HIV Testing

กรรณกา เจยมจรอนนต

นกเทคนคการแพทยช านาญการพเศษ

หวหนากลมภมคมกนวทยา

การเรยงตวของยนบนสายยโนมของเชอ HIV และหนาทในการสรางโปรตน

Prot.สวนยดกบเปลอกนอก

Prot.เปลอกนอก Prot.แกนกลาง

การแบงชนดของ HIV

gp36 ของ HIV2 gp105 ของ HIV-2

gp41 ของ HIV-1 gp120 ของ HIV-1

มากสด

พบมากในไทย

ความแตกตาง เอชไอไอว (HIV) และ เอดส (AIDS)

การตดเชอเอชไอว (HIV infection)

– โดยทวไปรางกายไมสามารถก าจดเชอออกไปได ท าใหระบบภมคมกนท างานบกพรอง

– แตการไดรบยาตาน สามารถควบคมไวรสได และผตดเชออาจไมมอาการเปนเวลาหลายสบป โดยผลขางคยงของยามนอยลงมาก

เอดส (AIDS)

– ระยะทภมคมกนรางกายบกพรองมากๆ (โดยเฉพาะเมอ CD4 นอยกวา 200)

– เกดอาการของโรคทเกดจากภมคมกนในรางกายเสอมหรอบกพรอง ท าใหมโอกาศตดเชอโรคฉวยโอกาส ไดงาย เชน ตดเชอราในปอด ในสมอง วณโรค หรอมะเรงบางชนด เปนตน

หลกการทวไป การตอบสนองของรางกายตอการตดเชอเอชไอว

ระยะเวลาหลงการตดเชอเอชไอว

weeks years

Infection Viral detection (NAT)

Viral detection (P24) 4th gen test

Antibody detection 3th gen test

ระยะการด าเนนของโรคเอดส

Cr. ดร.สดา ลยศรโรจนกล

Window Period คออะไร มความส าคญอยางไร

ชวงเวลาทคนไขไดรบเชอมาแลว แตยงไมสามารถตรวจ

พบได

–* รางกายแตละคน ตอบสนองการตดเชอ ในวลาไมเทากน

–**ความไวของ Test ทใช ไมเทากน

ในชวง window period รางกายไดรบเชอเอชไอวมาแลว เปนชวงทสงตอไปสผ อนไดสงมาก

Markers ทตรวจพบหลงการตดเชอ HIV ระยะตางๆ

HIV testing • Direct Testing

คอ การตรวจหาการตดเชอโดยตรง โดยตรวจหา Antigen ของเชอ ไดแก

- การตรวจหายโนมของเชอ (Nucleic Acid Testing หรอ NAT) หลกการ RT-PCR สามารถตรวจพบหลงการตดเชอไดประมาณ 6-11 วน

- การตรวจ HIV p24 Ag ใชไดในระยะแรกทผปวยยงไมมการสราง Ab ( WHO Standard = 2 IU/mL ) สามารถตรวจพบหลงการตดเชอไดประมาณ 16 วน

• Indirect Testing

คอตรวจหาการตดเชอทางออม โดยการตรวจหา Antibody ตอเชอ ปจจบนสามารถพฒนาชดตรวจใหมความไวคอตรวจพบหลงการตดเชอแลวประมาณ 3-4 สปดาห

1) First generation ใชหลกการ indirect enzyme immunoassay (EIA) โดยการใช viral lysate เปนแอนตเจนเคลอบบน solid phase เพอตรวจหาแอนตบอดในตวอยางตรวจ จากนนตรวจตดตามโดย anti-human IgG conjugate

ววฒนาการของชดตรวจ Anti-HIV

2) Second generation ใชหลกการเดยวกนแตแอนตเจนทใช เปน recombinant protein หรอเปปไทดสงเคราะห

3) Third generation ใชอยในปจจบน หลกการเปน double antigen sandwich EIA สามารถตรวจจบไดทง anti-HIV ชนด IgG และ IgM ทาใหมความไวในการตรวจ ระยะ seroconversion ไดดขน โดยทวไปใหความไว 3-8 สปดาห วนภายหลงตรวจพบเชอ (HIV RNA)

4) Fourth generation พฒนาโดยการเพมการทดสอบแอนตเจน p24 เขารวมดวย ทาใหตรวจไดทงแอนตเจนและแอนตบอดในเวลาเดยวกน มความไวสงขน ตรวจ ระยะ seroconversion ไดดขน โดยทวไปใหความไว 2-4 สปดาหภายหลงตรวจพบเชอ (HIV RNA)

ความสามารถในการตรวจของชดตรวจแตละรน

Days

ชนดของ test kits/ชดตรวจ และ window Period

ตรวจ HIV Antibodies

ตรวจ HIV-1 RNA (gene) หรอ NAT

ตรวจ HIV p24 (protein) Antigen

ใชกนโดยทวไป เพอวนจฉยการตดเชอ HIV (3rd gen)

ใชใน : 4th Gen EIA (P24 +

Antibody)

ตรวจพวก acute infection

3-8 สปดาห 2-4 สปดาห 7-14 วน

ตรวจ แอนตบอด ตรวจ แอนตบอด และแอนตเจน ตรวจ HIV ยน

Window Period

การตรวจคดกรอง Anti-HIV

• Machine based immunoassay ใชเครองตรวจวเคราะหในการท า หลกการทใช เชน EIA , CIA ผลของปฏกรยาจะเปนการเปรยบเทยบกบคา Cutoff ตองอานดวยเครอง

• Rapid test เปน Simple Assay ไมตองใชเครองมอทยงยาก ท างาย ไดผลเรว สวนใหญสามารถอานผลของปฏกรยาดวยตาเปลาได หลกการทใช เชน Immunochromatography , Particle agglutination

รปแบบ หลกการตางๆของชดตรวจ HIV

ชนด รปแบบ ขนตอน เวลาอานผล

Rapid test Immunochromatography 1-2 10-20 นาท

<5 นาท Immunofiltration (ไมมในไทย) 3-4

Simple test Gel particle agglutination 2-3 2 ชม

<30 นาท Indirect EIA 3-4

Immunoassay Machine 1-2 1-2 ชม

Nucleic acid (NAT)

Machine 1-2 4-8 ชม

หลกการ Immunochromatography

HIV Testing Algorithm คออะไร

ขนตอนการตรวจเพอวนจฉยการตดเชอเอชไอว โดยใชชดทดสอบตางกนหลายชด เพอเพมความถกตองของผลการตรวจ

ตองเลอก Testing algorithm ทเหมาะสม จะเพมความไว (sensitivity) และ

ความจ าเพาะ (specificity) ของการตรวจ

หลกการคอ การใชชดตรวจแรกทมความไวสงสด เพอคนหาผตดเชอใหไดเรวทสด

ชดตรวจท 2 และ ท 3 ควรมความจ าเพาะสงขนเปนล าดบ เพอเพมความจ าเพาะและความถกตองใหผลทตรวจ

แตละประเทศม algorithm ตางกน

แนวทางการตรวจวนจฉยการตดเชอเอชไอว ส าหรบผใหญ

หมายเหต ตองดรายละเอยด และอานเพมเตมใน “ แนวทางแนวทางการตรวจวนจฉยและ ดแลรกษาตดเชอเอชไอว และผ ปวยเอดสระดบชาต ป 2560”

แผนภมการตรวจวนจฉยการตดเชอเอช ไอ ว ทางหองปฏบตการส าหรบผใหญ

หรอเดกทมอายตงแต 24 เดอน ขนไป

มอะไรใหมใน HIV testing guideline

• Window period

– ปรบเปลยนจาก 3 เดอนเปน 1 เดอน เพราะชดตรวจหาการตดเชอในปจจบนมเทคโนโลยทกาวหนาขน

• กรณ “สรปผลไมได (inconclusive)”

– ใหนด 2 สปดาห และ 1 เดอน หากผลยงเปน inconclusive ใหสรปผลวาไมตดเชอได (ไมตองนด 3 เดอน)

• การตรวจ DNA PCR ในเดก

– ควรตรวจเมอเดกอายไมเกน 7 วน (eMTCT program)

• กรณการตรวจซ า ( Re testing )

23

มอะไรใหมใน HIV testing guideline cont.

• กรณการตรวจซ า ( Re testing )

–กรณผลลบ และยงม risk (ตรวจฟร 2ครง/ป)

• แนะน า PrEP ถามความเสยงสง

–กรณผลสรปไมได

–กรณผลบวก

• ตรวจผลบวกครงแรก (เพอยนยนตวตน ปองกนการสลบคน) เจาะเลอดใหม ตรวจ test เดยว

24

• เจาะเลอดดวยหลอด EDTA หรอ Clot blood ปรมาณอยางต า ๓ มลลลตร

• ท าการตรวจวเคราะหตามแผนภม แนวทางการวนจฉยการตดเชอเอชไอวทางหองปฏบตการ ส าหรบผใหญ และเดกทมอาย ๑๘ เดอนขนไป ซงมการใชน ายาตรวจวเคราะหหา Anti - HIV ๓ ชนด

• ก าหนดใหใชน ายาส าหรบการตรวจวเคราะห ๓ ชนด A1, A2 และ A3 ดงตอไปน

น ายา A1 คอ Alere Determine HIV ½

น ายา A2 คอ SD Bioline

น ายา A3 คอ First Response

การตรวจ Anti - HIV ของศนยบรการสาธารณสข

หมายเหต ๑.กรณผลบวก (Positive) ใหรายงานผลบวกใหกบผ เกยวของแลวตรวจสอบประวต หากพบวาเปนผตดเชอรายใหม หรอ ตรวจเปนครงแรก (newly diagnosis) ควรแนะน าใหเจาะเลอดครงท ๒ เพอยนยนตวบคคลโดยใชชดทดสอบเดมอยางนอย ๑ วธ

๒.การรายงานผลสรปไมได (Inconclusive) ใหตดตามผมารบบรการตรวจเลอดซ าท ๒ สปดาห และหรอ ๑ เดอน โดยทดสอบใหมตามล าดบขนตอน A1, A2 และ A3 เชนเดม หากผลการตรวจเปน inconclusive เหมอนเดม ภายหลง ๑ เดอน ใหรายงานผลลบ และปรกษาผ เชยวชาญ อยางไรกตามผใหการปรกษาควรเนนเรองการปองกนการถายทอดเชอแกผ อนอยางเครงครดดวย

ปญหาผลแลปผดพลาดสวนมากเกดจากอะไร

ผลแลปผดพลาด

เครองมอ อปกรณ

(equipment)

น ายาแลป

(reagents)

ความเหมาะสมของ test ทใช

(validated test)

ความช านาญผตรวจ (training)

การตรวจสอบการออกผล (verify

results)

การบรหารจดการ การท างาน (time

pressures, workload)

ปจจยทมผลตอการท าการทดสอบ • สงสงตรวจ - ชนดสารกนเลอดแขง - คณภาพ, ปรมาณ - การปนเปอน? - การบงช และ ทวนสอบได • ความสามารถของน ายาทดสอบทเลอกใช ความไว >= 99.5% ความจ าเพาะ >= 99% • คณภาพของน ายาทดสอบ • Marker ทเลอกใชกบระยะการตดเชอของผ ปวย • สารรบกวนการทดสอบ จากตวอยางบางตวอยางทมผลกบน ายาทดสอบ

บางชนด • ผท าการทดสอบ ความช านาญ? • วธการทดสอบ ปฏบตตาม WI Algorithm • การควบคมคณภาพ

ขนตอนการสงตรวจแลปและขอผดพลาดบอย

กอนตรวจแลป (ผดพลาด 46-68.2%) • ตวอยางไมพอ

• ตวอยางผดคน

• ลง ชอ รหสผด

• ชนดตวอยางไมเหมาะสม

• ตวอยางเกบไวไมด

ขณะตรวจแลป (ผดพลาด 7-13.3%) •ขาดการดแลรกษาเครองมอ

•คณภาพน ายาตรวจไมเหมาะสม

•ตวอยางผด สลบคน

•มสงกอกวนผลการทดสอบใน

ตวอยาง

หลงตรวจ (ผดพลาด 18.5-47%) •แปลผลผด

•บนทกผลผด ออกผลผดคน

•ใหผลกลบคนไขชามาก

•ไมรายงานคาวกฤต

สาเหตทท าใหเกดผลลบปลอมดวยวธตรวจคดกรองเบองตน • ผตดเชออยในระยะเพงตดเชอ หรอ ระยะ window period

• ความผดพลาดทางเทคนคของผท าการตรวจ

• ไมมการตอบสนองของระบบภมคมกนของผตดเชอ

สาเหตทท าใหเกดผลบวกปลอมดวยวธตรวจคดกรองเบองตน • ชดตรวจมความไวสงขน ท าใหความจ าเพาะลดลง

• ความผดพลาดทางเทคนคของผท าการตรวจ

• มแอนตบอดในผ ทเคยไดรบการฉดวคซนทดลอง HIV

• ชดทดสอบท าปฏกรยา Cross Reaction กบ แอนตบอดของเชออน

ขอด • งาย ผลเชอถอได

• ไมตองการเครองมออปกรณซบซอน

• ตองการความช านาญไมมาก

• ตรวจแบบเรวใหผลท าภายในวนเดยวได

• เพมสถานทตรวจไดไมยาก ไมตองลทนมาก

• สามารถเพมการเขาถง การปองกน และการบรการได

ขอควรระวง • การอานผล แปลผลขนกบความ

ช านาญของผตรวจ

• ตองท าตามผผลตอยางเครงครด

• การตรวจตดตาม การควบคมคณภาพ ของสถานทใหบรการ ทมมาก คอนขางล าบาก มคาใชจาย

ขอด ขอควรระวง HIV Rapid Tests

31

การใชระบบคณภาพเพอตดตามและตรวจสอบผลการตรวจ

Internal Quality Control (IQC)

• เปนเครองมอหรอวธการทท าไปพรอมขณะตรวจ เพอตรวจสอบวา วธทดสอบทท าอย ท างานไดถกตอง

• เพอใหมนใจวาผลทตรวจ ไดผลถกตอง

External Quality Assessment (EQA)

• เปนระบบการตรวจสอบ การท างานทางหองปฏบตการ โดยใช หนวยงานภายนอก

• เพอใหมนใจวา ผลทตรวจ ไดผลเหมอนแลปอนๆ

การควบคมคณภาพ

• IQC - Virotal Clear (HIV Ab-Negative)

- Virotal I (HIV Ab-Positive)

Determine HIV ½ ท าอาทตยละครงทมเทสต SD Bioline HIV ½ ท าเมอมรายบวก First Response HIV ½ ท าเมอมรายบวก • EQA สชส แจกจายตวอยาง ปงบประมาณละ 3 ครงๆละ 4 ตวอยาง

Internal Quality Control รวมกจกรรมคณภาพอนๆดวย

• ตวอยาง – การจดบนทก • การปฏบตงาน เพอชวยทวนสอบกลบได ถามปญหา หรอ ดจ านวน test ทท า หรอตดตาม คณภาพ

• จดบนทกอณภมต เยน หรอ inventory

– การปฏบตตาม SOPs ตาม algorithms?

ท าไมตองมระบบ BioSafety ส าหรบงาน HIV rapid test

• การสมผสกบ สารคดหลงผ ปวย เกดขนไดตลอดเวลา

• ตองปองกนทง ผปฏบตงาน ผ ปวย และ คนอนทอาจมาสมผสการอปกรณและสงของทเกยวของการตรวจ

• การก าจด waste ทตดเชอ

36

Universal precaution • การปฏบตงานทวไป

– วธการปฏบต

(ตวบคคล, บรเวณทปฏบตงาน, อปกรณและสงของทใช)

– การก าจดของเสย ของแหลมคม ตามนโยบายหนวยงาน

– การฆา ท าลาย disinfect บรเวณปฏบตงาน

• เอกสารเกยวกบระบบ safety

• Safety เกยวของ – กอนตรวจ ตงแตการจดเกบ สงสงตรวจ การเตรยม การจดสง

– ขณะตรวจ การ handle ตวอยาง น ายา

– หลงตรวจ: การก าจดของเสย

ขอควรระวงทวไป • Ethics: การรกษาความลบ • ระบบคณภาพ

– เอกสารและการจดบนทก – การจดการ น ายา อปกรณ reagent and supply chain

management – ระบบ inventory

• การใช และการดแลรกษาเครองมอ อปกรณ การ calibrateเพอความถกตองของการตรวจ และความปลอดภย

• การเกบตวอยางดวยวธตางๆ

การทดสอบทจะท าวนน

• ทดสอบตวอยางโดยปฏบตตาม Algorithm การตรวจ Anti-HIV

• IQC ?

• บนทกในแบบทดสอบ และ สรปผลในแบบบนทก

• ประเมนผลการตรวจวเคราะหของผ เขาอบรม