Hepatitis por cobre en perros

Definición de la enfermedadOrigenCaracterísticas generalesEspecies afectadasRazas de perros afectadas y prevalenciaImportancia de la enfermedad en la clínica veterinariaBase genética Diagnóstico clínicoDiagnóstico molecularConsejo genético a criadores y propietarios.

Definición de la enfermedadOrigenCaracterísticas generalesEspecies afectadasRazas de perros afectadas y prevalenciaImportancia de la enfermedad en la clínica veterinariaBase genéticaDiagnóstico clínicoDiagnóstico molecularConsejo genético a criadores y propietarios.

Definición de la enfermedad

Incapacidad de los hepatocitos para excretar por bilis el exceso de cobre absorbido.Desorden autosómico recesivo cuyo estudio en mayor profundidad ha sido realizado en la raza de perros Bedlington terrier.

Definición de la enfermedad

OrigenCaracterísticas generalesEspecies afectadasRazas de perros afectadas y prevalenciaImportancia de la enfermedad en la clínica veterinariaBase genética Diagnóstico clínicoDiagnóstico molecularConsejo genético a criadores y propietarios.

OrigenSe cree que los Bedlington terrier provienen de un rouge-coated Scotch terrier, de los cuales un gran numero de estos fueron llevados en el s. XVIII desde Escocia a Inglaterra. Allí se utilizaban principalmente como perros de caza.El origen de la patología se relaciona con un solo perro de la raza llamado Flint, el cual se uso como fundador de la misma (modelo cuello de botella).

Definición de la enfermedadOrigen

Características generalesEspecies afectadasRazas de perros afectadas y prevalenciaImportancia de la enfermedad en la clínica veterinariaBase genéticaDiagnóstico clínicoDiagnóstico molecularConsejo genético a criadores y propietarios.

Características generalesFisiopatologia.

Exceso de Cu en lisosomasATP7B membrana aparato de GolgiApoceruloplaminaceruloplasminaHepatitis por cobre (MURR1) perroEnfermedad de Wilson (ATP7B) hombre

Características generalesPrimeras manifestaciones clínicas.

pérdida de apetitovómitospérdida del pesodepresiónletargopoliuria/polidipsia

Muestras especificas de fallo hepático

ictericia problemas de la coagulaciónacumulación de líquidos en abdomen (ascitis)pérdida extrema del pesoanormalidades neurológicas (encefalopatía hepática)

Características generalesCaracterísticas de enfermedad autosómica recesiva (Mendeliana).

NN y NA son sanosAA enfermoNecesario que ambos padres sean portadores25% descendencia enferma y el 50% portadora

Definición de la enfermedadOrigenCaracterísticas generales

Especies afectadasRazas de perros afectadas y prevalenciaImportancia de la enfermedad en la clínica veterinariaBase genética Diagnóstico clínicoDiagnóstico molecularConsejo genético a criadores y propietarios.

Especies afectadas

PerroBóvidosOvinoPorcinoRatonesHombre

Definición de la enfermedadOrigenCaracterísticas generalesEspecies afectadas

Razas de perros afectadas y prevalenciaImportancia de la enfermedad en la clínica veterinariaBase genética Diagnóstico clínicoDiagnóstico molecularConsejo genético a criadores y propietarios.

Razas de perros afectadas y prevalencia

Definición de la enfermedadOrigenCaracterísticas generalesEspecies afectadasRazas de perros afectadas y prevalencia

Importancia de la enfermedad en la clínica veterinariaBase genéticaDiagnóstico clínicoDiagnóstico molecularConsejo genético a criadores y propietarios.

Importancia de la enfermedad en la clínica veterinaria

En España frecuencia de presentación no descrita diagnostico intuitivo y tratamiento sistematico de fallo hepático50% de los Bedlington en EEUUPaíses europeos:

Inglaterra 50%Holanda y Bélgica 37%

Estudio mas profundo en Bedlington por ser considerado modelo animal

Definición de la enfermedadOrigenCaracterísticas generalesEspecies afectadasRazas de perros afectadas y prevalenciaImportancia de la enfermedad en la clínica veterinaria

Base genética Diagnóstico clínicoDiagnóstico molecularConsejo genético a criadores y propietarios.

Base genética

El gen se identifico estudiando la descendencia enferma del perro fundador mediante estudios de segregación mediante ligamiento y se acotó la zona de la mutación mediante positional cloning. Luego se analizó esa región mediante el gen candidato por medio de desequilibrio de ligamiento.

Base genéticaEl positional cloning se realizó siguiendo los siguientes pasos:

Asignar el gen a un cromosomaConstruir un mapa físico por hibridación irradiación mediante un BAC específico de la región del cromosoma que contiene el gen y posterior mapeo fino por mapeo de homocigotosConstrucción de un mapa genético del gen potencial por comparación al humano

Base genéticaAsignar el gen a un cromosoma.

Mediante hibridación por fluorescencia in situ (FISH) usando el BAC N21-27, que contiene en marcador CO4107, se localiza este en el cromosoma 10 del perro en la región q26. Secuenciando este BAC se observa que es homóloga a la del gen MURR1 humano (localizado en el cromosoma 2, región p13-21) y con ello se excluyen otros genes responsables del transporte del cobre (ATP7B, CTR1, CTR2 y el ATOX1) como candidatos a ser los causantes de la toxicosis por cobre.

Base genéticaConstruir un mapa físico por hibridación irradiación mediante un BAC específico de la región del cromosoma que contiene el gen y posterior mapeo fino por mapeo de homocigotos

Construyen estos mapas y reducen el gen afectado a 500 kb. También se determina que la distancia entre el marcador CO4107 y el gende la toxicosis por cobre es tan pequeña que prácticamente es imposible que existan recombinaciones que dificulten la identificación del mismo (pero existen).

Base genéticaConstrucción de un mapa genético del gen potencial por comparación al humano.

A partir del RNA de perros afectados se realiza la transcripción viéndose una deleccion del exón 2 del MURR1 situándose los puntos de corte en 65.3091 y 65.3489 Mb del cromosoma 10 del perro, en los intrones 1 y 2 de MURR1 respectivamente, formándose un fragmento de 39.7 KBProteína truncada de 94 aa´s en vez de 188 que produce el alelo normalDistinguir por inmunoblotting y RT-PCR.

Base genética

Gen MURR1:En perros esta compuesto por 3 exones:

exón 1 de 226 bpexón 2 de 284 bpexón 3 de 1011 bp

El gen del perro tiene 170 kb, estando el marcador CO4107 localizado en el intrón 1 del MURR1 canino aproximadamente a 3,5 kb del punto donde se produce la delección.

Base genéticaGen MURR1:

Los dos límites de fracturación comparten homología de secuencia. El lado izquierdo de la zona de corte contiene la secuencia ATTTATGATAGT(CA)3(GA)13 y el derecho contiene la secuencia ATTTATGATAGT(CA)2(GA)13, esta homología pudo haber sido el factor determinante en la formación de la mutación, quizás por medio de recombinación.La longitud exacta del exón 1 sigue siendo desconocido, desde el sitio del comienzo de la transcripción que todavía tiene que ser determinado y aún no han identificado al promotor.La proteína MURR1 canina presenta una elevada homología con la humana y con la de ratón.

Base genéticaCaracterización molecular y funcional del MURR1.

Anticuerpos monoclonalesProteína de masa molecular de 23 kDDetectada en citosol y asociada a membranasLocalización subcelular asociada a un compartimento vesicular intracelular aun no identificado2003 se investiga la interacción entre el MURR1 y el transportador de cobre ATP7B viéndose que colaboran en la excreción biliar del cobre. Recientes estudios muestran interacciones ente el MURR1 y varias proteínas, lo que sugiere que posee una acción pleiotrópica.

Definición de la enfermedadOrigenCaracterísticas generalesEspecies afectadasRazas de perros afectadas y prevalenciaImportancia de la enfermedad en la clínica veterinaria

Base genética

Diagnóstico clínicoDiagnóstico molecularConsejo genético a criadores y propietarios.

Diagnóstico clínico

Epidemiológico: hembras/ 2-6 añosSignos clínicos:

IctericiaHepatomegaliaDebilidad/ perdida de apetito y de pesoSignos nerviososHepatitis activa crónica cirrosis fallo hepático muerteEn etapa avanzada signos vagos e inespecíficos

Diagnóstico clínico

Analíticas:Hematología: normal/ anemia y hemólisis suaves con alteración de la coagulación.Bioquímica: ALT 2/3 del nivel normal/ hiperbilirrubinemia y la bilirrubinuria (en casos de crisis hemolítica)/actividad de la ceruloplasmina oxidasa del plasma esta normal o aumentada levemente.

Diagnóstico clínico

Pruebas específicas:Biopsia hepática

Estudio anatomopatológicoEstudio cuantitativo (radioisopo Cu-64)Estudio semicuantitativo (ácido rubeánico o tinción con rhodamina)

Molecular

Diagnóstico clínico

Biopsia hepática: Estudio anatomopatológico.

Hepatitis necrótica aguda hepatomegaliaFibrosis y cirrosis higado pequeño

Diagnóstico clínico

Biopsia hepática:Estudio cuantitativo.

Medir niveles fecales de Cu-64 a las 48 horas después de la administración parenteralPerros afectados mostrarán reducida la radioactividad comparado con los perros normales, debido a la reducción de excreción biliar del cobreTécnicas de medida: espectroscopia por absorción atómica / análisis por activación de neutrón

Diagnóstico clínico

Biopsia hepática:Análisis histoquímico usando el ácido rubeánicoo tinción con rhodaminaEvaluar el numero y distribución de los gránulos que contienen cobre así como su intensidad

Diagnóstico clínico

Grupo IV: necrosis hepática y en cuyas áreas centrales muestran linfocitos, células plasmáticas y neutrófilos. También se observan rosetas de hepatocitos, figuras mitóticas y variación en el diámetro de los hepatocitos (signos de regeneración hepática). Acabando en cirrosis y fibrosis portal junto con presencia de muchos gránulos.

Grupo III: hepatitis multifocal en la zona centrolobulillar y vena central y gránulos de cobre. Cada foco de hepatitis esta compuesto de 1-3 hepatocitos necróticos y 3-4 macrófagos que han fagocitado células pigmentadas junto con unos pocos linfocitos, células plasmáticas y neutrófilos.

Grupo II: histológicamente normal y gránulos que contienen cobre en los hepatocitos centrolobulillares.

Grupo I: histomorfología normal y no hay presencia de gránulos de cobre

Diagnóstico clínico

Desventaja de las pruebas:No pueden realizarse en <1 añoSolo diferencian homocigotos enfermos (no los portadores)Cruento

Diagnóstico clínico

Molecular:Marcador CO4107: marcador molecular de DNA ligado por desequilibrio de ligamiento con la mutación que produce la enfermedad por su proximidad en el cromosomaPor detección de la deleccion del exón 2 del gen MURR1.

Definición de la enfermedadOrigenCaracterísticas generalesEspecies afectadasRazas de perros afectadas y prevalenciaImportancia de la enfermedad en la clínica veterinariaDiagnóstico clínicoBase genética

Diagnóstico molecularConsejo genético a criadores y propietarios.

Diagnóstico molecularTest por microsatélite CO4107:

Se realiza por su proximidad a la delecciónSe localiza en el intrón 1 de MURR1 a 3,5 kbMutación puntual por cambio de una citosina (normal) por una adenina (anormal)Distingue 2 alelos (163 bp y 167 bp):

163/163 sano163/167 portador167/167 enfermo

También llamados alelo 1 (sano) y alelo 2 (enfermo)

Diagnóstico molecular

Estimación de la eficacia de resultados en el diagnostico con el marcador CO4107.

el 90% de los perros que eran tipo 1/1 eran normales sobre el 72% de los perros del tipo 2/2 estaban enfermos mientras que el 90% de perros afectados son 2/2Si el perro es un 1/2 tiene una probabilidad del 95% de ser portador.

Diagnóstico molecularDiscrepancias en el diagnóstico por este marcador.

existencia de 2 tipos de recombinantes:perros sanos homocigotos para el alelo 2 que se ha demostrado ser homocigoto para el alelo salvaje del alelo MURR1: esto puede indicar que el alelo 2 puede estar relacionado con el alelo salvaje.perros afectados que son homocigotos y heterocigotos para el alelo 1: esto supone que el alelo 1 puede estar ligado a la delección del exón 2 del MURR1.

Diagnóstico molecularExplicación: existencia de HAPLOTIPOS

Mediante uso del marcador CO4107 y SNP´s (adenina y citosina) cubriendo una región genómica de 600 kb y usando como técnicas reveladoras una RT-PCR y un Northern-blot

Los haplotipos H-A y H-B 83% de los casosEl haplotipo H-C no se suele detectar, este haplotipo junto con el H-D es posible que se generasen por recombinación entre el marcador CO4107 y el gen CT-BTEl haplotipo H-E producido por la sustitución de una citosina en adenina en el extremo 5’ del sitio de unión del exón 2 del gen CT-BTEl haplotipo H-F resultante de una recombinación junto con una sustitución de una citosina por una adenina

Diagnóstico molecularHomocigoto H-A no esta afectadoHomocigoto H-B esta afectado por la enfermedadHeterocigoto H-B y H-D esta afectado aun teniendo intacto el exón 2Heterocigoto H-A y H-D esta afectado aun presentando ambos los exones 2 intactos en el genotipo 1.2Homocigoto H-E es sospechoso de poder padecer la enfermedad

Diagnóstico molecular

Conclusiones de esta situación:Que sea por otra mutación no identificada en el gen MURR1Una nueva mutación en otro gen totalmente diferenteExistencia de otros posible genes desconocidosLo único eficaz seria el test de la deleccion del exón 2 del gen por PCR pero sin tener conocimiento del promotor lo hace complicado

Definición de la enfermedadOrigenCaracterísticas generalesEspecies afectadasRazas de perros afectadas y prevalenciaImportancia de la enfermedad en la clínica veterinariaDiagnóstico clínicoBase genéticaDiagnóstico molecular

Consejo genético a criadores y propietarios.

Consejo genético a criadores y propietarios

Tratamiento.General

Líquidos intravenosos/ antibióticos / costicosteróidesDietético

Alimentos bajos en Cu (fruta fresca, huevos, pescado, lácteos, cereales procesados…)

Fármacos específicosD-d-penicilamina / clorhidrato de trientine / terapia oral del cinc / ácido ascórbico

Consejo genético a criadores y propietarios

Prevención.Cría selectiva de animales libres del gen alterado es la solución a largo plazo idealUsar el marcador genético CO4107Resultados pueden ser registrados en la OrthopedicFoundation for Animals (véase www.offa.org) y que se prueban también mediante biopsia hepática (perros > 1 año de edad)Los perros afectados no deben usarse para apareamiento, y la reproducción de sus padres se debe evitar también al tratarse de portadores.

BibliografíaARTICULOS- Ostrander et al. ( 2005). The Dog and its genome. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (Libro existente en la biblioteca de la facultad y en la biblioteca de LAGENBIO). - Forman OP, Boursnell ME, Dunmore BJ, Stendall N, van den Sluis B, Fretwell N, Jones C, WijmengaC, Rothuizen J, van Oost BA, Holmes NG, Binns MM, Jones (2005). Characterization of the COMMDI (MURRI) mutation causing copper toxicosis in Bedlington terriers. Anim Gene. 2005 Dec;36(6):497-501- J. Rothuizen, GJ. Ubbink, P. van Zon, E. Teske, Tsgam van den Ingh, 5Y. TOIDe. Yuzbasiyan-Gurkan. (1999). Diagnostic value of a microsatellite DNA marker for copper toxicosis in West-European Bedlington terriers and incidence of the disease. Animal Genetics 30 (3),190-194 . - Hyun, c., Filippich, LJ. Inherited canine copper toxicosis in Australian Bedlington Terriers.,.J Ve! Se! 5:19-28, 2004. - Hyun, c., Lavulo, LT., Filippich, LJ.: Evaluation of haplotypes associated with copper toxicosis in Bedlington Terriers in Australia., Am J Ve! Res 65: 1573-9, 2004.- Stuehler, S, Reichert, l, Stremmel, W., Schaefer, t.'1.Analysis of the human homologue ofthe canine copper toxicosis gene MURRI in Wilsoll disease patients., J . Mo/ Med82:629-34, 2004. - Thomburg LP, Shaw D, Dolan M, Raisbeck M, Crawford S, Dennis GL, Olwin DB (1986) Hereditary copper toxicosis in West Highland white terriers. Veterinary Pathology 23:148-54.

PAGINAS WEBhttp://www.vetsci.usyd.edu.au/lida/index.php?Pg=7&DID=414&DName=Wilson+disease&Op=2http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=277900http://www.upei.ca/~cidd/intro.htmhttp://www.vetgen.com/canine-ct-deletion.htmlhttp://www.vetgen.com/canine-ct-marker.htmlhttp://www.aht.org.uk/sci_diag_disc_genetic_dnacopper.htmlhttp://hmg.oxfordjournals.org/cgi/reprint/11/2/165.pdfhttp://www.canine-genetics.com/dnatest.htm