ICAMPIONITISSUTALIELOROTRATTAMENTONEILABORATORIDIANATOMIAPATOLOGICA

SerenaBoninDSM-Dip.ScienzeMediche

ClinicalSampes

BiologicalFluids

Blood

CSF

Urine

Synovialfluid

Lymphaticdrainage

Ascites

TissuesFFPE(99%)

Freshorfrozen(1%)

SOURCESOFCLINICALMATERIAL

Clinicalsamples

Cytologicalspecimens

Cellularsuspension

Smears

Cytocentrifugationand

Cytoinclusion

Formalin

AlternativeFixatives

BiologicalFluids

CTCs orfcDNA

Biopsy orsurgicalresection

Formalin

TIPIDICAMPIONE

BIOPSIEESCISSIONALI

INCISIONALI

PERRASCHIAMENTO

AGOBIOPSIE(FNA)

BIOPSIAPUNCH

AUTOPSIE

ALLPREANALYTICALFACTORSAFFECTRNAINTEGRITYMORESEVERELYTHANDNA

BoninS,StantaG.Nucleicacidsextractionmethodsinfixedandparaffin-embeddedtissuesincancerdiagnostics.ExpRevMol. Diagn.2013,13.

TissueSAFEVacuumUnit

Dedicatedvacuumunitinstalledin“dirtyroom“adjacenttosurgerysuite.

Eliminationofformalininsurgerytheatre.

Transportbiospecimens in“asfreshconditions”tothePathologylab.

PRELIEVO

• LAVAGGIODEITESSUTIPRELEVATI (intamponeneutroincondizionifisiologichepertogliereilsangue- consaccarosioodestranoperunabuonaconservazionemorfologicaperilcongelamento)• MODALITA’DIINVIO (infissativoosottovuoto)• TEMPIBREVI:autolisi(tipoditessuto)eputrefazione• STRUMENTI(coltelli,bisturi,forbici,tavolettadisughero,…)• TECNICADELPRELIEVOERISCHIBIOLOGICI• TIPODIMATERIALEINVIATO (pezzooperatorio,biopsia,agobiopsia,prelievoautoptico,materialecitologico)• DESCRIZIONEMACROSCOPICA• DIMENSIONI (adeguateaipreparatiistologiciconspessoreadattoallavelocitàdifissazione)• LOCALIZZAZIONEEDORIENTAMENTO (anatomia,lesione)

FISSAZIONE• SCOPO:fornireunimmagineistologicailpiùfedelepossibileallarealtàomegliocostantementeriproducibile(IMMAGINEEQUIVALENTE)

• RAPIDITA’DELLAFISSAZIONE:perevitarel’autolisi(liberazioneintracellularedienzimilitici)elaputrefazione(batterisaprofitiedambientali).

• CAPACITA’DIPENETRAZIONEDELFISSATIVO:velocitàdipenetrazioneneitessuti(dipendedallatemperatura,cheaumentaperòancheladegradazione)

• DURATADELLAFISSAZIONE:dipendedaltipodifissativo,daltipoditessuto,dalledimensionidelprelievo

• VOLUMEDELFISSATIVO:1:20perlaformalina• CONDIZIONIDELLAFISSAZIONE:immersionedeitessuti,pH7.3-7.4,pressioneosmotica0.5osm.

• INADEGUATEZZADELLAFISSAZIONE:perditadelcampione

Tipo

diFissativi

Chimici

Coagulanti

Additivi

Fisici

Calore(fiamma)

Dissecazionear.t.

Congelamento

Sublimazione(dell’acquasottovuoto)

Fornoamicro-onde

FISSATIVICHIMICI(Agisconosulleproteine)

AZIONESULLAIDRATAZIONEDELLEPROTEINE:• FISSATIVICOAGULANTI:ilfissativosisostituisceall’acquadiidratazionedelleproteinechedenaturanoeprecipitano(COAGULAZIONE)

REAZIONECONICOMPONENTITISSUTALI:• FISSATIVIADDITIVI:lemolecoledelfissativoreagisconochimicamenteconicomponentideltessuto,conconsumodelfissativo

FISSATIVIADDITIVIFORMALDEIDE:HCOH–gasincoloresolubileinacqua.Formalinaèlasoluzioneacquosadiformaldeideal37%.NellafissazionesiusaformalinatamponatacontamponefosfatoapH fisiologico.

MECCANISMOD’AZIONE:-legatraloroleproteineconpontimetilenici(-CH-)tragruppiconunHattivo

R-H+HCHO> R-CH2-OH+H-R’> R-CH2-R’+H2OPOTEREDIPENETRAZIONE:0.8mm/hUSO:-soluzionediluita10X(dettaformalina10%,mainrealtà4%)-Lalucetrasformalaformaldeideinacidoformico(bottigliescure,aggiuntacarbonatodiCa)-Lafissazionedurada12ha4-5gg-Perdegradazionedell’emoglobinaformaunpigmentobrunoscuro,chesipuòeliminareconl’aggiuntadialcool70%(95pp)edammoniaca5%(5pp)

-Capacitàconservative(neimuseiconframmentidimarmo(salidiCa)edopogorgogliamentodigasdicittà,monossidodiC>metaemoglobina,permantenereicolori)

-MummificazioneRISULTATI:-fissazionedeigrassi– scarsacoartazione– scioglieparzialmenteglicogenoeacidouricoPARAFORMALDEIDE: polimerodellaformaldeide

FISSATIVIADDITIVIMiscele fissatrici a base di acido picrico:

•Liquido di Bouin: composto dalla miscela di 15 parti di acido picrico in soluzione satura acquosa, 5 parti di formaldeide 40% ed 1 parte di acido acetico glaciale

•Liquido di Duboscq - Brasil: costituito da 150 ml di alcool etilico 80%, 60 ml di formaldeide 40%, 15 ml di acido acetico glaciale ed 1 g di acido picrico

Entrambi sono fissativi molto penetranti; tuttavia, la presenza dell’acido picrico e diquello acetico è di ostacolo ad eventuali indagini retrospettive e di estrazione del DNAe, inoltre, scioglie facilmente la maggior parte delle calcificazioni presenti.

FISSATIVICOAGULANTI

Fissativi alcoolici• Alcool etilico 95°• Alcool etilico 95° ed etere etilico anaparti• Alcool metilico• Alcool metilico ed acetone anaparti

L’alcool di per sé, per il basso potenziale di ossidazione e per la moderata capacità dipenetrazione, non è un buon fissativo per istologia ( ma è meglio di niente ); determinaeccessiva coartazione ed indurimento dei tessuti, denatura le proteine e coagulagrossolanamente il citoplasma; pertanto si preferisce utilizzarlo in associazione con altrecomponenti onde ottenere un fissativo più efficace ed omogeneo.

Si è soliti ricorrere all’alcool etilico 95° o all’alcool etilico 50° in egual volume al materialeprelevato come prefissaggio in citologia.

MISCELEDOFISSATIVIABASEDOALCOOL

• Liquido di Serra: composto da 2 parti di alcool etilico 95% ed 1 parte di formaldeide 40% cui si aggiungono poche gocce di acido acetico glaciale

• Liquido di Carnoy e MetaCarnoy : costituito da 6 parti di alcool etilico abs (metilico) , 3 parti di cloroformio ed 1 parte di acido acetico glaciale

• Liquido di Clarke: composto da 3 parti di alcool etilico abs ed 1 parte di acido acetico glaciale

• Formalina alcoolica di Lillie: costituita da 9 parti di alcool etilico abs ed 1 parte di formaldeide 40%

LAVAGGIODELFISSATIVO

DOPOLAFISSAZIONEIFRAMMENTIDITESSUTODEVONOESSERELAVATIPERALLONTANAREIRESIDUIDELFISSATIVOCHEPOTREBBEINFLUIRESUISUCCESSIVIPROCESSI

INCLUSIONE-ITESSUTIFISSATI,PERPOTERESSEREOSSERVATIALMICROSCOPIOOTTICO,DEVONOESSERESEZIONATIINFETTINESOTTILI2-8µm

-PEROTTENERESEZIONISOTTILIITESSUTIDEVONOESSERESUFFICIENTEMENTEDURIECOMPATTI>INCLUSIONEINMEZZISEMISOLIDI

-ILTESSUTODEVEESSEREIMBIBITODELLASOSTANZAUSATAPERL’INCLUSIONE>PARAFFINA

PARAFFINACH3-CH2- - - -CH2-CH3 (CnH2n+2)

-SIOTTIENEDAIRESIDUIDIDISTILLAZIONEDELPETROLIO

-ILPUNTODIFUSIONESIINNALZACONLALUNGHEZZADELLACATENA

-INISTOLOGIASIUSANODAC22 AC28,DIVIDENDOLEPARAFFINEINBASSOFONDENTI(45– 54°C)EALTOFONDENTI(58– 60°C)

-OGGINONSIUSANOPIU’LEPARAFFINENATURALI(SEMPREMISTUREDIVARIALUNGHEZZA),MAPARAFFINESINTETICHE,PUREEOMOGENEE(ES.PARAPLAST)

-ISOLVENTIPERLAPARAFFINASONO:XILENE,CLOROFORMIO,BENZENEETOLUENE

PROCESSAZIONEPERINCLUSIONEDEITESSUTI1-FISSAZIONE2-LAVAGGIO-ALCOOL70% - 4h I-ALCOOL95% - 4h I 3-DISIDRATAZIONE-ALCOOL100%- 4-6h I-ALCOOL100%- 4-6h I

-XILENE - 1-2h I 4-DIAFANIZZAZIONE-XILENE - 1-2h I

-PARAFFINA2-3X - 3-4hX1 5-INCLUSIONE6-COLATA (BLOCCODIPARAFFINACONTESSUTOORIENTATO)

7-RAFFREDDAMENTO(PARAFFINAOMOGENEA)

SEZIONIISTOLOGICHEMICROTOMI: -MICROTOMOASLITTA(ALAMAMOBILEOFISSA)

-MICROTOMOROTATIVO(SEZIONISERIATE)

-MICROTOMOCONGELATORE

-CRIOSTATO(MICROTOMOROTATIVOINCAMERAREFRIGERATA)

LAMEDELMICROTOMO:-PRESENTANOFACCETTESECONDARIEDITAGLIO-HANNOUNAINCLINAZIONEREGOLABILERISPETTOALLASUPERFICIEDITAGLIODI10– 15°-INFERIOREA10° LALAMASTRISCIASENZATAGLIARE-SUPERIOREA15° LALAMAFRANTUMALAPARAFFINA

DEPARAFFINAZIONEDELLESEZIONI

-XILENE - 5min SPARAFFINATURA-XILENE - 5min

-ALCOOL100% - 5min-ALCOOL100% - 5min-ALCOOL95% - 5min IDRATAZIONE-ALCOOL70% - 5min-ACQUADISTILLATA

COLORAZIONE

DECALCIFICAZIONEDEITESSUTIItessutidevonoprimaesserefissatiperevitarnelamacerazione.Ladecalcificazionevieneeffettuataspostando,medianteacidiforti,quellipiùdeboli(ac fosforico,ac carbonico)dailorosali(fosfatiecarbonatidiCa),perotteneresalidiCasolubili.

CaCO3+2HNO3 >Ca(NO3)2+H2O+CO2

Ladecalcificazionesipuòeseguirecon:-ac.nitrico 5-7.5%-ac.tricloroacetico 5%-ac.formico concentrato

Illiquidodecalcificantevacambiato2Xnelle24hedprocessodurapiùgiorni.Pertestareseiltessutoèdecalcificatosiusaunago.

COLORAZIONIISTOLOGICHE

COLORAZIONIISTOLOGICHE

-NEIPREPARATIISTOLOGICINATURALIILCONTRASTOFRALEVARIESTRUTTUREE’SCARSOOASSENTE

-ILCONTRASTOSIOTTIENECONISPECIFICICOLORANTIUSATIINISTOLOGIACHEHANNOPERLEVARIESTRUTTURETISSUTALIDIVERSAAFFINITA’

-ICOLORANTIUSATIINISTOLOGIASONOANIMALI,VAGETALIEDISINTESI(aniline)

COLORANTI : sono usulamente composti organici aromatici contenenti un gruppo CROMOFORO ( Luce visibile 400-800 mm) e uno AUXOCROMO.Nel cromoforo si trovano sempre gruppi funzionali dai quali dipende il colore. GRUPPI CROMOFORI: CARBOSSILE (C=O), AZO (-N=N-), NITROSO (-N=O), NITRO (–NO2), ETILENE (C=C)…………IL COLORE E’ PRESENTE MA DI BASSA INTENSITA’ E CON LA PRESENZA DI GRUPPI AUXOCROMI IL COLORE DIVIENE INTENSO.L’auxocromo è un gruppo chimico ionizzabile, unito covalentemente al cromoforo L’auxocromo è responsabile:

– della solubilita in acqua del colorante – della sua ionizzabilita – della capacita di contrarre legami stabili (spesso mediante legami di tipo salino) con le proteine o con altri componenti dei tessuti

A seconda della carica assunta in soluzione, l’auxocromo puo essere – acido (quando ionizza come anione) – basico (quando ionizza come catione) Questa caratteristica genera la fondamentale distinzione dei coloranti istologici in acidi e basici

Tipidiauxocromo•Gliauxocromiacidisonoigruppi:–solfonico(-SO3Hilpiufrequente)–carbossilico(-COOH)–idrossilico(-OH)•Gliauxocromibasicisono:–ilgruppoaminico(-NH2)edisuoiderivati–imetalli(nellecosiddettelacche)•Icolorantivengonoingenerepostiincommerciosottoformadisali:–Acidi:comesalidisodio,talvoltadipotassio,dicalcioodiammonio–Basici:comecloruri,talvoltacomeacetatiosolfati

COLORANTI2SIPOSSONODIVIDEREICOLORANTIINBASEALLACARICAELETTRICAIN:

BASICI -CATIONICONCARICAPOSITIVA

ACIDI -ANIONICONCARICANEGATIVA

NEUTRI -SIACARICHEPOSITIVECHENEGATIVE

ANFOTERI-LACARICADIPENDEDALpH

INDIFFERENTI -SENZACARICA

COLORAZIONEINDIRETTA-LACOLORAZIONEE’POSSIBILESOLODOPOUNPRETRATTAMENTOCONUNASOSTANZADETTAMORDENTE CHELIBERAIGRUPPIREATTIVICHESILEGANOALCOLORANTE

-QUESTOPROCESSOSIDEFINISCEMORDENZATURA

-SECOLORANTEEMORDENTEVENGONOUSATICONTEMPORANEAMENTESIHAUNALACCA

-IMORDENTISONOSOSTANZEOSSIDANTIQUALIACIDIESALIMETALLICI(ACCROMICO,SUBLIMATOCORROSIVO,…),AC.PICRICO,FENOLO,TETROSSIDOD’OSMIOEL’ALLUME(AlK(SO4)2*12H2O– SALEDOPPIOIDRATO)

DIFFERENZIAZIONESERVEPERLAVAREILCOLORANTEINECCESSO,MASOPRATTUTTOPERFISSARELACOLORAZIONESPECIFICA

COLORAZIONEEMATOSSILINAEOSINA1EMATOSSILINA:colorantevegetaleincristalligiallo-bruni,solubileinacqua(alcooleglicerina).-Ilverocolorantenonèl’ematossilina,mal’EMATEINAcheèilsuoprodottodiossidazione.

OH

OH

OH

OH

OHO

OH

OH

OH

OH

EMATOSSILINA EMATEINA

COLORAZIONEEMATOSSILINAEOSINA2

• -Perottenerel’emateinasilasciamaturareall’ariaovengonoaggiuntesostanzeossidanti(permanganatodiK….).• -Vieneusataassiemeall’allume(mordente,aformareunalacca)l’EMALLUME.• -Asecondadell’ossidanteemordenteusaticisonoleematossilineprendonovarinomi(Carazzi,Mayer,Harry,ferrica,…).• -E’uncolorantebasicocheagiscemeglioinambienteacidoereagisceconigruppifosforicidegliacidinucleici,colorandoinucleiinviolettoscuro.• -Ladifferenziazioneavvieneinacquacorrentechefavirareilcoloredalviolettoall’azzurro.

COLORAZIONEEMATOSSILINAEOSINA3EOSINA:coloranteartificialeacido(varieformedicuilapiùcomuneèl’eosinagialla).-E’solubileinacqua,siusainsoluzione1%.-Coloraicitoplasmi,lefibreelasostanzaintercellulareinrosapiùomenointenso.-Ladifferenziazionesifaconalcool95%.

COOH

Br Br

BrBr

O

O O

COLORAZIONEEMATOSSILINAEOSINA4

• Dopoaveridratatolesezioni:

• -EMATOSSILINA 10min• -DIFF.ACQUACORRENTE 30min• -EOSINA 1min• -DIFF.ALCOOL95% rapida

MONTAGGIOCOLORAZIONE

-ALCOOL70°-ALCOOL95° DISIDRATAZIONE-ALCOOL100°-ALCOOL100°

-XILENE DIAFANIZZAZIONE-XILENE

MONTAGGIOBalsamodelCanadaoEukitt+vetrinocoprioggetto

SEZIONISUTESSUTICONGELATI1Sipuòeseguireunesameistologicosusezioniditessutocongelato.

Lesezionisipossonotagliareda:

a)Tessutifissatiinformalina:iltessutoprimadiesserecongelatodevevenirlavatoestensivamenteconacqua.

b)Tessutifreschi: -sultessutolavatodalsanguesiesegueunprelievodellospessoredi2-3mm

-vienepostosuunsupportometallico-congelatoperqualchesecondosuivaporidiazotoliquido-immersoinazotoliquidoperunminuto

Iltagliovieneeseguitonelcriostato:

-Regolazionedellatemperatura(troppofreddoiltessutorisultafriabile,temperaturatroppoaltailtessutoèpastoso)

-Nellazonaditaglioc’èunalastrinaditefloncheraccoglieautomaticamentelasezione.

-Sitrasferiscelasezionedallalastrinaavvicinandounvetrinofreddo,l’adesioneeladistensionesulvetrinoavvieneperilcaloretrasferitodalpolpastrellodeldito

-Siessicarapidamenteagitandoilvetrinonell’aria

-Sipuòeseguireunarapidafissazionedi1mininacetoneoalcool

SEZIONISUTESSUTICONGELATI2

EMATOSSILINAEOSINA-EmatossilinadiHarryconcentrataper1min.-Acidocloridrico0.5%- 20immersioni-Ammoniaca2%inalcool– 20immersioni-Eosina1min.-Differenziazioneinalcool95%- rapida

DISIDRATAZIONE

DIAFANIZZAZIONE

MONTAGGIO

COLORAZIONERAPIDA