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BIOspektrum | 05.19 | 25. Jahrgang

TORSTEN KROLL1, MUBASHIR AHMAD2, ASPASIA PLOUBIDOU1, JAN TUCKERMANN2

1 LEIBNIZ-INSTITUT FÜR ALTERNSFORSCHUNG, FRITZ-LIPMANN-INSTITUT, JENA2 INSTITUT FÜR MOLEKULARE ENDOKRINOLOGIE DER TIERE, UNIVERSITÄT ULM

Osteoporosis, the condition of decreased bone density resulting in boneporosity, brittleness, and a increased fracture risk is rising with aging.Current treatments slow-down bone loss but cannot increase bone forma-tion and quality. Using osteoblasts – the bone forming cells – and RNAilibraries, we developed a high-content analysis approach which identifiedosteoblast modulators. Several among them are potential drug targets, toinduce increase in bone formation thus efficiently combating osteoporo-sis.

DOI: 10.1007/s12268-019-1091-1© Springer-Verlag 2019

ó Osteoporose beschreibt ein Krankheits-bild mit erhöhtem Knochenfrakturrisiko auf-grund verringerter Knochendichte. Insbe-sondere nach Oberschenkelhalsbrüchen oderWirbelfrakturen führt Osteoporose zu längeranhaltender Immobilität und ist zum Teilnicht mehr reversibel. Sie führt zu Bett -lägerigkeit und so zu vermehrten Pflege -fällen. Schätzungen zeigen, dass jede dritteFrau und jeder fünfte Mann über 50 einedurch Osteoporose verursachte Fraktur er -leiden wird [1, 2].

Neben der offensichtlichen Rolle der Kno-chen als Stützstruktur ist ein intakter Kno-chen notwendig für die Aufrechterhaltung derNischen für hämatopoetische Stammzellen,den Calciumhaushalt und trägt auch zumEnergiemetabolismus und Zuckerstoffwech-sel bei [3, 4]. Die Erhaltung eines gesundenKnochens ist daher von essenzieller Bedeu-tung, um pathologische Zustände des Alternsabmildern zu helfen.

Osteoporose entsteht, wenn das Gleichge-wicht zwischen der Knochenresorption durchKnochen-abbauende Osteoklasten und demKnochenaufbau durch Knochen-bildendeOsteoblasten gestört wird (Abb. 1). Zurzeitsind die wesentlichen Medikamente gegenOsteoporose solche, die den Knochenabbauverringern. Entweder wird eine Östrogener-satzztherapie oder es werden Bisphosphona-

te oder neutralisierende Antikörper gegendas Osteoklasten-induzierende CytokinRANKL (Denosumab) eingesetzt (Abb. 1).

Leider nimmt jedoch im Alter die Knochen-aufbauende Funktion von Osteoblasten ab,sodass bei diesen Therapieformen zwar derKnochenschwund aufgehoben werden kann,jedoch die Qualität der Knochen einge-schränkt bleibt. Seltene Nebenwirkungen ver-mindern zusätzlich die Akzeptanz dieser The-rapieform [5]. Knochen-aufbauende Thera-pien beruhen auf aufwendig biotechnologischhergestellten Wirkstoffen (Biologicals), wiedie Parahormontherapie oder die Verwendungvon neutralisierenden Antikörpern gegen dasWnt-inhibierende Protein Sclerostin [5].

High-content screening für Osteoblasten

RNAi-Screening in Knochen- bildenden Zellen

˘ Abb. 1: Knochen-homöostase und the-rapeutische Angriffs-punkte beim Kno-chenumbau. Oben,Mitte: Im Gegensatzzur Jugend und demmittleren Alter ist dasGleichgewicht zwi-schen Knochenauf-bau (schwarz) und -abbau (rot) im Altergestört. Unten: Kno-chen-aufbauendeOsteoblasten(schwarz), im Kno-chen residierendeOsteocyten (grün)und Knochen-abbau-ende Osteoklasten(rot) können thera-peutisch beeinflusstwerden.

Niedermolekulare Substanzen gegenRegulatorische Proteine?

Entwicklung Erhaltung Osteoporose

0 - 20 Jahre 21 - 50 Jahre > 50 Jahre

OsteoklastenOsteoblasten

KNOCHEN Osteocyten

Parathyroid HormoneAnti-Sclerostin Antikörper

DenosumabSERMSBisphosphonate

Knochen-abbau

Knochen-aufbau

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leiten, der eigent-lichen Knochenbil-dung. Dieser Prozessist während deraltersabhängigenOsteoporose gestört[6].

Um neue Regula-tionsproteine derOsteo blasten dif fe ren -zierung zu identifi-zieren, die sich mög-licherweise durchniedermolekulare

Substanzen beeinflussen lassen (Abb. 1),haben wir ein high-content screening etabliert(Abb. 2, [7, 8]).

Hochdurchsatzverfahren für dieDifferenzierung von OsteoblastenUm möglichst umfassend nach neuen Regu-lationsproteinen für die Osteoblastendiffe-renzierung suchen zu können, haben wir unsentschieden, siRNAs (small interfering RNAs)einzusetzen, die jeweils spezifisch die Expres-sion eines Gens unterdrücken. Um siRNA-Bibliotheken auf 384-Well-Mikrotiterplatteneinsetzen zu können und im Hochdurchsatzdie Osteoblastendifferenzierung zu bestim-men, haben wir einen readout für die Diffe-renzierung auf Fluoreszenzbasis etabliert, dieZellkulturbedingungen auf 384-Well-Plattenminiaturisiert und die Transfektionsbedin-gungen für den siRNA-Transfer in primäreOsteoblastenzellen optimiert. Primäre Oste-oblasten, die direkt aus Schädeldecken vonMäusen gewonnen wurden, wurden verwen-det, um der in vivo-Situation möglichst nahe-zukommen.

Für den Nachweis der Aktivität der alkali-schen Phosphatase (ALP) diente ein künstli-ches Substrat (ELF® 97), das nach seinerUmsetzung durch die Phosphatase eine star-ke, grüne Fluoreszenz zeigt. Die Intensitätder ALP-Aktivität wurde als Gradmesser derfrühen Osteoblastendifferenzierung verwen-

Günstig zu synthetisierende niedermole-kulare Substanzen, die Osteoblasten und damitden Knochenaufbau fördern, wären jedochhilfreich, um den großen Bevölkerungsanteil,der unter Osteoporose leidet, sinnvoll und kos-teneffektiv zu behandeln. Solche Substanzensind zurzeit noch weitgehend unbekannt. Diesliegt daran, dass die Bildung von Osteoblas-ten zwar im Prinzip verstanden ist, jedoch nurwenige Regulationsproteine der Osteoblas-tendifferenzierung bekannt sind. Diese wiede-rum sind oft keine Zielstrukturen für nieder-molekulare Substanzen, während Faktoren,die sich durch Medikamente gut inhibierenlassen, weitgehend unbekannt sind.

Osteoblasten differenzieren aus mesen-chymalen Vorläuferzellen, die sich in derNähe von Blutgefäßen, im Knochenmarks-stroma und an cortikalen Knochensäumenbefinden. Schlüsseltranskriptionsfaktoren,wie Runx2 und Osterix, leiten ihre Differen-zierung ein – ein Prozess, den man weitge-hend in Zellkulturexperimenten nachvollzie-hen kann. Wenn die Differenzierung einge-leitet wurde, werden zunächst frühe Marker-gene der Differenzierung induziert, wie diealkalische Phosphatase, gefolgt von der Syn-these von Kollagen I, dem Hauptproteinbe-standteil der Knochen. Gegen Ende der Dif-ferenzierung werden Genprodukte produziert,wie Osteocalcin, und die Zellen sind in derLage, die Mineralisierung der Matrix einzu-

det. Weiterhin wurden die Zellkerne mittelseines rot fluoreszierenden DNA-bindendenFarbstoffes (DRAQ5) markiert. Damit lässtsich gleichzeitig die Anzahl der Zellen bestim-men und die Aktivität der ALP pro Einzel-zelle darstellen (Abb. 2, [8]).

Um einen hohen Durchsatz zu ermöglichen,wurde das System, das zuvor in Zellkultur-schalen und -platten (bis 24 Wells mit einemDurchmesser von 15,6 Millimetern) durchge-führt wurde, für Platten mit 384 Wells miteinem Durchmesser von 2,6  Millimeternangepasst (Abb. 3). Durch die Verkleinerungkann die Anzahl der pro Test notwendigenZellen verringert werden, allerdings werdenZellkulturprozeduren wie Medienwechselschwieriger. Zwingend ist hier der Einsatzvon Mehrkanal pipetten oder Pipettierroboter(Abb. 3). Wir verwendeten Mehrkanalpipettenfür die Zellkultur und einen Pipettierroboterfür die Vorbereitung der Transfektion, dieFixierung und die Färbung der 384-Well- Platten. Dazu wurden die verschiedenen Standardprotokolle für die Automatisierungangepasst. Insbesondere die Transfektion(Einschleusung) der siRNA musste dahin -gehend optimiert werden.

Eine weitere Voraussetzung war die auto-matische Bildaufnahme und -auswertung.Dafür wurde ein vollautomatisches Mikro-skop genutzt, das eigenständig fokussiertund pro Well mehrere Aufnahmen macht(Abb. 3). Diese Bilder wurden mit einer auto-matischen Bilderkennungssoftware (high-content-Analyse) ausgewertet. Hier kamOpen-Source-Software zum Einsatz (Cellpro-filer). Die dafür entwickelte Analysepipeli-ne ermöglicht es, in den Bildern automatischdie Zellkerne als Objekte zu erkennen und zuzählen sowie die ALP-Substrataktivität überdie Anzahl der gebildeten Spots und derenFluoreszenzintensität zu quantifizieren [7].Für eine größere Anzahl an Screening-Plat-ten kam ein Plattenroboter zum Einsatz, derdas Mikroskop selbstständig beladen hat.Mittels dieses Vorgehens war es nun mög-

¯ Abb. 2: Prinzip der in vitro-Osteoblastendifferenzierung und ihr auto-matisierter Nachweis durch automatische Mikroskopie und high-content-Analyse. A, Aus Osteoprogenitorzellen lassen sich reifende Osteoblastendifferenzieren, die alkalische Phosphatase (ALP) exprimieren. B, Fluores -zenzfärbung der Zellkerne mit DRAQ5 (rot) und der alkalischen Phos -phatase mit ihrem Substrat ELF® 97 (grün) werden durch die automa -tische Mikroskopie und Bildaufnahme visualisiert. C, Überlagerung derSignale für die Zellkerne (links) und der ALP-Aktivitätsspots (rechts) zueinem kombinierten Bild, bei dem die Zellgrenzen (Mitte) durch einenAlgorithmus festgelegt werden, um Zellzahlen und ALP-Spots pro Zelle zubestimmen.

Osteoprogenitor Osteoblast

Osteogene Induktion

Aut

omat

isch

eB

ildau

fnah

me

Aut

omat

isch

eB

ildan

alys

e

Nachweis der ALP-Aktivität(ELF 97)

Zellkernfärbung(DRAQ5)

Zellk

ern

ALP

Akt

ivitä

t

Zellkerne OverlayALP

Aktivitätsspots

A

B

C

lich, verschiedene siRNA-Bibliotheken zuscreenen.

Erste ErgebnisseMit dieser Methode konnten wir zeigen, dassbekannte Regulatoren die frühe Osteoblas-

tendifferenzierung wie erwartet beeinflus-sen (Abb. 3). Während bei der Transfektionvon Kontroll-siRNA, die aufgrund ihrerSequenz keine Gene unterdrücken kann,eine moderate ALP-Aktivität pro Zelle messbar war, bewirkte die Unterdrückung

des Differen zierung-aktivierenden FaktorsRunx2 eine Ernied rigung und die Unter -drückung der Expression des Differenzie-rung-hemmenden Faktors Lyn [8] hingegeneine Steigerung der ALP-Aktivität der Zelle(Abb. 3).

¯ Abb. 3: Schematische Darstellung der expe-rimentellen Abfolge des RNAi-Screenings unddes Versuchsprinzips am Beispiel bekannterRegulatoren der Osteogenese. A, Schema desteilautomatisierten siRNA-Screenings. siRNAwird in 384-Well-Platten vorgelegt, und die Zel-len werden in den Platten zwei Tage vor derosteogenen Induktion (Tag –2) revers transfi-ziert. Die Zellen werden von Tag 0 bis Tag 6 mitosteogenem Medium zu frühreifen Osteoblastendifferenziert („osteogene Induktion“). Dabeiwerden Medienwechsel durchgeführt undschließlich die Zellen fixiert. Bei diesen Schrit-ten kommen Pipettierroboter und Multikanalpi-petten zum Einsatz. Nach der Fixierung werdendie Zellen mit den fluoreszenten Substratenangefärbt und in den 384-Well-Platten automa-tisch mikroskopiert (siehe auch Abb. 2). B, Bei-spielhafte Ergebnisse für eine siRNA, die gegeneinen Aktivator der Osteoblastendifferenzierunggerichtet ist (siRunx2), eine Kontroll-siRNA(siControl) und eine siRNA, die gegen einenSuppressor der Osteobastendifferenzierunggerichtet ist (siLyn). Während die Transfektionder siRNA eine mäßige Aktivität der alkalischenPhosphatase (ALP) pro Zelle bewirkt, führt dieHemmung der Expression von Runx2 (siRunx2)zu einer reduzierten ALP-Aktivität und die Hem-mung der Expression von Lyn (siLyn) zu einerSteigerung der ALP-Aktivität pro Zelle. Über denVergleich der ALP-Aktivität gegenüber Kontroll-siRNAs können mittels siRNA-Bibliothekengenomweit Gene auf ihre Fähigkeit getestetwerden, die Osteoblastendifferenzierung zuregulieren.

ABCDEFGHIJKLMNOP

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

ABCDEFGHIJKLMNOP

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Transfektion MediumwechselFixierung,Labeling

AutomatischeMikroskopie

Tag -2 Tag 0 Tag 3 Tag 6

ABCDEFGHIJKLMNOP

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24ABCDEFGHIJKLMNOP

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24ABCDEFGHIJKLMNOP

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Zellen

siRNA

in vitro Osteogene Induktion

Osteoblast(Reduzierte ALP Aktivität)

Osteoprogenitor Osteoblast

Osteoblast(Erhöhte ALP Aktivität)

Zellkern ALP Aktivität

siRunx2

siControl

siLyn

**

ALP Aktivität/Zelle (%)

0

100

200

300

***Aktivator

Suppressor

OsteogeneInduktion

siRNA

siRNA

A

B

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Bei einer kleinen Bibliothek, die 320 ver-schiedene Gene adressiert, fanden wir aufdiese Weise fünf potenzielle Suppressorenund 60 Aktivatoren der Osteoblastendiffe-renzierung [8]. Einige der identifizierten Genesind bekannte Regulatoren der Osteoblasten-differenzierung, wie z. B. Hgf und Herpud1[9, 10]. Daneben fanden wir Gene mit un -bekannter Rolle in der Osteoblastogenese. Die-se Liste potenzieller Regulatoren kann auchfalsch-positive Ergebnisse (z. B. durch mögli-che off-target-Effekte) enthalten. Um dieseauszuschließen, validierten wir Kandidatenmittels weiterer Experimente und der Bestim-mung von alternativen Differenzierungs -markern.

PerspektivenDurch das hier vorgestellte siRNA-Screeningwar es möglich, mit größeren siRNA-Biblio-theken Proteine zu finden, für die niedermo-

lekulare Wirksubstanzen bekannt sind unddie zum Teil bereits klinisch in anderenKrankheitsbildern erprobt wurden. Diesehaben wir in noch unveröffentlichten Arbei-ten überprüft, und einige erhöhen im expe-rimentellen Tiermodell die Knochendichte.Wir hoffen, dass auf Grundlage dieser Ergeb-nisse in Zukunft niedermolekulare Substan-zen gegen Osteoporose etabliert werden kön-nen. ó

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Korrespondenzadresse:Prof. Dr. Jan TuckermannInstitut für Molekulare Endokrinologie der TiereUniversität UlmHelmholtzstraße 8/1D-89081 UlmTel.: 0731-50-32600jan.tuckermann@uni-ulm.de

AUTORENTorsten Kroll1991–1997 Chemie-Studium an der Universität Jena und derUniversity of Kent, Canterbury, UK. 1997–2004 Promotionzum Dr. rer. nat. am Hans-Knöll-Institut Jena und der Univer-sität Jena. 2004–2012 Wissenschaftlicher Mitarbeiter amUniversitätsklinikum Jena. 2012–2015 Forschungsingenieuram Leibniz Institut für Alternsforschung – Fritz-Lipmann- Institut (FLI) Jena. Seit 2016 Manager der Core Facility Functional Genomics am FLI Jena.

Aspasia Ploubidou1993–1998 Promotion (Ph.D.) der Biologie an der Universityof Manchester, UK. 1998–2004 Postdoc-Aufenthalt am Europäischen Laboratorium für Molekularbiologie (EMBL),Heidelberg. Seit 2005 Gruppenleiterin am Leibniz Institut fürAlternsforschung – Fritz Lipmann Institute, Jena. 2007–2015Gründung und Leitung der Core Facility „Functional Geno-mics“ am FLI in Jena.

Mubashir Ahmad2004–2009 Bachelor und Masterstudium der Biochemie.2012–2018 Promotion zum Doktor der Naturwissen -schaften am Institut für Molekulare Endokrinologie derTiere der Universität Ulm. Seit 2018 Postdoc am Institutfür Molekulare Endo krinologie der Tiere der UniversitätUlm

Jan Tuckermann1989–1995 Diplom-Biologiestudium an der UniversitätKarlsruhe. 1996–1999 Promotion zum Doktor der Natur-wissenschaften am Deutschen Krebsforschungszentrumund der Universität Karlsruhe. 1999–2004 Postdoc-Auf-enthalt am Deutschen Krebsforschungszentrum Heidel-berg. 2004–2012 Juniorgruppenleiter am Leibniz Institutfür Alternsforschung – Fritz-Lipmann-Institut Jena. Seit2012 W3-Universitätsprofessor für Zoologie und Endo -krinologie und Leiter des Instituts für Molekulare Endo -krinologie der Tiere, Universität Ulm.