроматографических методов не позволил эффективно очистить ИЛ-

36РА от ЛПС.

Альтернативой подходам к очистке от ЛПС, основанным на хроматографии, является

т.н. двухфазная система с Triton X-114. В раствор белка, содержащий ЛПС, вводят детергент

Triton X-114, охлаждают раствор до +4 °С для увеличения растворимости детергента, затем

раствор нагревают выше температуры помутнения этого детергента (+23 °С). Растворимость

детергента в воде критически снижается, и он образует мицеллы, в которые включается ЛПС.

Мицеллы отделяются от раствора центрифугированием. Triton X-114 с ЛПС скапливается внизу

пробирки в виде отдельной гидрофобной фазы, которая не смешивается с верхней водной

фазой, содержащей белок [5, 24, 83].

105

Для очистки образца рекомбинантного ИЛ-36РА с содержанием эндотоксина в

концентрации 6800 EU/мл (3400 EU/мг белка) протестировали сначала две концентрации Triton

X-114 – 0,25% и 0,125% (объёмные проценты), обработку проводили при +37 °С.

В обоих случаях удалось снизить концентрацию ЛПС в растворе менее чем до 5 EU/мл,

но при использовании 0,25% Triton X-114 потери ИЛ-36РА были выше (Таблица 1). Их

причиной явились в первую очередь потери в объёме получаемого раствора. При каждой

обработке объём нерастворимой в воде фракции, содержащей Triton X-114, оказывался немного

больше объёма вносимого 10% раствора детергента. Кроме того, при отборе верхней водной

фазы неизбежно приходилось оставлять немного жидкости, чтобы не захватить часть фракции с

Triton X-114. Поэтому на каждом этапе обработки неизбежно терялось около 10% объёма

исходного раствора. Кроме того, часть ИЛ-36РА выпала в осадок, который удалили из раствора

при центрифугировании.

Обработку Triton X-114 в концентрации 0,125% при +30 °С повторили дважды. После

первой обработки удалось снизить концентрацию ЛПС в растворе менее чем до 30 EU/мл после

первой обработки и менее чем 5 EU/мл после второй (Таблица 1). Потери объёма образца ИЛ-

36РА на каждом этапе обработки 0,125% Triton X-114 при +30 °С составили 4-5% (Таблица

2).Концентрация ИЛ-36РА в растворе оставалась неизменной и составляла 2 мг/мл. Таким

образом, с точки зрения выхода конечного продукта предпочтительным подходом оказывается

двукратная обработка 0,125% Triton X-114 при +30 °С.

Эти данные вполне согласуются в описанными в литературе [83, 177]. При этом

концентрация 0,125% Triton X-114, видимо, оказывается на грани минимальной достаточной

для эффективной работы системы, т.к. было показано, что при концентрации 0,1% Triton X-114

эффективность очистки снижается [177]. При этом критическая концентрация

мицеллообразования (далее СМС) для Triton X-114 составляет 0,0113% по данным

производителя (Thermo Scientific, США), в концентрации ниже СМС детергент неизбежно

останется растворённым в водной фазе.

Таким образом, оптимальными условиями удаления ЛПС из препаратов ИЛ-36РА

являются: концентрация Triton X-114 0,125%, время инкубации при +4 °C – 30 минут,

нагревание проб до температуры от +23 °С до +30 °С - до полного помутнения образца,

центрифугирование 1 минута при 5000 g или 5 минут при 1000 g в нагретом до +25 °C роторе.

Этот метод может быть применим для большинства полипептидов в типичных биологических

буферных растворах без примесей. Однако такую очистку необходимо проводить до

106

добавления к образцу других детергентов, используемых при хранении, т.к. это делает

невозможным разделение фаз в данных условиях [161, 170].

Таблица 2. Концентрация белка, ЛПС и Triton X-114 в пробах ИЛ-36РА после обработки

Triton X-114 в различных условиях. Указан разброс значений в трёх исследованных образцах.

Концентрация белка измерялась после диализа, содержание ЛПС определялась до диализа.

Концентрации Triton X-114 сравнивались между группой после диализа и соответствующей

группой до диализа. n = 3, тест Манна-Уитни, *,† p < 0,05.

Объём

пробы (мкл)

(ИЛ-36РА)

(мг/мл)

(ЛПС)

(EU/мл)

(Triton X-114)

(мкг/мл)

Исходный образец 1000 2000 6800 0

1х обработка 0,125% Triton

X-114 при +30°С 940-950

22-29 152-163


X-114 при +30°С 900-910

0-4 161-167*


X-114 при +30°С и диализ 890-910 1985-2046

0,3-0,6*


X-114 при +37°С 940-950

0-4 144-171†


X-114 при +37°С и диализ 940-950 1811-1857 0,3-0,7†


X-114 при +37 °С 910-920 2-4


X-114 при +37 °С и диализ 900-910 1819-1878

Однако, как было отмечено выше, после протокола очистки в водной фазе остаётся

примесь Triton X-114 в концентрации ниже СМС. Поэтому следующими задачами стали

определение остаточного Triton X-114 в растворе и очистка от него.

107

Существуют методы колориметрического определения неионных детергентов, подобных

Triton X-114 [176]. Они требуют применения зачастую весьма токсичных реагентов и поэтому

не очень удобны в использовании. Благодаря наличию в молекуле Triton X-114 фенольного

кольца (Рисунок 51), он может быть детектирован УФ-детектором при длине волны 280 нм.

Однако при этой длине волны поглощают свет и белки, содержащие остатки триптофана и

тирозина.

Рисунок 51. Общая химическая формула (1,1,3,3-тетраметилбутил)фенил-

полиэтиленгликолей или детергентов серии Triton. Каждый из них представляет из себя смесь

полимеров с различной длиной цепи. Для Triton X=114 n=7-8, для Triton X-100 n=9-10.

Удобным и быстрым методом количественного определения примеси Triton X-114 в

образце явился ОФ-ВЭЖХ с детекцией пиков по поглощению света при 280 нм. Triton X-114

легко дифференцируется от пика ИЛ-36РА (Рисунок 52). Количество Triton X-114 определяется

относительно площади пика Triton X-114 в стандартном образце. Метод обладает

чувствительностью до 0,005%.

Примесь Triton X-114 после очистки от ЛПС составила в среднем 160±15 мкг/мл по

данным ОФ-ВЭЖХ (Таблица 2). Это примерно соответствует критической концентрации

мицеллообразования Triton X-114, которая составляет около 113 мкг/мл (0,21 мМ или 0,0113%).

Отличие может объясняться различиями в солевом составе раствора, а также случайным

отбором малого количества гидрофобной фазы после разделения.

Методы очистки растворов от примеси детергентов, в том числе Triton X-114, основаны

на тех же принципах, что и методы очистки растворов от ЛПС. Происходит разделение молекул

детергентов и молекул белка по размеру, заряду или гидрофобности. По описанным выше

причинам опробованные хроматографические методы очистки, основанные на разделении

молекул по заряду и гидрофобности, не были эффективны для ИЛ-36РА.

108

Рисунок 52. Типичная ОФ-ВЭЖХ хроматограмма обработанных Triton X-114 образцов

ИЛ-36РА до и после диализа. Пик 1’15’’ соответствует ИЛ-36РА, пик 3’10’’ соответствует

Triton X-114.

Методы, основанные на отделении молекул детергентов по размеру, включают в себя

гель-фильтрацию [5], диафильтрацию и диализ [171]. Гель-фильтрация удобна только для

очистки образцов в аналитических количествах. Для очистки проб большого объёма намного

удобнее методы диафильтрации и диализа. Однако, оба метода могут эффективно работать

только в случае, когда концентрация Triton X-114 ниже СМС. Молекулярный вес мицеллы

Triton X-114 в зависимости от условий может достигать около 100 кДа [151], в то время как вес

одиночной молекулы Triton X-114 составляет 537 Да. Это позволяет удалять его с помощью

мембран с соответствующим порогом отсечения [177].

Диализ образца ИЛ-36РА с примесью 160±15 мкг/мл Triton X-114 (по данным ОФ-

ВЭЖХ) после очистки от ЛПС проводился против 50 мМ натрий-цитратного буфера, рН 6,0-

6,2, в котором предполагалось дальнейшее хранение и использование ФС ИЛ-36РА.

Концентрация Triton X-114 в растворе ИЛ-36РА после диализа составила 0,04% (Таблица 2).

При большем разбавлении представляется возможным достичь большей эффективности

диализа.

109

4.2.2.4. Метод очистки ИЛ-36РА с применением анионообменной

хроматографии: материальный баланс

Технология получения ФС ИЛ-36РА в масштабе лабораторного производства состоит из

следующих стадий: культивирование штамма-продуцента, лизис биомассы, осветление её

методом флоккуляции, негативная анионообменная хроматография на сорбенте Q Sepharose

Fast Flow (GE, США), гидрофобная хроматография на сорбенте Butyl-650 S (Tosoh, Япония),

ультрафильтрационное концентрирование на мембране Ultracel PL-10 (Merck-Millipore, США),

очистка от ЛПС с помощью двухфазной системы с детергентом Triton X-114 и диализ.

Заключительными этапами получения ФС ИЛ-36РА стали добавление Tween-80 до конечной

концентрации 0,01% и стерилизующая фильтрация с использованием шприцевых фильтров с

пористостью 0,22 мкм Millex (Merck-Millipore, США). Выход ИЛ-36РА после всех этапов

очистки составил в среднем 51,4% (в расчете на содержание ИЛ-36РА в биомассе штамма-

продуцента) (Таблица 3).

Таблица 3. Выход и потери ИЛ-36РА в процессе получения ФС в масштабе

лабораторного производства. Приведены усреднённые значения измерений от трёх

последовательных экспериментов. Концентрации ИЛ-36РА на всех стадиях до диализа

определены методом ИФА, на стадиях диализа и стерилизации – с помощью набора BCA

Protein Assay kit (Thermo Fisher Scientific, США). В случае измерений методом ИФА значения

потерь округлены до целых чисел. Чистота ИЛ-36РА определена с помощью ОФ-ВЭЖХ.

Концентрация ЛПС определена с помощью набора ChromoLAL (CapeCod, США).

Образец ИЛ-

36РА, г

Потери

ИЛ-36РА

на стадии,

%

Количество

ИЛ-36РА, %

Чистота

ИЛ-

36РА, %

ЛПС,

EU/мг

ИЛ-

36РА

Биомасса штамма-

продуцента

1,216 100,0%

Осветлённый лизат

биомассы

1,070 12% 88,0%

Лизат биомассы после

флоккуляции

0,910 15% 74,8%

110

Образец ИЛ-

36РА, г

Потери

ИЛ-36РА

на стадии,

%


ИЛ-36РА, %

Чистота

ИЛ-

36РА, %

ЛПС,

EU/мг

ИЛ-

36РА

Фракция, не связавшаяся

с Q

0,882 3% 72,6% 31,3%

Фракция,

элюировавшаяся с Butyl-

650

0,697 21% 57,3% 96,2% 9814

Образец после

ультрафильтрации

0,690 1% 56,7%

Образец после Triton X-

114

0,628 9% 51,6%

Образец после диализа 0,628 0,0% 51,6%


стерилизации

0,625 0,5% 51,4% 95,8% 2

После завершения процедуры очистки перед дальнейшим использованием проводили

выходной контроль полученной ФС ИЛ-36РА на соответствие требованиям разработанного

проекта фармацевтической статьи предприятия (ФСП) (Приложение 1). Результатов контроля

ФС ИЛ-36РА приведены в Таблице 4.

Таблица 4. Результаты тестирования типичного образца ФС ИЛ-36РА на соответствие

требованиям проекта ФСП.

Наименование

показателей

Требования проекта ФСП Результаты анализа

Описание Прозрачная или слегка

опалесцирующая бесцветная

жидкость

Прозрачная бесцветная

жидкость

111




Подлинность:

- рецепторный

антагонист

интерлейкина-36

1. Биологический

метод

Должен достоверно подавлять

продукцию интерлейкина-8

клетками линии А-549/IL36R+,

вызванную 10 нг/мл интерлейкина-

36 гамма, в концентрации не более

12 нг/мл (биологический метод)

Достоверно подавляет

продукцию

интерлейкина-8 клетками

линии

А-549/IL36R+, вызванную

10 нг/мл интерлейкина-36

гамма, в концентрации 12

нг/мл

2. Обращенно-

фазовая

высокоэффективная

жидкостная

хроматография

(ОФ-ВЭЖХ)

Время удерживания основного

пика на хроматограмме раствора

препарата должно соответствовать

времени удерживания основного

пика рабочего стандартного

образца

Соответствует

3. Капиллярное

изоэлектрическое

фокусирование

(кИЭФ)

Изоэлектрическая точка основной

формы белка должна быть

(5,230,05)

Изоэлектрическая точка

основной формы белка

5,20

Прозрачность Должен быть прозрачным по

сравнению с водой или

выдерживать сравнение с эталоном

I

Прозрачный

112




Цветность Должен быть бесцветный

Бесцветный

рН От 6,0 до 6,5

6,1

Посторонние

примеси

1.ВЭЖХ

Суммарное содержание

посторонних

неидентифицированных примесей

не должно превышать 5%,

содержание единичной

неидентифицированной примеси –

не более 2,5% от площади

основного пика


посторонних

неидентифицированных

примесей – 2,64%,

содержание единичной

неидентифицированной

примеси – 1,05%

2. ОФ-ВЭЖХ Суммарное содержание

посторонних примесей не должно

превышать 5%


посторонних примесей –

1,99%

Родственные примеси Содержание дезамидированной

формы с pI (5,060,05) не должно

превышать 5 %

Содержание

дезамидированной формы

– 3,12%

Бактериальные

эндотоксины

Не более 10 ЕЭ на 1 мг белка

4 ЕЭ на 1 мг белка

Количественное

определение:




Не менее 5,0 мг/мл 5,0 мг/мл

113

Таким образом, разработанная технология позволила получать высокоочищенный ИЛ-

36РА, соответствующий требованиям разработанного проекта ФСП, при единовременной

обработке биомассы массой 240-300 г от одного культивирования штамма-продуцента ИЛ-36Ра

в биореакторе объёмом 10 литров.


масштабе пилотного промышленного производства

Дальнейшее масштабирование технологии получения ИЛ-36РА проведено при

культивировании штамма-продуцента в масштабе пилотного промышленного производства

(биореактор 250 л, объём культуры 160 л). Описанная выше технология очистки ИЛ-36РА,

включающая флоккуляцию и негативную анионообменную хроматографию на сорбенте Q

Sepharose Fast Flow (GE, США), оказалась неудобна для дальнейшего масштабирования.

Поэтому был разработан метод очистки ИЛ-36РА на сорбенте SP Sepharose Fast Flow (GE,

США).

4.2.3.1. Оптимизация метода кислотного фракционирования лизата биомассы

штамма-продуцента ИЛ-36РА

Для оптимизации метода пробоподготовки перед очисткой ИЛ-36РА на сорбенте SP

Sepharose Fast Flow (GE, США), сначала определили параметры хроматографической

системы.Поскольку наиболее значимым параметром для эффективности сорбции раствора на

сорбент SP Sepharose Fast Flow (GE, США) является значение рН, был проведен ряд

экспериментов, где, приняв за константу ионную силу раствора и параметры

хроматографической системы, варьировали только значение рН. Выяснили, что оптимальным

является значение рН 4,0-4,1. При увеличении рН эффективность сорбции снижается и при рН

4,4 сорбция не происходит вообще. При рН менее 4,0 эффективность сорбции не увеличивается.

Поэтому далее лизат биомассы наносили на сорбент при рН 4,0.

На ранних этапах работы от применения катионнообменной хроматографии отказались,

т.к. потери ИЛ-36РА при закислении лизата составляли около 50%. Тогда биомассу лизировали

трёхкратным замораживанием и оттаиванием. На этом этапе пробоподготовку лизата

проводили иначе.

114

Биомассу заморозили и разморозили один раз, ресуспендировали в 50 мМ трис-

ацетатном буфере, рН 7,0, перемешивали 30 минут, затем добавляли 50% уксусную кислоту до

получения рН 4,0. Осадок удалили центрифугированием. Потери ИЛ-36РА при таком методе

составили в среднем 39%.

Очевидно, что потери ИЛ-36РА происходили за счёт агрегации при переходе через

изоточку pI 5,2. Поскольку центрами агрегации могли служить частицы клеточного дебриса,

взвешенные в растворе, к протоколу был добавлен шаг осветления первичного лизата

центрифугированием перед закислением. Это позволило снизить потери ИЛ-36РА в среднем до

31%.

Добавление в раствор детергентов (0,1-1% Triton X-100, 0,1-1% Triton X-114, 0,1-1%

Tween-80) и цвиттерионов (0,1-1% таурин или бетаин) не принесло никакого значимого

результата. Не уменьшили потерь ИЛ-36РА также длительное перемешивание раствора,

двукратное его разбавление перед закислением, более медленное закисление, использование

25% уксусной кислоты, а также использование формиатной буферной системы.

Получаемый раствор содержал значительно меньше примесных белков (Рисунок 53), не

нуждался в дальнейшем осветлении и был пригоден к нанесению на сорбент (Рисунок 54).

1 2 3 4 5 МВ, кДа

Рисунок 53. Элетрофореграмма образца лизата биомассы ИЛ-36РА на разных этапах

обработки. Дорожки: 1 – лизат до осветления; 2 – лизат после закисления уксусной кислотой,

надосадочная фракция; 3 – лизат после закисления уксусной кислотой, осадок; 4 – лизат после

закисления муравьиной кислотой, надосадочная фракция; 5 – лизат после закисления

муравьиной кислотой, отмытый осадок.

115

А Б

В Г

Рисунок 54. Фотографии образца лизата биомассы ИЛ-36РА на разных этапах лизиса. А

– лизис 50 мМ трис-ацетатным буфером, до осветления, Б – после осветления, В – после

закисления, Г – после финального центрифугирования.

Таким образом, был оптимизирован протокол получения лизата биомассы штамма-

продуцента ИЛ-36РА с рН 4,0, пригодного для нанесения на хроматографический сорбент.

4.2.3.2. Оптимизация метода очистки ИЛ-36РА с применением

катионообменной хроматографии

Ранее было обнаружено, что ИЛ-36РА полностью сорбируется на сорбент SP Sepharose

Fast Flow (GE, США) при нанесении в 50 мМ трис-ацетатном буфере рН 4,0. Далее требовалось

оптимизировать условия элюции ИЛ-36РА таким образом, чтобы с одной стороны получить

максимально чистый ИЛ-36РА с минимальными потерями, и с другой стороны сделать метод

масштабируемым. Кроме того, этот метод решили оптимизировать сразу для применения в

116

стандартных условиях при + 4-8 °С в холодильных шкафах для уменьшения риска

контаминации ЛПС.

В ряде экспериментов выяснили, что ИЛ-36РА эффективно элюируется 0,4 М NaCl в 50

мМ трис-ацетатном буфере рН 4,0. При этом около 30% ИЛ-36РА элюировалась также при

промывке сорбента 2 М NaCl в том же буфере. Около 30% ИЛ-36РА элюировалось при

регенерации сорбента 0,2 М NaOH (Рисунок 55).

МВ, кДа 1 2 3 4 5 6 7


очистки ИЛ-36РА из лизата биомассы штамма-продуцента на сорбенте SP Sepharose Fast Flow

(GE, США) при элюции различными концентрациями NaCl. Дорожки: 1 – исходный лизат, рН

7,0, 2 – осадок после закисления лизата, 3 – лизат рН 4,0, 4 – несвязавшаяся фракция, 5 –

элюат0,4М NaCl, 6 –промывка 2 М NaCl,7 – регенерация 0,2 М NaOH.

Изменение условий проведения хроматографической очистки (двуступенчатая элюция

буферами с разными значениями рН (5,5 и 7,0) и регенерация 0,2 М NaOH) не улучшило

полученный результат (Рисунок 56). Однако это позволило избежать перехода белка через его

изоточку рН 5,2 при подготовке ко второму этапу хроматографической очистки.

117

1 2 3 4 5 МВ, кДа


очистки ИЛ-36РА из лизата биомассы штамма-продуцента на сорбенте SP Sepharose Fast Flow

(GE, США) при элюции растворами с различными рН. Дорожки: 1 – лизат рН 4,0; 2 –

несвязавшаяся фракция; 3 – элюат рН 5,5; 4 – элюат рН 7,0; 5 – регенерация 0,2 М NaOH.

Предположив, что фракция ИЛ-36РА, которая обладает повышенной сорбционной

способностью, состоит из частично денатурированных или неправильно упакованных молекул,

был проведен ряд экспериментов по ренатурации ИЛ-36РА, получаемого на этапе лизиса

биомассы.

Лизаты с рН 7,0 или рН 4,0 без добавок либо с добавлением 1 мМ бета-меркаптоэтанола,

либо 0,1% Tween-80, либо обеих добавок сразу инкубировали при + 4 °С в течение 1, 3, 7 и 14

дней. После этого проводили хроматографическую очистку образцов на сорбенте SP Sepharose

Fast Flow (GE, США) по методике с элюцией ИЛ-36РА растворами с рН 5,5, рН 7,0 и 0,2 М

NaOH. Сравнивали процентное соотношение ИЛ-36РА, элюировавшегося различными

растворами. В случае рефолдинга при рН 4,0 никаких изменений не произошло. В случае

рефолдинга при рН 7,0 при увеличении времени инкубации возрастала доля ИЛ-36РА,

элюирующегося при рН 5,5. Она достигала максимума к 14 дню, составив 88% (Рисунок 57).

При этом доля целевого белка, смываемого при рН 7,0 и регенерации колонки, снизилась до 8%

и 0%, соответственно. Добавки не внесли какого-либо значимого вклада в эффективность

рефолдинга.

118

Рисунок 57. Сравнение относительного количества ИЛ-36РА, элюировавшегося с

сорбента SP Sepharose Fast Flow (GE, США) при элюции растворами с рН 5,5, рН 7,0 и 0,2 М

NaOH после рефолдинга различной длительности. Концентрации ИЛ-36РА в образцах

определены методом ИФА.

Таким образом, удалось существенно уменьшить потери при хроматографической

очистке на сорбенте SP Sepharose Fast Flow (GE, США). Чистота ИЛ-36РА, получаемого при

элюции раствором рН 5,5 составляла в среднем 84% (Рисунок 58). Чистота ИЛ-36РА,

получаемого при элюции раствором рН 7,0 составляла в среднем 12% (Рисунок 58). Окисленная

форма ИЛ-36РА в процессе очитки не образуется.

Однако получаемый на этом этапе ИЛ-36РА содержал в среднем 160 EU ЛПС на мг ИЛ-

36РА. Поскольку с хроматографическим сорбентом эффективно связывался ИЛ-36РА, а не

ЛПС, то для удаления последнего ввели дополнительные промывки растворов детергентов,

таких, как Triton X-100 или Triton X-114.

Сорбент с иммобилизованным ИЛ-36РА промывали 10 объёмами 1% растворов этих

детергентов, затем 10 объёмами % раствора Tween-80 для удаления остаточных количеств этих

детергентов и 10 объёмами обычного отмывочного раствора. В результате отмывок обоими

детергентами был достигнут одинаковый результат: при элюции был получен ИЛ-36РА с

содержанием ЛПС 2-4 EU/мг белка. Triton X-100 и Triton X-114 не были обнаружены в образце

после анализа методом ОФ-ВЭЖХ. Снижение объемов растворов детергентов снизило

эффективность удаления ЛПС.

119

1 2 3 4 5 6 МВ, кДа

Рисунок 58. Типичная электрофореграмма фракций, полученных после

хроматографической очистки ИЛ-36РА из лизата биомассы штамма-продуцента на сорбенте SP

Sepharose Fast Flow (GE, США) с элюцией растворами с различными рН, после оптимизации

процесса пробоподготовки. Дорожки: 1 –лизат, рН4,0, 2 – несвязавшаяся фракция, 3 – элюат,

рН 5,5, 4 – элюат, рН 7,0, 5 – элюат, рН 7,0, хвостовая часть пика, 6 – регенерация 0,2 М NaOH.

Таким образом, разработана методика хроматографической очистки ИЛ-36РА из

биомассы штамма-продуцента с использованием катионообменной хроматографии,

позволяющей получать апирогенный ИЛ-36РА.

4.2.3.3. Метод очистки ИЛ-36РА с применением катионообменной

хроматографии: материальный баланс

Выход биомассы после одного культивирования штамма-продуцента ИЛ-36РА в

реакторе с рабочим объёмом 160 л составлял в среднем 3 400 г. Это потребовало

масштабирования процесса очистки ИЛ-36РА.

Очистку на SP Sepharose Fast Flow (GE, США) проводили по разработанной методике,

увеличив объём сорбента до 500 мл. Очистка дала такие же результаты, как и в меньшем

объёме, однако, в элюате с рН 7,0 выпадал осадок, содержащий ИЛ-36РА. Эту фракцию

отбрасывали.

Объём сорбента Butyl-650 S (Tosoh, Япония) также был увеличен до 300 мл. 50 мМ

натрий-фосфатный буфер рН 6,0 с 300 мМ сульфата аммония заменили на натрий-цитратный

120

буфер рН 6,0 со 150 мМ сульфата аммония. Отмывку примесей проводили 50 мМ натрий-

цитратным буферным раствором рН 6,0 с 50 мМ сульфата аммония. Элюцию ИЛ-36РА

проводили 50 мМ натрий-цитратным буферным раствором, рН 6,0 без сульфата аммония.

Регенерацию сорбента проводили водой. Эти изменения позволили обойтись без диализа

получаемого после концентрирования ИЛ-36РА против цитратного буфера, в котором далее

хранится ФС ИЛ-36РА. Заключительными этапами получения ФС ИЛ-36РА после описанных

шагов были добавление Tween-80 до конечной концентрации 0,01% и стерилизующая

фильтрация с использованием шприцевых фильтров с пористостью 0,22 мкм Millex (Merck-

Millipore, США). Выход ФС ИЛ-36РА при получении в пилотном масштабе составил в среднем

36,8% (в расчете на содержание ИЛ-36РА в биомассе штамма-продуцента) (Таблица 5).

Физико-химические характеристики и биологическая активность получаемого с

использованием этого метода ИЛ-36РА соответствовали требованиям проекта

фармацевтической статьи препарата (ФСП) и были аналогичны характеристикам ИЛ-36РА,

полученного нами ранее (Таблица 4).

Таблица 5. Выход и потери ИЛ-36РА в процессе хроматографической очистки с

применением катионообменной хроматографии в пилотном масштабе. Приведены усреднённые

значения измерений от трёх последовательных экспериментов. Концентрации ИЛ-36РА в

образцах на всех стадиях до ультрафильтрации определены методом ИФА, на стадиях

ультрафильтрации и стерилизации – с помощью набора BCA Protein Assay kit (Thermo Fisher

Scientific, США). В случае измерений методом ИФА значения потерь округлены до целых

чисел. Чистота ИЛ-36РА определена с помощью ОФ-ВЭЖХ. Концентрация ЛПС определена с

помощью набора ChromoLAL (CapeCod, США).

Образец Количество

ИЛ-36РА, г

Потери ИЛ-

36РА на

стадии, %


ИЛ-36РА, %

Чистота

ИЛ-36РА,

%

ЛПС, EU/мг

ИЛ-36РА

Биомасса штамма-

продуцента 4,154

100%


биомассы рН 7,0 3,656 12% 88,0%


биомассы рН 4,0 2,815 23% 67,8%

121

Образец Количество

ИЛ-36РА, г

Потери ИЛ-

36РА на

стадии, %


ИЛ-36РА, %

Чистота

ИЛ-36РА,

%

ЛПС, EU/мг

ИЛ-36РА

Элюат с SP FF - рН 5,5 2,280 19% 54,9% 81,2% 2

Элюат с Butyl-650 1,733 24% 41,7%


ультрафильтрации 1,542 11% 37,1%


стерилизации 1,527 1,0% 36,8% 96,1% 4

Таким образом, была разработана технология хроматографической очистки ИЛ-36РА,

пригодная для использования в пилотном промышленном производстве. С её применением

получен и очищен биологически активный ИЛ-36РА в количестве 50 г с чистотой более 95% по

ОФ-ВЭЖХ, с примесью менее 5% метиониновой и дезамидированной форм и содержанием

ЛПС менее 10 EU на мг белка. Полученный ИЛ-36РА был использован для проведения

доклинических исследований эффективности и токсичности разрабатываемого лекарственного

препарата для лечения псориаза.

122

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Поскольку для полной биологической активности ИЛ-36РА необходимо отщепление

инициаторного остатка метионина, нами разработан способ получения безметионинового ИЛ-

36РА в Escherichia coli. Создана серия плазмид, несущих ген метионинаминопептидазы (МАП)

E. coli под контролем различных промоторов, для коэкспресии ИЛ-36РА и МАП и

протестировано их влияние на продукцию ИЛ-36РА. Наибольшая продукция ИЛ-36РА с

содержанием менее 5% непроцессированной формы с неотщеплённым инициаторным остатком

метионина показана нами для штамма E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A), в котором

ген МАП контролировался индуцируемым арабинозой промотором. Полученный ИЛ-36РА

обладал биологической активностью, соответствующей активности ИЛ-36РА, выпускаемого

фирмой R&D Systems (США). Разработанный нами способ получения ИЛ-36РА, включающая

культивирование штамма E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) в биореакторах объёмом

до 250 л, позволяет получить значительно большие количества целевого белка, чем методики,

предложенные ранее другими авторами [53, 134].

Установлено, что в процессе выделения и хранения при рН > 7.0 ИЛ-36РА подвергается

дезамидированию. Для оценки содержания дезамидированной формы ИЛ-36РА в получаемом

препарате разработан метод анализа на основе кИЭФ. Технология получения и хранения белка

оптимизирована для минимизации этих модификаций.

Разработаны три методики хроматографической очистки ИЛ-36РА, пригодные для

очистки ИЛ-36РА из биомассы культур различных объёмов. Наиболее прогрессивная из них

позволяет в течение трехнедельного производственного цикла получать 8-10 г

высокоочищенного ИЛ-36РА.

Наработанный белок использован для проведения доклинических исследований

эффективности и безопасности разрабатываемого во ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» лекарственного

средства на основе ИЛ-36РА для лечения тяжёлых форм псориаза. Было показано отсутствие

острой токсичности в дозах до 200 мг/кг (в 2000 раз превосходит расчётную терапевтическую

дозу для человека), хронической токсичности (20 мг/кг 90 дней), репродуктивной токсичности,

пирогенности, мутагенности и аллергенности.

123

6. ВЫВОДЫ

1. Создана и охарактеризована серия штаммов-продуцентов безметионинового

рекомбинантного ИЛ-36РА человека на основе E. coli BL21 DE3, трансформированных одной

их плазмид, несущих ген метионинаминопептидазы E. coli (map) под контролем различных

промоторов, и плазмидой, несущей ген ИЛ-36РА человека (IL36RN). Штамм E. coli

BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) является наиболее продуктивным и обеспечивает

получение ИЛ-36РА с содержанием непроцессированной формы менее 5%.

2. Оптимизирована методика культивирования штамма E. coli BL21[DE3](pET-

IL36Raf)(pBAD15A) для применения в биореакторах объёмом до 250 л, что позволяет получить

до 24 г неочищенного ИЛ-36РА от одного запуска биореактора.

3. Разработаны три способа хроматографической очистки ИЛ-36РА из биомассы

культур различных объёмов, которые позволяют получать препарат ИЛ-36РА с чистотой более

95% по ОФ-ВЭЖХ, содержащий менее 5% дезамидированной формы и менее 10 EU ЛПС на мг

белка. Наиболее прогрессивная методика позволяет получить 8-10 г очищенного ИЛ-36РА за

один производственный цикл.

4. Установлено, что ИЛ-36РА в процессе выделения и хранения при рН > 7,0

подвергается дезамидированию. Для оценки содержания дезамидированой формы ИЛ-36РА

разработан метод анализа на основе кИЭФ.

5. Подобраны условия хранения ИЛ-36РА, минимизирующие дезамидирование ИЛ-

36РА. Разработан состав фармацевтической субстанции ИЛ-36РА. Образцы ФС ИЛ-36РА

хранятся в растворе этого состава не менее года без изменений своих свойств.

6. Биологическая активность получаемого по разработанной методике в масштабе

пилотного промышленного производства ИЛ-36РА в модельной системе in vitro на основе

клеток линии А549, трансфицированных плазмидой, несущей ген рецептора ИЛ-36,

соответствует биологической активности коммерческого стандартного препарата. Получаемый

ИЛ-36РА способен купировать развитие воспаления in vivo в модели псориазоподобного

дерматита на мышах.

124

7. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

IgG1 – иммуноглобулин G1

IL36RN – ген рецепторного антагониста интерлейкина-36

LB – Lysogeny broth, «литическая среда», питательная среда для роста культур бактерий

pI:C – полиинозин-полицитидиловая кислота

Th1 – Т-клетка хелпер 1 типа

Th17 – Т-клетка хелпер 17 типа

TLR – Toll-like рецептор

ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография

ГЛФ – готовая лекарственная форма

ГП-ВЭЖХ – гель-проникающая ВЭЖХ

ГПП – генерализованный пустулёзный псориаз

ДСР – динамическое светорассеяние

ИЛ – интерлейкин

ИЛ-1РА – рецепторный антагонист ИЛ-1

ИЛ-36РА – рецепторный антагонист ИЛ-36

ИПТГ – Изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид

ИФА – иммуноферментный анализ

ИФНγ – интерферон γ

кИЭФ – капиллярное изоэлектрофокусирование

ЛПС – бактериальный липополисахарид

МАП – метионинаминопептидаза

ОЕ – оптическая единица

ОФ-ВЭЖХ – обращенно-фазовая ВЭЖХ

ПААГ – полиакриламидный гель

Т.п.н. – Тысячи пар нуклеотидов

ТФУ – трифторуксусная кислота

125

ФНОα – фактор некроза опухоли α

ФС – фармацевтическая субстанция

ФСП – фармакопейная статья предприятия

126

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Знаменская Л.Ф. Заболеваемость и распространенность псориаза в Российской Федерации /

Л. Ф. Знаменская, Л. Е. Мелехина, Е. В. Богданова, А. А. Минеева // Вестник Дерматологии И

Венерологии – 2012. – № 5 – 20–29 c.

2. Мишина О.С. Заболеваемость псориазом и псориатическим артритом среди городского и

сельского населения Российской федерации / О. С. Мишина, А. С. Дворников, Е. С. Донцова, Л.

Н. Борзунова, А. П. Обухов // Вестник Новых Медицинских Технологий Электронное Издание

– 2012. – № 1.

3. Abbas O. Acrodermatitis continua of Hallopeau is a clinical phenotype of DITRA: evidence that it is

a variant of pustular psoriasis / O. Abbas, S. Itani, S. Ghosn, A. G. Kibbi, G. Fidawi, M. Farooq, Y.

Shimomura, M. Kurban // Dermatol. Basel Switz. – 2013. – Т. 226 – № 1 – 28–31 p.

4. Afonina I.S. Proteolytic Processing of Interleukin-1 Family Cytokines: Variations on a Common

Theme / I. S. Afonina, C. Müller, S. J. Martin, R. Beyaert // Immunity – 2015. – Т. 42 – № 6 – 991–

1004 p.

5. Aida Y. Removal of endotoxin from protein solutions by phase separation using Triton X-114 / Y.

Aida, M. J. Pabst // J. Immunol. Methods – 1990. – Т. 132 – № 2 – 191–195 p.

6. Andre R. Regulation of expression of the novel IL-1 receptor family members in the mouse brain /

R. Andre, D. Lerouet, I. Kimber, E. Pinteaux, N. J. Rothwell // J. Neurochem. – 2005. – Т. 95 – № 2 –

324–330 p.

7. Anspach F.B. Removal of endotoxins by affinity sorbents / F. B. Anspach, O. Hilbeck // J.

Chromatogr. A – 1995. – Т. 711 – № 1 – 81–92 p.

8. Aoyagi T. IL-36 receptor deletion attenuates lung injury and decreases mortality in murine influenza

pneumonia / T. Aoyagi, M. W. Newstead, X. Zeng, S. L. Kunkel, M. Kaku, T. J. Standiford // Mucosal

Immunol. – 2017. – Т. 10 – № 4 – 1043–1055 p.

9. Asseldonk E.J.P. van The effect of the interleukin-1 cytokine family members IL-1F6 and IL-1F8

on adipocyte differentiation / E. J. P. van Asseldonk, R. Stienstra, T. B. Koenen, L. J. H. van Tits, L.

127

A. B. Joosten, C. J. Tack, M. G. Netea // Obes. Silver Spring Md – 2010. – Т. 18 – № 11 – 2234–2236

p.

10. Bal E. Mutation in IL36RN impairs the processing and regulatory function of the interleukin-36

receptor antagonist and is associated with DITRA syndrome / E. Bal, A. C. Lim, M. Shen, J.

Douangpanya, M. Madrange, R. Gazah, M. Tauber, W. Beghdadi, J. L. Casanova, E. Bourrat, H.

Bachelez, J. E. Towne, A. Smahi // Exp. Dermatol. – 2017.

11. Barton J.L. A tissue specific IL-1 receptor antagonist homolog from the IL-1 cluster lacks IL-1, IL-

1ra, IL-18 and IL-18 antagonist activities / J. L. Barton, R. Herbst, D. Bosisio, L. Higgins, M. J.

Nicklin // Eur. J. Immunol. – 2000. – Т. 30 – № 11 – 3299–3308 p.

12. Ben-Bassat A. Processing of the initiation methionine from proteins: properties of the Escherichia

coli methionine aminopeptidase and its gene structure / A. Ben-Bassat, K. Bauer, S. Y. Chang, K.

Myambo, A. Boosman, S. Chang // J. Bacteriol. – 1987. – Т. 169 – № 2 – 751–757 p.

13. Berglöf E. IL-1Rrp2 expression and IL-1F9 (IL-1H1) actions in brain cells / E. Berglöf, R. Andre,

B. R. Renshaw, S. M. Allan, C. B. Lawrence, N. J. Rothwell, E. Pinteaux // J. Neuroimmunol. – 2003.

– Т. 139 – № 1–2 – 36–43 p.

14. Bhosale M. Characterization of two M17 family members in Escherichia coli, Peptidase A and

Peptidase B / M. Bhosale, S. Pande, A. Kumar, S. Kairamkonda, D. Nandi // Biochem. Biophys. Res.

Commun. – 2010. – Т. 395 – № 1 – 76–81 p.

15. Blumberg H. Opposing activities of two novel members of the IL-1 ligand family regulate skin

inflammation / H. Blumberg, H. Dinh, E. S. Trueblood, J. Pretorius, D. Kugler, N. Weng, S. T.

Kanaly, J. E. Towne, C. R. Willis, M. K. Kuechle, J. E. Sims, J. J. Peschon // J. Exp. Med. – 2007. – Т.

204 – № 11 – 2603–2614 p.

16. Boehncke W.-H. Etiology and Pathogenesis of Psoriasis / W.-H. Boehncke // Rheum. Dis. Clin.

North Am. – 2015. – Т. 41 – № 4 – 665–675 p.

17. Boehncke W.-H. Psoriasis / W.-H. Boehncke, M. P. Schön // Lancet Lond. Engl. – 2015. – Т. 386

– № 9997 – 983–994 p.

128

18. Bozoyan L. Interleukin-36γ is expressed by neutrophils and can activate microglia, but has no role

in experimental autoimmune encephalomyelitis / L. Bozoyan, A. Dumas, A. Patenaude, L. Vallières //

J. Neuroinflammation – 2015. – Т. 12 – 173 p.

19. Brau-Javier C.N. Chronic cutaneous pustulosis due to a 175-kb deletion on chromosome 2q13:

excellent response to anakinra / C. N. Brau-Javier, J. Gonzales-Chavez, J. R. Toro // Arch. Dermatol. –

2012. – Т. 148 – № 3 – 301–304 p.

20. Bruschi M. Post-translational modified proteins are biomarkers of autoimmune-processes: NETosis

and the inflammatory-autoimmunity connection / M. Bruschi, A. Petretto, R. Bertelli, M. Galetti, A.

Bonanni, F. Pratesi, P. Migliorini, G. Candiano, A. Vaglio, G. M. Ghiggeri // Clin. Chim. Acta Int. J.

Clin. Chem. – 2017. – Т. 464 – 12–16 p.

21. Busfield S.J. Identification and gene organization of three novel members of the IL-1 family on

human chromosome 2 / S. J. Busfield, C. A. Comrack, G. Yu, T. W. Chickering, J. S. Smutko, H.

Zhou, K. R. Leiby, L. M. Holmgren, D. P. Gearing, Y. Pan // Genomics – 2000. – Т. 66 – № 2 – 213–

216 p.

22. Carrier Y. Inter-regulation of Th17 cytokines and the IL-36 cytokines in vitro and in vivo:

implications in psoriasis pathogenesis / Y. Carrier, H.-L. Ma, H. E. Ramon, L. Napierata, C. Small, M.

O’Toole, D. A. Young, L. A. Fouser, C. Nickerson-Nutter, M. Collins, K. Dunussi-Joannopoulos, Q.

G. Medley // J. Invest. Dermatol. – 2011. – Т. 131 – № 12 – 2428–2437 p.

23. Cassell S. Psoriatic arthritis: pathogenesis and novel immunomodulatory approaches to treatment /

S. Cassell, A. Kavanaugh // J. Immune Based Ther. Vaccines – 2005. – Т. 3 – 6 p.

24. Cavallaro A.S. Endotoxin-free purification for the isolation of bovine viral diarrhoea virus E2

protein from insoluble inclusion body aggregates / A. S. Cavallaro, D. Mahony, M. Commins, T. J.

Mahony, N. Mitter // Microb. Cell Factories – 2011. – Т. 10 – 57 p.

25. Chen H. Alterations of plasma inflammatory biomarkers in the healthy and chronic obstructive

pulmonary disease patients with or without acute exacerbation / H. Chen, Y. Wang, C. Bai, X. Wang //

J. Proteomics – 2012. – Т. 75 – № 10 – 2835–2843 p.

129

26. Chen R.H. Factors affecting endotoxin removal from recombinant therapeutic proteins by anion

exchange chromatography / R. H. Chen, C.-J. Huang, B. S. Newton, G. Ritter, L. J. Old, C. A. Batt //

Protein Expr. Purif. – 2009. – Т. 64 – № 1 – 76–81 p.

27. Chustz R.T. Regulation and function of the IL-1 family cytokine IL-1F9 in human bronchial

epithelial cells / R. T. Chustz, D. R. Nagarkar, J. A. Poposki, S. Favoreto, P. C. Avila, R. P. Schleimer,

A. Kato // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. – 2011. – Т. 45 – № 1 – 145–153 p.

28. Clancy D.M. Neutrophil extracellular traps can serve as platforms for processing and activation of

IL-1 family cytokines / D. M. Clancy, C. M. Henry, G. P. Sullivan, S. J. Martin // FEBS J. – 2017. – Т.

284 – № 11 – 1712–1725 p.

29. Cohen P. The TLR and IL-1 signalling network at a glance / P. Cohen // J. Cell Sci. – 2014. – Т.

127 – № Pt 11 – 2383–2390 p.

30. Costa L. Efficacy of tocilizumab in a patient with refractory psoriatic arthritis / L. Costa, F. Caso,

L. Cantarini, A. Del Puente, R. Scarpa, M. Atteno // Clin. Rheumatol. – 2014. – Т. 33 – № 9 – 1355–

1357 p.

31. Dalbøge H. In vivo processing of N-terminal methionine in E. coli / H. Dalbøge, S. Bayne, J.

Pedersen // FEBS Lett. – 1990. – Т. 266 – № 1–2 – 1–3 p.

32. D’Erme A.M. IL-36γ (IL-1F9) Is a Biomarker for Psoriasis Skin Lesions / A. M. D’Erme, D.

Wilsmann-Theis, J. Wagenpfeil, M. Hölzel, S. Ferring-Schmitt, S. Sternberg, M. Wittmann, B. Peters,

A. Bosio, T. Bieber, J. Wenzel // J. Invest. Dermatol. – 2015. – Т. 135 – № 4 – 1025–1032 p.

33. Dinarello C. IL-1 family nomenclature / C. Dinarello, W. Arend, J. Sims, D. Smith, H. Blumberg,

L. O’Neill, R. Goldbach-Mansky, T. Pizarro, H. Hoffman, P. Bufler, M. Nold, P. Ghezzi, A.

Mantovani, C. Garlanda, D. Boraschi, A. Rubartelli, M. Netea, J. van der Meer, L. Joosten, T.

Mandrup-Poulsen, M. Donath, E. Lewis, J. Pfeilschifter, M. Martin, M. Kracht, H. Muehl, D. Novick,

M. Lukic, B. Conti, A. Solinger, P. Kelk, K. Peyman, F. van de Veerdonk, C. Gabel // Nat. Immunol. –

2010. – Т. 11 – № 11 – 973 p.

34. Dunn E. Annotating genes with potential roles in the immune system: six new members of the IL-1

family / E. Dunn, J. E. Sims, M. J. Nicklin, L. A. O’Neill // Trends Immunol. – 2001. – Т. 22 – № 10 –

533–536 p.

130

35. Dunn E.F. High-resolution structure of murine interleukin 1 homologue IL-1F5 reveals unique

loop conformations for receptor binding specificity / E. F. Dunn, N. J. Gay, A. F. Bristow, D. P.

Gearing, L. A. J. O’Neill, X. Y. Pei // Biochemistry (Mosc.) – 2003. – Т. 42 – № 37 – 10938–10944 p.

36. Farahnik B. Topical Botanical Agents for the Treatment of Psoriasis: A Systematic Review / B.

Farahnik, D. Sharma, J. Alban, R. K. Sivamani // Am. J. Clin. Dermatol. – 2017. – Т. 18 – № 4 – 451–

468 p.

37. Farooq M. Mutation analysis of the IL36RN gene in 14 Japanese patients with generalized pustular

psoriasis / M. Farooq, H. Nakai, A. Fujimoto, H. Fujikawa, A. Matsuyama, N. Kariya, A. Aizawa, H.

Fujiwara, M. Ito, Y. Shimomura // Hum. Mutat. – 2013. – Т. 34 – № 1 – 176–183 p.

38. Finch A. Analysis of mitogen-activated protein kinase pathways used by interleukin 1 in tissues in

vivo: activation of hepatic c-Jun N-terminal kinases 1 and 2, and mitogen-activated protein kinase

kinases 4 and 7 / A. Finch, W. Davis, W. G. Carter, J. Saklatvala // Biochem. J. – 2001. – Т. 353 – №

Pt 2 – 275–281 p.

39. Fits L. van der Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-

23/IL-17 axis / L. van der Fits, S. Mourits, J. S. A. Voerman, M. Kant, L. Boon, J. D. Laman, F.

Cornelissen, A.-M. Mus, E. Florencia, E. P. Prens, E. Lubberts // J. Immunol. Baltim. Md 1950 –

2009. – Т. 182 – № 9 – 5836–5845 p.

40. Franken K.L. Purification of his-tagged proteins by immobilized chelate affinity chromatography:

the benefits from the use of organic solvent / K. L. Franken, H. S. Hiemstra, K. E. van Meijgaarden, Y.

Subronto, J. den Hartigh, T. H. Ottenhoff, J. W. Drijfhout // Protein Expr. Purif. – 2000. – Т. 18 – № 1

– 95–99 p.

41. Frottin F. The proteomics of N-terminal methionine cleavage / F. Frottin, A. Martinez, P. Peynot,

S. Mitra, R. C. Holz, C. Giglione, T. Meinnel // Mol. Cell. Proteomics MCP – 2006. – Т. 5 – № 12 –

2336–2349 p.

42. Gabay C. Regulation and function of interleukin-36 cytokines in homeostasis and pathological

conditions / C. Gabay, J. E. Towne // J. Leukoc. Biol. – 2015. – Т. 97 – № 4 – 645–652 p.

43. Gagnon P. Monoclonal antibody purification with hydroxyapatite / P. Gagnon // New Biotechnol. –

2009. – Т. 25 – № 5 – 287–293 p.

131

44. Ganesan R. Generation and functional characterization of anti-human and anti-mouse IL-36R

antagonist monoclonal antibodies / R. Ganesan, E. L. Raymond, D. Mennerich, J. R. Woska, G.

Caviness, C. Grimaldi, J. Ahlberg, R. Perez, S. Roberts, D. Yang, K. Jerath, K. Truncali, L. Frego, E.

Sepulveda, P. Gupta, S.-E. Brown, M. D. Howell, K. A. Canada, R. Kroe-Barrett, J. S. Fine, S. Singh,

M. L. Mbow // mAbs – 2017. – 0 p.

45. Garber C. Systemic Treatment of Recalcitrant Pediatric Psoriasis: A Case Series and Literature

Review / C. Garber, M. Creighton-Smith, E. P. Sorensen, N. Dumont, A. B. Gottlieb // J. Drugs

Dermatol. JDD – 2015. – Т. 14 – № 8 – 881–886 p.

46. Garlanda C. Decoys and Regulatory «Receptors» of the IL-1/Toll-Like Receptor Superfamily / C.

Garlanda, F. Riva, E. Bonavita, S. Gentile, A. Mantovani // Front. Immunol. – 2013. – Т. 4 – 180 p.

47. Gasteiger E. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server / под ред. J. Walker.

Humana Press, 2005. – 571–607 p.

48. Gresnigt M.S. Biology of IL-36 cytokines and their role in disease / M. S. Gresnigt, F. L. van de

Veerdonk // Semin. Immunol. – 2013. – Т. 25 – № 6 – 458–465 p.

49. Griffiths C.E.M. Pathogenesis and clinical features of psoriasis / C. E. M. Griffiths, J. N. W. N.

Barker // Lancet Lond. Engl. – 2007. – Т. 370 – № 9583 – 263–271 p.

50. Grote A. JCat: a novel tool to adapt codon usage of a target gene to its potential expression host /

A. Grote, K. Hiller, M. Scheer, R. Münch, B. Nörtemann, D. C. Hempel, D. Jahn // Nucleic Acids Res.

– 2005. – Т. 33 – № suppl 2 – W526–W531 p.

51. Grunberg-Manago M. Messenger RNA stability and its role in control of gene expression in

bacteria and phages / M. Grunberg-Manago // Annu. Rev. Genet. – 1999. – Т. 33 – 193–227 p.

52. Gudjonsson J.E. Immunopathogenic mechanisms in psoriasis / J. E. Gudjonsson, A. Johnston, H.

Sigmundsdottir, H. Valdimarsson // Clin. Exp. Immunol. – 2004. – Т. 135 – № 1 – 1–8 p.

53. Günther S. Molecular determinants of agonist and antagonist signaling through the IL-36 receptor /

S. Günther, E. J. Sundberg // J. Immunol. Baltim. Md 1950 – 2014. – Т. 193 – № 2 – 921–930 p.

132

54. Hamon Y. Interleukin-1beta secretion is impaired by inhibitors of the Atp binding cassette

transporter, ABC1 / Y. Hamon, M. F. Luciani, F. Becq, B. Verrier, A. Rubartelli, G. Chimini // Blood

– 1997. – Т. 90 – № 8 – 2911–2915 p.

55. Heidenreich R. Angiogenesis drives psoriasis pathogenesis / R. Heidenreich, M. Röcken, K.

Ghoreschi // Int. J. Exp. Pathol. – 2009. – Т. 90 – № 3 – 232–248 p.

56. Henry C.M. Neutrophil-Derived Proteases Escalate Inflammation through Activation of IL-36

Family Cytokines / C. M. Henry, G. P. Sullivan, D. M. Clancy, I. S. Afonina, D. Kulms, S. J. Martin //

Cell Rep. – 2016. – Т. 14 – № 4 – 708–722 p.

57. Hoffman S.J. Expression of fully functional tetrameric human hemoglobin in Escherichia coli / S.

J. Hoffman, D. L. Looker, J. M. Roehrich, P. E. Cozart, S. L. Durfee, J. L. Tedesco, G. L. Stetler //

Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 1990. – Т. 87 – № 21 – 8521–8525 p.

58. Hussain S. IL36RN mutations define a severe autoinflammatory phenotype of generalized pustular

psoriasis / S. Hussain, D. M. Berki, S.-E. Choon, A. D. Burden, M. H. Allen, J. I. Arostegui, A.

Chaves, M. Duckworth, A. D. Irvine, M. Mockenhaupt, A. A. Navarini, M. M. B. Seyger, P. Soler-

Palacin, C. Prins, L. Valeyrie-Allanore, M. A. Vicente, R. C. Trembath, C. H. Smith, J. N. Barker, F.

Capon // J. Allergy Clin. Immunol. – 2015. – Т. 135 – № 4 – 1067–1070.e9 p.

59. Jiang Z. Interleukin-36γ induced by the TLR3-SLUG-VDR axis promotes wound healing via

REG3A / Z. Jiang, Y. Liu, C. Li, L. Chang, W. Wang, Z. Wang, X. Gao, B. Ryffel, Y. Wu, Y. Lai // J.

Invest. Dermatol. – 2017.

60. Jorgensen I. Programmed cell death as a defence against infection / I. Jorgensen, M. Rayamajhi, E.

A. Miao // Nat. Rev. Immunol. – 2017. – Т. 17 – № 3 – 151–164 p.

61. Julien O. Caspases and their substrates / O. Julien, J. A. Wells // Cell Death Differ. – 2017. – Т. 24

– № 8 – 1380–1389 p.

62. Kanazawa N. Novel IL36RN mutation in a Japanese case of early onset generalized pustular

psoriasis / N. Kanazawa, T. Nakamura, N. Mikita, F. Furukawa // J. Dermatol. – 2013. – Т. 40 – № 9 –

749–751 p.

133

63. Keermann M. Transcriptional landscape of psoriasis identifies the involvement of IL36 and

IL36RN / M. Keermann, S. Kõks, E. Reimann, E. Prans, K. Abram, K. Kingo // BMC Genomics –

2015. – Т. 16 – 322 p.

64. Kelly J.B. Current and future oral systemic therapies for psoriasis / J. B. Kelly, P. Foley, B. E.

Strober // Dermatol. Clin. – 2015. – Т. 33 – № 1 – 91–109 p.

65. Kerwin B.A. Polysorbates 20 and 80 used in the formulation of protein biotherapeutics: structure

and degradation pathways / B. A. Kerwin // J. Pharm. Sci. – 2008. – Т. 97 – № 8 – 2924–2935 p.

66. Kingsbury D.J. Safety, effectiveness, and pharmacokinetics of adalimumab in children with

polyarticular juvenile idiopathic arthritis aged 2 to 4 years / D. J. Kingsbury, B. Bader-Meunier, G.

Patel, V. Arora, J. Kalabic, H. Kupper // Clin. Rheumatol. – 2014. – Т. 33 – № 10 – 1433–1441 p.

67. Klotsche J. Long-term safety of etanercept and adalimumab compared to methotrexate in patients

with juvenile idiopathic arthritis (JIA) / J. Klotsche, M. Niewerth, J.-P. Haas, H.-I. Huppertz, A. Zink,

G. Horneff, K. Minden // Ann. Rheum. Dis. – 2016. – Т. 75 – № 5 – 855–861 p.

68. Kovach M.A. IL-36γ is a crucial proximal component of protective type-1-mediated lung mucosal

immunity in Gram-positive and -negative bacterial pneumonia / M. A. Kovach, B. Singer, G.

Martinez-Colon, M. W. Newstead, X. Zeng, P. Mancuso, T. A. Moore, S. L. Kunkel, M. Peters-

Golden, B. B. Moore, T. J. Standiford // Mucosal Immunol. – 2017.

69. Kovach M.A. IL-36γ is secreted in microparticles and exosomes by lung macrophages in response

to bacteria and bacterial components / M. A. Kovach, B. H. Singer, M. W. Newstead, X. Zeng, T. A.

Moore, E. S. White, S. L. Kunkel, M. Peters-Golden, T. J. Standiford // J. Leukoc. Biol. – 2016. – Т.

100 – № 2 – 413–421 p.

70. Kumar S. Interleukin-1F7B (IL-1H4/IL-1F7) is processed by caspase-1 and mature IL-1F7B binds

to the IL-18 receptor but does not induce IFN-gamma production / S. Kumar, C. R. Hanning, M. R.

Brigham-Burke, D. J. Rieman, R. Lehr, S. Khandekar, R. B. Kirkpatrick, G. F. Scott, J. C. Lee, F. J.

Lynch, W. Gao, A. Gambotto, M. T. Lotze // Cytokine – 2002. – Т. 18 – № 2 – 61–71 p.

71. Kumar S. Identification and initial characterization of four novel members of the interleukin-1

family / S. Kumar, P. C. McDonnell, R. Lehr, L. Tierney, M. N. Tzimas, D. E. Griswold, E. A.

134

Capper, R. Tal-Singer, G. I. Wells, M. L. Doyle, P. R. Young // J. Biol. Chem. – 2000. – Т. 275 – №

14 – 10308–10314 p.

72. Kurinna S. Autocrine and Paracrine Regulation of Keratinocyte Proliferation through a Novel

Nrf2-IL-36γ Pathway / S. Kurinna, S. Muzumdar, U. A. Köhler, T. Kockmann, U. Auf dem Keller, M.

Schäfer, S. Werner // J. Immunol. Baltim. Md 1950 – 2016. – Т. 196 – № 11 – 4663–4670 p.

73. Langley R.G. Evaluating psoriasis with Psoriasis Area and Severity Index, Psoriasis Global

Assessment, and Lattice System Physician’s Global Assessment / R. G. Langley, C. N. Ellis // J. Am.

Acad. Dermatol. – 2004. – Т. 51 – № 4 – 563–569 p.

74. Lazarevic V. T-bet in disease / V. Lazarevic, L. H. Glimcher // Nat. Immunol. – 2011. – Т. 12 – №

7 – 597–606 p.

75. Levine D. Evaluation and management of psoriasis: an internist’s guide / D. Levine, A. Gottlieb //

Med. Clin. North Am. – 2009. – Т. 93 – № 6 – 1291–1303 p.

76. Levitt M. A simplified representation of protein conformations for rapid simulation of protein

folding / M. Levitt // J. Mol. Biol. – 1976. – Т. 104 – № 1 – 59–107 p.

77. Li N. Alarmin function of cathelicidin antimicrobial peptide LL37 through IL-36γ induction in

human epidermal keratinocytes / N. Li, K. Yamasaki, R. Saito, S. Fukushi-Takahashi, R. Shimada-

Omori, M. Asano, S. Aiba // J. Immunol. Baltim. Md 1950 – 2014. – Т. 193 – № 10 – 5140–5148 p.

78. Li R. Increased βTrCP are associated with imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in

mice via NF-κB signaling pathway / R. Li, J. Wang, X. Wang, J. Zhou, M. Wang, H. Ma, S. Xiao //

Gene – 2016.

79. Lian L.-H. The double-stranded RNA analogue polyinosinic-polycytidylic acid induces

keratinocyte pyroptosis and release of IL-36γ / L.-H. Lian, K. A. Milora, K. K. Manupipatpong, L. E.

Jensen // J. Invest. Dermatol. – 2012. – Т. 132 – № 5 – 1346–1353 p.

80. Liang J. Mutations in IL36RN are associated with geographic tongue / J. Liang, P. Huang, H. Li, J.

Zhang, C. Ni, Y. Wang, J. Shen, C. Li, L. Kang, J. Chen, H. Zhang, Z. Wang, Z. Zhang, M. Li, Z. Yao

// Hum. Genet. – 2017. – Т. 136 – № 2 – 241–252 p.

135

81. Liao Y.-D. Removal of N-terminal methionine from recombinant proteins by engineered E. coli

methionine aminopeptidase / Y.-D. Liao, J.-C. Jeng, C.-F. Wang, S.-C. Wang, S.-T. Chang // Protein

Sci. Publ. Protein Soc. – 2004. – Т. 13 – № 7 – 1802–1810 p.

82. Liu H.F. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production / H.

F. Liu, J. Ma, C. Winter, R. Bayer // mAbs – 2010. – Т. 2 – № 5 – 480–499 p.

83. Liu S. Removal of endotoxin from recombinant protein preparations / S. Liu, R. Tobias, S.

McClure, G. Styba, Q. Shi, G. Jackowski // Clin. Biochem. – 1997. – Т. 30 – № 6 – 455–463 p.

84. López-Ferrer A. The safety of ustekinumab for the treatment of psoriatic arthritis / A. López-

Ferrer, A. Laiz, L. Puig // Expert Opin. Drug Saf. – 2017. – Т. 16 – № 6 – 733–742 p.

85. Lovenberg T.W. Cloning of a cDNA encoding a novel interleukin-1 receptor related protein (IL

1R-rp2) / T. W. Lovenberg, P. D. Crowe, C. Liu, D. T. Chalmers, X. J. Liu, C. Liaw, W. Clevenger, T.

Oltersdorf, E. B. De Souza, R. A. Maki // J. Neuroimmunol. – 1996. – Т. 70 – № 2 – 113–122 p.

86. Lowe A.J. Methods for chromatographic removal of endotoxin / A. J. Lowe, C. L. Bardliving, C.

A. Batt // Methods Mol. Biol. Clifton NJ – 2012. – Т. 899 – 265–275 p.

87. Machado S.H. Safety of tocilizumab in the treatment of juvenile idiopathic arthritis / S. H.

Machado, R. M. Xavier // Expert Opin. Drug Saf. – 2017. – Т. 16 – № 4 – 493–500 p.

88. Magne D. The new IL-1 family member IL-1F8 stimulates production of inflammatory mediators

by synovial fibroblasts and articular chondrocytes / D. Magne, G. Palmer, J. L. Barton, F. Mézin, D.

Talabot-Ayer, S. Bas, T. Duffy, M. Noger, P.-A. Guerne, M. J. H. Nicklin, C. Gabay // Arthritis Res.

Ther. – 2006. – Т. 8 – № 3 – R80 p.

89. Makrides S.C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli / S. C.

Makrides // Microbiol. Rev. – 1996. – Т. 60 – № 3 – 512–538 p.

90. Marrakchi S. Interleukin-36-receptor antagonist deficiency and generalized pustular psoriasis / S.

Marrakchi, P. Guigue, B. R. Renshaw, A. Puel, X.-Y. Pei, S. Fraitag, J. Zribi, E. Bal, C. Cluzeau, M.

Chrabieh, J. E. Towne, J. Douangpanya, C. Pons, S. Mansour, V. Serre, H. Makni, N. Mahfoudh, F.

Fakhfakh, C. Bodemer, J. Feingold, S. Hadj-Rabia, M. Favre, E. Genin, M. Sahbatou, A. Munnich, J.-

L. Casanova, J. E. Sims, H. Turki, H. Bachelez, A. Smahi // N. Engl. J. Med. – 2011. – Т. 365 – № 7 –

620–628 p.

136

91. Martinon F. The inflammasomes: guardians of the body / F. Martinon, A. Mayor, J. Tschopp //

Annu. Rev. Immunol. – 2009. – Т. 27 – 229–265 p.

92. Medina-Contreras O. Cutting Edge: IL-36 Receptor Promotes Resolution of Intestinal Damage / O.

Medina-Contreras, A. Harusato, H. Nishio, K. L. Flannigan, V. Ngo, G. Leoni, P.-A. Neumann, D.

Geem, L. N. Lili, R. A. Ramadas, B. Chassaing, A. T. Gewirtz, J. E. Kohlmeier, C. A. Parkos, J. E.

Towne, A. Nusrat, T. L. Denning // J. Immunol. Baltim. Md 1950 – 2015.

93. Mehta D. Ultraviolet B Phototherapy for Psoriasis: Review of Practical Guidelines / D. Mehta, H.

W. Lim // Am. J. Clin. Dermatol. – 2016. – Т. 17 – № 2 – 125–133 p.

94. Milora K.A. Interleukin-36β provides protection against HSV-1 infection, but does not modulate

initiation of adaptive immune responses / K. A. Milora, S. R. Uppalapati, J. C. Sanmiguel, W. Zou, L.

E. Jensen // Sci. Rep. – 2017. – Т. 7 – № 1 – 5799 p.

95. Mutamba S. Expression of IL-1Rrp2 by human myelomonocytic cells is unique to DCs and

facilitates DC maturation by IL-1F8 and IL-1F9 / S. Mutamba, A. Allison, Y. Mahida, P. Barrow, N.

Foster // Eur. J. Immunol. – 2012. – Т. 42 – № 3 – 607–617 p.

96. Nicklin M.J.H. A sequence-based map of the nine genes of the human interleukin-1 cluster / M. J.

H. Nicklin, J. L. Barton, M. Nguyen, M. G. FitzGerald, G. W. Duff, K. Kornman // Genomics – 2002.

– Т. 79 – № 5 – 718–725 p.

97. Nolan K.F. The human interleukin 18 gene IL18 maps to 11q22.2-q22.3, closely linked to the

DRD2 gene locus and distinct from mapped IDDM loci / K. F. Nolan, D. R. Greaves, H. Waldmann //

Genomics – 1998. – Т. 51 – № 1 – 161–163 p.

98. Onoufriadis A. Mutations in IL36RN/IL1F5 are associated with the severe episodic inflammatory

skin disease known as generalized pustular psoriasis / A. Onoufriadis, M. A. Simpson, A. E. Pink, P.

Di Meglio, C. H. Smith, V. Pullabhatla, J. Knight, S. L. Spain, F. O. Nestle, A. D. Burden, F. Capon,

R. C. Trembath, J. N. Barker // Am. J. Hum. Genet. – 2011. – Т. 89 – № 3 – 432–437 p.

99. Pace A.L. Asparagine deamidation dependence on buffer type, pH, and temperature / A. L. Pace,

R. L. Wong, Y. T. Zhang, Y.-H. Kao, Y. J. Wang // J. Pharm. Sci. – 2013. – Т. 102 – № 6 – 1712–

1723 p.

137

100. Pan G. IL-1H, an interleukin 1-related protein that binds IL-18 receptor/IL-1Rrp / G. Pan, P.

Risser, W. Mao, D. T. Baldwin, A. W. Zhong, E. Filvaroff, D. Yansura, L. Lewis, C. Eigenbrot, W. J.

Henzel, R. Vandlen // Cytokine – 2001. – Т. 13 – № 1 – 1–7 p.

101. Papp K. Safety Surveillance for Ustekinumab and Other Psoriasis Treatments From the Psoriasis

Longitudinal Assessment and Registry (PSOLAR) / K. Papp, A. B. Gottlieb, L. Naldi, D. Pariser, V.

Ho, K. Goyal, S. Fakharzadeh, M. Chevrier, S. Calabro, W. Langholff, G. Krueger // J. Drugs

Dermatol. JDD – 2015. – Т. 14 – № 7 – 706–714 p.

102. Paul C. Fixed combination calcipotriol plus betamethasone dipropionate aerosol foam in the

treatment of psoriasis vulgaris: rationale for development and clinical profile / C. Paul, B. Bang, M.

Lebwohl // Expert Opin. Pharmacother. – 2017. – Т. 18 – № 1 – 115–121 p.

103. Penha R. IL-36 receptor is expressed by human blood and intestinal T lymphocytes and is dose-

dependently activated via IL-36β and induces CD4+ lymphocyte proliferation / R. Penha, J. Higgins,

S. Mutamba, P. Barrow, Y. Mahida, N. Foster // Cytokine – 2016. – Т. 85 – 18–25 p.

104. Piatkov K.I. Formyl-methionine as a degradation signal at the N-termini of bacterial proteins / K.

I. Piatkov, T. T. M. Vu, C.-S. Hwang, A. Varshavsky // Microb. Cell – 2015. – Т. 2 – № 10 – 376–393

p.

105. Podlipnik S. Pneumocystis jirovecii pneumonia in a patient with pustular psoriasis with an IL-

36RN deficiency treated with infliximab: Case report and review of the literature / S. Podlipnik, L. de

la Mora, M. Alsina, J. M. Mascaró // Australas. J. Dermatol. – 2017. – Т. 58 – № 2 – e44–e47 p.

106. Proudfoot A.E. Extension of recombinant human RANTES by the retention of the initiating

methionine produces a potent antagonist / A. E. Proudfoot, C. A. Power, A. J. Hoogewerf, M. O.

Montjovent, F. Borlat, R. E. Offord, T. N. Wells // J. Biol. Chem. – 1996. – Т. 271 – № 5 – 2599–2603

p.

107. Rabhi-Essafi I. A strategy for high-level expression of soluble and functional human interferon

alpha as a GST-fusion protein in E. coli / I. Rabhi-Essafi, A. Sadok, N. Khalaf, D. M. Fathallah //

Protein Eng. Des. Sel. PEDS – 2007. – Т. 20 – № 5 – 201–209 p.

108. Raj D. Keratinocyte apoptosis in epidermal development and disease / D. Raj, D. E. Brash, D.

Grossman // J. Invest. Dermatol. – 2006. – Т. 126 – № 2 – 243–257 p.

138

109. Reichelt P. Single step protocol to purify recombinant proteins with low endotoxin contents / P.

Reichelt, C. Schwarz, M. Donzeau // Protein Expr. Purif. – 2006. – Т. 46 – № 2 – 483–488 p.

110. Renert-Yuval Y. IL36RN mutation causing generalized pustular psoriasis in a Palestinian patient /

Y. Renert-Yuval, L. Horev, S. Babay, S. Tams, Y. Ramot, A. Zlotogorski, V. Molho-Pessach // Int. J.

Dermatol. – 2014. – Т. 53 – № 7 – 866–868 p.

111. Rossi-Semerano L. First clinical description of an infant with interleukin-36-receptor antagonist

deficiency successfully treated with anakinra / L. Rossi-Semerano, M. Piram, C. Chiaverini, D. De

Ricaud, A. Smahi, I. Koné-Paut // Pediatrics – 2013. – Т. 132 – № 4 – e1043-1047 p.

112. Ryoo J.Y. Meta-analysis of the Efficacy and Safety of Secukinumab for the Treatment of Plaque

Psoriasis / J. Y. Ryoo, H.-J. Yang, E. Ji, B. K. Yoo // Ann. Pharmacother. – 2016. – Т. 50 – № 5 –

341–351 p.

113. Saikaly S.K. Biologics and Pediatric Generalized Pustular Psoriasis: An Emerging Therapeutic

Trend / S. K. Saikaly, M. Mattes // Cureus – 2016. – Т. 8 – № 6 – e652 p.

114. Salem S.A.M. Bath psoralen+ultraviolet A photochemotherapy vs. narrow band-ultraviolet B in

psoriasis: a comparison of clinical outcome and effect on circulating T-helper and T-

suppressor/cytotoxic cells / S. A. M. Salem, M. A. E.-T. Barakat, C. M. Z. M. Morcos //

Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. – 2010. – Т. 26 – № 5 – 235–242 p.

115. Scheiermann P. Application of IL-36 receptor antagonist weakens CCL20 expression and impairs

recovery in the late phase of murine acetaminophen-induced liver injury / P. Scheiermann, M.

Bachmann, L. Härdle, T. Pleli, A. Piiper, B. Zwissler, J. Pfeilschifter, H. Mühl // Sci. Rep. – 2015. – Т.

5 – 8521 p.

116. Schmitz J. IL-33, an interleukin-1-like cytokine that signals via the IL-1 receptor-related protein

ST2 and induces T helper type 2-associated cytokines / J. Schmitz, A. Owyang, E. Oldham, Y. Song,

E. Murphy, T. K. McClanahan, G. Zurawski, M. Moshrefi, J. Qin, X. Li, D. M. Gorman, J. F. Bazan,

R. A. Kastelein // Immunity – 2005. – Т. 23 – № 5 – 479–490 p.

117. Sehgal V.N. Anthralin/dithranol in dermatology / V. N. Sehgal, P. Verma, A. Khurana // Int. J.

Dermatol. – 2014. – Т. 53 – № 10 – e449-460 p.

139

118. Setta-Kaffetzi N. Rare pathogenic variants in IL36RN underlie a spectrum of psoriasis-associated

pustular phenotypes / N. Setta-Kaffetzi, A. A. Navarini, V. M. Patel, V. Pullabhatla, A. E. Pink, S.-E.

Choon, M. A. Allen, A. D. Burden, C. E. M. Griffiths, M. M. B. Seyger, B. Kirby, R. C. Trembath, M.

A. Simpson, C. H. Smith, F. Capon, J. N. Barker // J. Invest. Dermatol. – 2013. – Т. 133 – № 5 –

1366–1369 p.

119. Sharaf N. Long-range DNA interactions at the IL-1/IL-36/IL-37 gene cluster (2q13) are induced

by activation of monocytes / N. Sharaf, M. J. Nicklin, F. S. di Giovine // Cytokine – 2014. – Т. 68 – №

1 – 16–22 p.

120. Shirokov D.A. [Designing of hybrid human interferon alfa-2 strain-producers and the use of

enteropeptidase for obtaining N-terminal methionine-free interferons] / D. A. Shirokov, V. V.

Riabichenko, R. I. Akishina, T. P. Ospel’nikova, A. V. Glazunov, G. G. Chestukhina, V. P. Veĭko //

Mol. Biol. (Mosk.) – 2011. – Т. 45 – № 3 – 510–516 p.

121. Sims J.E. A new nomenclature for IL-1-family genes / J. E. Sims, M. J. Nicklin, J. F. Bazan, J. L.

Barton, S. J. Busfield, J. E. Ford, R. A. Kastelein, S. Kumar, H. Lin, J. J. Mulero, J. Pan, Y. Pan, D. E.

Smith, P. R. Young // Trends Immunol. – 2001. – Т. 22 – № 10 – 536–537 p.

122. Sims J.E. The IL-1 family: regulators of immunity / J. E. Sims, D. E. Smith // Nat. Rev. Immunol.

– 2010. – Т. 10 – № 2 – 89–102 p.

123. Smith D.E. Four new members expand the interleukin-1 superfamily / D. E. Smith, B. R.

Renshaw, R. R. Ketchem, M. Kubin, K. E. Garka, J. E. Sims // J. Biol. Chem. – 2000. – Т. 275 – № 2

– 1169–1175 p.

124. Solbiati J. Processing of the N termini of nascent polypeptide chains requires deformylation prior

to methionine removal / J. Solbiati, A. Chapman-Smith, J. L. Miller, C. G. Miller, J. E. Cronan // J.

Mol. Biol. – 1999. – Т. 290 – № 3 – 607–614 p.

125. Sugiura K. IL36RN mutations underlie impetigo herpetiformis / K. Sugiura, N. Oiso, S. Iinuma,

H. Matsuda, M. Minami-Hori, A. Ishida-Yamamoto, A. Kawada, H. Iizuka, M. Akiyama // J. Invest.

Dermatol. – 2014. – Т. 134 – № 9 – 2472–2474 p.

140

126. Sugiura K. A novel IL36RN/IL1F5 homozygous nonsense mutation, p.Arg10X, in a Japanese

patient with adult-onset generalized pustular psoriasis / K. Sugiura, T. Takeichi, M. Kono, Y. Ogawa,

Y. Shimoyama, Y. Muro, M. Akiyama // Br. J. Dermatol. – 2012. – Т. 167 – № 3 – 699–701 p.

127. Thomas C. Structure of the activating IL-1 receptor signaling complex / C. Thomas, J. F. Bazan,

K. C. Garcia // Nat. Struct. Mol. Biol. – 2012. – Т. 19 – № 4 – 455–457 p.

128. Thomi R. Increased expression of the interleukin-36 cytokines in lesions of hidradenitis

suppurativa / R. Thomi, M. Kakeda, N. Yawalkar, C. Schlapbach, R. E. Hunger // J. Eur. Acad.

Dermatol. Venereol. JEADV – 2017.

129. Thorlakson H.H. Lysophosphatidic acid induces expression of genes in human oral keratinocytes

involved in wound healing / H. H. Thorlakson, S. A. Engen, O. Schreurs, K. Schenck, I. J. S. Blix //

Arch. Oral Biol. – 2017. – Т. 80 – 153–159 p.

130. Tomuschat C. Altered expression of IL36γ and IL36 receptor (IL1RL2) in the colon of patients

with Hirschsprung’s disease / C. Tomuschat, A. M. O’Donnell, D. Coyle, P. Puri // Pediatr. Surg. Int. –

2017. – Т. 33 – № 2 – 181–186 p.

131. Torsekar R. Topical Therapies in Psoriasis / R. Torsekar, M. M. Gautam // Indian Dermatol.

Online J. – 2017. – Т. 8 – № 4 – 235–245 p.

132. Tortola L. Psoriasiform dermatitis is driven by IL-36-mediated DC-keratinocyte crosstalk / L.

Tortola, E. Rosenwald, B. Abel, H. Blumberg, M. Schäfer, A. J. Coyle, J.-C. Renauld, S. Werner, J.

Kisielow, M. Kopf // J. Clin. Invest. – 2012. – Т. 122 – № 11 – 3965–3976 p.

133. Towne J.E. Interleukin (IL)-1F6, IL-1F8, and IL-1F9 signal through IL-1Rrp2 and IL-1RAcP to

activate the pathway leading to NF-kappaB and MAPKs / J. E. Towne, K. E. Garka, B. R. Renshaw,

G. D. Virca, J. E. Sims // J. Biol. Chem. – 2004. – Т. 279 – № 14 – 13677–13688 p.

134. Towne J.E. Interleukin-36 (IL-36) ligands require processing for full agonist (IL-36α, IL-36β, and

IL-36γ) or antagonist (IL-36Ra) activity / J. E. Towne, B. R. Renshaw, J. Douangpanya, B. P. Lipsky,

M. Shen, C. A. Gabel, J. E. Sims // J. Biol. Chem. – 2011. – Т. 286 – № 49 – 42594–42602 p.

135. Tsutsui H. Interleukin-1 Family Cytokines in Liver Diseases / H. Tsutsui, X. Cai, S. Hayashi //

Mediators Inflamm. – 2015. – Т. 2015 – 630265 p.

141

136. Tsutsumi N. The structural basis for receptor recognition of human interleukin-18 / N. Tsutsumi,

T. Kimura, K. Arita, M. Ariyoshi, H. Ohnishi, T. Yamamoto, X. Zuo, K. Maenaka, E. Y. Park, N.

Kondo, M. Shirakawa, H. Tochio, Z. Kato // Nat. Commun. – 2014. – Т. 5 – 5340 p.

137. Veerdonk F.L. van de IL-38 binds to the IL-36 receptor and has biological effects on immune

cells similar to IL-36 receptor antagonist / F. L. van de Veerdonk, A. K. Stoeckman, G. Wu, A. N.

Boeckermann, T. Azam, M. G. Netea, L. A. B. Joosten, J. W. M. van der Meer, R. Hao, V. Kalabokis,

C. A. Dinarello // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 2012. – Т. 109 – № 8 – 3001–3005 p.

138. Vigne S. IL-36R ligands are potent regulators of dendritic and T cells / S. Vigne, G. Palmer, C.

Lamacchia, P. Martin, D. Talabot-Ayer, E. Rodriguez, F. Ronchi, F. Sallusto, H. Dinh, J. E. Sims, C.

Gabay // Blood – 2011. – Т. 118 – № 22 – 5813–5823 p.

139. Vigne S. IL-36 signaling amplifies Th1 responses by enhancing proliferation and Th1

polarization of naive CD4+ T cells / S. Vigne, G. Palmer, P. Martin, C. Lamacchia, D. Strebel, E.

Rodriguez, M. L. Olleros, D. Vesin, I. Garcia, F. Ronchi, F. Sallusto, J. E. Sims, C. Gabay // Blood –

2012. – Т. 120 – № 17 – 3478–3487 p.

140. Vlasak J. Identification and characterization of asparagine deamidation in the light chain CDR1 of

a humanized IgG1 antibody / J. Vlasak, M. C. Bussat, S. Wang, E. Wagner-Rousset, M. Schaefer, C.

Klinguer-Hamour, M. Kirchmeier, N. Corvaïa, R. Ionescu, A. Beck // Anal. Biochem. – 2009. – Т. 392

– № 2 – 145–154 p.

141. Wakankar A.A. Formulation considerations for proteins susceptible to asparagine deamidation

and aspartate isomerization / A. A. Wakankar, R. T. Borchardt // J. Pharm. Sci. – 2006. – Т. 95 – № 11

– 2321–2336 p.

142. Wang D. Structural insights into the assembly and activation of IL-1β with its receptors / D.

Wang, S. Zhang, L. Li, X. Liu, K. Mei, X. Wang // Nat. Immunol. – 2010. – Т. 11 – № 10 – 905–911

p.

143. Wang J. A systematic review on the efficacy and safety of Infliximab in patients with psoriasis /

J. Wang, Q. Zhan, L. Zhang // Hum. Vaccines Immunother. – 2016. – Т. 12 – № 2 – 431–437 p.

144. Wang W. Dual effects of Tween 80 on protein stability / W. Wang, Y. J. Wang, D. Q. Wang //

Int. J. Pharm. – 2008. – Т. 347 – № 1–2 – 31–38 p.

142

145. Weber A. Interleukin-1 (IL-1) pathway / A. Weber, P. Wasiliew, M. Kracht // Sci. Signal. – 2010.

– Т. 3 – № 105 – cm1 p.

146. Wetzel R. Assignment of the disulphide bonds of leukocyte interferon / R. Wetzel // Nature –

1981. – Т. 289 – № 5798 – 606–607 p.

147. Winter G. Formulation Strategies for Recombinant Protein and Related Biotech Drugs / под ред.

O. Kayser, H. Warzecha. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2012. – 235–256 p.

148. Yan R. Topical calcipotriol/betamethasone dipropionate for psoriasis vulgaris: A systematic

review / R. Yan, S. Jiang, Y. Wu, X.-H. Gao, H.-D. Chen // Indian J. Dermatol. Venereol. Leprol. –

2016. – Т. 82 – № 2 – 135–144 p.

149. Yao J. Interleukin-1 (IL-1)-induced TAK1-dependent Versus MEKK3-dependent NFkappaB

activation pathways bifurcate at IL-1 receptor-associated kinase modification / J. Yao, T. W. Kim, J.

Qin, Z. Jiang, Y. Qian, H. Xiao, Y. Lu, W. Qian, M. F. Gulen, N. Sizemore, J. DiDonato, S. Sato, S.

Akira, B. Su, X. Li // J. Biol. Chem. – 2007. – Т. 282 – № 9 – 6075–6089 p.

150. Yi G. Structural and functional attributes of the Interleukin-36 receptor / G. Yi, J. A. Ybe, S. S.

Saha, G. Caviness, E. Raymond, R. Ganesan, M. L. Mbow, C. C. Kao // J. Biol. Chem. – 2016.

151. Yordanova D. Molecular Modeling of Triton X Micelles: Force Field Parameters, Self-Assembly,

and Partition Equilibria / D. Yordanova, I. Smirnova, S. Jakobtorweihen // J. Chem. Theory Comput. –

2015. – Т. 11 – № 5 – 2329–2340 p.

152. Yuan X. Role of IL-38 and Its Related Cytokines in Inflammation// Mediators of Inflammation

[Электронный ресурс]. URL: https://www.hindawi.com/journals/mi/2015/807976/ (дата обращения:

31.07.2017).

153. Zelickson B.D. Generalized pustular psoriasis. A review of 63 cases / B. D. Zelickson, S. A.

Muller // Arch. Dermatol. – 1991. – Т. 127 – № 9 – 1339–1345 p.

154. Zimmerman T. Simultaneous metal chelate affinity purification and endotoxin clearance of

recombinant antibody fragments / T. Zimmerman, C. Petit Frère, M. Satzger, M. Raba, M. Weisbach,

K. Döhn, A. Popp, M. Donzeau // J. Immunol. Methods – 2006. – Т. 314 – № 1–2 – 67–73 p.

143

155. Bachmann M. IL-36γ/IL-1F9, an Innate T-bet Target in Myeloid Cells / M. Bachmann, P.

Scheiermann, L. Härdle, J. Pfeilschifter, H. Mühl // J. Biol. Chem. – 2012. – Т. 287 – № 50 – 41684–

41696 p.

156. Bowers P. Antibodies directed against interleukin 36 receptor (il-36r) / P. Bowers, A. J.

Mcknight, D. J. King, M. Londei – 2016.

157. Bufler P. A complex of the IL-1 homologue IL-1F7b and IL-18-binding protein reduces IL-18

activity / P. Bufler, T. Azam, F. Gamboni-Robertson, L. L. Reznikov, S. Kumar, C. A. Dinarello, S.-H.

Kim // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 2002. – Т. 99 – № 21 – 13723–13728 p.

158. Cowen E.W. DIRA, DITRA, and New Insights Into Pathways of Skin Inflammation / E. W.

Cowen, R. Goldbach-Mansky // Arch. Dermatol. – 2012. – Т. 148 – № 3 – 381–384 p.

159. Davies M.J. Protein oxidation and peroxidation / M. J. Davies // Biochem. J. – 2016. – Т. 473 –

№ Pt 7 – 805–825 p.

160. FitzGerald O. Psoriatic arthritis: from pathogenesis to therapy / O. FitzGerald, R. Winchester //

Arthritis Res. Ther. – 2009. – Т. 11 – № 1 – 214 p.

161. Gu T. Clouding of Triton X-114: The effect of added electrolytes on the cloud point of Triton X-

114 in the presence of ionic surfactants / T. Gu, P. A. Galera-Gómez // Colloids Surf. Physicochem.

Eng. Asp. – 1995. – Т. 104 – № 2–3 – 307–312 p.

162. Hirel P.H. Extent of N-terminal methionine excision from Escherichia coli proteins is governed

by the side-chain length of the penultimate amino acid. / P. H. Hirel, M. J. Schmitter, P. Dessen, G.

Fayat, S. Blanquet // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 1989. – Т. 86 – № 21 – 8247–8251 p.

163. Johnston A. IL-1F5, F6, F8, and F9: a novel IL-1 family signaling system that is active in

psoriasis and promotes keratinocyte antimicrobial peptide expression / A. Johnston, X. Xing, A. M.

Guzman, M. Riblett, C. M. Loyd, N. L. Ward, C. Wohn, E. P. Prens, F. Wang, L. E. Maier, S. Kang, J.

J. Voorhees, J. T. Elder, J. E. Gudjonsson // J. Immunol. Baltim. Md 1950 – 2011. – Т. 186 – № 4 –

2613–2622 p.

164. Li S. Extracellular forms of IL-37 inhibit innate inflammation in vitro and in vivo but require the

IL-1 family decoy receptor IL-1R8 / S. Li, C. P. Neff, K. Barber, J. Hong, Y. Luo, T. Azam, B. E.

144

Palmer, M. Fujita, C. Garlanda, A. Mantovani, S. Kim, C. A. Dinarello // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.

A. – 2015. – Т. 112 – № 8 – 2497–2502 p.

165. Lorenzo J.R. Prediction of Spontaneous Protein Deamidation from Sequence-Derived Secondary

Structure and Intrinsic Disorder / J. R. Lorenzo, L. G. Alonso, I. E. Sánchez // PLOS ONE – 2015. – Т.

10 – № 12 – e0145186 p.

166. Molgora M. Regulatory Role of IL-1R8 in Immunity and Disease / M. Molgora, I. Barajon, A.

Mantovani, C. Garlanda // Front. Immunol. – 2016. – Т. 7.

167. Mulero J.J. IL1HY1: A Novel Interleukin-1 Receptor Antagonist Gene / J. J. Mulero, A. M. Pace,

S. T. Nelken, D. B. Loeb, T. R. Correa, R. Drmanac, J. E. Ford // Biochem. Biophys. Res. Commun. –

1999. – Т. 263 – № 3 – 702–706 p.

168. Nestle F.O. Psoriasis / F. O. Nestle, D. H. Kaplan, J. Barker // N. Engl. J. Med. – 2009. – Т. 361 –

№ 5 – 496–509 p.

169. Newton D.L. Single Amino Acid Substitutions at the N-Terminus of a Recombinant Cytotoxic

Ribonuclease Markedly Influence Biochemical and Biological Properties / D. L. Newton, L. Boque, A.

Wlodawer, C. Y. Huang, S. M. Rybak // Biochemistry (Mosc.) – 1998. – Т. 37 – № 15 – 5173–5183 p.

170. Parikh J. Clouding Behavior and Thermodynamic Study of Nonionic Surfactants in Presence of

Additives / J. Parikh, J. Rathore, D. Bhatt, M. Desai // J. Dispers. Sci. Technol. – 2013. – Т. 34 – № 10

– 1392–1398 p.

171. Pryde J.G. Fractionation of membrane proteins by temperature-induced phase separation in Triton

X-114. Application to subcellular fractions of the adrenal medulla. / J. G. Pryde, J. H. Phillips //

Biochem. J. – 1986. – Т. 233 – № 2 – 525–533 p.

172. Rossi-Semerano L. Tolerance and efficacy of off-label anti-interleukin-1 treatments in France: a

nationwide survey / L. Rossi-Semerano, B. Fautrel, D. Wendling, E. Hachulla, C. Galeotti, L.

Semerano, I. Touitou, I. Koné-Paut // Orphanet J. Rare Dis. – 2015. – Т. 10.

173. Shen T.J. Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli. / T. J. Shen, N.

T. Ho, V. Simplaceanu, M. Zou, B. N. Green, M. F. Tam, C. Ho // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. –

1993. – Т. 90 – № 17 – 8108–8112 p.

145

174. Smith A.J.P. Cytokine and cytokine receptor gene polymorphisms and their functionality / A. J. P.

Smith, S. E. Humphries // Cytokine Growth Factor Rev. – 2009. – Т. 20 – № 1 – 43–59 p.

175. Teodorowicz M. Optimized Triton X-114 assisted lipopolysaccharide (LPS) removal method

reveals the immunomodulatory effect of food proteins / M. Teodorowicz, O. Perdijk, I. Verhoek, C.

Govers, H. F. J. Savelkoul, Y. Tang, H. Wichers, K. Broersen // PLOS ONE – 2017. – Т. 12 – № 3 –

e0173778 p.

176. Weber J.R. Determination of Nonionic Ethylene Oxide Adduct in Some Commercial Products. /

J. R. Weber, E. F. Degner, K. S. Bahjat // Anal. Chem. – 1964. – Т. 36 – № 3 – 678–679 p.

177. Zhang J. Endotoxin Removal from Recombinant Human-like Collagen Preparations by Triton X-

114 Two-phase Extraction / J. Zhang, C. Zhu, D. Fan // Biotechnology(Faisalabad) – 2013. – Т. 12 –

№ 2 – 135–139 p.

146

9. ПРИЛОЖЕНИЕ

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Регистрационное удостоверение № ______________

Дата регистрации «____»________________ 20___ г.

Федеральное государственное унитарное предприятие

«Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов»

Федерального медико-биологического агентства

(ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» ФМБА России)

Россия, 197110, г. Санкт-Петербург, ул.Пудожская, д.7

ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ ПРЕДПРИЯТИЯ

__________________________________________(номер)

Рекомбинантный рецепторный антагонист интерлейкина-36 человека

субстанция

ПРОИЗВОДИТЕЛЬ

ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» ФМБА России, Россия

ФАСОВЩИК (ПЕРВИЧНАЯ УПАКОВКА)


УПАКОВЩИК (ВТОРИЧНАЯ (ПОТРЕБИТЕЛЬСКАЯ) УПАКОВКА)


ВЫПУСКАЮЩИЙ КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА


147

СПЕЦИФИКАЦИЯ

«Рекомбинантный рецепторный антагонист интерлейкина-36 человека», субстанция

Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-

исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального медико-

биологического агентства, Россия

ПОКАЗАТЕЛИ МЕТОДЫ НОРМЫ

Описание Визуальный Прозрачная или слегка

опалесцирующая бесцветная

жидкость

Подлинность:




1. Биологический, по

разделу «Специфическая

активность»

2. Электрофорез в ПААГ

3. Обращенно-фазная

высокоэффективная

жидкостная

хроматография (ОФ-

ВЭЖХ), по разделу

«Посторонние примеси»

4. Капиллярное

изоэлектрическое

фокусирование (кИЭФ), по

разделу «Родственные

примеси»

1. Должен достоверно подавлять

продукцию интерлейкина-8

клетками линии А-549/IL36R+,

вызванную интерлейкином-36 гамма

2. На электрофореграмме в

восстанавливающих условиях

должна быть 1 полоса рецепторного

антагониста интерлейкина-36 с

кажущейся молекулярной массой

(17000±500) Да

3. Время удерживания основного

пика на хроматограмме раствора

субстанции должно соответствовать

времени удерживания основного

пика рабочего стандартного образца

4. Изоэлектрическая точка основной

формы белка должна быть

(5,230,05)

148


Прозрачность ГФ ХIII, визуальный Должен быть прозрачным по

сравнению с водой или выдерживать

сравнение с эталоном I

Цветность ГФ ХIII, визуальный Должен быть бесцветным

рН ГФ ХIII,

Потенциометрический

От 6,0 до 6,5

Посторонние

примеси

1. ВЭЖХ

2. ОФ-ВЭЖХ

1. Суммарное содержание

посторонних,

неидентифицированных примесей не

должно превышать 5 %, содержание

единичной неидентифицированной

примеси – не более 2,5 % от

площади основного пика

2. Суммарное содержание

посторонних примесей не должно

превышать 5 %.

Родственные

примеси

кИЭФ Содержание дезамидированной

формы с pI (5,060,05) не должно

превышать 5 %.

Белок клеток-

продуцентов

Иммуноферментный

анализ

Не более 100 нг на 1 мг белка

ДНК клеток-

продуцентов

Полимеразная цепная

реакция в реальном

времени

Не более 2 нг на 1 мг белка

Бактериальные

эндотоксины

ГФ ХIII Не более 10 ЕЭ на 1 мг белка

Аномальная

токсичность

ГФ ХIII Должен быть нетоксичным

149


Стерильность ГФ ХIII, метод прямого

посева

Должен быть стерильным

Количественное

определение:




ГФ ХIII,

спектрофотометрический

метод

Не менее 10,0 мг/мл

Специфическая

активность

Биологический Должен достоверно подавлять

продукцию ИЛ-8 клетками линии А-

549/IL36R+, вызванную 10 нг/мл

интерлейкина-36 гамма, в

концентрации не более 12 нг/мл

Упаковка 10 или 20 мл в стеклянной бутылке

для крови, трансфузионных и

инфузионных препаратов,

укупоренной пробкой из резины и

обжатой колпачком алюминиевым

или в пластиковой бутылке из

перфторированного сополимера

этиленпропилена, укупоренной

навинчиваемой крышкой из

сополимера этилентетрафторэти-

лена. 1 бутылка в пачке из картона

Маркировка В соответствии с ФСП

Транспортирование СП 3.3.2.1248-03 При температуре от 2 до 8 °С.

Допускается транспортирование при

темп. от 2 до 25 °С в течение 5 сут

Хранение СП 3.3.2.1248-03 При температуре от 2 до 8 °С

Срок годности 2 года

150

Настоящая фармакопейная статья предприятия распространяется на «Рекомбинантный

рецепторный антагонист интерлейкина-36 человека», субстанцию, применяемую для

изготовления стерильных лекарственных средств. Субстанцию получают биотехнологическим

способом с использованием рекомбинантных технологий на основе клеток-продуцентов E.coli

BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15a). Субстанция представляет собой рекомбинантный

рецепторный антагонист интерлейкина-36 человека в буферном растворе с рН 6,0-6.5,

содержащем натрия цитрат (EP/BP/USP, ГОСТ 245-76) – 14,705 мг, динатрия эдетат

(EP/BP/USP, ГОСТ 10652-73) – 0,3362 мг, полисорбат-80 (EP/BP/USP, ФС 42-2540-88) – 0,099

мг, воду для инъекций (ФС 42-2620-97) – до 1 мл.

МНН: не существует

Номенклатурное название

Рекомбинантный рецепторный антагонист интерлейкина-36 человека относится к

цитокинам семейства интерлейкина-1.

Номенклатурного названия IUPAC и IUMAB не существует.

Официальное научное полное название – рецепторный антагонист интерлейкина-36

(interleukin-36 receptor antagonist).

Первичная структура

Рекомбинантный рецепторный антагонист интерлейкина-36 человека состоит из 154

аминокислот, не содержит N-концевого метионина, по физико-химическим и биологическим

свойствам полностью идентичен природному белку.

Аминокислотная последовательность:

Val-Leu-Ser-Gly-Ala-Leu-Cys-Phe-Arg-Met-Lys-Asp-Ser-Ala-Leu-Lys-Val-Leu-

Tyr-Leu-His-Asn-Asn-Gln-Leu-Leu-Ala-Gly-Gly-Leu-His-Ala-Gly-Lys-Val-Ile-

Lys-Gly-Glu-Glu-Ile-Ser-Val-Val-Pro-Asn-Arg-Trp-Leu-Asp-Ala-Ser-Leu-Ser-

Pro-Val-Ile-Leu-Gly-Val-Gln-Gly-Gly-Ser-Gln-Cys-Leu-Ser-Cys-Gly-Val-Gly-

Gln-Glu-Pro-Thr-Leu-Thr-Leu-Glu-Pro-Val-Asn-Ile-Met-Glu-Leu-Tyr-Leu-Gly-

Ala-Lys-Glu-Ser-Lys-Ser-Phe-Thr-Phe-Tyr-Arg-Arg-Asp-Met-Gly-Leu-Thr-Ser-

Ser-Phe-Glu-Ser-Ala-Ala-Tyr-Pro-Gly-Trp-Phe-Leu-Cys-Thr-Val-Pro-Glu-Ala-

Asp-Gln-Pro-Val-Arg-Leu-Thr-Gln-Leu-Pro-Glu-Asn-Gly-Gly-Trp-Asn-Ala-Pro-

Ile-Thr-Asp-Phe-Tyr-Phe-Gln-Gln-Cys-Asp

Эмпирическая формула: C756H1172N196O223S8.

Молекулярная масса: 16,8 кДа.

Описание. Прозрачная или слегка опалесцирующая бесцветная жидкость.

151

Подлинность. Определяют четырьмя методами: биологический (1), электрофорез в

ПААГ (2), ОФ-ВЭЖХ (3), кИЭФ (4).

1. Должен достоверно подавлять продукцию интерлейкина-8 клетками линии А-

549/IL36R+, вызванную интерлейкином-36 гамма. Определяют биологическим методом по

разделу «Специфическая активность».

2. На электрофореграмме должна быть одна полоса рецепторного антагониста

интерлейкина-36 с кажущейся молекулярной массой (17000±500) Да. Определяют методом

электрофореза в полиакриламидном геле (градиент 4-20 %) в присутствии додецилсульфата

натрия в восстанавливающих условиях.

Электрофорез выполняют на приборе типа BioRad, Mini-Protean Tetra Cell, используя

набор стандартных белков с молекулярной массой от 14400 до 116000 Да (Thermo Fisher

Scientific, кат. №26610). Полимеризацию геля проводят между пластинами из стекла в

специальном приспособлении для заливки геля, входящем в комплект прибора или

аналогичном в соответствии с инструкцией к прибору.

Приготовление 30 % раствора акриламида/бисакриламида. 29,2 г акриламида («Серва»,

кат. № 10675 или аналогичного качества) и 0,8 г N,N’-метиленбисакриламида («Серва», кат. №

29195 или аналогичного качества) помещают в химический стакан вместимостью 100 мл,

растворяют в 70 мл воды при перемешивании. Раствор фильтруют через фильтр типа «Syringе

Filter NY» с размером пор 0,45 мкм (Corning, кат. №431225) и хранят в закрытом флаконе

темного стекла при температуре 4-6 °С в течение 1 мес.

Приготовление 1,5 М трис-гидрохлоридного буферного раствора рН 8,8. 9,08 г трис-

(оксиметил)аминометана («Серва», кат. № 37190 или аналогичного качества) помещают в

мерный химический стакан вместимостью 100 мл, растворяют при перемешивании в 40 мл

воды и потенциометрически доводят рН раствора до значения 8,8 кислотой

хлористоводородной концентрированной. Объем раствора доводят водой до 50 мл,

перемешивают. Раствор фильтруют через фильтр типа «Syringе Filter NY» с размером пор 0,45

мкм (Corning, кат.№ 431225,) и хранят при температуре 4-6 °С в течение 3 мес в закрытом

флаконе.

Приготовление 0,5 М трис-гидрохлоридного буферного раствора рН 6,8. 3,03 г трис-

(оксиметил)аминометана помещают в мерный химический стакан вместимостью 100 мл и

растворяют при перемешивании в 40 мл воды, потенциометрически доводят рН раствора до

значения 6,8 кислотой хлористоводоводородной концентрированной. Объем раствора доводят

152

водой до 50 мл и перемешивают. Раствор фильтруют через фильтр типа Syring Filter NY с

размером пор 0,45 мкм (Corning, кат. № 431225) и хранят при температуре 4-6 °С в течение 3

мес в закрытом флаконе.

Приготовление 10 % раствора натрия додецилсульфата (ДСН). 10,0 г натрия

додецил сульфата («Серва», кат. № 20760 или аналогичного качества) помещают в мерный

химический стакан вместимостью 100 мл, добавляют 90 мл воды и перемешивают до полного

растворения. Хранят при температуре 18-25 °С.

Приготовление 10 % раствора аммония персульфата (ПСА). 100 мг аммония

персульфата («Серва», кат. № 13375 или аналогичного качества) помещают во флакон

вместимостью 2-5 мл, растворяют в 1,0 мл воды при перемешивании встряхиванием. Раствор

готовят непосредственно перед использованием.

Приготовление электродного буферного раствора. Используют буферный рабочий

раствор для электрофореза в системе натрия додецилсульфат - полиакриламидный гель (ГФ

XII,ч.1, с.334). Хранят при температуре 4-6 °С в течение 6 мес.

Приготовление раствора для приготовления образца. В пробирку вместимостью 10 мл

помещают 2,5 мл 0,5 М трис-гидрохлоридного буферного раствора рН 6,8, 4,0 мл 10 %

раствора ДСН, 2,0 мл глицерина, 1,0 мл β-меркаптоэтанола (Sigma, кат. № М 7154 или

аналогичного качества), 0,5 мл воды и 4,0 мг бромфенолового синего, тщательно

перемешивают. Срок годности раствора 2 недели при температуре 18-25 °С.

Приготовление раствора концентрирующего геля. В пробирку вместимостью 10 мл с

помощью автоматических микропипеток с переменным объемом помещают 0,76 мл воды, 0,31

мл 0,5 М трис-гидрохлоридного буферного раствора с pH 6,8, 0,17 мл 30 % раствора

акриламида/бисакриламида, 0,012 мл 10 % раствора ДСН, 0,006 мл 10 % раствора ПСА, 0,001

мл тетраметил-этилендиамина (ТЕМЕД, «Серва», кат. № 35925 или аналогичного качества) и

тщательно перемешивают. Раствор готовят непосредственно перед использованием.

Приготовление раствора исследуемого препарата. 10 мкл образца исследуемой

субстанции помещают в пробирку типа Эппендорф, добавляют 90 мкл дистиллированной воды,

100 мкл раствора для приготовления образца, выдерживают в твердотельном термостате при

температуре 70° в течение 10 мин и охлаждают до температуры 18-25 °С. Раствор готовят

непосредственно перед использованием.

Заливка геля. Градиентный смеситель (Amersham Biosciences, кат. № 18-1013-72 или

подобный) устанавливают на магнитной мешалке, ячейку с выходным отверстием соединяют

153

шлангом с перистальтическим насосом, соединение между ячейками перекрывают. В ячейку

без выходного отверстия с помощью автоматических микропипеток с переменным объемом

помещают 0,325 мл 30 % раствора акриламид/бисакриламида, 0,625 мл 1,5 М трис-

гидрохлоридного буферного раствора pH 8,8, 1,525 мл воды, 0,025 мл 10 % раствора ДСН,

тщательно перемешивают («легкий» раствор - 4% Т, 2,7 % С).

В ячейку с выходным отверстием с помощью автоматических микропипеток с

переменным объемом помещают 1,65 мл 30 % раствора акриламида/бисакриламида, 0,625 мл

1,5 М трис-гидрохлоридного буферного раствора pH 8,8, 0,175 мл воды и 0,025 мл 10 %

раствора ДСН («тяжелый» раствор – 20 % Т, 2,7 % С). Полученный раствор тщательно

перемешивают на магнитной мешалке, помещая в ячейку магнит для перемешивания.

Растворы готовят непосредственно перед использованием. В каждую ячейку добавляют

по 0,025 мл 10 % раствора персульфата аммония и 0,002 мл ТЕМЕД («Серва», кат. № 35925 или

аналогичного качества), включают насос и открывают соединение между ячейками.

Заливку растворов между стеклами установки осуществляют с помощью

перистальтического насоса со скоростью около 25 мл/ч при постоянном перемешивании в

ячейке с «тяжелым» раствором. Затем с помощью шприца (ТУ 64-1-378-83 или аналогичный)

сверху аккуратно наслаивают 100 мкл изопропанола. Время полимеризации 10-15 мин при

температуре 18-20 °С. После окончания процесса полимеризации, о чем свидетельствует

появление четкой границы раздела между слоями изопропанола и геля, изопропанол сливают

через край, поверхность геля тщательно просушивают с помощью фильтровальной бумаги.

Потом между стеклами при помощи шприца заливают раствор концентрирующего геля и

вставляют гребенку с 10 зубьями толщиной, равной толщине прокладок (1,00 мм). Время

полимеризации 10-15 мин при температуре 18-20 °С.

Проведение электрофореза

Штатив вынимают из столика для заливки геля и устанавливают в ячейке с электродами,

которую затем помещают в ванну. Ванну и ячейку заливают электродным буферным раствором

таким образом, чтобы он был выше слоя геля на 0,5-0,6 см. Затем вынимают гребенку из

концентрирующего геля. Образцы исследуемого препарата наносят в объеме 5 мкл на дорожку,

раствор стандартных белков – также 5 мкл на дорожку. Все образцы наслаиваются на дно лунок

под слой электродного буферного раствора с помощью микрошприца (Hamilton или

аналогичного).

154

Сразу после нанесения образцов ванну закрывают крышкой и подключают электроды к

источнику питания. На источнике питания устанавливают напряжение 200 В. Процесс

заканчивают, когда лидирующий краситель достигнет нижней границы стекол. Длительность

электрофореза (45 5) мин. По окончании процесса отключают источник питания, разбирают

электрофоретическую установку и освобождают гель.

Гель переносят в ванночку с чистой дистиллированной водой на 15 минут. Затем воду

сливают и заливают гель коммерческим окрашивающим раствором PageBlue Protein Staining

Solution (Thermo Fisher Scientific, кат.№24620) объемом около 15 мл и выдерживают в течение

60 мин. Затем гель трехкратно отмывают чистой дистиллированной водой. Объем воды для

одной отмывки около 30 мл, продолжительность отмывки 1 - 2 мин.

После отмывки геля строят градуировочную зависимость длины пробега полосы от

десятичного логарифма молекулярной массы маркерных белков, по которой определяют

кажущуюся молекулярную массу исследуемого образца.

3. Время удерживания основного пика на хроматограмме раствора субстанции должно

соответствовать времени удерживания основного пика рабочего стандартного образца.

Определяют методом ОФ-ВЭЖХ по разделу «Посторонние примеси».

4. Изоэлектрическая точка основной формы белка должна быть (5,230,05). Определяют

методом капиллярного изоэлектрического фокусирования (кИЭФ) по разделу «Родственные

примеси».

Прозрачность. Должен быть прозрачным по сравнению с водой или выдерживать

сравнение с эталоном сравнения I (ГФ ХIII, ОФС.1.2.1.007.15).

Цветность. Должен быть бесцветным (ГФ ХIII, ОФС.1.2.1.006.15).

рН. От 6,0 до 6,5 (ГФ ХIII, ОФС. 1.2.1.0004.15, потенциометрически).

Посторонние примеси. Определяют двумя методами: ВЭЖХ (1), ОФ-ВЭЖХ (2).

1. Суммарное содержание посторонних, неидентифицированных примесей не должно

превышать 5 %, содержание единичной неидентифицированной примеси – не более 2,5 % от

площади основного пика. Определение проводят методом эксклюзионной высокоэффективной

жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Приготовление буферного раствора для хроматографии:

155

а) приготовление 0,2 М раствора динатрия гидрофосфата (раствор А). 71,8 г динатрия

гидрофосфата вносят в мерную колбу вместимостью 1 л, добавляют около 700 мл воды,

растворяют и доводят объем раствора водой до метки, перемешивают.

б) приготовление 0,2 М раствора натрия дигидрофосфата (раствор В). 31,2 г натрия

дигидрофосфата вносят в мерную колбу вместимостью 1 л, добавляют около 700 мл воды,

растворяют и доводят объем раствора водой до метки, перемешивают.

в) в мерную колбу вместимостью 1 л вносят 130 мл раствора А, 120 мл раствора В и навеску

аммония сульфата в количестве 26,4 г, растворяют при перемешивании. Затем доводят объем

раствора водой до метки, перемешивают. Значение рН полученного раствора должно быть 6,5

0,1 (контролируют потенциометрически). При необходимости рН раствора доводят до нужного

значения 1 М раствором кислоты хлористоводородной или 1 М раствором натрия гидроксида.

Срок годности растворов 4 дня при температуре 4-6 °С.

Проверка пригодности хроматографической системы

Хроматографическая система считается пригодной, если выполняются следующие

условия:

– относительное стандартное отклонение, рассчитанное для площади основного пика на

основании 6 введений раствора (1) составляет не более 5,0 % (ГФ XI, вып.1, с.199);

– эффективность хроматографической колонки, рассчитанная по основному пику (раствор 1),

должна быть не менее 1500 теоретических тарелок (ГФ XI, вып.1, с.105);

Эффективность хроматографической колонки вычисляют по формуле:

,545,5

2

W

tN

(1)

где: t – время удерживания основного пика, мин;

W – ширина пика у основания, мин.

Коэффициент асимметрии пика, рассчитанный по пику интерлейкина-7 (раствор 1)

должен быть не более 3,0.

Коэффициент асимметрии пика (Т) вычисляют по формуле:

,2

05,0

a

WT

(2)

где: а - расстояние от начала пика на высоте 5 % от базовой линии до

перпендикуляра, проведенного из его вершины, в мм;

156

W0,05 - ширина пика на высоте 5 % от базовой линии, в мм.

0,1 мл препарата разбавляют в 20 раз буферным раствором для хроматографии в мерной

колбе вместимостью 10 мл (раствор с концентрацией 0,5 мг/мл).

40 мкл полученного раствора анализируют на хроматографе высокого давления HP

1O9O M (Hewlett Packard, США) или аналогичного типа с УФ-детектором, получая не менее 5

хроматограмм в следующих условиях:

- Колонка Superdex 75 10/30 GL (GE, США);

- детекция при длине волны 220 нм (с интегратором или комплектом для компьютерной

обработки результатов хроматографии);

- скорость потока подвижной фазы – 0,75 мл/мин;

- подвижная фаза: 0,2 М аммония сульфат, 50 мМ натрия фосфат с рН 6,5 (буферный раствор

для хроматографии);

- время детекции – 30 мин;

- температура колонки – 20 оС;

- масштаб регистрации – 0,05 единиц оптической плотности.

- время удерживания пика рекомбинантного рецепторного антагониста интерлейкина-36

около 20 мин;

- обработка результатов анализа – с помощью интегратора или подходящей компьютерной

программы.

Суммарное содержание посторонних, неидентифицированных примесей или единичной

примеси в процентах от содержания основного вещества (Х) вычисляют по формуле:

,100

xa

x

SS

SX

(3)

где: Sx - сумма площадей минорных пиков или площадь пика единичной

примеси на хроматограмме испытуемого раствора;

Sа - площадь основного пика на хроматограмме испытуемого

раствора;

100 - пересчет в проценты

Результаты анализа считаются достоверными, если выполняются требования теста «Проверка

пригодности хроматографической системы».

157

2. Суммарное содержание посторонних примесей не должно превышать 5 %.

Определение проводят методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной

хроматографии (ОФ-ВЭЖХ).

Хроматографическое исследование образцов проводят на хроматографе высокого

давления НР-1050 с DAD детектором (Hewlett-Packard, СШA) или аналогичном хроматографе,

имеющем градиентную систему подачи элюента, термостат для колонки, УФ-детектор и

систему сбора и обработки данных (интегратор или компьютер с соответствующим

программным обеспечением).

Приготовление буферного раствора А. В конической колбе вместимостью 1 л на весах

взвешивают 699,0 г воды, 300 мл ацетонитрила с учетом плотности 0,782 г/мл, добавляют

1,0 мл трифторуксусной кислоты. Перемешивают и дегазируют любым удобным способом.

Хранят в плотно укупоренном флаконе при температуре 18-25 °С. Срок годности раствора 7

сут.

Приготовление буферного раствора В. В конической колбе вместимостью 1 л на весах

взвешивают 299,0 г воды, 700 мл ацетонитрила с учетом плотности 0,782 г/мл, добавляют

1,0 мл трифторуксусной кислоты. Перемешивают и дегазируют любым удобным способом.

Хранят в плотно укупоренном флаконе при температуре 18-25 °С. Срок годности раствора 7

сут.

Приготовление рабочего раствора определяемого вещества. Концентрация рабочего

раствора исследуемого образца должна быть не менее 1,25 мг/мл, т.е. не менее 25 мкг

рекомбинантного ИЛ-36РА человека на введение в объеме, не превышающем 0,02 мл. Для

приготовления рабочего раствора исследуемый образец субстанции разбавляют в 8 раз. Для

этого в пробирку типа эппендорф помещают 25 мкл исследуемого образца и 175 мкл воды.

Приготовление образцов для калибровки (стандартных образцов). В качестве

калибровочного (стандартного) образца используют раствор рабочего стандартного образца

(РСО) с концентрацией не менее 1,0 мг/мл.

Уравновешивают хроматографическую колонку буферным раствором А минимум в

течение 15 мин с помощью перистальтического насоса.

Хроматографию растворов стандартного образца и испытуемого образца субстанции

проводят в следующих условиях:

158

- колонка Jupiter, 5 мкм, 300 А (Phenomenex), или аналогичная колонка из нержавеющей

стали, длиной 0,25 м и внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная силикагелем С18 для

хроматографии (диаметр частиц 5 мкм, размер пор 300 А);

- детектирование на УФ-детекторе при длине волны 220 нм;

- температура колонки – 35 °С;

- скорость потока подвижной фазы 1,5 мл/мин;

- объем вводимой пробы 20 мкл;

- масштаб регистрации – 0,5 единиц оптической плотности;

- время анализа – 20 мин;

- градиент – 30-70 % ацетонитрила за 20 мин (от 100% буферного раствора А до 100%

буферного раствора B).

- обработка результатов анализа – с помощью интегратора или подходящей компьютерной

программы.

Сравнивают хроматограммы раствора стандартного образца и раствора испытуемого

препарата по количеству пиков и временам их удерживания.

Суммарное содержание посторонних примесей в процентах от содержания основного

вещества (Х) вычисляют по формуле:

,100

xa

x

SS

SX

(4)

Где: Sx - сумма площадей минорных пиков на хроматограмме испытуемого

раствора;

Sа - площадь основного пика на хроматограмме испытуемого раствора


Родственные примеси. Содержание дезамидированной формы с pI (5,060,05) не должно

превышать 5 %. Определяют методом капиллярного изоэлектрического фокусирования

(кИЭФ).

Исследование проводят с помощью системы капиллярного электрофореза «Капель-

105М», или аналогичной, с возможностью детекции на длине волны 280 нм и системой

обработки результатов, предусматривающей интегрирование пиков. Изоэлектрическое

159

фокусирование проводится в капилляре с нейтральным покрытием eCAPTM (Beckman-Coulter,

США). Все растворы готовят на деионизированной воде.

Приготовление анодного электродного раствора – анолита. В пробирку объемом 15 мл

наливают 7 мл деионизированной воды, затем добавляют 137 мкл 85% фосфорной кислоты и

доводят объем водой до 10 мл. Раствор перемешивают и хранят при комнатной температуре в

течение 30 дней.

Приготовление катодного электродного раствора – католита. В пробирку объемом 15

мл наливают 7 мл воды, затем при перемешивании и охлаждении добавляют 0,12 г натрия

гидроксида, растворяют и доводят объем водой до 10 мл. Хранят при комнатной температуре в


Приготовление химического мобилизатора. В пробирку объемом 15 мл наливают 7 мл

деионизированной воды, затем добавляют 200 мкл ледяной уксусной кислоты и доводят объем

водой до 10 мл. Раствор перемешивают и хранят при комнатной температуре в течение 30 дней.

Приготовление катодного стабилизатора. 43,5 мг L-аргинина помещают в пробирку

типа Эппендорф, добавляют 300 мкл воды и перемешивают до полного растворения. Затем

объем доводят водой до 500 мкл, перемешивают и хранят при комнатной температуре в


Приготовление анодного стабилизатора. 13,5 мг иминодиуксусной кислоты помещают

в пробирку типа Эппендорф, добавляют 300 мкл воды и перемешивают до полного

растворения. Затем объем доводят водой до 500 мкл, перемешивают и хранят при комнатной

температуре в течение 30 дней.

Приготовление 4,3 М раствора мочевины. 2,6 г мочевины помещают в пробирку

объемом 15 мл, добавляют 5 мл воды и перемешивают до полного растворения. Затем объем

доводят водой до 10 мл, перемешивают и фильтруют через фильтр с размером пор 0,45 мкм.

Раствор хранят при температуре 2-8°С в течение 30 дней.

Приготовление геля для кИЭФ, содержащего 3 М мочевину. 0,5 г мочевины помещают в

пробирку объемом 15 мл, добавляют 1,5 мл геля для кИЭФ (Beckman Coulter) и перемешивают

до полного растворения. Затем добавляют гель для кИЭФ до объема 2,75 мл, перемешивают и

фильтруют через фильтр с размером пор 0,45 мкм. Раствор хранят при температуре 2-8°С в


Приготовление 20 мМ трис-буфера рН 8.0. В пробирке объемом 15 мл растворяют 24 мг

трис(гидроксиметил)аминометана в 9 мл деионизованной воды, доводят рН буфера

160

концентрированной соляной кислотой до 8, затем объем раствора доводят водой до 10 мл и

перемешивают. Раствор хранят при температуре 2-8°С в течение 30 дней.

Обессоливание образца субстанции. Раствор белка объемом до 500 мкл наносят на

ультрафильтрационную спин-колонку Amicon Ultra-0.5 (Merck-Millipore, США) и

центрифугируют при 14000g в течение 7 минут. Затем фильтрат удаляют, в колонку добавляют

раствор 20 мМ трис-буфера рН 8.0 до конечного объема 500 мкл и повторяют

центрифугирование. Замену буфера проводят дважды.

Приготовление пробы для кИЭФ. Для приготовления пробы в пробирку объемом 1,5 мл

добавляют 100 мкл геля для кИЭФ, содержащего 3 М мочевину, 6 мкл амфолитов Pharmalyte 3-

10, 10 мкл катодного стабилизатора, 1 мкл анодного стабилизатора, по 0,5 мкл каждого

пептидного маркера и 5 мкл обессоленного образца субстанции. Пробу перемешивают и

центрифугируют в течение 5 минут при 5000g.

Подготовка капилляра к проведению капиллярного изоэлектрического фокусирования

В начале каждого дня проводят предварительную подготовку капилляра к проведению

капиллярного изоэлектрического фокусирования. После выполнения анализов в конце дня

осуществляют подготовку капилляра к хранению.

Для всех растворов, устанавливающихся в систему капиллярного электрофореза,

используют пробирки типа Эппендорф объемом 1,5 мл с удаленными крышками. Объем

заполнения – 700 мкл для рабочих растворов и 300 мкл для слива. Перед установкой пробирки

центрифугируют в течение 5 мин при 5000 g.

Кассету с установленным покрытым капилляром длиной 45 см и внутренним диаметром

50 мкм помещают в систему капиллярного электрофореза Капель-105М (Люмэкс, Россия), при

этом концы капилляра не должны находиться на воздухе более пяти минут и должны быть

немедленно помещены в деионизированную воду.

В начале каждого дня в прибор устанавливают рабочие растворы и проводят

кондиционирование капилляра. Для этого осуществляют последовательные промывки

капилляра деионизованной водой (4 мин, 2000 мбар), химическим мобилизатором (4 мин, 2000

мбар), деионизованной водой (1 мин, 2000 мбар), гелем для кИЭФ (8 мин, 2000 мбар). Во время

всех этапов осуществляется термостатирование капилляра при температуре 20 °С и детекция на

длине волны 205 нм.

Проведение капиллярного изоэлектрического фокусирования

161

Перед введением пробы капилляр промывается раствором 4,3 М мочевины (4 мин, 2000

мбар), затем деионизованной водой (4 мин, 2000 мбар). Образцы вводят при давлении 2000

мбар в течение 2 мин с последующим погружением входного и выходного электрода в воду.

Фокусировка проводится раствором анолита на входном конце и католита на выходном конце

капилляра при напряжении 25 кВ в течение 20 минут. Затем для химической мобилизации на

выходе капилляра устанавливается пробирка с уксусной кислотой (химическим

мобилизатором) и подается напряжение 25 кВ в течение 60 минут, после чего капилляр

промывается деионизованной водой (5 мин, 2000 мбар). Во время всех этапов осуществляется

термостатирование капилляра при температуре 20 °С и детекция на длине волны 280 нм.

Обработка результатов

На полученных во время этапа мобилизации электрофореграммах отмечают пики,

соответствующие пептидным маркерам и изоформам белка. Интегрирование пиков

производится автоматически в программе Эльфоран (Люмэкс, Россия). Расчет

изоэлектрических точек белков осуществляется по уравнению, полученному методом линейной

регрессии по зависимости изоэлектрических точек пептидных маркеров от времени их

миграции. Отмечают пики, соответствующие нативной форме ИЛ-36РА (pI = 5,23±0,03) и

дезамидированной форме белка (pI =5,060,03).

Содержание примеси дезамидированной формы в процентах от содержания основного

вещества (Х) вычисляют по формуле:

,100

дезнат

дез

SS

SX

(5)

где: Sдех - площадь пика дезамидированной формы на хроматограмме

испытуемого раствора;

Sнат - площадь пика нативной формы на хроматограмме испытуемого

раствора;


Белок клеток-продуцентов. Не более 100 нг на 1 мг белка. Определяют методом

твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческой тест-системы E.

сoli HCP ELISA kit (F410, Cygnus Technologies, США).

162

Перед постановкой теста все компоненты набора выдерживают при комнатной

температуре в течение 1 ч.

Приготовление промывочного буферного раствора. Концентрат промывочного

буферного раствора из набора переносят в мерную колбу и доводят объем водой до 1 л,

перемешивают. Срок годности буферного раствора соответствует сроку годности набора при

хранении при температуре 2-8 °С.

Постановка теста

Для постановки теста готовят необходимое количество стрипов с иммобилизованными

антителами к белкам клеток E. сoli. При анализе от одного до двух образцов необходимо два

стрипа, от трех до шести образцов – три стрипа и т.д. Нужное количество стрипов

устанавливают в рамке, остальные убирают в пакет и плотно закрывают.

Вносят по 100 мкл конъюгата козьих антител к белкам E.coli с пероксидазой хрена из

набора во все лунки стрипов.

Далее вносят в лунки по 50 мкл стандартных растворов из набора с концентрациями

антигена 0, 1, 3, 12, 40 и 100 нг/мл в дубликатах, а также исследуемые образцы субстанции по

50 мкл в дубликатах.

Накрывают рамку со стрипами крышкой и инкубируют 2 ч при комнатной температуре

на шейкере (около 600 об/мин).

После окончания инкубации тщательно промывают лунки стрипов промывочным

буферным раствором (не менее 350 мкл на лунку) 4 раза. Удаляют остатки буферного раствора

из лунок аккуратным постукиванием перевернутой рамкой со стрипами по фильтровальной

бумаге. Не допускают высыхания стрипов до следующего этапа.

Вносят во все лунки по 100 мкл субстрата TMБ (3,3’,5,5’-тетраметилбензидин) из

набора. Инкубируют стрипы 30 мин при комнатной температуре. Вносят во все стрипы по 100

мкл Стоп-раствора (0,5М серная кислота) из набора. Определяют оптическую плотность в

лунках при длине волны 450 нм с помощью планшетного ридера Victor 2 (Wallac, США) или

аналогичного.

Учет результатов

Значения оптических плотностей в параллельных лунках усредняют. С использованием

программы Excel (Microsoft, США) или другой строят калибровочную кривую зависимости

оптической плотности в лунках со стандартными растворами от концентрации антигена.

163

Анализируя линейный участок кривой, строят линию тренда линейного типа и находят ее

формулу, которая имеет вид:

bXkY (6)

Далее подставляют усредненное значение оптической плотности (D) в лунках, куда

вносился образец субстанции, в уравнение вместо Y и определяют содержание примесей белка

клеток-продуцентов в нг/мл (Сhcp/мл) по формуле:

kbDC млhcp )(/ (7)

Затем рассчитывают содержание примесей белка клеток-продуцентов (Сhcp.) в нг/мг ИЛ-

36РА по формуле:

б

млhcp

hcpС

СC

/

(8)

где Сб – концентрация белка в субстанции.

ДНК клеток-продуцентов. Не более 2 нг на 1 мг белка. Определяют с помощью

полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с использованием коммерческого

набора E.coli Host Cell DNA Extraction & Amplification Kit in Tubes (D410T, Cygnus

Technologies, США).

Приготовление 0,5 М раствора трилона Б. 18,6 г трилона Б растворяют в 80 мл воды,

устанавливают потенциометрически рН 8,0 с помощью 30 % раствора натрия гидроксида,

доводят объем водой до 100 мл, перемешивают. Срок годности раствора 1 мес при температуре

2-8 °С.

Приготовление TE буферного раствора. 0,121 г трис(гидроксиметил)аминометана

помещают в мерную колбу или стакан вместимостью 100 мл, добавляют 0,2 мл 0,5 М раствора

трилона Б с рН 8,0 и доводят водой до метки, перемешивают. Срок годности раствора 1 мес при

температуре 2-8 °С.

Приготовление рабочего раствора протеиназы К. 3 мкл концентрата протеиназы К из

набора переносят в микроцентрифужную пробирку, добавляют 27 мкл ТЕ буферного раствора.

Перемешивают встряхиванием. Раствор используют свежеприготовленным.

Экстракция ДНК из исследуемого образца. Помещают 125 мкл исследуемой субстанции

в микропробирку объемом 2 мл, добавляют 375 мкл раствора для разбавления ДНК (из набора)

164

и 25 мкл рабочего раствора протеиназы К. Перемешивают на вортексе и инкубируют 30 мин

при температуре 60 °С в твердотельном термостате. Затем центрифугируют микропробирку 1

мин при 10000 g.

Вносят по 500 мкл стандартных растворов ДНК клеток E. coli из набора (концентрации

0, 0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 100.0 пг/10 мкл) в микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл.

Добавляют по 500 мкл буферного раствора для экстракции из набора в микропробирки с

исследуемым образцом и стандартными растворами. Перемешивают каждую микропробирку на

вортексе в течение 5 сек. Добавляют в каждую микропробирку по 1 мл буферного раствора для

преципитации из набора. Перемешивают каждую микропробирку на вортексе в течение 5 сек и

инкубируют при комнатной температуре 5 мин. Центрифугируют микропробирки 10 мин при

10000 g.

Сливают супернатант из микропробирок и постукиванием по фильтровальной бумаге

удаляют остатки супернатанта. Добавляют в каждую микропробирку по 1,5 мл буферного

раствора для промывания ДНК и перемешивают на вортексе 5 сек. Инкубируют при комнатной

температуре 20 мин, за это время 2 раза перемешивают микропробирки на вортексе.

Центрифугируют микропробирки 5 мин при 10000 g. Сливают супернатант из микропробирок и

постукиванием по фильтровальной бумаге удаляют остатки супернатанта.

Ресуспендируют осадки в 250 мкл ТЕ буферного раствора, подогретого до 50 °С.

Перемешивают микропробирки на вортексе, инкубируют 5 мин при комнатной температуре и

повторно перемешивают.

Постановка полимеразной цепной реакции в реальном времени

Смешивают 62,5 мкл смеси праймеров из набора и 312,5 мкл реагента Power SYBR®

Green PCR Master Mix (4367659, Thermo Fisher Scientific, США) в чистой микропробирке.

Вносят по 15 мкл полученной смеси в 21 лунку планшета для ПЦР в реальном времени из

набора. Далее вносят в лунки по 10 мкл экстрагированных стандартных и исследуемых

образцов (по три лунки для каждого образца). Заклеивают планшет входящей в набор пленкой.

Слабым постукиванием по краю планшета удаляют пузырьки воздуха со дна лунок. Помещают

планшет в амплификатор iQ5 (Bio-Rad, США) или аналогичный и проводят амплификацию с

параметрами: 1 цикл – 10 мин при 95 °С; 35 циклов – 15 сек при 95 °С и 1 мин при 61 °С; метка

– SYBR.

Расчет концентрации ДНК в исследуемой субстанции

165

Значения Сt, полученные при амплификации параллельных образцов, усредняют и с

использованием программы Excel (Microsoft, США) строят калибровочную кривую

зависимости Сt от концентрации ДНК в стандартных образцах. Определяют формулу линии

тренда линейного типа для калибровочной кривой, которая имеет вид:

bXkY (9)

Далее по обратной формуле из усредненного значения Ctобр, полученного для

исследуемого образца субстанции, определяют концентрацию ДНК клеток E.coli в экстракте

субстанции (Э

ДНКC ) в пг/10 мкл:

kbCtCЭ

ДНК )( обр (10)

Затем определяют уровень примеси ДНК клеток E.coli в 1 мл субстанции (СДНК/мл) в

нг/мл по формуле:

,1004Э

ДНК/ CC млДНК (11)

где: 4 – разведение при экстрагировании ДНК из субстанции;

100 – коэффициент пересчета из пг/10 мкл в нг/мл.

Далее рассчитывают содержание примеси ДНК E. coli на 1 мг белка (СДНК) по формуле:

,ДНК/мл бДНК СCC (12)

где: Сб – концентрация белка в субстанции (мг/мл).

Бактериальные эндотоксины. Не более 10 ЕЭ на 1 мг белка (ГФ ХIII,

ОФС.1.2.4.0006.15).

Аномальная токсичность. Должен быть нетоксичным (ГФ ХIII, ОФС.1.2.4.0004.15).

Тест-доза 5,0 мг рецепторного антагониста интерлейкина-36 (0,5 мл субстанции без

разведения), внутрибрюшинно.

Стерильность. Должен быть стерильным (ГФ ХIII, ОФС.1.2.4.0003.15). Определяют

методом прямого посева.

Количественное определение. Рецепторный антагонист интерлейкина-36. Не менее

10,0 мг/мл. Определяют спектрофотометрическим методом (спектрофотометрия в

ультрафиолетовой и видимой областях, ГФ ХIII, ОФС.1.2.1.1.0003.15).

166

Приготовление цитратного буферного раствора. В пробирку вместимостью 15 мл

помещают 1,0 мг полисорбата-80, 3,36 мг динатрия эдетата, 147 мг натрия цитрата, с помощью

автоматической пипетки добавляют 10 мл воды для инъекций, перемешивают до полного

растворения компонентов.

Проведение измерений.

150 мкл субстанции помещают в кювету спектрофотометра с толщиной слоя 1 см,

добавляют 2,85 мл цитратного буферного раствора, кювету закрывают крышкой, содержимое

перемешивают 10-кратным переворачиванием и определяют оптическую плотность раствора при

длине волны 280 нм (D280). В качестве контроля используют цитратный буферный раствор.

Концентрацию рецепторного антагониста интерлейкина-36 (С, мг/мл) в субстанции вычисляют по

формуле:

,20

%1,0

1

280

смA

DC

(13)

где: D280 - оптическая плотность испытуемого раствора субстанции, о.е./мл;

А0,1%1см - коэффициент удельного поглощения рецепторного антагониста

интерлейкина-36, равный оптической плотности раствора с

концентрацией 1 мг/мл при 280 нм - 1,43 о.е./мг;

20 - коэффициент разведения субстанции.

Измерение повторяют три раза и результат усредняют.

Специфическая активность. Должен достоверно подавлять продукцию интерлейкина-8

клетками линии А-549/IL36R+, вызванную 10 нг/мл интерлейкина-36, в концентрации не более

12 нг/мл. Определение проводят биологическим методом.

Специфическую активность рецепторного антагониста интерлейкина-36 оценивают

путем определения способности препарата отменять продукцию ИЛ-8 в культуре клеток А-

549/IL36R+, стимулированных ИЛ-36 гамма.

Приготовление маточного раствора ИЛ-36 гамма

Во флакон, содержащий 10 мкг рекомбинантного ИЛ-366835-IL, R&D Systems, США,

стерильно добавляют 1,0 мл среды DMEM (1.3.5, Биолот, Россия) с 1% фетальной телячьей

сыворотки (ФТС) (1.1.12, Биолот, Россия). Полученный раствор концентрации 10 мкг/мл

аликвотируют по 25 мкл в микроцентрифужные пробирки. Хранят при температуре – 70 °С в

течение 6 месяцев.

167

Культивирование клеток линии A-549/IL36R+. Клетки культивируют в культуральных

флаконах с площадью поверхности 75 см2 в 20 мл среды DMEM, содержащей 10% ФТС и 0,5

мкг/мл пуромицина гидрохлорида. Для снятия клеток с пластика используют раствор Трипсина-

Версена (1:1) (1.2.8, Биолот, Россия). Клетки пересевают каждые 4 дня. Посевная доза

составляет 1 млн клеток на флакон. Для теста клетки могут быть использованы на 3 или 4 сутки

после очередного пересева.

Подготовка клеточной культуры -549/IL36R+ для проведения теста. Из флакона с

культурой A-549/IL36R+ на 3 или 4 сутки после очередного пересева сливают культуральную

среду, однократно промывают монослой 10 мл подогретой до +37 °С средой DMEM и затем

снимают клетки с пластика 10 мл раствора Трипсина-Версена (1:1) (1.2.8, Биолот, Россия).

Суспензию клеток переносят в 15-мл пробирку, центрифугируют при 200 g 10 мин. Осадок

ресуспендируют в 5 мл среды DMEM и подсчитывают клеточность и жизнеспособность (по

окраске трипановым синим) в камере Горяева под инвертированным микроскопом. Далее

готовят взвесь клеток в среде DMEM с 10% ФТС с концентрацией 4х105 клеток на миллилитр и

переносят по 100 мкл на лунку в плоскодонный планшет для культивирования клеток (5598,

Corning, США) из расчета 5 рядов по 8 лунок для анализа одного образца субстанции. Планшет

помещают на сутки в СО2-инкубатор при +37 °С, 5% СО2.

Приготовление рабочего раствора ИЛ-36К 20 мкл маточного раствора ИЛ-36

прибавляют 4980 мкл среды DMEM с 1% ФТС, получая раствор с концентраций 40 нг/мл. С

учетом разведения в 4 раза в тесте конечная концентрация ИЛ-36 будет составлять 10 нг/мл.

Раствор используют свежеприготовленным.

Приготовление разведений исследуемого образца субстанции ИЛ-36РА. Разведения

исследуемого образца субстанции готовят таким образом, чтобы их конечные концентрации в

тесте составляли от 3 мкг/мл до 4 нг/мл (семь последовательных разведений с шагом 3). С

учетом разведения в 4 раза в тесте первое разведение готовится с концентрацией 12 мкг/мл. Для

этого к 10 мкл исследуемой субстанции с концентрацией 10 мг/мл добавляют 990 мкл среды

DMEM с 1% ФТС, получая раствор с концентрацией 100 мкг/мл. Дальнейшие разведения

субстанции готовят в круглодонном планшете для культивирования клеток (5799, Corning,

США). В первую лунку планшета добавляют 39,6 мкл приготовленного раствора субстанции

ИЛ-36РА с концентрацией 100 мкг/мл и 290 мкл среды DMEM с 1% ФТС, а в следующие шесть

лунок по 220 мкл среды среды DMEM с 1% ФТС. Из первой лунки переносят во вторую 110

мкл раствора, перемешивают. Затем в следующих пяти лунках готовят аналогичным образом

168

еще пять последовательных трехкратных разведений субстанции ИЛ-36РА. Растворы

исследуемой субстанции готовят непосредственно перед использованием.

96-луночный плоскодонный планшет с культурой А-549/IL36R+ для постановки теста

вынимают из СО2-инкубатора и оценивают плотность и равномерность монослоя в лунках под

инвертированным микроскопом. Клетки во всех лунках должны образовать плотный

равномерный монослой. Далее всю среду из лунок с клетками аккуратно отбирают, стараясь не

повредить монослой и вносят по 100 мкл свежей среды DMEM с 10% ФТС.

Затем в лунки с клетками вносят по 50 мкл приготовленных ранее разведений

исследуемого образца субстанции ИЛ-36РА, причем каждое разведений вносят не менее чем в

четыре лунки планшета. Затем во все лунки планшета добавляют по 50 мкл приготовленного

рабочего раствора ИЛ-36. Одновременно в этом же планшете ставят необходимые контроли:

- не менее чем в 4 лунки добавляют 50 мкл среды DMEM с 1% ФТС и 50 мкл

приготовленного рабочего раствора ИЛ-36 (контроль действия ИЛ-36).

- не менее чем в 8 лунок добавляют 100 мкл среды DMEM с 1% ФТС для определения

спонтанного уровня продукции ИЛ-8 культурой клеток.

Культуральный планшет возвращают в СО2-инкубатор на 20-24 часа. После окончания

времени инкубации планшет вынимают из СО2-инкубатор и определяют концентрацию ИЛ-8 в

супернатантах с помощью набора для иммуноферментного анализа ИНТЕРЛЕЙКИН-8-ИФА-

БЕСТ (Вектор-Бест, Россия) по инструкции изготовителя. Все супернатанты предварительно

разводят в 20 раз буфером для разведения образцов из набора. После расчета концентрации ИЛ-

8 в супернатантах полученные значения умножают на 20, чтобы учесть это разведение.

Данные по концентрации ИЛ-8 в параллельных лунках усредняют. Достоверность

отличий рассчитывают с помощью непарного Т-теста Стъюдента с неравными отклонениями,

используя программу Excel (Microsoft, США). Отличия считаются достоверными при значениях

вероятности Т-теста (р) меньших 0,05.

Тест считается удовлетворительным, если спонтанная продукция ИЛ-8 в

соответствующих контрольных лунках составляет не более 500 пг/мл, а в лунках контроля

действия ИЛ-36 концентрация ИЛ-8 больше, чем спонтанная продукция не менее чем в 5 раз.

Для оценки специфической активности субстанции ИЛ-36РА производят расчет

достоверности различий продукции ИЛ-8 клетками A-549/IL36R+ в присутствии различных

концентраций анализируемого образца субстанции от уровня ИЛ-8 в лунках контроля действия

169

ИЛ-36. Препарат считается активным, если минимальная концентрация ИЛ-36РА, при которой

продукция ИЛ-8 достоверно снижается, составляет не более 12 нг/мл.

Упаковка.

Первичная упаковка. 10 или 20 мл в бутылке стеклянной для крови, трансфузионных и

инфузионных препаратов по ГОСТ 10782-85, укупоренной пробкой из резины марок ИР-21,

25 П или 52-369/1 по ТУ 38.006269-95 или ТУ 38.106618-95 и обжатой колпачком

алюминиевым по ГОСТ Р 51314-99 или в пластиковой бутылке из перфторированного

сополимера этиленпропилена марки Teflon FEP (Nalgene, США), укупоренной навинчиваемой

крышкой из сополимера этилентетрафторэтилена марки Tefzel ETFE (Sigma-Aldrich, Германия).

На каждую бутылку наклеивают этикетку из бумаги писчей по ГОСТ 18510-87 или

этикеточной по ГОСТ 7625-86 или самоклеящуюся на бумажной основе из ленты клеевой по

ГОСТ 18251-87 или по ТУ 9571-001-20806751-2003. 1 бутылку помещают в пачку из картона

коробочного по ГОСТ 7933-89 или из картона хром-эрзац мелованного по ТУ 13-0281020-97-90

или картона хром-эрзац макулатурного мелованного по ТУ ОП 5453-011-04766356-00.

Групповая упаковка и транспортная тара в соответствии с ГОСТ 17768-90.

Маркировка.

На этикетке бутылки указывают:

название субстанции, концентрацию в мг/мл, сокращенное наименование предприятия-

изготовителя и его товарный знак, «субстанция», назначение, объем в мл, номер серии, дату

изготовления, срок годности, условия хранения.

На этикетке групповой упаковки дополнительно указывают количество пачек.

Транспортирование. СП 3.3.2.1248-03, при температуре от 2 до 8 °С. Допускается

транспортирование при температуре от 2 до 25 °С в течение 5 сут.

Хранение. СП 3.3.2.1248-03. При температуре от 2 до 8 °С.

Срок годности. 1 год.

Назначение. Для изготовления стерильных лекарственных средств.

Примечание. Реактивы, приведенные в

настоящей фармакопейной статье предприятия, описаны

в соответствующих разделах Государственной

Фармакопеи ХIII издания.

I H E M Q ? G L G H E ? C D B G : 36 B A M D H O ... - spbu.ru · N _ ^ _ j Z = h k m ^ Z j k l \ _...

Documents

Transcript of I H E M Q ? G L G H E ? C D B G : 36 B A M D H O ... - spbu.ru · N _ ^ _ j Z = h k m ^ Z j k l \ _...