HOLOTYPE HLA™ CONFIGURATION (H32) G d’ V 8 2016/05/30 · V4 26/02/2016 Robert Pollock...

HOLOTYPEHLA™CONFIGURATION96/7A&CE

(H32)GUIDEd’UTILISATION

VERSION82016/05/30

DESTINÉAUDIAGNOSTICINVITRO

Préparel’ANDàl’analyseparséquençagesurl’IlluminaMiSeq0086

OmixonHolotypeHLA96/7ConfigurationA&CEGuided’UtilisationV8.Copyright©2016,OmixonBiocomputingLtd.Confidentiel&Propriétéd’Omixon Page2│44

Tabledesmatières

ContenuHistoriquedudocument–Notesimportantesetmisesàjour..........................................................................................5Informationssurlefabriquant.........................................................................................................................................7Légendedessymboles.....................................................................................................................................................7HolotypeHLA-96/7Configuration1&CE:contenus........................................................................................................8

Boîtedesamorces(primers)contenuesdansleKit.................................................................................................................................................8Boîtedesréactifsdepréparationdeslibrairiescontenusdanslekit.......................................................................................................................8Plaqued’Adaptateursà96puits...............................................................................................................................................................................8ClasseurExcelWorkbook..........................................................................................................................................................................................9Logiciel–OmixonHLATwin......................................................................................................................................................................................9

Transportetstockage......................................................................................................................................................9Miseengardeetprécautions..........................................................................................................................................9Consignesdesécurité....................................................................................................................................................10Paramètresdeperformance..........................................................................................................................................10Assistancetechnique.....................................................................................................................................................10Appareils,réactifsetfournitures...................................................................................................................................11

RecommandationsenÉquipementtechnique.......................................................................................................................................................11Recommandationsenmatièrederéactifsassociés...............................................................................................................................................11Fournituresrecommandées...................................................................................................................................................................................12

MentionLégale.............................................................................................................................................................13Noteimportanteavantdecommencer..........................................................................................................................14

Recommandationentermed’isolationd’ADNgénomique....................................................................................................................................14Leprincipedelaméthode.............................................................................................................................................14Résumédesétapestechniques......................................................................................................................................16Glossaire/Définitions.....................................................................................................................................................17Étape1–AmplificationHLAetpréparationduMasterMix...........................................................................................18

Listederéactifs.......................................................................................................................................................................................................18Protocole................................................................................................................................................................................................................18

MasterMix:HLA-A,B,C,DRB1,DPB1etDQA1................................................................................19

MasterMix:HLA-DQB1Set1(optionnel)etDQB1Set2(requis).......................................................19Étape2–AmplificationHLAClasseIetII.......................................................................................................................20


MasterMixavecenzymeTaqPolymerase:HLA‐A,B,C,DRB1,DQA1etDPB1...............................20

MasterMixavecenzymeTaqPolymerase:HLA-DQB1Set1(optionnel)etHLA-DQB1Set2(requis)20

AmplificationdeclasseI(HLA-A,BetC)...........................................................................................21

AmplificationdeclasseII(HLA-DRB1,DQB1set1,DQB1set2,DPB1,etDQA1)................................21


TaillesattenduesdesAmplicons.......................................................................................................21Étapes3–QuantificationetnormalisationdesAmplicons(avecfluoromètredeplaque)..............................................22

Listedesréactifs.....................................................................................................................................................................................................22Protocole................................................................................................................................................................................................................22

PurificationdesproduitsdePCRavecExoSAP-IT...............................................................................24Étape4–Préparationdelibrairies.................................................................................................................................25


MasterMixdefragmentation..........................................................................................................25

Programmedefragmentation..........................................................................................................26

MasterMixderéparationdesextrémités.........................................................................................26

Programmederéparationdesextrémités........................................................................................27

MasterMixdeligation.....................................................................................................................28

Programmedeligation.....................................................................................................................28Étape5–Sélectiondelatailledelibrairie.....................................................................................................................30


Étape6–QuantificationdelaLibrairie..........................................................................................................................31Listederéactifs.......................................................................................................................................................................................................31Protocole................................................................................................................................................................................................................31

MixdeprimerpourlaqPCR..............................................................................................................31

MasterMixpourlaqPCR..................................................................................................................32Étape7–SéquençagesurplateformeIlluminaMiSeq....................................................................................................33

Listederéactifs.......................................................................................................................................................................................................33

CapacitédeskitsderéactifsMiSeq...................................................................................................33Protocole................................................................................................................................................................................................................33

Étape8–AnalysedesdonnéesduséquençageHLA.......................................................................................................35Protocolepourlelancementautomatisédesanalyses..........................................................................................................................................35

Configurationetparamétrageinformatique....................................................................................35

Protocolepourexécuterl’analyse.....................................................................................................35Protocolepourlelancementmanueldesanalysesavecposte«server».............................................................................................................35


Protocolepourexécuterl’analyse.....................................................................................................35Protocolepourlelancementmanuelavecposte«Desktop»(bureau)................................................................................................................36


Protocolepourexécuterl’analyse.....................................................................................................36Figuressupplémentaires...............................................................................................................................................37

Exempledeplaquepourplaqued’amplicon,plaqued’amplification,plaquededilution,plaquedequantificationd’amplicon(pourlocusindividuel)etplaquederéactions..........................................................................................................................................................................37Exempledeplaquedequantification.....................................................................................................................................................................38ExempledeplaqueqPCR........................................................................................................................................................................................38


Annexe1:PippinPrep..................................................................................................................................................39ProgrammerlePippinPrep....................................................................................................................................................................................39ExécuterlePippinPrep...........................................................................................................................................................................................39

Annexe2:SampleSheet(Feuillederoute)....................................................................................................................42Annexe3:Quantificationd’ampliconavecuninstrumentdeqPCR...............................................................................45



Historiquedudocument–NotesimportantesetmisesàjourVersion Date Auteur Résumédesmodifications Autorisépar V1 5/12/2015 RobertPollock Premièreversion,ébauche. GergelyTölgyesiV2 18/01/2016 RobertPollock Deuxièmeébauche,corrections

mineursGergelyTölgyesi

V3 10/02/2016 RobertPollock Troisièmeébauche,miseàjourdesexplicationsdessymboles,miseàjourdesrecommandationsdecyclesdecongélation/décongélation,miseàjourdel’utilisationvisée.

GergelyTölgyesi

V4 26/02/2016 RobertPollock Quatrièmeébauche,miseàjourdelasectionsurconsignesdesécurité

GergelyTölgyesi

V5 05/04/2016 RobertPollock Cinquièmeversion,ajoutderecommandationsalternativespourlaquantificationdesamplicons

EfiMelista

V6 09/04/2016 EfiMelista Modifiéde"enzymeLR-PCR"à"TaqPolymerase"basésurlechangementdedocumentationdeQiagen

GergelyTolgyesi

V7 23/04/2016 EfiMelista DQB1Set1etSet2miseàjourdeladéclaration

GergelyTolgyesi

V8 30/05/2016 EfiMelista Indicateursdeperformancemisàjour,Miseàjourdesvolumesderéactifsdepréparationdelalibrarie

GergelyTolgyesi

AvertissementOmixonaentrepris tous leseffortspossiblespourqueceguided’utilisation (GU) soitprécis.Omixondécline toute responsabilitéencasd’inexactitudesoud’omissions. Les informationsdeceGUpeuventêtremodifiéesàtoutmomentsanspréavis.Omixonnepeutêtretenupourresponsableencasd’erreurdanslecontenudeceGU.Omixonseréserveledroitd’apporterdesaméliorationsàceGUet/ouauxproduitsquiysontdécritssanspréavis.


Sivousremarquezdesinformationsincorrectes,incomplètesoupouvantêtremalinterprétées,nous vous serions grés de bien vouloir nous faire part de vos commentaires et suggestions.Mercidelesenvoyerà[email protected].


InformationssurlefabriquantRaisonsociale:OmixonBiocomputingLtd

Adressepourlesvisites:Fehérváriút50-52/6

Ville:Budapest

Codepostal:H-117

Pays:Hongrie

LégendedessymbolesNumérodelotNuméroderéférencedanslecatalogueConsulterleGuided’UtilisationContientdesréactifspourunnombreNdetests

Fabricantlégal.Ladateassociéeàcesymbolefaitréférenceàladatedefabrication.

Températuredestockagerecommandée

Dated’expiration

DispositifmédicaldeDiagnosticinVitro

Contientdescomposantsderemplacement


HolotypeHLA-96/7Configuration1&CE:contenusBoîtedesamorces(primers)contenuesdansleKitLecoffretdesamorcescontientdessolutionsdeprimerprêtà l’emploipour laPCRLongRangecibléedes gènesHLA -A, B, C,DPB1,DQA1etDQB1 ainsi queDRB1. En complément, il contient égalementdeux types d’additifs de PCR (Primer d’amplification 1 et primer d’amplification 2 ou Enhancer 1 etEnhancer2)

Primermix n°réf Réactions Vol/tube #Tubes CodecouleurHLA-A P012 96 220μl 1 JauneHLA-B P022 96 220μl 1 RougeHLA-C P032 96 220μl 1 OrangeHLA-DRB1 P042 96 220μl 1 VertHLA-DQB1(Set1) P052 96 220μl 1 BleuHLA-DQB1(Set2) P062 96 220μl 1 NoirHLA-DQA1 P072 96 220μl 1 BrunHLA-DPB1 P082 96 220μl 1 VioletPrimerd’amplification1DQB

E01 96 1100μl 1 incolorePrimerd’amplification2DQB

E02 96 300μl 1 incolore

BoîtedesréactifsdepréparationdeslibrairiescontenusdanslekitLe coffret de préparation de librairie contient des réactifs pour la préparation de la librairie desampliconHLA (fragmentation, réparationet adélynationdesextrémitésdes ampliconset ligationdesindexesdesadaptateursauxséquences).

Réactif N°réf Réactions Vol/tube TubesCodecouleurEnzymedeFragmentation(A) R11 96 278μl 1 JauneTampon(Buffer)deFragmentation(B) R21 96 278μl 1 RougeEnzymedeRéparationdesExtrémités(C) R31 96 162μl 1 VertTampondeRéparationdesExtrémités(D) R41 96 324μl 1 OrangeEnzymedeLigation(E) R51 96 324μl 1 BleuTampon(Buffer)deLigation(F) R61 96 1800μl 2 Noir

Plaqued’Adaptateursà96puitsLaplaqued’adaptateur indexé96puits contient les indexesNGS(ADNOligonucléotidesdoublebrin)dansuneSolutionde5μlpourgénérerdeslibrairiesdeséquençageindividuels.Laplaqued’adaptateurindexé 96 puits contient suffisamment d’indexes différents pour la production de 96 librairiesindividuellesNGSetl’identificationdeséchantillons.


Réactifs n°réf réactions Vol/puits #PlaquePlaqued’adaptateurA1(i1-96)

N1 96 5μl 1

ClasseurExcelWorkbookUnclasseurExcel(workbook)estfourniensupportduprotocoleHolotypeHLA96/7.Ilgénèrelafeuilled’échantillonMiSeq (MiSeq sample sheet), facilite les calculs, les agencements de plaque, le suivi, etbienplusencore.Sivousn’endisposezpasencore,[email protected].

Logiciel–[email protected]éditsOmixonHLATwin,associésàl’achatdevotrekitHolotypeHLA96/7.Noteimportante:Utilisez dans un seul etmême workflow les trois composants du kit HolotypeHLA 96/7 et le logicielOmixonHLATwin,pourconstituerunworkflowdediagnosticinvitro!MercidevousréférezàlasectionAvertissementetPrécautionspourconnaitrelesrestrictionsd’emploiduproduit.Descomposantsderemplacementsontdisponiblessurdemandespécialed’utilisateur.Veuillezdenoterqu’Omixon fournit le remplacementdeboîtesde composants etnonde flacons individuels! [email protected]’informations.

TransportetstockageLeskitssontexpédiésdansuneboîteenpolystyrèneaveccarboglaceetdoiventêtrestockésà-20°Càleur arrivée. Merci de vérifier vos contrôles des températures et la procédure de suivi de voscongélateurs.Effectuezleurmaintenancerégulièrement!Stockésà-20°C,leskitsnon-ouvertssontstablejusqu’àleurdated’expiration(inscritesurl’étiquettedukit).Après ouverture du produit, il est recommandé de ne pas effectuer plus de quatre (4) cycles decongélation/décongélation afin de préserver la stabilité du produit. Les kits ouverts sont stablesjusqu’à3mois.

MiseengardeetprécautionsRestrictionsd’utilisationduproduit

• Pour unemeilleure performance,merci d’utiliser la procédureworkflow du kit Holotype HLA96/7 et le logiciel Omixon HLA Twin pour le typage NGS avec les appareils, équipements etréactifsrecommandésdansleparagraphe«Équipementsetréactifs».

• L’utilisationd’autresappareilsqueceuxspécifiésdanslasection«Équipementsetréactifs»doitêtrevérifiéeetvalidéeminutieusementparl’utilisateur!


• Nepasdilueroureconstituerlesréactifsdansd’autresvolumesqueceuxdécritdansceGU.NepasutilisermoinsdevolumederéactifquecequiestdécritdansceGU.Celapeut induiredeserreurs!

• Omixonnepeutpasfournirdesupportpourunquelconqueproblèmerésultantd’unedéviationdesétapesduprotocoledécritdansceGU.

• Ne pas utiliser le produit en cas de dommage détectable des composants (flacon ou plaqueendommagé,bouchondesserréetc…)!

Consignesdesécurité• Lire les paragraphes dédiés aux «consignes de sécurité» et aux «notes importantes» pour

chacun des réactifs et des kits mentionnés dans le paragraphe «Appareils, réactifs etfournitures»avantdecommencer.

• Lorsdemanipulationsdeproduitschimiques,toujoursporteruneblousedelaboratoire,desgantsjetablesetdes lunettesdeprotection.Pourdeplusamples informations,mercideconsulter lesfichesdedonnéessécuritéspécifiquesdisponiblesauprèsdufournisseur.

• Un récapitulatif des composants chimiquesdes réactifs duproduit se trouvedans les fiches desécuritédukitHolotypeHLA96/7disponiblesurdemande.

• Lesdéchetsdescomposantsduproduitsontàéliminercommelesautresdéchetsmédicaux.

ParamètresdeperformancePrincipauxparamètresdeperformance,établisd’aprèslavalidationdeproduit.

HLA-A HLA-B HLA-DRB1 HLA-C HLA-DPB1 HLA-DQA1 HLA-DQB1

Sensitivity99.054% 99.171% 98.335% 96.310% 98.818% 98.927% 95.724%

Specificity99.966% 99.982% 99.956% 99.863% 99.946% 99.881% 99.775%

Precision99.054% 99.171% 98.335% 96.310% 98.818% 98.927% 95.724%

Accuracy99.935% 99.965% 99.915% 99.736% 99.897% 99.785% 99.572%

Reproducibility 100.00% 100.00% 99.28% 100.00% 99.28% 100.00% 99.28%

Repeatability 100.00% 100.00% 100.00% 100.00% 100.00% 100.00% 100.00%

AssistancetechniquePourtoutedemanded’assistancegénéraleconcernantceprotocole,[email protected].

Assistancetéléphonique:États-Unis|+1(617)500-0790Europe|+36705748001Lerestedumonde|+1(617)500-0790


Appareils,réactifsetfournitures

RecommandationsenÉquipementtechnique§ Thermocycleur,format96puits§ Fluoromètredeplaque (ouun autre instrumentdedétectionpar fluorescencede format 96

puitspourutiliseravecleSystèmePromegaQuantiFluordsDNAdoublebrin)§ PippinPrep(cat#PIP001)ouBluePippin(cat#BLU0001)fabriquésparSAGEScience§ InstrumentdeqPCR,deformatdeplaque96ou384puits§ IlluminaMiSeq(cat#SY-410-1003)§ Ordinateur64-bit4cœursouplus,et16GodeRAM§ Stockagedesdonnéesàlongterme(approximativement2ToparMiSeqparan)

Recommandationsenmatièrederéactifsassociés§ TroussesPCRLongRangedeQiagen(Cat#206401,206402ou206403)

§ Chaqueéchantillonnécessite4μld’enzymeTaqPolymerase§ LatrousseLongRangePCRCat#206401(20)contient8μld’enzymeTaqPolymerase§ LatrousseLongRangePCRCat#206402(100)contient40μld’enzymeTaqPolymerase§ La trousse LongRange PCR Cat# 206403 (250) contient 100 μl d’enzyme TaqPolymerase

§ ExoSAP-ITparAffymetrix(Cat#78200,78201,78202,ou78205)§ Chaqueéchantillonnécessite4μld’enzymeExoSAP-IT§ Cat#78200contenant200μld’enzymeExoSAP-IT§ Cat#78201contenant1mld’enzymeExoSAP-IT§ Cat#78202contenant4mld’enzymeExoSAP-IT§ Cat#78205contenant10mld’enzymeExoSAP-IT

§ Troussedequantificationdelibrairie–Illumina/UniversalparKAPABiosystems(Cat#KK4824)§ SystèmeQuantiFluordsDNAdePromega(Cat#E2670)§ Billes AMPure XP Agencourt AMPure XP par Beckman Coulter (Cat# A63880, A63881, ou

A63882)§ ChaqueutilisationdeHolotypeHLAnécessite900μldebillesAMpureXP§ Cat#A63880contenant5mldebillesAMPureXP§ Cat#A63881contenant60mldebillesAMPureXP§ Cat#A63882contenant450mldebillesAMPureXP

§ CassettedeGeld’agarose1,5%,sanscolorantpour lePippinPrep/BluePippin (cat#CDF1510pourlePippinPrepetBDF1510pourleBluePippin)

§ Éthanolpourbiologiemoléculaire(moleculargrade)§ Eaustérilepourbiologiemoléculaire(sansDNaseetRNase)§ Hydroxydedesodium§ 1×TEbuffer(pH8.0)§ TroussederéactifsMiSeqd’Illumina

o TroussederéactifsMiSeqv2(500-cycle)Cat#MS-102-2003o TroussederéactifsMiSeqv2(500-cycle)Cat#MS-103-1003o TroussederéactifsMiSeqv2(300-cycle)Cat#MS-102-2002o TroussederéactifsMiSeqv2(300-cycle)Cat#MS-103-1002o TroussederéactifsMiSeqv2(300-cycle)Cat#MS-103-1001


CapacitédestroussesdeRéactifsMiSeq

TrousseréactifsIlluminaMiSeq

TempsHeure

EchantillonsX2-96/7

Std500Cycle(MS-102-2003) ~39 96

Std300Cycle(MS-102-2002) ~24 80

Micro300Cycle(MS-103-1002) ~19 28

Nano500Cycle(MS-103-2003) ~28 12

Nano300Cycle(MS-103-1001) ~17 6

Fournituresrecommandées

§ Tubesdemicrocentrifugationde1,5ml

§ Tubesdemicrocentrifugationde1,5ml(typeLowBind)§ Tubesdemicrocentrifugation«LowBind»de2,0ml(EppendorfADN LoBind

(022431048)recommandé)§ Pipeteursàvolumeréglable(capacité1.0-1000μl)§ Pipeteursàvolumeréglable8canaux(capacité2.0-500μl)§ Plaquesà96puitscompatibleaveclethermocycleur§ Plaquesà96puitscompatiblesavecfluoromètredeplaque

§ Plaquesà96puitscompatiblesavecl’instrumentdeqPCRplaque§ Plaquesà96puitsprofonds(capacité>1000μl)

§ Filmadhésifpourplaquespourusagegénéral § Filmadhésifpourplaquescompatibleaveclethermocycleur(testéenPCRLongRange) § Filmadhésifoptiquepourplaquescompatibleavecl’instrumentdeqPCR§ Supportmagnétiquecompatibleavecdestubesmicrocentrifugationde2ml § PortoirsPCR96puitspourrefroidir(2pièces) § Tubesconiquesde50ml § Réservoirsde50ml


MentionLégaleLe Manuel de l’utilisateur Holotype HLA 96/7 et tout son contenu sont la propriété d’OmixonBiocomputing («Omixon») et ils sont exclusivement destinés à l’usage contractuel par le client parrapportau(x)produit(s)décrit(s)parleprésentetàaucuneautrefin.Cedocumentetsoncontenunedevrait être utilisé ou distribué à aucune autre fin et/ou, par ailleurs, communiqué, divulgué oureproduitsansleconsentementécritpréalabled’Omixon.Omixonneconcèdeparcedocumentaucunelicenceavecsesdroitsdepatente,demarque,d’auteuroudedroitcommunouautredroitssimilairesd’aucuntiers.Omixon Target HLA Twin («Logiciel») est concédé sous licence sous les termes et conditions du«Omixon TargetHLA Twin EULA» (www.omixon.com/hla--twin--eula/). En cas de désaccord avec lestermesetlesconditionsstipulés,Omixonnecèderapasdelicenceetn’autoriserapasl’utilisationouàl’installationlelogiciel.Les instructions de ce document doivent être strictement et explicitement suivies par un personnelqualifiéetparfaitementforméafindegarantiruneutilisationcorrecteetsûredu(es)produit(s)décrit(s)ici. Le contenude cedocumentdoit être intégralement luet compris avant touteutilisationdu (des)produit(s).TOUTMANQUEMENTÀLALECTURECOMPLÈTEOUAUSUIVISTRICTEDESINSTRUCTIONSCONTENUESDANSLEPRÉSENTDOCUMENTPOURRAITENTRAINERLADÉGRADATIONDU(DES)PRODUIT(S)OUDESBLESSURESÀDESPERSONNESYCOMPRISLESUTILISATEURSOUD’AUTRESPERSONNESETDESDÉGATSSURD’AUTRESMATÉRIELS.OMIXONDÉCLINETOUTERESPONSABILITÉLIÉEÁUNUSAGEIMPROPREDU(DES)PRODUIT(S)DÉCRIT(S)ICI(YCOMPRISDESPARTIESDECELUI-CIOULELOGICIEL)OUL’UTILISATIONDUPRODUITENDEHORSDUCHAMPD’APPLICATIONSTRICTEDESLICENCESOUAUTORISATIONSDELIVRÉPAROMIXIONDANSLECADREDEL’AQUISITIONPARLECLIENTDU(DES)PRODUIT(S).USAGELIMITÉAUDOMAINEDELARECHERCHE©2015OmixonLtd.Tousdroitsréservés.

UsageviséHolotype HLA96/7 - configuration A & CE – nommé ci-après «Holotype HLA», est un produit,combinantdesréactifspourtestdediagnosticinvitro,etunlogicield’analysededonnées(OmixonHLATwinTM).Ilviseàidentifieretàdéfinirlesantigènesdesleucocyteshumains(HumanLeukocyteAntigen-HLA)declasseIetII.IlestutilisépourletypageHLAaveclaplateformeNGSIlluminaMiSeq.HolotypeHLA fournitdes informations sur l’histocompatibilitéhumainepour les lociHLAClasse I (A,BetC)etclasseII(DPB1,DQA1,DQB1etDRB1)enutilisantdel’ADNgénomiquehumain.LelogicielOmixonHLATwinTMinclusdansHolotypeHLA,sertàtrouverlesconcordancesetàanalyserdonnéesdeséquencegénéréesparleMiSeqdusystèmeIllumina®,aboutissant,àuntypageHLAhaute


précision,deniveaualléliquequatredigitsavecuntauxd’ambiguïtétrèsbas.Holotype HLA est un produit destiné au diagnostic in vitro effectué par du personnel de santéprofessionnel, telquedestechniciensde laboratoireoudesmédecins, formésautypageHLAdansdeslaboratoiresdediagnosticaccréditésEFIouASHIoucapabledetravaillerselonlesspécificationsEFIouASHI.

NoteimportanteavantdecommencerRecommandationentermed’isolationd’ADNgénomiqueL’ADN génomique Humain (ADNg) doit être préparé avec des kits de préparation d’ADNconvenablementtestés,disponiblessurlemarché,etceci,pourassurerlaconstancedelaqualitédelapréparation.Quellequesoitl’approche,unedéterminationprécisedelaconcentrationetdelapuretéestrequisepouruneperformancedetestrobuste.

L’ADNdoitêtredépourvudecontaminantspouvantaffecterl’amplification,lapréparationdelalibrairieet lesétapesde séquençage (parex. alcool, sels, détergents, formaldéhydeethéparine). Le sangnedoitpasêtrecollectédansdestubeshéparinésetleséchantillonsdesangdespatientssoustraitementà l’héparine doivent être écartés. De la même façon, les échantillons lipémiques ou hémolysés nedoiventpasêtreutilisés.

L’ADNgénomiquepeutêtreutiliséimmédiatements’ilaétépréparédansdel’eaunoncontaminéeennucléaseous’ilaétéstockélongtempsàunetempératureégaleouinférieureà-20°Cdansunesolutionde tamponTE. Lescycles répétésdecongélation/décongélationdoiventêtreévitésafinde réduire sadégradation.

Une concentration de 20-30ng/µl d’ADN est hautement recommandée afin d’obtenir 100-150ngd’apportd’ADNgénomiqueparamplificationPCR.

Un rapport d’absorbance 260nm/280nm et 260nm/230nm de valeur 1,7-2 sont fortementrecommandés.

LeprincipedelaméthodePendant longtemps, la communauté HLA s’est efforcée de mettre au point une méthode capabled’identifier avec précision, le considérable polymorphisme de l’antigène HLA et de leurs produitsgénétiques. La PCR, combinée à d’autres technologies (séquençage Sanger, SSOP, SSP, Luminex), apermisuneaméliorationnotablede ladescriptiondupolymorphismeHLA,maisnéanmoins,plusieurslimitescontinuentàrestreindrenotrecapacitéàcaractériserlesgènesHLAdemanièreexhaustive.Cesdernières années, de nouvelles technologiescollectivement nommées séquençage de nouvellegénérationouNGS(NextGenerationSequencing)ontapportédespossibilitésinéditespermettantunedescription complète des gènesHLA de façon haploïde. Le séquençage haut débit se caractérise pardeuxparticularités:1)leséquençageclonaldefragmentsd’ADNet2)undébitextrêmementélevé.LeNGSpermetdevoirlespolymorphismes,éliminantainsi lesambiguïtésetpermettantletypageHLAàtroisouquatredigitssanstestsdecontrôle,fournissantparconséquent,unesolutionpotentiellementcomplèteàlaproblématiquedutypageHLA.Leprotocoledécritci-dessous,combineuneamplificationPCRLongRange (longueportée),desgènesHLAavec le séquençageNGS suruneplateforme IlluminaMiSeq. Plus spécifiquement, les lociHLA-A,B, C,DQA1etDQB1 sont amplifiés sur la totalitéde leurgènedecodage,ycomprisdesélémentsdesrégionsnontraduitsdesextrémités3’et5’,tandisquelelocusDRB1estpartiellementamplifiédel’intron1à intron4et leDPB1estamplifiédel’intron1à la


régionnontraduite3’.Lesampliconssonttraitésselonlaprocédureci-dessous:

1. Fragmentation enzymatique des amplicons, afin d’adapter leur taille au séquençage sur laplateformeIllumina.

2. Traitementdesextrémitésdesampliconsfragmentés.

3. Ligationdesséquencesd’adaptateurquisontutiliséestoutaulongduprocessussurleMiSeqpourcapturer,amplifieretséquencerl’ADN.Lesadaptateurscontiennentégalementunindicequiestunecourteséquence,uniqueàchaqueadaptateuretquiidentifielesoriginesdechaquelibrairie(échantillon/locus).

Après le pool (mise en commun) des Librairies (bibliothèques), la sélection des tailles et laquantification, leséchantillonssontchargés sur leMiSeqpour leséquençage.Leprocessus,danssonintégralité, prend entre 3 à 5 jours selon la cellule choisie sur la plateforme Illumina. Ci-dessous leschémarésumantlesétapesduprotocole:


Résumédesétapestechniques


Glossaire/Définitions§ Plaquededilutiond’amplicons–Plaqueà96puitsprofonds,utiliséepourdiluerlesamplicons

delaplaqued’ampliconsprêteàêtrequantifiée.§ Plaque d’amplicons – également appelé plaques d’amplification; Dans le cas du DQB1 le

contenudesdeuxplaquesd’amplification(set1etset2)sontcombinéspourformerlaplaqued’amplicon.

§ Plaquedequantificationd’amplicons:plaque96puitscompatiblelefluomomètredeplaqueoùsontquantifiélesampliconsdilués.

§ Plaqued’amplification:plaque96puitsservantàamplifierleslociHLA.§ Librairiefinale:librairieregroupanttoutesleslibrairiesd’échantillonsprêtesàêtreséquencées

dansunrununiquedeMiSeq.§ PlaquedeRéaction:Plaquesur laquelle lesréactionsséquentiellesqui fragmentent,réparent

desextrémitésetligaturentlesadaptateursindexésàampliconssontexécutées.§ PlaquedeRéactif: Plaque servantàaliquoter lesdifférents réactifsutiliséspourpréparer les

librairies§ Librairie d’échantillon: librairie obtenue en combinant (poolant) tous les loci HLA d’un

échantillondonné.§ Plaque de librairie d’échantillon: plaque contenant une librairie d’échantillon (tous les loci

combinés)parpuit.§ PlaquedeQuantificationdesStandards–plaqueà96puitscompatibleaveclefluoromètrede

plaque où sont placés les standards d’ADN pour permettre la quantification d’amplicon.


Étape 1 –AmplificationHLA et préparation duMasterMixDurée:~2heures10minutesCette étape vise à préparer desMaster mix spécifiques pour amplifier chaque locus HLA. Les lociamplifiésparceprotocolesontleHLA-A,leHLA-B,leHLA-C,HLA-DRB1,leHLA-DQB1,leHLA-DPB1etleHLA-DQA1.,PourleHLADQB1,deuxsetsdeprimersontfournis:LeSet1amplifielesexons1à4etleSet2amplifie lesexons2à5,Chacundessetsestsuffisantpourobtenirdesrésultatsdegénotypageprécis, dans l'hypothèse d'une amplification réussie. Le taux d'échec d'amplification du set 1 estsupérieur à celui recommandé pour un génotypage fiable. C'est pourquoi, Omixon préconisel'utilisationduSet2seulpourlegénotypageàdesfinscliniques.LeSet1estoptionnel,ilrecommandélorsquelacouverturecomplètedugèneDQB1Exon1etintron1estsouhaitée.

Remarque: Tous les réactifsnécessairespour l’amplification sont inclusdans lesMasterMixde cetteétapeexceptélemélangeenzymatiqueLongRangePCR.

Listederéactifs

Objet Conservation SourcePrimerMixHLA-A –20°C OmixonPrimerMixHLA-B –20°C OmixonPrimerMixHLA-C –20°C OmixonPrimerMixHLA-DQB1(Set1)optionnel –20°C OmixonPrimerMixHLA-DQB1(Set2)requis –20°C OmixonPrimerMixHLA-DRB1 –20°C OmixonPrimerMixHLA-DQA1 –20°C OmixonPrimerMixHLA-DPB1 –20°C OmixonPrimerd’amplificationDQB1 –20°C OmixonPrimerd’amplificationDQB2 –20°C OmixonTampon(buffer)PCRLongRange(10×) –20°C Qiagen10mMdNTPs –20°C QiagenH2Ostérileàusagemoléculaire –20°C Qiagen

Protocole1.1 -Sortirdukittouslesprimermix,leprimerd’amplificationDQB1,leprimerd’amplificationDQB

2etletampon(bufferPCRLongRange)(10X)etlesdécongeleràtempératureambiante.

1.2 -Créer leprimerd’amplificationDQBcombiné.Ajouter132μlduprimerd’amplificationDQB2directementdansletubedeleprimerd’amplificationDQB1etré-étiquetezletubeentantqueprimerd’amplificationDQBcombiné

1.3 -Créer un Master Mix pour chaque Primer Mix suivant les tableaux ci-dessous:


MasterMix:HLA-A,B,C,DRB1,DPB1etDQA1

Réactif Volume/éch./locus Volume/96éch./locusPrimermix 2μl 204μlTampon(buffer)PCRLongRange(10×)

2,5μl 255μldNTPMix(10mMchacun) 1,25μl 127,5μlH2Ostérileàus.moléculaire 13,85μl 1412,7μlVolumetotal 19,6μl 1999,2μl

MasterMix:HLA-DQB1Set1(optionnel)etDQB1Set2(requis)

Réactif Volume/éch./locus Volume/96éch./locusPrimermix 2μl 204μlTamponPCRLongRange(10×) 2,5μl 255μldNTPMix(10mMchacun) 1,25μl 127,5μlPrimerd’amplificationDQBcombiné

5,6μl 571,2μlH2Ostérileàus.moléculaire 7,85μl 800,7μlVolumetotal 19,2μl 1958,4μl

1.4 VortexerchaqueMasterMixetcentrifugerpendant1seconde.Placer lesMasterMixsur de laglace.

1.5 Diluer tous les ADN génomiques de façon à obtenir une concentration entre 20 et 30 ng/μl(volumeminimal45µl).

Remarque:LeHolotypeHLAcontientsuffisammentderéactifspour96réactionsetunpeude volume supplémentaire pour tenir compte des pertes dues au pipetage et auxamplificationséchouées.


Étape2–AmplificationHLAClasseIetIIDurée:~8heures10minutesL’étape2apourobjectifd’amplifierleslociHLA.Lesconditionsdel’amplificationHLAClasseIetClasseII ont été optimisées sur deux programmes de PCR distincts. Une fois les réactions PCR terminées,l’amplificationestvérifiéesurgeld’agarose.

Listederéactifs

Objet Conservation SourceMasterMixHLA-A –20°C Étape1MasterMixHLA-B –20°C Étape1MasterMixHLA-C –20°C Étape1MasterMixHLA-DPB1 –20°C Étape1MasterMixHLA-DQB1(Set1) –20°C Étape1MasterMixHLA-DQB1(Set2) –20°C Étape1MasterMixHLA-DRB1 –20°C Étape1MasterMixHLA-DQA1 –20°C Étape1EnzymeMixTaqPolymerase –20°C QiagenADNgénomique 4°C UtilisateurH2Ostérileàusagemoléculaire 20°C Utilisateur

Protocole2.1 Sortir de l’emballage l’enzymeMix TaqPolymerase, la centrifuger et l’ajouter à chaqueMaster

Mixenvidantlapipettesoigneusementàchaquefois.suivreletableauci-dessous:

MasterMixavecenzymeTaqPolymerase:HLA-A,B,C,DRB1,DQA1etDPB1

MasterMixavecenzymeTaqPolymerase:HLA-DQB1Set1(optionnel)etHLA-DQB1Set2(requis)

Réactif Vol./échantillon/locus Vol./96échantillons/locusMasterMixdel’étape1 19,2μl 1958,4μLEnzymeMixTaqPolymerase 0,8μl 81,6μlTotal 20μl 2040μl

Réactif Vol./échantillon/locus Vol./96échantillons/locusMasterMixdel’étape1 19,6μl 1999,2μlEnzymeMixTaqPolymerase 0,4μl 40,8μlTotal 20μl 2040μl


2.2 Vortexer brièvement et centrifuger les Master Mix chargés en enzyme. Aliquoter 20µl dechaqueMasterMixchargésenenzymedanslespuitsséparésdeplaquesPCR96puits.Ajouterl’enzymeTaqPolymeraseàchaqueMasterMix.

Remarque:lesamplificationsdeclasseIetIIontétéoptimiséesenutilisantdeuxprogrammesPCRdistincts,decefait,chacuned’entreellesnécessiteunePlaquedePCRà96puitsséparée.

2.3 Ajouter 5 μl de chaque échantillon d’ADN génomique dilué dans les puits correspondants dechacune des plaques préparées dans l’étape précédente. Mixer par pipetage. Sceller etinspectervisuellementchaquepuits.Centrifugertouteslesplaquesd’amplification.

2.4 Placer les plaques d’amplification dans des thermocycleurs séparés et exécuter les programmessuivantspourl’amplificationdeclasseIetII:

AmplificationdeclasseI(HLA-A,BetC)

Nombredecycles Température Durée1 95°C 3minutes

35

95°C 15secondes65°C 30secondes68°C 5minutes

1 68°C 10minutes1 4°C ∞

AmplificationdeclasseII(HLA-DRB1,DQB1set1,DQB1set2,DPB1,etDQA1)

Nombredecycles Température Durée1 95°C 3minutes

35

93°C 15secondes60°C 30secondes68°C 9minutes

1 68°C 10minutes1 4°C ∞

2.5 Vérifier le succèsde la réactiond’amplificationenemployant2μldechaqueampliconsurgeld’agarose2%standard,à250Vpendant30minutes.

TaillesattenduesdesAmplicons

LocusHLA TaillesattenduesdesAmplicons(kb)HLA-A,BetC ~3kbHLA-DRB1 ~4,3kb

HLA-DQB1(Set1) ~4,7kbHLA-DQB1(Set2) ~5,8kb

HLA-DQA1 ~4,5kbHLA-DPB1 ~4,5kb

Possibilitédepausesansrisqued’altérerlamanipulation:Lesampliconspeuventêtreconservésà4°Cjusqu’aulendemainoupourlesconserverpluslongtemps,lesstockerà-20°C.


Étapes 3 – Quantification et normalisation desAmplicons(avecfluoromètredeplaque)Durée:~1heureLaquantificationetlanormalisationdesAmpliconsbienqu’optionnelle,sontfortementrecommandéespourassurer un apport précis dans l’étape de préparation des librairies. La concentration des Amplicons estmesurée à l’aide du Quantifluor dsDNA System. Le QuantiFluor dsDNA System contient un marqueurfluorescentsefixantsurl’ADNetunstandardADNLambdaquipermetderéaliserunequantificationprécisede petites quantités d’ADN double brin. Se référer à l’annexe 3 en ce qui concerne les instructionsd’utilisationdel’appareilàPCRpoureffectuerlaquantificationdesamplicons.

Listedesréactifs

Objet Conservation SourcePlaque(s)d’AmplificationClasseI 4°C Étape2Plaque(s)d’AmplificationClasseII 4°C Étape2ADNStandardLambda(100ng/μL) 4°C PromegaColorantADNdoublebrinQuantiFluor200×

4°C PromegaTampon(buffer)TE20×(pH7.5) 4°C PromegaH2Ostérileàusagemoléculaire 20°Cà25°C UtilisateurExoSAP-iT -20°C Affymetrix

Protocole3.1 –Préparerdesstandardsd’ADNpardilutionsérielleenutilisantdel’ADNstandardQuantiFluor

“Lambda”(100ng/μL)suivantletableaudedilutionci-dessous:Étiquettesurletube ADNutilisée Volumed’ADN

(μl)VolumeduTE1x

(μl)Conc.finale(ng/μl)

Standard1 ADNLambda 7,5μl 492,5μl 1,5ng/μlStandard2 Standard1 250μl 250μl 0,75ng/μlStandard3 Standard2 250μl 250μl 0,38ng/μlStandard4 Standard3 250μl 250μl 0,19ng/μlStandard5 Standard4 250μl 250μl 0,09ng/μlStandard6 Standard5 250μl 250μl 0,05ng/μlBlanc Blanc 0μl 250μl 0ng/μl

3.2 PréparerdesPlaquesdeDilutiond’Ampliconspourchaque locus:Aliquoter498μldetamponTE1xdansdesplaquesàpuitsprofondsà96puitsàpartirdesplaquesd’amplicons.Ajouter2μld’ADNamplifiéàpartirdesPlaquesd’Ampliconsvers lespuitscorrespondantsde laPlaquedeDilution d’Amplicons, bien vider la pipette par pipetage. Sceller la plaque et bien vortexer.Centrifugerlaplaque.


3.3 Préparerunesolution1xdeColorantQuantiFluorselonlaformulesuivante:0,5μldeColorantQuantiFluor (200X) + 99,5 μl de tampon 1× TE. Préparer suffisamment de solution 1x deColorant QuantiFluor pour que chaque échantillon (total des échantillons des Plaquesd’Amplicons)etquechaquestandard(14autotal)puissentavoir100μld’aliquote.

3.4 Préparer une plaque de quantification des standards et des plaques de quantificationd’Amplicons. Aliquoter 100μl de solution 1x de colorant QuantiFluor à des puits dans lesplaquesoptiquesneuvesà96puitsenseréférantauformatdelaplaquedequantificationdesstandardsetlesplaquesdequantificationd’Amplicons(voirlesfiguresenannexe).

3.5 Ajouter100μldechaquestandardpréparéplushaut,endouble,àdespuitsindividuelsdanslaplaquedequantificationdesstandards(14puitsautotal).Mixerparpipetage.

3.6 Ajouter 100 μl d’amplicons dilués, prélevés dans les puits correspondants des plaques dedilutiond’ampliconsdanslespuitsindividuelsdesplaquesdequantificationd’amplicons.Mixerparpipetage.

3.7 Effectuerunrundelaplaquedequantificationdesstandardsdanslefluoromètre,puisfairedemêmeaveclaplaquedequantificationd’amplicons.

3.8 Calculer la concentrationd’ADNdesplaquesdequantificationd’ampliconsgrâceauxdonnéesRFUgénéréesparlefluoromètre.

3.9 Diluerl’ADNdanslesPlaquesd’Ampliconsavecdel’H2Ostérilepourquelaconcentrationfinaled’ADNsoitde67ng/μlenviron.

§ Silaconcentrationdel’ADNest≥150ng/μl:ajouter25μldeH2O

§ Silaconcentrationdel’ADNest100–150ng/μl:ajouter10μldeH2O§ Silaconcentrationdel’ADNest≤100ng/μl:nepasajouterdeH2O

3.10 Pourchaqueéchantillon,mélanger15μlduDQB1(Set1)etduDQB1(Set2)dansunpuitinutilisé.

Remarque:LeDQB1Set1etSet2amplifienttouslesdeuxlesexons2,3et4.Sil’unedesréactionsDQB1échoueouestsensiblementplusfaiblequel’autre,ellesnedoiventpasêtrecombinéesàuneréactionréussie,pournepasdiluerunebonneamplification.

3.11 Pourchaqueéchantillon,poolertousleslocidansuneseuleplaqued’amplicons.Combiner5μldechaquelocusd’unéchantillondansunenouvelleplaquePCRà96puits.Chaqueéchantillondoitoccuperunseulpuitsd’unvolumede35μl.Quandlelocusfinaldechaqueéchantillonestajouté,mixerbienàl’aided’unepipette.

3.12 Aliquoter 4 μl d’ExoSAP-IT (Affymetrix) dans chaque amplicon dans la plaque d’amplicons etmixerparpipetage.

3.13 Scellerlaplaqued’ampliconsparunjointthermiqueetcentrifuger.

3.14 PlacerlesPlaquesd’Ampliconsdansunthermocycleuretexécuterleprogrammesuivant:


PurificationdesproduitsdePCRavecExoSAP-IT

Nombredecycles Température Durée1 37°C 45minutes1 80°C 15minutes1 4°C ∞

Possibilitédepausesansrisqued’altérerlamanipulation.Lesampliconspeuventêtreconservésà4°Cjusqu’aulendemainoupourlesconserverpluslongtemps,lesstockerà-20°C.


Étape4–PréparationdelibrairiesDurée:~3heureset15minutesAu cours de cette étape, les librairies d’amplicons sont préparées pour le séquençage sur le MiSeqIllumina.Lafragmentationdesfragmentsd’ADNlongssefaitparréactionenzymatique.Lesextrémitéssont ensuite réparées et adénylées, et les adaptateurs sont ligaturés aux extrémités. Les librairiesindexéessontpooléesetpurifiéespouratteindre laconcentrationcorrespondanteà l’étapedesbillesAMPureXP.

Remarque:Omixonconseilled’utiliserdesvolumesplusimportantsquenécessairepour96échantillons car certains des enzymes et des tampons sont visqueux ce qui peutprovoqueruneperteexcessivelorsdupipetage.

Listederéactifs

Objet Conservation SourcePlaqued’Amplicons 4°C Étape3Plaqued’adaptateurs(5μLparpuits) –20°C OmixonEnzymedefragmentation(A) –20°C OmixonTampondefragmentation(B) –20°C OmixonEnzymederéparationdesextrémités(C) –20°C OmixonTamponderéparationdesextrémités(C) –20°C OmixonEnzymedeligation(E) –20°C OmixonTampondeligation(F) –20°C OmixonBillesAMPureXP 4°C BeckmanCoulterÉthanolà80%(fraichementpréparé) 20°Cà25°C UtilisateurH2Ostérileàusagemoléculaire 20°Cà25°C Utilisateur

Protocole4.1 Mettrelethermocycleurenmarche.Vérifierquelecouverclechauffantestentraindese

chauffer.

Remarque:Veilleràvortexervigoureusementl’enzymedefragmentation(A)avantutilisation.

4.2 PréparerleMasterMixdefragmentationensuivantletableauci-dessous:

MasterMixdefragmentation

Réactif Volumeparlibrairie(μl)

Volumesrecommandésparplaquecomplète(μl)

Codecouleur

Enzymedefragmentation(A) 2μl 220,8μl JauneTampondefragmentation(B) 2μl 220,8μl RougeVolumetotal 4μl 441,6μl


4.3 Prépareruneplaquederéactifs.PlacerunenouvelleplaquePCRà96puitssurleportoirPCRàblocfroidetaliquoterunequantitéégaledeMasterMixdeFragmentationdanschaquepuitsd’unecolonne.

Remarque:Laréactiondefragmentationaétéconçuepourque l’ADNobtenusoitde latailleidéale pour réaliser un séquençage sur le MiSeq Illumina. Il est important de conserver lesréactifs au frais jusqu’audémarragede la réactiondans le thermocycleurpourempêcherunefragmentationexcessive. Ilestrecommandéd’utiliserdespipettesmulticanauxpourréduire lapossibilitéd’unefragmentationexcessive.

4.4 Centrifugerlaplaqued’ampliconspendant10secondesetlaplacersurdelaglace.

4.5 Prépareruneplaquederéaction.PlacerunenouvelleplaquePCRà96puitssurleportoirPCRàblocfroidpourlesrefroidir.

4.6 Àl’aided’unepipettemulticanaux,aliquoter4μldeMasterMixdefragmentationàpartirdelaplaque des réactifs vers les puits de la plaque de réaction en correspondance avec la plaqued’amplicons.

4.7 À l’aide d’une pipette multicanaux, transférer 16 µl de chaque amplicon de la plaqued’ampliconsverslespuitscorrespondantssurlaplaquederéaction.Mixerparpipetage.

4.8 Couvrirlaplaquederéactionparunjointthermiqueetcentrifugerpendant10secondes.

4.9 Laisserincuberlaplaquederéactiondanslethermocycleurselonleprogrammesuivant:

Programmedefragmentation

NombredeCycles Température durée1 37°C 10minutes1 70°C 15minutes1 4°C ∞

Possibilité de pause sans risque d’altérer la manipulation : Les amplicons peuvent êtreconservésà4°Cjusqu’aulendemainou,pourlesconserverpluslongtemps,lesstockerà-20°C.

4.10 Préparer le Master Mix de réparation des extrémités en suivant le tableau ci-dessous:

MasterMixderéparationdesextrémités

Réactif Volumeparlibrairie(μl)

Volumesrecommandéspour96librairies(μl)

Codecouleur

H2Ostérileàusagemoléculaire 1,25μl 139,2μlEnzymedeRéparationdesExtrémités(C) 1,25μl 139,2μl VertTampondeRéparationdesExtrémités(D) 2,5μl 278,4μl OrangeVolumetotal 5μl 556,8μl


4.11 AliquoterunequantitéégaledeMasterMixversunenouvellecolonnedelaplaquederéactifs.

4.12 Centrifugerlaplaquederéactions(contenantleséchantillonsfragmentés)pendant10secondes.Aliquoter5μldeMasterMixderéparationdesextrémitésàpartirdelaplaquedesréactifsàlaPlaquedeRéaction,Mixerbienparpipetage.

4.13 CouvrirlaPlaquedeRéactionparunjointthermiqueetcentrifugerpendant10secondes.4.14 LaisserincuberlaPlaquedeRéactiondanslethermocycleurselonleprogrammesuivant:

Programmederéparationdesextrémités

Nombredecycles Température Durée1 20°C 30minutes1 65°C 30minutes1 4°C ∞

Possibilitédepausesansaltérerlamanipulation:Lesampliconspeuventêtreconservésà4°Cjusqu’aulendemainou,sipourlesconserverpluslongtemps,onpeutlesstockerà-20°C.

4.15 Retirer la Plaque des Adaptateurs indexés du congélateur (-20°C) et laisser décongeler àtempératureambiantedèsqueleprogrammederéparationdesextrémitésadémarrédanslethermocycleur.Lorsquelaplaquedesadaptateursestàtempératureambiante,lacentrifuger3minutesà3000tr/min.

4.16 Retirerdélicatement le filmde laplaquedesadaptateurs,nepas tropsecouer laplaquedesadaptateursafind’éviterlacontaminationcroisée.

4.17 Transférer le volume complet de chaquepuits depuis la plaquede réaction (25µl) vers lespuitscorrespondantdelaplaquedesadaptateurs.

Remarque:Silatotalitédelaplaquedesadaptateursn’estpasutilisée,ilestpossibled’utiliseruniquementlenombrenécessaired’adaptateurs.Couperlefilmdelaplaqueentrelespuitsàutiliseretlespuitsàgarder.Retirerdélicatementlefilmdelaplaquedesadaptateurs,laissantlefilmenplaceau-dessusdespuitsàgarder.

a. Transférer25µldechaqueéchantillondelaplaquederéactionversunpuitsnon-utilisédanslaplaquedesadaptateurs,bienmixeràl’aided’unepipette.

b. Transférer la totalitédechaqueéchantillondepuisde laplaquedesadaptateursvers lepuitoriginaldelaplaquederéaction.

c. Sceller de nouveau la plaque des adaptateurs et la remettre au congélateur (-20°C).Utiliser la plaque de réaction au lieu de la plaque des adaptateurs pour les étapesrestantesdumanuel.

4.18 Préparer leMasterMix de ligation. Préparer suffisamment deMasterMix de ligation pourchaqueéchantillondanslaplaquederéaction.


.

MasterMixdeligation

Réactif Volume(μl) Volumesrecommandésparplaquecomplète(μl)

Codecouleur

EnzymedeLigation(E) 2,5μl 252,5μl BleuTampondeLigation(F) 30μl 3030μl NoirVolumetotal 32,5μl 3282.5μl

4.19 Aliquoter le Master Mix de ligation dans une colonne neuve de la plaque des réactifs.L’utilisationd’unepipettemulticanauxestrecommandée.

4.20 Aliquoter 32,5μl de Master Mix de ligation dans chaque puits de la plaque de réaction.L’utilisationd’unepipettemulticanauxestrecommandée.Mixeraveclapipette.

4.21 Couvrirlaplaquedesadaptateursparunthermo-filmetcentrifugerpendant10secondes.

4.22 Laisserincuberlaplaquedesadaptateursdanslethermocycleurselonleprogrammesuivant:

Programmedeligation

NombredeCycles Température durée1 25°C 10minutes1 65°C 20minutes1 4°C ∞

Possibilitédepausesansaltérerlamanipulation:Lesampliconspeuventêtreconservésà4°Cjusqu’aulendemainou,sipourlesconserverlongtemps,ilspeuventêtrestockésà-20°C.

4.23 MettrelesbillesAMPureXPàtempératureambiante,s’assurerl’ensembleesthomogène(pasd’amasoudegrappes).Préparer5mld’éthanolà80%(4mld’EtOH+1mldeH2O).

4.24 Préparerlalibrairieenajoutanttouslespoolsd’amplicons(librairiespécifiqueparéchantillon)dansunaliquoteversédansunseultubedemicrocentrifugation«LowBind»(2,0ml).I. Pour 16 échantillons et plus: Calculer la quantité de chaque librairie d’échantillon afin

poolerenuneseule librairieunvolumetotalde900µl.Diviser900μlpar lenombredeslibrairiesd’amplicons.Celadonneralevolumed’aliquoteàprendredechaqueampliconetapipeterdanslalibrairie.

II. Pourmoins de 16 échantillons: Transférer 60 μl de chaque librairie d’échantillons versunelibrairie.

4.25 Ajouter900µldebillesAMPureXPautubedupoolfinal.Bienmixersurunvortexetcentrifugerbrièvement.Veilleràcequelesbillesneseséparentpas.Laisserincuberlalibrairiependant10minutesàtempératureambiante.

Remarque: Si le volume du pool final est inférieur à 900 μl de librairie, ajouter un volumeéquivalentdebillesAMPureXP.Leratiolibrairie/billesdoitêtre1:1.

4.26 Placerletubedupoolfinalsurlesupportmagnétiquependant10minutes.


4.27 Retirer avec précaution et jeter le surnageant du tube de librairie, en laissant le tube sur lesupportmagnétique.Veillerànepastoucherlesbilles.

4.28 Ajouterau tubede librairie, toujoursplacé sur le supportmagnétique,1,5à2mld’éthanolà80% fraichement préparé, S’assurer que le volume d’éthanol soit suffisant pour recouvrir lesbilles.

Remarque:Appliquerl’éthanolsurlecôtédutube,oùiln’yapasdebilles.

4.29 Laisser incuber la librairie à température ambiante pendant 30secondes, puis, retirersoigneusementlesurnageantetlejeter.

4.30 Répéterlesétapes4.28et4.29.

4.31 Centrifuger le tube de librairie pendant 5 secondes, remettre immédiatement le tube sur lesupportmagnétiqueenlelaissantouvert, retirerl’éthanolrésiduelàl’aided’unepipettesanstoucherlesbilles.

Remarque: Veiller à ceque le culot debilles ne contiennepasd’éthanol résiduel. Cela peutnécessiter de bouger le tube sur le support magnétique afin d’enlever l’éthanol sansbouleverserleculotdebilles.

4.32 laissersécher lesbillesà l’air librependant5-8minutessur lesupportmagnétique, jusqu’àcequeleculotdebillessoitsec.

4.33 Retirer le tube de librairie du supportmagnétique et éluer la librairie en versant 31µl d’eaustérileàusagemoléculairesurlesbillesdansletube.Lapointedelapipettenedoitpastoucherlesbillescarellesrisqueraientd’yadhérer.

4.34 Vortexer letubepourremettreensuspension lesbillesetcentrifugerbrièvement.Veilleràcequelesbillesneseséparentpas.

4.35 Laisserincuberlalibrairieàtempératureambiantependant2minutes.

4.36 Placerletubedelibrairiesurlesupportmagnétiquependant2minutes.

4.37 Collecter la librairie: Tout en gardant la librairie finale sur le supportmagnétique, transférer31µldusurnageant versunnouveautubedemicrocentrifugation(type«LowBind»)de1,5ml.

Possibilitédepausesansaltérerlamanipulation:Lesampliconspeuventêtreconservésà4°Cjusqu’aulendemainou,pourlesconserverlongtemps,ilspeuventêtrestockésà-20°C.


Étape5–SélectiondelatailledelibrairieDurée:~1heureL’étape5consisteàutiliserlalibrairiedel’étape4poureffectuerunesélectiondetailledefragmentàl’aide d’un Pippin Prep. Le Pippin Prep sélectionne automatiquement une fourchette de tailles defragmentsADNetleséluedansunechambredecollection.Remarque:UnBluePippinpeutêtreutiliséàlaplaced’unPippinPrep.Voirenannexe1lesinstructionsd’utilisationduPippinPrep.

Listederéactifs

Objet Conservation SourceCassettedegeld’agarose1,5%,sanscolorant 20°Cà25°C SageScienceMarkerMix/colorantdechargePippin 4°C SageScience(étiqueté«K»)* Librairiepoolée 4°C Étape4

*Remarque:LeMarkerKestutiliséaveclePippinPrep.LeBluePippinutiliseleMarkerR2.

Protocole5.1 Mettrelecolorantdecharge«markerK»àtempératureambiante.

5.2 Ajouter31µldupoolfinalnettoyéà10µldesolutiondecharge«MarkerK».

5.3 Mixeràl’aided’unvortexetcentrifuger.

5.4 ConfigurerlePippinPreppourrecueillir lesfragmentsd’ADNcomprisentre650et1300bases.Ajouterle40μld’échantillonsdanslepuitdechargementetexécuter.Laduréed’exécutionestentre45à50minutes.

5.5 Recueillir tout le contenu (approximativement 40 µl) dans la chambre de collection de lacassette du Pippin Prep et le transférer dans un nouveau tube demicro centrifugation «LowBind»de1,5ml.Ceciestlalibrairiesélectionnéepartaille.

Possibilité de pause sans altérer lamanipulation : Les librairies peuvent être conservées à -20°Cpourunepériodeprolongée.


Étape6–QuantificationdelaLibrairieDurée:~1heure

Ilestnécessairedequantifierlalibrairiesélectionnéepartailleafind’obtenirunrésultatoptimalsurleséquenceurMiSeqIllumina.LaqPCRpermetd’enmesureravecprécisionlaconcentration.

Listederéactifs

Objet Conservation SourcePrimerPremixIllumina10× -20°C KAPABiosystemsMasterMixKAPASYBRFASTqPCR2× -20°C KAPABiosystemsStd1(20,0pM) -20°C KAPABiosystemsStd2(02,0pM) -20°C KAPABiosystemsStd3(0,20pM) -20°C KAPABiosystemsStd4(0,02pM) -20°C KAPABiosystemsStandardsd’ADNIllumina -20°C KAPABiosystemsH2Ostérileàusagemoléculaire UtilisateurTamponTE1×(pH8.0) UtilisateurLibrairiesélectionnéepartaille 4°C Étape5

Protocole6.1 PréparerunPrimerMixqPCRàl’usaged’unPrimerPremixIllumina10×etd’unMasterMix

KAPASYBRFASTqPCR2×:

Remarque: La trousse qPCR KAPA SYBR FAST (qPCRMasterMix, Primer Premix et ROX)contient des réactifs qui sont combinés au cours de la première utilisation de la trousse. Lesréactifs du kit KAPA SYBR FAST qPCR et le Primer Mix sont stables jusqu’à 30 cycles decongélation/décongélationauminimum.

MixdeprimerpourlaqPCR

Réactifs Volume(ml)PrimerPremixIllumina10× 1mlMasterMixKAPASYBRFASTqPCR2× 5mlVolumetotal 6ml

6.2 PréparerunMasterMixqPCR.


MasterMixpourlaqPCR

6.3 Préparerunesériededilutionsdelalibrairiesélectionnéepartaille.

a. Préparerunedilution à 1:1000enajoutant 1µl d’ADNde la librairie sélectionnéepartailleà999µlde tamponTE1x (pH8.0),enveillantà soigneusementvider lapipette.Vortexeretcentrifuger..

b. Préparerunedilution à 1:2000en ajoutant 100µl de la dilution à 1:1000à 100µl detamponTE1x(pH8.0).Vortexeretcentrifugerpendant5secondes.

6.4 PrépareruneplaquedequantificationqPCRdansuneplaquePCRà96puitscompatibleàvotresystèmeqPCR.

6.5 Aliquoter16μldeMasterMixqPCRentriplepourlesstandards1à4,unedilutionà1:1000etunedilutionà1:2000(voirlesfiguresenannexe).

6.6 Aliquoter 4μl des standards 1 à 4, la dilution 1:1000 et la dilution 1:2000 dans les puitscorrespondants.

6.7 ScellerlaplaquedequantificationqPCRetcentrifugerpendant10secondes.Remarque:Veiller à réduireaumaximum laproductiondesbullesd’airdans lespuitsde laplaquedequantificationqPCR.

6.8 Déterminer la concentration de l’ADN de la librairie sélectionnée par taille en utilisant lamachineqPCR.

6.9 En utilisant les résultats de la plaque de quantification qPCR, diluer 10μl de la librairiesélectionnée par taille afin de la porter à une concentration de 2nM en ajoutant de la H2Ostérile dans un nouveau tube de micro centrifugation «Low Bind» de 1,5ml. Conserver lalibrairiesélectionnéeparlataillerestanteà–20°C.

Possibilitédepausesansaltérerlamanipulation:Leslibrairiespeuventêtreconservésà-20°Cpendantunelonguepériode,unere-quantificationdelalibrairieestfortementrecommandéeavantd’exécuterlerunsurleMiSeq.

Réactif Volume(μl)PrimerMixqPCR 228μlH2Ostérileàusagemoléculaire 76μlVolumetotal 304μl


Étape7–SéquençagesurplateformeIlluminaMiSeqDurée:~40heures45minutesLa plateforme Illumina MiSeq est un instrument automatisé de NGS qui peut séquencer la librairiesélectionnée par taille, préparéedans les étapesprécédentes. Tous les échantillons indexés sontdé-multiplexésautomatiquementpendantledéroulementduséquençage.

Petite astuce– vouspouvezutiliserunPhiX spike-in à1%commecontrôle additionnelpoursuivre la réaction de séquençage. Référez-vous à la documentation Illumina sur le contrôlePhiXpourdeplusamplesinformations.

Listederéactifs

Objet Conservation SourceCartouchederéactifs -20°C IlluminaHT1 -20°C IlluminaPR2 4°C IlluminaMiSeqFlowCell 4°C IlluminaLibrairieà2nM 4°C Étape6NaOH,0,2N 20°Cà25°C UtilisateurH2Ostérile 20°Cà25°C Utilisateur

CapacitédeskitsderéactifsMiSeqKitderéactifsIlluminaMiSeq Duréeenheures X2-96/7Échantillons

Std500cycles(MS-102-2003)

~39 96

Std300cycles(MS-102-2002)

~24 80

Micro300cycles(MS-103-1002)

~19 28

Nano500cycles(MS-103-1003)

~28 12

Nano300cycles(MS-103-1001)

~17 6

Protocole7.1 PréparerlaplateformeMiSeqselonlesprotocolesstandardsd’Illumina.

7.2 Préparerune librairiedénaturéeà1nM:Dansunnouveau tubedemicro centrifugation (type«Low Bind») de 1,5ml, Combiner 10μl de 0,2N NaOH fraichement préparé et 10μl de lalibrairie sélectionnée par taille diluée à 2nM. Vortexer et centrifuger. Laisser incuber cettelibrairieDénaturéeà1nMàtempératureambiantependant5minutes.

7.3 Préparerunelibrairiedénaturéeà20pM:Ajouter980µldeHT1refroidiet20µldelasolutiondelibrairiedénaturéeà1nM.Vortexeretcentrifuger.


7.4 Préparerunelibrairiedénaturéeà9pM:Ajouter550µldeHT1refroidiet450µldelasolutionde librairiedénaturéeà20pMdansunnouveautubedemicrocentrifugationde1,5ml (type«LowBind»).Vortexeretcentrifugerpendant.

7.5 Aliquoter600μldelalibrairiedénaturéeà9pMdansleréservoird’échantillonsdechargedelacartouchederéactifsMiSeq.

Petite astuce– Il est conseilléd’utiliser leworkbook fournit pour créer la feuilled’échantillonrequisepourleMiSeq.


Étape8–AnalysedesdonnéesduséquençageHLALeMiSeqIlluminavatraiterlaLibrairiepooléeà9pMetgénérerdesdonnéesdeséquençagedansunfichierfastQ.SeréférerauManuelHLATwinpourl’installationcorrectedeHLATwinetpourlesdétailsde l’interprétationde l’analysedegénotypagedesdonnéesdeséquençage.Pourensavoirplussur lamise enœuvreduprotocole automatisé et pour les questions liées à l’installationou à l’analyse desdonnées,[email protected].

Protocolepourlelancementautomatisédesanalyses

Configurationetparamétrageinformatique1. Installerle«ServeurHLATwin»surleposte«Serveur».

2. InstallerHLATwinClientsurleposte«client»–desclientsHLATwinmultiplespeuventseconnecterauserveur.

3. Pouravoirdesinstructionspersonnaliséesconcernantl’automatisation,contacterlesServicessupportOmixon([email protected]).

Protocolepourexécuterl’analyse1. DémarrerleClientHLATwinetidentifiez-vous.

2. Lesdonnéesontdéjàététraitéesouellessontencoursdetraitement.RevoirlesrésultatsenutilisantleSystèmedecodecouleurdansHLATwin.

3. Exporterlesrésultatset/oulesséquencesconsensusdegénotypageàvotreconvenance.

Protocolepourlelancementmanueldesanalysesavecposte«server»

Configurationetparamétrageinformatique

1. InstallerHLATwinServersurleposte«server».

2. InstallerHLATwinClientsurle(s)poste(s)«client».

Protocolepourexécuterl’analyse1. DémarrerClientHLATwinetconnecter-vous.

2. SélectionnerlesdonnéesMiSeqauformatfastQetdémarrerl’exécutiondutypageHLAHolotype.

3. UnefoisletypageHLAHolotypeterminé,revoirlesrésultatsenutilisantleSystèmedecodecouleurdansHLATwin.

4. Exporterlesrésultatset/oulesséquencesconsensusdegénotypageàvotreconvenance.


Protocolepourlelancementmanuelavecposte«Desktop»(bureau)

Configurationetparamétrageinformatique1. Installer«HLATwinDesktop».

Protocolepourexécuterl’analyse1. DémarrerHLATwinetidentifiez-vous.

2. SélectionnerlesdonnéesMiSeqauformatfastQetdémarrerl’exécutiondutypageHLAHolotype.

3. UnefoisletypageHLAHolotypeestterminé,revoirlesrésultatsenutilisantleSystèmedecodecouleurdansHLATwin.

4. Exporterlesrésultatset/oulesséquencesconsensusdegénotypageàvotreconvenance


FiguressupplémentairesExemple de plaque pour plaque d’amplicon, plaque d’amplification,plaque de dilution, plaque de quantification d’amplicon (pour locusindividuel)etplaquederéactions.


Exempledeplaquedequantification

Plaquedequantificationdesstandards

ExempledeplaqueqPCR


Annexe1:PippinPrepProgrammerlePippinPrep1. Cliquersurl’ongletd’éditeurdeprotocoleetcliquersurlebouton«New»(Nouveau).2. Cliquer sur l’icône de dossier à côté du champCassette et sélectionner«1.5%DFMarker K»

(«MarkerK1,5%DF»)pourlePippinPrepou«1.5%DFMarkerR2»(«MarkerR21,5%DF»)pourleBluePippin.

3. Danslapisteencoursdeprogrammation:a. Mettreenlumièrelechamp«Range»(«Fourchette»).b. Paramétrerlavaleurduchamp«RefLane»(«VoiedeRéf»)àcorrespondreaunumérode

lapistedanslaquellevoustravaillez.c. Paramétrerlavaleurduchamp«Start*»(«Démarrer*»)à650.d. Paramétrerlavaleurduchamp«End*»(«Arrêter*»)à1300.

4. Danslechampdelapistederéférence,sélectionnerlapistedanslaquellevoustravaillez.5. Cliquersurlebouton«SaveAs»(«Enregistrersous»)etdonnerunnomàvotreprogramme

ExécuterlePippinPrep1. DémarrerlePippinPrepenappuyantsurleboutond’alimentationaudosdel’appareil.2. Examiner visuellement le Pippin Prep. Veiller à ce que les 5 LEDs soient allumés et que

l’intérieurdel’appareilsoitpropreetsec.3. Cliquersur le logoSageScienceenbasàdroitedel’écran.Celavouspermettradesaisirvotre

motdepasse.Lemotdepasseparamétrépardéfautdufabricantest«pips».4. Cliquersurl’onglet«FactorySetup»(«Paramétraged’usine»)etveilleràcequelavaleur

«Base-to-Threshold»(«Base-à-Seuil»)soitparamétréà0,02.5. Placerledispositifd’étalonnageàl’intérieurduPippinPrep,enveillantàcequelabandefoncée

soitorientéeverslebasetpasseau-dessusdeslumièresLED.6. Dansl’onglet«Main»(«Principal»),cliquersurlebouton«Calibration»(«Étalonnage»).7. Danslafenêtredel’étalonnage,veilleràcequelechamp«TargetIpHmA»(«mApHIcible»)

soitparamétréà0,80 (0,60pour leBluePippin)etensuite cliquer sur lebouton«Calibrate»(«Étalonner»).

8. Ouvrir l’onglet «Protocols» («Protocoles»). Cliquer sur le bouton «Load» («Charger») etsélectionner le programme pour HLA Holotype et la piste spécifique que vous allez utiliser.Veilleràceque:a. Lapisteappropriéesoitactivée.b. L’indicateurdelasélectiondelargespectresoitallumé.c. Lapistederéférencesoitlamêmequecellequiseraexécutée.

9. Ouvrirl’onglet«Main»(«Principal»).Veilleràceque:a. Leprogrammequevousavezchargésoitlemêmequeceluiquiestsélectionné.b. Lapistederéférenceappropriéesoitsélectionnéeetqu’ellesoitlamêmequecellede

l’échantillonquiseraexécuté.10. Inspecter la cassette.Avantd’enlever le film scellant lespuits, vérifier s’il y adesbullesd’air

derrière l’accès à la chambre d’élution. Si des bulles d’air sont présentes derrière cet accès,taperdélicatementlacassettedansvotremainpourexpulserlesbullesd’air.


11. Placerlacassetteàl’intérieurduPippinPrepaveclefilmtoujourscouvrantlespuits.12. Retirersoigneusementlefilm,enveillantàenleverlefilmàpartirducôtépropredelacassette

(piste5)verslecôtéutilisédelacassette(piste1).S’assurerqu’aucunliquiden’estdéverséaucoursduretraitdufilmafind’évitertoutrisquedecontamination.

13. Enlever la totalité du tampon à partir de chaque puit d’accès à la chambre d’élution et ydéposer40μldenouveautampond’électrophorèse.

14. Ajouterunefinebandedefilmau-dessusdespuitd’accèsàlachambred’élution.15. Lesréservoirsdontleniveauestinférieurau¾duvolumetotal,doiventêtrecomplétésavecdu

tampond’électrophorèse.Nepastropremplirlespuits!Letampondoittoutjusteatteindreleplastiquedupuitspournepasqu’ildébordelorsquelecouvercleglisse.Appliquerletamponencommençantparlespuitspropres(piste5)etencontinuantverslespuitsutilisés(piste1).

16. S’assurer que chaque chambre de charge (puits avec agarose) est remplie de tampond’électrophorèse.Letampondoitjusterecouvrirl’agarose,etavoiruneapparenceplate.

17. FermerlentementlePippinPrep,enveillantàcequ’àaucunendroit,lecouverclenetouchepasletamponlorsquel’appareilseferme.

18. Réaliserlecontrôledecontinuité.Ilarriveparfois,lorsquelescapteurssèchentunpeu,quelecontrôle échoue au premier essai. Si cela arrive, refaire le test, une fois qu’il a réussi ouvrirdoucement le Pippin Prep. Vérifier que le couvercle ne fasse pas déborder de fluide sur lacassette.

19. VortexerbrièvementvotreMarkerKetcentrifuger.Ajouter10μldeMarkerKàvotrelibrairiede~30μl.

20. Vortexerbrièvementvotrelibrairieetcentrifuger.21. Enlever40μldetampondupuitsd’échantillonquevousallezutiliser.22. Ajouter env. 40μl de tampon à partir de la librairie chargée de Marker K vers le puits

d’échantillonquevousallezutiliser.23. Marquerlapistequevousutilisezenyinscrivantlesinitialesdutechnicienetladate.24. Fermer lePippinPrepet cliquer sur lebouton«Start» («Démarrer»). S’assurerque lapiste

appropriéeaitétéactivée.L’exécutiondel’échantillondoitdurer45minutesenviron.25. Unefois lerunestterminé,ouvrir lePippinPrepavecprécaution.Vérifierquelecouverclene

fassepasdéborderdefluidesurlacassette.26. Enleverlefilmcouvrantlespuitd’accèsàlachambred’élution,nepastoucherleliquide.27. Prélever la totalité de l’échantillon à partir du puit d’accès à la chambre d’élution et le

transférerdansuntubeLowBindde1,5mlpropre.28. Couvrir tous lespuitsouvertsdedeuxpiècesde filmà scellerdesplaques.Nepasoublierde

laisserunelanguetteducôtépropre.Celafaciliteral'enlèvementdufilmàpartirducôtépropreverslecôtéutilisé.

29. Placerlacassettescelléedanssonemballageetlamettredecôté.30. Prendrelacassettedelavageetlaremplird’eauMiliQ.31. FermerlecouvercleduPippinPrepavecprécaution.Vérifierquelecouverclenefassepas

déborderdefluidesurlacassette.32. LaisserlePippinPrepfermépendantquelquessecondes.33. OuvrirlePippinPrep,Vérifierquelecouverclenefassepasdéborderdefluidesurlacassette.34. Enleverlacassettedelavageenvidantl’eaudelacassetteetlalaissersécher.35. NettoyertouteeauverséesurlePippinPrepetlefermeravecprécaution.


36. Sélectionnerlebouton«ShutDown»(«Éteindre»)danslemenuPippinPrep


Annexe2:SampleSheet(Feuillederoute)[Header],,,,,,,IEMFileVersion,4,,,,,,InvestigatorName,RHP,,,,,,ExperimentName,030315S_RHP,,,,,,Date,3/3/15,,,,,,Workflow,GenerateFASTQ,,,,,,Application,FASTQOnly,,,,,,Assay,CHOPPCRFree,,,,,,Description,030315L_RHP,,,,,,Chemistry,Default,,,,,,,,,,,,,[Reads],,,,,,,251,,,,,,,251,,,,,,,,,,,,,,[Settings],,,,,,,Adapter,AGATCGGAAGAGCACACGTC,,,,,,AdapterRead2,AGATCGGAAGAGCGTCGTGT,,,,,,,,,,,,,[Data],,,,,,,Sample_ID,Sample_Name,Sample_Plate,Sample_Well,I7_Index_ID,index,Sample_Project,Description001__030315S_RHP_1,001__030315S_RHP_1,030315P_RHP,A1,1,TAAGTGATC,030315S_RHP,002__030315S_RHP_2,002__030315S_RHP_2,030315P_RHP,B1,2,GTGGTATTC,030315S_RHP,003__030315S_RHP_3,003__030315S_RHP_3,030315P_RHP,C1,3,ATAAGTACT,030315S_RHP,004__030315S_RHP_4,004__030315S_RHP_4,030315P_RHP,D1,4,TAGGATTCA,030315S_RHP,005__030315S_RHP_5,005__030315S_RHP_5,030315P_RHP,E1,5,AAGTGCATA,030315S_RHP,006__030315S_RHP_6,006__030315S_RHP_6,030315P_RHP,F1,6,TACACACAA,030315S_RHP,007__030315S_RHP_7,007__030315S_RHP_7,030315P_RHP,G1,7,TCTCCGAGC,030315S_RHP,008__030315S_RHP_8,008__030315S_RHP_8,030315P_RHP,H1,8,AGTAACCGC,030315S_RHP,009__030315S_RHP_9,009__030315S_RHP_9,030315P_RHP,A2,9,AGGCAAGTT,030315S_RHP,010__030315S_RHP_10,010__030315S_RHP_10,030315P_RHP,B2,10,CCGTACTAT,030315S_RHP,011__030315S_RHP_11,011__030315S_RHP_11,030315P_RHP,C2,11,GCCAGGTGC,030315S_RHP,012__030315S_RHP_12,012__030315S_RHP_12,030315P_RHP,D2,12,CAACATCAC,030315S_RHP,013__030315S_RHP_13,013__030315S_RHP_13,030315P_RHP,E2,13,GTCAGCACC,030315S_RHP,014__030315S_RHP_14,014__030315S_RHP_14,030315P_RHP,F2,14,CTTGGCTGT,030315S_RHP,015__030315S_RHP_15,015__030315S_RHP_15,030315P_RHP,G2,15,GTAGTACTA,030315S_RHP,016__030315S_RHP_16,016__030315S_RHP_16,030315P_RHP,H2,16,GCAAGTCAA,030315S_RHP,017__030315S_RHP_17,017__030315S_RHP_17,030315P_RHP,A3,17,ATTACTACC,030315S_RHP,018__030315S_RHP_18,018__030315S_RHP_18,030315P_RHP,B3,18,CGCTCTAAT,030315S_RHP,019__030315S_RHP_19,019__030315S_RHP_19,030315P_RHP,C3,19,ACTTCGGTC,030315S_RHP,020__030315S_RHP_20,020__030315S_RHP_20,030315P_RHP,D3,20,TGGTACGAC,030315S_RHP,021__030315S_RHP_21,021__030315S_RHP_21,030315P_RHP,E3,21,TGCATAATG,030315S_RHP,022__030315S_RHP_22,022__030315S_RHP_22,030315P_RHP,F3,22,CTGGTTGGC,030315S_RHP,023__030315S_RHP_23,023__030315S_RHP_23,030315P_RHP,G3,23,CTCTTATTC,030315S_RHP,024__030315S_RHP_24,024__030315S_RHP_24,030315P_RHP,H3,24,AGGACTCTC,030315S_RHP,


025__030315S_RHP_25,025__030315S_RHP_25,030315P_RHP,A4,25,GCATTCCAA,030315S_RHP,026__030315S_RHP_26,026__030315S_RHP_26,030315P_RHP,B4,26,TCAAGGTCA,030315S_RHP,027__030315S_RHP_27,027__030315S_RHP_27,030315P_RHP,C4,27,CACTCCGTT,030315S_RHP,028__030315S_RHP_28,028__030315S_RHP_28,030315P_RHP,D4,28,CAGCCAGTT,030315S_RHP,029__030315S_RHP_29,029__030315S_RHP_29,030315P_RHP,E4,29,AGCAGCACA,030315S_RHP,030__030315S_RHP_30,030__030315S_RHP_30,030315P_RHP,F4,30,TTCCGTAAG,030315S_RHP,031__030315S_RHP_31,031__030315S_RHP_31,030315P_RHP,G4,31,TCCTGTGGA,030315S_RHP,032__030315S_RHP_32,032__030315S_RHP_32,030315P_RHP,H4,32,GTGATAGCC,030315S_RHP,033__030315S_RHP_33,033__030315S_RHP_33,030315P_RHP,A5,33,TAGCTCTGA,030315S_RHP,034__030315S_RHP_34,034__030315S_RHP_34,030315P_RHP,B5,34,GCGAGTTGA,030315S_RHP,035__030315S_RHP_35,035__030315S_RHP_35,030315P_RHP,C5,35,TAGGTAATG,030315S_RHP,036__030315S_RHP_36,036__030315S_RHP_36,030315P_RHP,D5,36,GTAACTATA,030315S_RHP,037__030315S_RHP_37,037__030315S_RHP_37,030315P_RHP,E5,37,CTCCAGCCG,030315S_RHP,038__030315S_RHP_38,038__030315S_RHP_38,030315P_RHP,F5,38,AATATACCG,030315S_RHP,039__030315S_RHP_39,039__030315S_RHP_39,030315P_RHP,G5,39,GCGAGACGT,030315S_RHP,040__030315S_RHP_40,040__030315S_RHP_40,030315P_RHP,H5,40,CCACCGGAT,030315S_RHP,041__030315S_RHP_41,041__030315S_RHP_41,030315P_RHP,A6,41,CGACGAGGT,030315S_RHP,042__030315S_RHP_42,042__030315S_RHP_42,030315P_RHP,B6,42,GCGCTGGCA,030315S_RHP,043__030315S_RHP_43,043__030315S_RHP_43,030315P_RHP,C6,43,GGCACTAGG,030315S_RHP,044__030315S_RHP_44,044__030315S_RHP_44,030315P_RHP,D6,44,CTGGAATCG,030315S_RHP,045__030315S_RHP_45,045__030315S_RHP_45,030315P_RHP,E6,45,CTTGTTATC,030315S_RHP,046__030315S_RHP_46,046__030315S_RHP_46,030315P_RHP,F6,46,AACCACTTA,030315S_RHP,047__030315S_RHP_47,047__030315S_RHP_47,030315P_RHP,G6,47,GGCGCTTCT,030315S_RHP,048__030315S_RHP_48,048__030315S_RHP_48,030315P_RHP,H6,48,CCGAGGCTT,030315S_RHP,049__030315S_RHP_49,049__030315S_RHP_49,030315P_RHP,A7,49,TCGATCGTT,030315S_RHP,050__030315S_RHP_50,050__030315S_RHP_50,030315P_RHP,B7,50,TTGGCTACG,030315S_RHP,051__030315S_RHP_51,051__030315S_RHP_51,030315P_RHP,C7,51,TATTGCGTC,030315S_RHP,052__030315S_RHP_52,052__030315S_RHP_52,030315P_RHP,D7,52,GATTCTAGG,030315S_RHP,053__030315S_RHP_53,053__030315S_RHP_53,030315P_RHP,E7,53,TCCAACACT,030315S_RHP,054__030315S_RHP_54,054__030315S_RHP_54,030315P_RHP,F7,54,TACCGAGGT,030315S_RHP,055__030315S_RHP_55,055__030315S_RHP_55,030315P_RHP,G7,55,TTGTACCGA,030315S_RHP,056__030315S_RHP_56,056__030315S_RHP_56,030315P_RHP,H7,56,TAGTGGAGG,030315S_RHP,057__030315S_RHP_57,057__030315S_RHP_57,030315P_RHP,A8,57,GACCTGTTA,030315S_RHP,058__030315S_RHP_58,058__030315S_RHP_58,030315P_RHP,B8,58,TTCTTCCTA,030315S_RHP,059__030315S_RHP_59,059__030315S_RHP_59,030315P_RHP,C8,59,ATTCCGGTT,030315S_RHP,060__030315S_RHP_60,060__030315S_RHP_60,030315P_RHP,D8,60,GTTAGGCTC,030315S_RHP,061__030315S_RHP_61,061__030315S_RHP_61,030315P_RHP,E8,61,AGTCTGACT,030315S_RHP,062__030315S_RHP_62,062__030315S_RHP_62,030315P_RHP,F8,62,ATACATAAC,030315S_RHP,063__030315S_RHP_63,063__030315S_RHP_63,030315P_RHP,G8,63,CGTTACGGC,030315S_RHP,064__030315S_RHP_64,064__030315S_RHP_64,030315P_RHP,H8,64,CCGCACTGG,030315S_RHP,065__030315S_RHP_65,065__030315S_RHP_65,030315P_RHP,A9,65,CACGTAGGC,030315S_RHP,066__030315S_RHP_66,066__030315S_RHP_66,030315P_RHP,B9,66,TAGAGCCAC,030315S_RHP,067__030315S_RHP_67,067__030315S_RHP_67,030315P_RHP,C9,67,TTGTCCAAT,030315S_RHP,068__030315S_RHP_68,068__030315S_RHP_68,030315P_RHP,D9,68,CCTGGTTCA,030315S_RHP,069__030315S_RHP_69,069__030315S_RHP_69,030315P_RHP,E9,69,ATCAATATG,030315S_RHP,070__030315S_RHP_70,070__030315S_RHP_70,030315P_RHP,F9,70,TGGTAACCG,030315S_RHP,071__030315S_RHP_71,071__030315S_RHP_71,030315P_RHP,G9,71,TTCTTGACG,030315S_RHP,072__030315S_RHP_72,072__030315S_RHP_72,030315P_RHP,H9,72,GTTCGTATC,030315S_RHP,


073__030315S_RHP_73,073__030315S_RHP_73,030315P_RHP,A10,73,ATCCTAGGA,030315S_RHP,074__030315S_RHP_74,074__030315S_RHP_74,030315P_RHP,B10,74,GCATTATAT,030315S_RHP,075__030315S_RHP_75,075__030315S_RHP_75,030315P_RHP,C10,75,TGACGTCTA,030315S_RHP,076__030315S_RHP_76,076__030315S_RHP_76,030315P_RHP,D10,76,TCAGATCCA,030315S_RHP,077__030315S_RHP_77,077__030315S_RHP_77,030315P_RHP,E10,77,CTCTGTGGT,030315S_RHP,078__030315S_RHP_78,078__030315S_RHP_78,030315P_RHP,F10,78,AGCGAGCGC,030315S_RHP,079__030315S_RHP_79,079__030315S_RHP_79,030315P_RHP,G10,79,ACTCCTACG,030315S_RHP,080__030315S_RHP_80,080__030315S_RHP_80,030315P_RHP,H10,80,CGTAACATC,030315S_RHP,081__030315S_RHP_81,081__030315S_RHP_81,030315P_RHP,A11,81,CCGGTGTAT,030315S_RHP,082__030315S_RHP_82,082__030315S_RHP_82,030315P_RHP,B11,82,CGGATCCTG,030315S_RHP,083__030315S_RHP_83,083__030315S_RHP_83,030315P_RHP,C11,83,AGGCGCTAC,030315S_RHP,084__030315S_RHP_84,084__030315S_RHP_84,030315P_RHP,D11,84,ATTCTGCTA,030315S_RHP,085__030315S_RHP_85,085__030315S_RHP_85,030315P_RHP,E11,85,ACTTGTAGG,030315S_RHP,086__030315S_RHP_86,086__030315S_RHP_86,030315P_RHP,F11,86,GCCTGTTGT,030315S_RHP,087__030315S_RHP_87,087__030315S_RHP_87,030315P_RHP,G11,87,ACACGACCA,030315S_RHP,088__030315S_RHP_88,088__030315S_RHP_88,030315P_RHP,H11,88,CAGCTCGGT,030315S_RHP,089__030315S_RHP_89,089__030315S_RHP_89,030315P_RHP,A12,89,ATCAACCTA,030315S_RHP,090__030315S_RHP_90,090__030315S_RHP_90,030315P_RHP,B12,90,GCGGAAGCG,030315S_RHP,091__030315S_RHP_91,091__030315S_RHP_91,030315P_RHP,C12,91,CCTGTTAGG,030315S_RHP,092__030315S_RHP_92,092__030315S_RHP_92,030315P_RHP,D12,92,ATCTGAGCC,030315S_RHP,093__030315S_RHP_93,093__030315S_RHP_93,030315P_RHP,E12,93,ACCTCCTCA,030315S_RHP,094__030315S_RHP_94,094__030315S_RHP_94,030315P_RHP,F12,94,CGCGAAGAG,030315S_RHP,095__030315S_RHP_95,095__030315S_RHP_95,030315P_RHP,G12,95,GTTCTCCTG,030315S_RHP,096__030315S_RHP_96,096__030315S_RHP_96,030315P_RHP,H12,96,GAATGACCA,030315S_RHP,


Annexe3: Quantification d’amplicon avec uninstrumentdeqPCR

Listederéactifs

Objet Conservation SourceTampon(buffer)TE20×(pH7.5) 4°C PromegaADNStandardLambda(100ng/μL) 4°C PromegaColorantADNdoublebrinQuantiFluor200× 4°C PromegaH2Ostérileàusagemoléculaire 20°Cà25°C UtilisateurPlaque(s)d’AmplificationClasseI 4°C Étape2Plaque(s)d’AmplificationClasseII 4°C Étape2

Protocole1. Préparerdesstandardsd’ADNpardilutionsérielleenutilisantdestubesmicrocentrifugationde

1,5ml et de l’ADN standardQuantiFluor “Lambda” (100 ng/μl). suivre le tableau de dilution ci-dessous:

Étiquettesurletube

ADNutilisée Volumed’ADN(μl)VolumeduTE1x(μL) Conc.finaleng/μL

Standard1 ADNLambda 7,5μl 492,5μl 1,5ng/μlStandard2 Standard1 250μl 250μl 0,75ng/μlStandard3 Standard2 250μl 250μl 0,38ng/μlStandard4 Standard3 250μl 250μl 0,19ng/μlStandard5 Standard4 250μl 250μl 0,09ng/μlStandard6 Standard5 250μl 250μl 0,05ng/μlStandard7,blanc Blanc 0μl 250μl 0ng/μl

2. Préparer des plaques de dilution d’amplicons avec des plaques à puits profonds à 96 puits(capacitéde1mlparpuits).Ajouter498μldetamponTE1xdanslespuitscorrespondantsauxplaques d’amplicons. Aliquoter 2 μl d’ADN amplifié à partir des plaques d’amplicons vers lespuits correspondantsde laplaquededilutiond’amplicons, bien vider lapipetteparpipetage.Scellerlaplaqueetbienvortexer.Centrifugerlaplaquependant10secondes.

3. Préparerunesolution1xdecolorantQuantiFluorselonlaformulesuivante:0,5μldecolorantQuantiFluor(200X)+99,5μldetampon1×TE.Préparersuffisammentdesolution1xdecolorantQuantiFluor pourquechaqueéchantillon (totaldeséchantillonsdesPlaquesd’Amplicons) etquechaquestandard(6standardset1blancendouble)puissentavoir50μld’aliquote.

4. Aliquoter50μldesolution1xdecolorantQuantiFluordansdespuitsdansdenouvellesplaquesà96puitscompatibleavecvotreappareilàPCR.

5. Enutilisant lesstandardspréparésci-dessous,ajouter100μldechaquestandardendouble,àdes puits individuels d’une plaque de quantification à 96 puits (14 puits au total).Mixer par


pipetage.

6. Ajouter50μld’ampliconsdilués,prélevésdanslespuitscorrespondantsdesplaquesdedilutiond’amplicons dans les puits individuels des plaques de quantification d’amplicons. Mixer parpipetage.

7. Placerchaqueplaquedequantificationdansl’appareildePCRl’unaprèsl’autreetexécuterunrunensuivantceprogramme:

NombredeCycles Température Durée1 25°C 10secondes 25°C 15secondes2 25°C 30secondes(acquisitiondonnées)

8. Calculer la concentrationd’ADNdesplaquesdequantificationd’ampliconsgrâceauxdonnéesRFUgénéréesparlefluoromètre.

9. Diluerl’ADNdanslesPlaquesd’Ampliconsavecdel’H2Ostérilepourquelaconcentrationfinaled’ADNsoitde67ng/μlenviron.

§ Silaconcentrationdel’ADNest≥150ng/μl:ajouter25μldeH2O

§ Silaconcentrationdel’ADNest100–150ng/μl:ajouter10μldeH2O

§ Silaconcentrationdel’ADNest≤100ng/μl:nepasajouterdeH2O

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