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High-content imaging per lo studio di farmaci anti-tumorali e di nuovi bersagli terapeutici Italia Anna Asteriti 1,2 , Annalisa Verrico 1 , Valeria Colicchia 3 , Giuseppe Giannini 3 , Pietro Cirigliano 4 , Giulia Guarguaglini 1,2 , Patrizia Lavia 1,2 , Francesca Degrassi 1 1. Istituto di Biologia e Patologia Molecolari, Consiglio Nazionale delle Ricerche, c/o Sapienza Università di Roma, Via degli Apuli 4; 2. Nikon Reference Center for Central-Southern Italy @IBPM; 3. Dipartimento di Medicina Molecolare, Sapienza Università di Roma; 4. Nikon Instruments S.p.A., Campi Bisenzio, IT • Le metodiche di imaging in campo biomedico hanno conosciuto uno sviluppo impressionante, che ha trasformato la microscopia da approccio descrittivo a disciplina quantitativa (“high content”) che consente di ottenere informazioni spazio-temporali accurate e ad alta risoluzione. • Le metodiche di video-registrazione in time-lapse aggiungono un livello di informazione dinamica, essenziale per la comprensione di processi quali la divisione cellulare, il differenziamento, la senescenza, il signalling intracellulare, la comunicazione tra cellule, la migrazione, la risposta ad infezioni, l’induzione di morte cellulare. INTRODUZIONE SCOPO DEL LAVORO RISULTATI Le metodologie di imaging “high content” permettono un aumentato livello di informatività sulla risposta cellulare a farmaci o altre strategie terapeutiche, e sulla eterogeneità intercellulare, non ottenibile con tecniche classiche che analizzano popolazioni cellulari in toto. Tali metodologie consentono una valutazione anche quantitativa della complessità della risposta cellulare, essenziale per un approccio di medicina personalizzata. RINGRAZIAMENTI Condizioni costanti di T°C, CO2, umidità per diversi giorni Il microscopio Nikon Eclipse Ti presso il Nikon reference center - IBPM-CNR supporti per acquisizione simultanea di diverse condizioni sperimentali a. xy multipoint b. Z-stack c. multicanali (fluorescenza) d. tempo NIS-Elements HC (High Content Analysis) Completa motorizzazione Acquisizione multidimensionale http://bbcd.bio.uniroma1.it/bbcd/archivionotizie/cnr-microscopy-platform-nikon-reference-center-ibpm L’imaging permette di correlare, al livello della singola cellula, specifici eventi molecolari con cambiamenti globali nell’organizzazione della cellula e nelle strutture subcellulari; misura quantitativamente specifiche risposte (ad es. l’internalizzazione di segnali); rivela eventi “stocastici”, che non sarebbero apprezzati altrimenti (ad es., l’eterogeneità del comportamento di singole cellule in una popolazione tumorale). Pertanto si sta affermando come strumento di indagine fondamentale nel campo della scoperta e valutazione biologica di nuovi farmaci e terapie biologiche. Scopo del lavoro è stato lo sviluppo di metodologie e protocolli di imaging avanzato per la caratterizzazione di molecole con potenziale anti-tumorale e la validazione di nuovi bersagli terapeutici 1. VIDEO-REGISTRAZIONE DEGLI EFFETTI DI MOLECOLE DI INTERESSE TERAPEUTICO: DAGLI STUDI IN VITRO AL LIVELLO PRE-CLINICO 2. IDENTIFICAZIONE DI NUOVI BERSAGLI TERAPEUTICI Mediante videoregistrazione si è voluto seguire l’effetto di Alisertib sul destino di cellule di osteosarcoma trattate. La video-registrazione ha rivelato - inibizione della proliferazione dose- dipendente, - senza induzione significativa di morte in mitosi, né nella successiva interfase (fino a 44 ore dal trattamento); - generazione di cellule geneticamente sbilanciate che possono dar luogo a cloni resistenti e di aumentata aggressività. 1A. Video-registrazione in modalità high-throughput ed analisi automatizzata mediante “machine learning” per seguire, nel tempo, il destino di cellule trattate con l’inibitore della chinasi mitotica Aurora-A Alisertib FLUORESCENZA TRANSILLUMINAZIONE Asteriti et al., 2014, Oncotarget; collaborazione con Beate Neumann e Volker Hilsenstein, Advanced Light Microscopy Facility, EMBL, Hidelberg, DE) 1B. SAR (structure-activity relationship)-based drug design: video-registrazione nel tempo della eterogeneità nelle risposte cellulari a nuovi inibitori dell’apparato mitotico La progettazione di farmaci anti-mitotici è un campo molto attivo, perché inducono morte mitotica indipendente dallo status di p53. Di Cesare et al., 2017, Oncotarget; collaborazione Prof. R. Silvestri (Drug Design and Synthesis Center, Sapienza) 1C. Attivazione di nuovi checkpoints: inibitori degli enzimi PARP causano catastrofe mitotica in linee di neuroblastoma in maniera dipendente da MYCN Collaborazione Prof. G. Giannini (Dip. Medicina Molecolare, Sapienza) Colicchia et al., 2017, Oncogene ESEMPI DI MITOSI ANOMALE VIDEO-REGISTRATE IN COLTURE TRATTATE CON ATI divisione sbilanciata divisione normale morte mitotica ARIL-TIOINDOLI (ATIs): INIBITORI PROGETTATI IN BASE ALLA STRUTTURA DELLA TUBULINA La video-registrazione ha visualizzato diversi destini cellulari in colture trattate con 3 inibitori della famiglia ATI. Nei grafici: ogni linea rappresenta il destino di una singola cellula, videoregistrata da 24 a 48 h post-trattamento: - piccole modifiche strutturali (in alto a sin) possono influenzare in maniera significativa la risposta cellulare, e quindi l’efficacia di induzione di morte mitotica; - in tutti i casi, le colture mostrano eterogeneità nella risposta a ciascuna molecola. - la video-registrazione è quindi essenziale per valutare la frequenza di cellule “escaper” in risposta a nuovi trattamenti. Acquisizione Segmentazione Misure ed analisi - Serie completa di immagini (campi multipli) - Generazione automatica di maschere di segmentazione - Misure simultanee dell’intensità del segnale nelle selezioni Griglia di acquisizione pre-definita Acquisizione lungo asse z z-axis λ-acquisizione File multidimensionale (xyzλ) Maximum Intensity Projection (xyλ) nuclei (DAPI) cromosomi (DAPI) cromosomi (pH3Ser10) fuso (alfa-tub) Rappresentazione schematica del protocollo di acquisizione Segmentazione: mitosi vs. interfasi macro ad hoc 2B. Sviluppo di metodologie di imaging in situ (Proximity Ligation Assay, PLA) in modalità automatizzata Validazione di nuove interazioni tra fattori pro-tumorigenici mediante PLA automatizzata Imp beta/RAN PLA PLA/DAPI PLA/alfa-tub controllo IPZ Intensità di PLA (a.u.) 8x10 6 6x10 6 4x10 6 2x10 6 0 CTR IPZ **** Interazione di Importina beta con un partner noto (validazione) Interazione di Importina beta con un nuovo target: Bub3, fattore del checkpoint mitotico Imp beta/ BUB3 PLA PLA/DAPI PLA/alfa-tub controllo IPZ Gli inibitori delle PARP (tra cui Olaparib) sono in fase di studio preclinico e clinico per diversi tumori. La video-registrazione in time-lapse di cellule di neuroblastoma trattate con Olaparib ha mostrato una modalità inattesa di morte: le cellule entrano in mitosi anche in presenza di danno al DNA e vanno incontro a catastrofe mitotica. Questo destino è specifico delle cellule di neuroblastoma con amplificazione di MYCN, condizione caratteristica dei neuroblastomi più aggressivi. Per facilitare lo screening di interazioni proteina-proteina (o proteine/ inibitore) abbiamo sviluppato ed automatizzato protocolli per in situ Proximity Ligation Assay, per visualizzare velocemente, in condizioni native, interazioni tra proteine in singole cellule nella loro dinamica spazio-temporale. Affiancando la PLA a screening proteomici abbiamo identificato l’interazione tra Importina beta, una proteina sovraespressa in molti tumori, e il fattore di checkpoint Bub3. L’interazione è specifica ed è inibita dall’inibitore importazolo (IPZ). Le misure di intensità di fluorescenza per i segnali di PLA sono mostrate in unità arbitrarie (a.u.) 2.0x10 6 1.5x10 6 1.0x10 6 5.0x10 5 0 CTR IPZ **** Intensità di PLA (a.u.) 2A. La proteina cinetocorica Hec1 e le interazioni tra microtubuli e cinetocori rappresentano un bersaglio efficace nella terapia del cancro Abbiamo indotto l’espressione (+doxy) della proteina Hec1 mutata nella regione di interazione con i microtubuli (EGFP- Hec1) allo scopo di promuovere una forte malsegregazione dei cromosomi e aneuploidia. La video-registrazione di una cellula che esprime la proteina Hec1 mutata (verde) e α-tubulina (rosso) identifica la formazione di fusi multipolari (frecce) minuti L’espressione di EGFP-Hec1 produce mitosi multipolari con massiccia malsegregazione dei cromosomi e morte da mitosi (pannello B). L’efficienza dell’induzione di catastrofe mitotica è più alta di quella ottenuta con classici veleni del fuso (nocodazolo o taxolo). L’interazione tra microtubuli e cinetocori è quindi un buon bersaglio per lo sviluppo di terapie antitumorali: EGFP-Hec1 inibisce la crescita tumorale in xenotrapianti in topo promuovendo la formazioni di fusi multipolari anche in vivo. E’ in corso lo sviluppo di piccole molecole che inibiscono l’interazione. Orticello et al., 2015, Oncogene Interfase Morte in interfase Mitosi normale Mitosi anomala Morte dopo mitosi anomala Entrata in mitosi e riadesione senza divisione Morte dopo riadesione senza divisione Arresto in mitosi “Blebbing” durante l’arresto in mitosi Morte in mitosi singole cellule ore controllo Olaparib morte (% cellule) Morte in interfase Catastrofe mitotica Alisertib cellule poliploidi cellule morte cellule mitotiche cellule multinucleate % cellule % cellule % cellule % cellule interfase mitosi multinucleata poliploide morte CONCLUSIONI Serie di immagini nel tempo Osservazione fenotipi Elaborazione quantitativa modificato da Neumann et al., 2010 Aurora-A è una chinasi pro-oncogenica Sono in corso 57 trial clinici con l’inibitore Alisertib (inbitore competitivo per sito ATP) (ClinicalTrials.gov) CELLULE U2OS-H2B-GFP mod da Gascoigne and Taylor, Cancer Cell,2008 ATI Scaffold R1 R2 H 6,7Cl 2 6MeO MycN MycN amplificato Nocodazolo Taxolo Tempo (x1000min) Riconoscimento automatico di cellule positive per l’espressione di marker di interesse, in questo caso mitotici sonde fluorescenti rivelano l’interazione proteina A proteina B Amplificazione “rolling cycle” Ab secondari con sonde a DNA Ab primari contro: Ligation AB in situ PLA

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High-content imaging per lo studio di farmaci anti-tumorali e di nuovi bersagli terapeutici

Italia Anna Asteriti1,2, Annalisa Verrico1, Valeria Colicchia3, Giuseppe Giannini3, Pietro Cirigliano4, Giulia Guarguaglini1,2, Patrizia Lavia1,2, Francesca Degrassi1

1.  Istituto di Biologia e Patologia Molecolari, Consiglio Nazionale delle Ricerche, c/o Sapienza Università di Roma, Via degli Apuli 4; 2. Nikon Reference Center for Central-Southern Italy @IBPM; 3. Dipartimento di Medicina Molecolare, Sapienza Università di Roma; 4. Nikon Instruments S.p.A., Campi Bisenzio, IT

•  Le metodiche di imaging in campo biomedico hanno conosciuto uno sviluppo impressionante, che ha trasformato la microscopia da approccio descrittivo a disciplina quantitativa (“high content”) che consente di ottenere informazioni spazio-temporali accurate e ad alta risoluzione. •  Le metodiche di video-registrazione in time-lapse aggiungono un livello di informazione dinamica, essenziale per la comprensione di processi quali la divisione cellulare, il differenziamento, la senescenza, il signalling intracellulare, la comunicazione tra cellule, la migrazione, la risposta ad infezioni, l’induzione di morte cellulare.

INTRODUZIONE

SCOPO DEL LAVORO

RISULTATI

Le metodologie di imaging “high content” permettono un aumentato livello di informatività sulla risposta cellulare a farmaci o altre strategie terapeutiche, e sulla eterogeneità intercellulare, non ottenibile con tecniche classiche che analizzano popolazioni cellulari in toto. Tali metodologie consentono una valutazione anche quantitativa della complessità della risposta cellulare, essenziale per un approccio di medicina personalizzata.  

RINGRAZIAMENTI

Condizioni costanti di T°C, CO2, umidità per diversi giorni

Il microscopio Nikon Eclipse Ti presso il Nikon reference center - IBPM-CNR

Ø  supporti per acquisizione simultanea di diverse condizioni sperimentali

a. xy multipoint b. Z-stack c. multicanali (fluorescenza)

d. tempo

Ø  NIS-Elements HC (High Content Analysis) Ø  Completa motorizzazione

Ø  Acquisizione multidimensionale

http://bbcd.bio.uniroma1.it/bbcd/archivionotizie/cnr-microscopy-platform-nikon-reference-center-ibpm

L’imaging permette di correlare, al livello della singola cellula, specifici eventi molecolari con cambiamenti globali nell’organizzazione della cellula e nelle strutture subcellulari; misura quantitativamente specifiche risposte (ad es. l’internalizzazione di segnali); rivela eventi “stocastici”, che non sarebbero apprezzati altrimenti (ad es., l’eterogeneità del comportamento di singole cellule in una popolazione tumorale). Pertanto si sta affermando come strumento di indagine fondamentale nel campo della scoperta e valutazione biologica di nuovi farmaci e terapie biologiche.

Scopo del lavoro è stato lo sviluppo di metodologie e protocolli di imaging avanzato per la caratterizzazione di molecole

con potenziale anti-tumorale e la validazione di nuovi bersagli terapeutici

1. VIDEO-REGISTRAZIONE DEGLI EFFETTI DI MOLECOLE DI INTERESSE TERAPEUTICO: DAGLI STUDI IN VITRO AL LIVELLO PRE-CLINICO

2. IDENTIFICAZIONE DI NUOVI BERSAGLI TERAPEUTICI

Mediante videoregistrazione si è voluto seguire l’effetto di Alisertib sul destino di cellule di osteosarcoma trattate. La video-registrazione ha rivelato -  inibizione della proliferazione dose-

dipendente, -  senza induzione significativa di morte

in mitosi, né nella successiva interfase (fino a 44 ore dal trattamento);

-  generazione di cellule geneticamente sbilanciate che possono dar luogo a cloni resistenti e di aumentata aggressività.

1A. Video-registrazione in modalità high-throughput ed analisi automatizzata mediante “machine learning” per seguire, nel tempo, il destino di cellule trattate con l’inibitore della chinasi mitotica Aurora-A Alisertib

FLUORESCENZA TRANSILLUMINAZIONE

Asteriti et al., 2014, Oncotarget; collaborazione con Beate Neumann e Volker Hilsenstein, Advanced Light Microscopy Facility, EMBL, Hidelberg, DE)

1B. SAR (structure-activity relationship)-based drug design: video-registrazione nel tempo della eterogeneità nelle risposte cellulari a nuovi inibitori dell’apparato mitotico

La progettazione di farmaci anti-mitotici è un campo molto attivo, perché inducono morte mitotica indipendente dallo status di p53.

Di Cesare et al., 2017, Oncotarget; collaborazione Prof. R. Silvestri (Drug Design and Synthesis Center, Sapienza)

1C. Attivazione di nuovi checkpoints: inibitori degli enzimi PARP causano catastrofe mitotica in linee di neuroblastoma in maniera dipendente da MYCN

Collaborazione Prof. G. Giannini (Dip. Medicina Molecolare, Sapienza) Colicchia et al., 2017, Oncogene

ESEMPI DI MITOSI ANOMALE VIDEO-REGISTRATE IN COLTURE TRATTATE CON ATI divisione sbilanciata divisione normale morte mitotica

ARIL-TIOINDOLI (ATIs): INIBITORI PROGETTATI IN BASE ALLA STRUTTURA DELLA TUBULINA

La video-registrazione ha visualizzato diversi destini cellulari in colture trattate con 3 inibitori della famiglia ATI. Nei grafici: ogni linea rappresenta il destino di una singola cellula, videoregistrata da 24 a 48 h post-trattamento: - piccole modifiche strutturali (in alto a sin) possono influenzare in maniera significativa la risposta cellulare, e quindi l’efficacia di induzione di morte mitotica; -  in tutti i casi, le colture mostrano eterogeneità nella risposta a ciascuna molecola. -  la video-registrazione è quindi essenziale per valutare la frequenza di cellule “escaper” in risposta a nuovi trattamenti.

Acquisizione

Segmentazione

Misure ed analisi

- Serie completa di immagini (campi multipli)

- Generazione automatica di maschere di segmentazione

- Misure simultanee dell’intensità del segnale nelle selezioni

Griglia di acquisizione pre-definita

Acquisizione lungo asse z

z-ax

is

λ-acquisizione

File multidimensionale (xyzλ)

Maximum Intensity Projection (xyλ)

nuclei (DAPI) cromosomi (DAPI) cromosomi (pH3Ser10) fuso (alfa-tub)

Rappresentazione schematica del protocollo di acquisizione

Segmentazione: mitosi vs. interfasi

macro ad hoc

2B. Sviluppo di metodologie di imaging in situ (Proximity Ligation Assay, PLA) in modalità automatizzata

Validazione di nuove interazioni tra fattori pro-tumorigenici mediante PLA automatizzata

Imp beta/RAN PLA PLA/DAPI PLA/alfa-tub

cont

rollo

IP

Z

Inte

nsità

di P

LA (a

.u.)

8x106

6x106

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CTR IPZ

****

Interazione di Importina beta con un partner noto (validazione)

Interazione di Importina beta con un nuovo target: Bub3, fattore del checkpoint mitotico

Imp beta/BUB3 PLA PLA/DAPI PLA/alfa-tub

cont

rollo

IP

Z

Gli inibitori delle PARP (tra cui Olaparib) sono in fase di studio preclinico e clinico per diversi tumori. La video-registrazione in time-lapse di cellule di neuroblastoma trattate con Olaparib ha mostrato una modalità inattesa di morte: le cellule entrano in mitosi anche in presenza di danno al DNA e vanno incontro a catastrofe mitotica. Questo destino è specifico delle cellule di neuroblastoma con amplificazione di MYCN, condizione caratteristica dei neuroblastomi più aggressivi.

Per facilitare lo screening di interazioni proteina-proteina (o proteine/inibitore) abbiamo sviluppato ed automatizzato protocolli per in situ Proximity Ligation Assay, per visualizzare velocemente, in condizioni native, interazioni tra proteine in singole cellule nella loro dinamica spazio-temporale.

Affiancando la PLA a screening proteomici abbiamo identificato l’interazione tra Importina beta, una proteina sovraespressa in molti tumori, e il fattore di checkpoint Bub3. L’interazione è specifica ed è inibita dall’inibitore importazolo (IPZ). Le misure di intensità di fluorescenza per i segnali di PLA sono mostrate in unità arbitrarie (a.u.)

2.0x106

1.5x106

1.0x106

5.0x105

0

CTR IPZ

****

Inte

nsità

di P

LA (a

.u.)

2A. La proteina cinetocorica Hec1 e le interazioni tra microtubuli e cinetocori rappresentano un bersaglio efficace nella terapia del cancro

Abbiamo indotto l’espressione (+doxy) della proteina Hec1 mutata nella regione di interazione con i microtubuli (EGFP-Hec1) allo scopo di promuovere una forte malsegregazione dei cromosomi e aneuploidia.

La video-registrazione di una cellula che esprime la proteina Hec1 mutata (verde) e α-tubulina (rosso) identifica la formazione di fusi multipolari (frecce)

minuti

L’espressione di EGFP-Hec1 produce mitosi multipolari con massiccia malsegregazione dei cromosomi e morte da mitosi (pannello B). L’efficienza dell’induzione di catastrofe mitotica è più alta di quella ottenuta con classici veleni del fuso (nocodazolo o taxolo). L’interazione tra microtubuli e cinetocori è quindi un buon bersaglio per lo sviluppo di terapie antitumorali: EGFP-Hec1 inibisce la crescita tumorale in xenotrapianti in topo promuovendo la formazioni di fusi multipolari anche in vivo. E’ in corso lo sviluppo di piccole molecole che inibiscono l’interazione.

Orticello et al., 2015, Oncogene

Interfase

Morte in interfase

Mitosi normale

Mitosi anomala

Morte dopo mitosi anomala

Entrata in mitosi e riadesione senza divisione

Morte dopo riadesione senza divisione

Arresto in mitosi

“Blebbing” durante l’arresto in mitosi

Morte in mitosi

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Catastrofe mitotica

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cellule poliploidi cellule morte

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interfase mitosi multinucleata poliploide morte

CONCLUSIONI

Serie di immagini nel tempo

Osservazione fenotipi

Elaborazione quantitativa

modificato da Neumann et al., 2010

Aurora-A è una chinasi pro-oncogenica Sono in corso 57 trial clinici con l’inibitore Alisertib (inbitore competitivo per sito ATP) (ClinicalTrials.gov)

CELLULE U2OS-H2B-GFP  

mod da Gascoigne and Taylor, Cancer Cell,2008

ATI Scaffold

R1   R2  

H  

6,7-­‐Cl2  

6-­‐MeO  

MycN    -­‐  

MycN  amplificato  

Nocodazolo Taxolo

Tempo (x1000min)

Riconoscimento automatico di cellule positive per l’espressione di marker di interesse, in questo caso mitotici

sonde fluorescenti rivelano l’interazione proteina A proteina B

Amplificazione “rolling cycle”

Ab secondari con sonde a DNA

Ab primari contro: Ligation A B

in situ PLA