GUIA_DE_LABORATORIO_DE_BIOQUIMICA

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS

FACULTAD DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES

INGENIERÍA AMBIENTAL

GUIA DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

TABLA DE CONTENIDO

Pág. RECOMENDACIONES PARA ELTRABAJO DE LABORATORIO ..................................................................... 1

pH y BUFFERS ................................................................................................................................................... 5

IDENTIFICACION DE CARBOHIDRATOS ......................................................................................................... 6

LIPIDOS .............................................................................................................................................................. 9

DESNATURALIZACION Y CUANTIFICACION DE PROTEINAS ..................................................................... 11

CINETICA ENZIMATICA .................................................................................................................................. 14

EXTRACCIÓN DE ADN .................................................................................................................................... 17

PIGMENTOS .................................................................................................................................................... 19

BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................................................. 21

ANEXO 1. GUIA PRESENTACION DE PREINFORMES E INFORMES .......................................................... 22

ANEXO 2. UNIDADES Y SIMBOLOS ............................................................................................................... 23

ANEXO 3. DIAGRAMA DE FLUJO ................................................................................................................... 24

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UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES

INGENIERÍA AMBIENTAL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

RECOMENDACIONES PARA ELTRABAJO DE LABORATORIO REQUERIMIENTOS PARA EL DESARROLLO DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO Antes de la práctica es obligatorio leer la guía y preparar el respectivo preinforme. Al iniciar la práctica se realizará un quiz sobre el laboratorio a desarrollar. Durante la práctica se deben registrar las observaciones y datos en el preinforme elaborado con anterioridad. Asimismo los datos obtenidos durante la práctica de laboratorio se deben registrar en una hoja blanca tamaño carta que debe ser entregada al profesor (incluir nombre de los autores, grupo y subgrupo). MATERIAL DE LABORATORIO Cada grupo debe llevar al laboratorio: jabón para lavar el material, papel absorbente. La falta de los implementos anteriormente mencionados afectará la nota del informe de laboratorio. Cada equipo de trabajo es responsable del material que se le asigne, además del equipo especial (por ejemplo centrífugas, balanzas, muflas, estufas, espectrofotómetros, etc.) en caso de pérdida o daño, deberá responder de ello, y rellenar la correspondiente ficha. Antes de empezar con el procedimiento experimental o utilizar algún aparato revisar todo el material, y su manual de funcionamiento en su caso. El material al igual que el lugar de trabajo debe quedar limpio, si esto no se cumple se penalizará con la nota del informe. NORMAS DE SEGURIDAD El laboratorio debe ser un lugar seguro para trabajar donde no se deben permitir descuidos o bromas. Para ello se tendrán siempre presente los posibles peligros asociados al trabajo con materiales peligrosos. Nunca hay excusa para los accidentes en un laboratorio bien equipado en el cual trabaja personal bien informado. A continuación se exponen una serie de normas que deben conocerse y seguirse en el laboratorio:

• Durante la estancia en el laboratorio el alumno debe ir provisto de bata con mangas largas, gafas de seguridad y guantes de latex. La bata deberá emplearse durante toda la estancia en el laboratorio. Las gafas de seguridad siempre que se manejen productos peligrosos y durante la calefacción de disoluciones. Los guantes deben utilizarse obligatoriamente en la manipulación de productos tóxicos o cáusticos.

• Quítese todos los accesorios personales que puedan comprender riesgos de accidentes mecánicos,

químicos o por fuego, como son anillos, pulseras, collares y sombreros. La responsabilidad por las consecuencias de no cumplir esta norma dentro del laboratorio es enteramente del estudiante.

• Nunca deben llevarse lentes de contacto sin gafas protectoras, pues éstos retienen las sustancias

corrosivas en el ojo impidiendo su lavado y extendiendo el daño.

• Está prohibido fumar, beber o comer en el laboratorio • El pelo largo se llevará siempre recogido.

• Debe conocerse la toxicidad y riesgos de todos los compuestos con los que se trabaje.

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• Los frascos de los reactivos deben cerrarse inmediatamente después de su uso, durante su utilización los tapones deben depositarse siempre boca arriba sobre la mesa.

• No se debe pipetear ninguna sustancia con la boca.

• Mantenga sólo el material requerido para la sesión, sobre la mesa de trabajo. Los frascos de

reactivos deben permanecer en las baldas. Los demás objetos personales o innecesarios deben guardarse o colocarse lejos del área de trabajo.

• Las vitrinas para gases tienen que utilizarse en todo trabajo con compuestos químicos que pueden

producir gases peligrosos o dar lugar a salpicaduras.

• No deben manipularse jamás productos o disolventes inflamables en las proximidades de llamas.

• Si algún reactivo se derrama, debe retirarse inmediatamente dejando el lugar perfectamente limpio. Las salpicaduras de sustancias básicas deben neutralizarse con un ácido débil (por ej. Ácido cítrico) y las de sustancias ácidas con una base débil (bicarbonato sódico).

• No deben verterse residuos sólidos en los fregaderos, deben emplearse los recipientes para residuos

que se encuentran en el laboratorio.

• Los ácidos y bases concentrados se encuentran en la vitrina del laboratorio. En ningún caso deben sacarse de la vitrina, cuando se requiera un volumen de estos reactivos se llevará el recipiente adecuado a la vitrina para tomar allí mismo la cantidad necesaria.

• Cuando se tengan dudas sobre las precauciones de manipulación de algún producto debe

consultarse al profesor antes de proceder a su uso.

• Los recipientes utilizados para almacenar disoluciones deben limpiarse previamente, eliminando cualquier etiqueta anterior y rotulando de nuevo inmediatamente.

• No calentar nunca enérgicamente una disolución. La ebullición debe ser siempre suave.

• El mechero debe cerrarse, una vez utilizado, tanto de la llave del propio mechero como la toma del

gas de la mesa.

• Las disoluciones y recipientes calientes deben manipularse con cuidado. Para la introducción y extracción de recipientes de hornos y estufas deben utilizarse las pinzas y guantes adecuados.

• Las heridas y quemaduras deben ser tratadas inmediatamente. En el caso de salpicaduras de ácidos

sobre la piel lavar inmediatamente con agua abundante, teniendo en cuenta que en el caso de ácidos concentrados la reacción con el agua puede producir calor. Es conveniente retirar la ropa para evitar que el corrosivo quede atrapado entre la ropa y la piel.

• Deben conocerse la situación específica de los elementos de seguridad (lavaojos, ducha, extintor,

salidas de emergencia,...) en el laboratorio, así como todas las indicaciones sobre seguridad expuestas en el laboratorio.

• No debe llevarse a la boca ningún material de laboratorio; si algún reactivo es accidentalmente

ingerido, avise de inmediato al profesor o al técnico del Laboratorio.

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NORMAS DE TRABAJO • Las disoluciones de reactivos, que no sean patrones ni muestras, se almacenan en botellas de vidrio

o plástico que deben limpiarse y rotularse perfectamente.

• Las balanzas deben dejarse a cero y perfectamente limpias después de finalizar la pesada.

• Cerca de las balanzas sólo deben permanecer los estudiantes que se encuentren pesando (uno por balanza).

• Las sustancias patrón tipo primario anhidras se encuentran en el desecador y sólo deben extraerse

el tiempo necesario para su pesada. El desecador debe permanecer siempre cerrado.

• El material asignado a cada práctica debe permanecer en el lugar asignado a dicha práctica. No se debe coger material destinado a prácticas distintas a la que se está realizando. Bajo ningún concepto se sacarán reactivos o material de prácticas fuera del laboratorio.

CALENTAR Y DESTILAR

• Para recoger recipientes calientes como cápsulas, crisoles, vasos, etc., utilizar las correspondientes pinzas. También nos podremos ayudar de un paño del laboratorio.

• Cuando se calienten líquidos, evitar que la posible proyección pueda alcanzar a cualquier persona o

reactivo incompatible. Al calentar una solución en un tubo de ensayo, debe hacerse bajo el nivel del líquido y constantemente agitando. No debe apuntarse con el tubo al compañero o a sí mismo, pues puede proyectarse.

• Al calentar vidrio, dejar enfriar antes de cogerlo. Colocarlo sobre un material térmicamente aislante,

el vidrio caliente tiene el mismo aspecto que el vidrio frío.

• No manipular productos inflamables (benceno, tolueno, éter, etc.) en presencia de mecheros encendidos. No destilar éter con llama o en presencia de mecheros encendidos.

• Procure mantener la llama del mechero de color azul, ya que la llama amarilla produce tizne. GASES

• Las reacciones en las que se prevea un desprendimiento de gases, deben realizarse siempre en la vitrina de gases.

• Cuando se va a oler un gas, no hacerlo nunca directamente, sino abanicando hacia sí con la mano.

PUESTO DE TRABAJO

• Conservar siempre limpios los aparatos y el puesto de trabajo. Evitar derrames de sustancias, pero si cayera alguna, recogerla inmediatamente.

• Todas las prácticas deberán realizarse con limpieza y, al terminar, toda el área de trabajo deberá

quedar ordenada y limpia.

MANEJO DE SUSTANCIAS • No tocar los productos químicos con las manos. Usar papel, espátulas, etc. Usar guantes para el

manejo de reactivos corrosivos y/o altamente tóxicos. Una vez finalizada la práctica de laboratorio lavarse las manos.

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• Al usar cualquier tipo de reactivos, asegúrese que es el deseado y lea su etiqueta. Si es transferido de recipiente etiquételo de nuevo.

• Todos los reactivos deberán manejarse con el equipo perfectamente limpio. Al pipetear líquidos

transfiéralos a otro recipiente para su uso. Los reactivos no usados no se devuelven a los frascos. Nunca pipetee directamente del frasco.

• No manejar reactivos sin haber leído sus frases R y S, registrando sus propiedades en el cuaderno

de prácticas de laboratorio.

• Dilución de ácidos: añadir lentamente el ácido al agua contenida en un vaso, agitando constantemente y enfriando el vaso receptor. Nunca añadir agua al ácido.

• Al agitar moderadamente un tubo de ensayo golpee con la punta del dedo la base del tubo. Cuando

requiera una agitación vigorosa por inversión del recipiente, tápelo con un tapón de vidrio esmerilado o papel ParaFilm. Nunca lo haga con la mano.

RESIDUOS

• En el laboratorio se encuentran disponibles contenedores para la disposición de residuos líquidos (acuosos, orgánicos, con metales, etc.) no se debe arrojar nada por la cañería ni al piso del laboratorio. Si ocurre algún accidente avise inmediatamente para aplicar el procedimiento adecuado.

• Todos los desperdicios sólidos y papeles deberán colocarse en los bidones de basura, el material de

vidrio roto deberá descartarse en el recipiente especial para ese efecto. LECTURA DE VOLUMEN En aquellos recipientes de cuello estrecho (pipeta, buretam matraz aforado) se forma un menisco que es la superficie cóncava o convexa que separa a la fase líquida de la fase gas. Las fuerzas de adsorción entre la superficie del vidrio y el líquido provocan la curvatua del menisco. La lectura del volumen ha de de realizarse de tal modo que los ojos estén en un plano tangente al menisco. Ver Figura 1. Figura 1. Lectura de volumen en recipientes con formación de menisco

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pH y BUFFERS Objetivos

1. Identificar el pH de soluciones de interés. 2. Observar el efecto amortiguador de las soluciones buffer.

Materiales

• 2 vasos de precipitado de 100 mL • 1 probeta de 50 mL • 2 Pipetas aforadas de 1 mL • Papel indicador • Papel tornasol • pH-metro

Reactivos

• Solución Buffer* • Acido clorhídrico 0.1M • NaOH 0.1M

* Buffer: Mezclar 250mL acido acético 0.1M y 250 mL de acetato de sodio 0.1M (recién preparado). Cada grupo debe llevar al laboratorio leche, vinagre, gaseosa Procedimiento Experimento I

1. Envasar aproximadamente 50 mL de leche en un vaso de precipitado correctamente lavado 2. Medir el pH con el pH-metro, papel tornasol y papel indicador universal

Repita el procedimiento con vinagre, gaseosa y agua Experimento II

1. Medir el pH de la solución Buffer. 2. Colocar en la probeta 20 mL del buffer y completar hasta 50 mL con agua destilada. Pasar al vaso de

precipitado y medir el pH. 3. Colocar en la probeta 20 mL de la solución preparada en el numeral 2 y agregar con la pipeta

graduada 1.0 mL de HCl 0.1M. Pasar al vaso de precipitado y medir el pH. 4. Colocar en la probeta 20 mL de agua destilada y agregar con la pipeta graduada 1.0 mL de HCl

0.1M. Pasar al vaso de precipitado y medir el pH. 5. Colocar en la probeta 20 mL de la solución preparada en el numeral 2 y agregar con la pipeta

graduada 1.0 mL de NaOH 0.1M. Pasar al vaso de precipitado y medir el pH. 6. Colocar en la probeta 20 mL de agua destilada y agregar con la pipeta graduada 1.0 mL de NaOH

0.1M. Pasar al vaso de precipitado y medir el pH. Observaciones Experimento I: Construir una tabla donde se muestren los valores de referencia de pH para estas muestras y os valores experimentales. Analizar Experimento II: Determinar el pH teórico de cada una de las soluciones preparadas y compararlas con los resultados experimentales. Calcular el error.

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IDENTIFICACION DE CARBOHIDRATOS Objetivo

1. Identificar una muestra problema a partir de reacciones químicas. 2. Identificar los diferentes tipos de carbohidratos

Fundamentos Los carbohidratos son polihidroxialdehidos o polihidroxicetonas, conocidos como aldosas y cetosas respectivamente, éstos grupos funcionales le confieren la base para la mayoría de las reacciones usadas para su identificación y cuantificación. Asimismo los carbohidratos se pueden clasificar por el número de carbonos que posee la estructura. Cuando un carbohidrato es formado por una molécula se conoce como monosacárido; por dos, disacárido y por más de dos, polisacárido. Los disacáridos son dos monosacáridos unidos gracias a un enlace glucosídico. Si este enlace se efectúa entre dos carbonos anoméricos, el disacárido no tendrá el potencial aldehído o cetona libre, por lo tanto no dan positivas aquellas pruebas que involucren la participación de estos grupos, recibiendo el nombre de azúcar no reductor. Materiales

• 6 tubos de ensayo • Pinzas para tubo de ensayo • 1 Gradilla • 1 Mechero • 1 Trípode • 1 Malla de asbesto • 1 Pipeta de 5 mL • 1 Pipeta de 1 mL • 1 Vaso de precipitado de 250 mL

Reactivos

• Muestra problema • Blancos: agua, glucosa, fructosa, ribosa, sacarosa* • Acido sulfúrico concentrado • Acido clorhídrico concentrado • Solución de NaOH • Reactivo de Molish • Reactivo de Barfoed • Reactivo de Bial • Reactivo de Seliwanoff • Reactivo de Benedict

* Debido a la sensibilidad de las pruebas, la concentración de las muestras de carbohidratos debe oscilar entre 1 - 10 g/L.

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Preparación de reactivos • Reactivo de Molish: α-naftol al 10% en etanol -fresco- • Reactivo de Barfoed: disolver 13.3 g de acetato de cobre en aproximadamente 200 mL de agua

destilada y agregar 1.8 mL de acido acético glacial • Reactivo de Bial: disolver 1.5 g de orcinol en 500mL de HCl concentrado en 250 mL de agua

destilada, añadir 20 gotas de cloruro férrico al 1% • Reactivo de Seliwanoff: tomar 3 mL de resorcinol al 0.5 % en agua, añadir 12 mL HCl concentrado,

añadir agua c.s.p. 35mL • Reactivo de Benedict: disolver 173 g de citrato de sodio y 100 g de carbonato de sodio en 800 mL de

agua caliente, filtrar a través de papel de filtro en una probeta de 1000 mL, completar hasta 850 mL. Mientras tanto, disolver 17.3 g de sulfato de cobre en 100 mL de agua, completar hasta 150 mL. Verter la primera solución en un vaso de precipitado de 2L y añadir lentamente la solución de sulfato de cobre agitando continuamente.

Procedimiento Identificación de una solución problema Para la identificación de una muestra problema se seguirán una serie de pasos sistemáticamente, de acuerdo a la Figura 2. Figura 2. Marcha analítica para carbohidratos.

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Cada prueba (de acuerdo a los cuadros de decisión de la Figura 2) se debe realizar para tres muestras: solución problema, blanco (+) y agua (-). Prueba de Molish Añadir 1 mL de la solución de carbohidrato a un tubo de ensayo rotulado, posteriormente agregar 2 gotas del reactivo de Molish, mezclar. Cuidadosamente agregar aproximadamente 0.5 mL de H2SO4 concentrado por las paredes del tubo, de tal forma que se formen dos capas. Un color rojo violeta en la interfase entre el ácido y la solución acuosa indica una prueba positiva para carbohidratos. Prueba de Barfoed A 1 mL de reactivo de Barfoed agregar 0.5 mL de solución de carbohidrato en un tubo de ensayo debidamente rotulado y mezclar. Poner el tubo en baño de agua hirviendo. La aparición de un precipitado rojo antes de los 6 min indica la presencia de un monosacárido. La aparición de un escaso precipitado rojo después de 9 min indica la presencia de disacárido o polisacárido. Prueba de Bial En un tubo de ensayo agregar 2.5 mL de reactivo de Bial y luego agregar aproximadamente 1 mL de la muestra. Llevar a baño de maría hirviente durante 3 min. La aparición de un color verde botella, brillante y totalmente transparente, indica la presencia de una pentosa. Algunos azucares dan con el Bial una coloración verde, pero está es opaca. Prueba de Seliwanoff Añadir 1 mL del reactivo de Seliwanoff a 0.5 mL de la solución de carbohidrato en un tubo de ensayo debidamente rotulado. Mezclar y colocar el tubo en un baño de agua hirviendo por 4 minutos. Un color rojo intenso es prueba positiva para cetohexosas. El color es más fuerte si se continúa calentando, pero en éste caso las aldohexosas también darán color rojo. Prueba de Benedict A 2 mL del reactivo de Benedict añadir 8 gotas de la solución de la muestra de carbohidrato en un tubo de ensayo debidamente rotulado. Mezclar y calentar la solución en un baño de agua hirviente durante 5 minutos. Un precipitado verde; amarillo o rojo, indica resultado positivo para azúcares reductores. Los diferentes colores que pueden aparecer se deben al tamaño de las partículas formadas: Las partículas grandes forman precipitados rojo y las partículas pequeñas un precipitado verde. Examinar el color y la cantidad de precipitado obtenido. Una pequeña cantidad de precipitado no es prueba positiva. Prueba de Sacarosa A 5 mL de la muestra de carbohidrato agregar 5 gotas de HCl concentrado, calentar durante 5 minutos en un baño de agua hirviendo, enfriar y agregar NaOH hasta que la solución sea neutra o débilmente alcalina. Con la solución hidrolizada realizar la prueba de Seliwanoff. Observaciones No olvide plantear el diagrama de flujo para cada prueba.

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LIPIDOS Objetivo Reconocer algunas propiedades físico químicas representativas de los lípidos. Fundamento Saponificación Las grasas reaccionan en caliente con el hidróxido sódico o potásico descomponiéndose en los dos elementos que las integran: glicerina y ácidos grasos. Éstos se combinan con los iones sodio o potasio del hidróxido para dar jabones, que son en consecuencia las sales sódicas o potásicas de los ácidos grasos. En los seres vivos, la hidrólisis de los triglicéridos se realiza mediante la acción de enzimas específicos (lipasas) que dan lugar a la formación de ácidos grasos y glicerina. Lieberman-Buchard El anhídrido acético reacciona con el colesterol en solución clorofórmica para producir un color característico azul-verdoso. La naturaleza exacta del cromóforo es desconocida pero la reacción probablemente incluye la esterificación del grupo hidroxilo en la posición 3 junto con otros arreglos en la molécula. Procedimiento Experimento 1. Saponificación Materiales

• Tubos de ensayo • Gradilla • Varillas de vidrio • Mechero • Vaso de precipitado • Pipetas

Reactivos

• Solución de NaOH al 20% • Aceite vegetal (aceite de oliva) • Grasa animal (mantequilla) • Acido graso (ácido esteárico)

Colocar en un tubo de ensayo 2 mL de aceite (muestra líquida) o colocar una muestra de grasa (sólida) hasta una altura de 0.5 cm aproximadamente (calentar la muestra solida en baño María hasta su fusión). Agregar 2 mL de NaOH al 20%. Agitar enérgicamente y colocar el tubo al baño maría durante 30 minutos. Después de dejar en reposo, se pueden observar en el tubo 3 fases: una inferior clara que contiene la solución de sosa sobrante junto con la glicerina formada, otra intermedia semisólida que es el jabón formado y una superior lipídica de aceite/grasa inalterado.

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Experimento 2. Reacción de Lieberman-Buchard Materiales

• 1 Tubo de ensayo • 1 Pipeta de 5mL

Reactivos

• Cloroformo • Colesterol • Anhídrido acético • H2SO4 concentrado

Procedimiento Agregar 1.5 mL de disolución de colesterol en cloroformo un tubo de ensayo, luego agregar 5 gotas de anhídrido acético y dos gotas de H2SO4 concentrado (éste último por las paredes del tubo), mezclar suavemente. Observar y anotar los cambios de coloración que se producen.

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DESNATURALIZACION Y CUANTIFICACION DE PROTEINAS Objetivos

1. Comprobar la desnaturalización de proteínas por diferentes efectos. 2. Cuantificar una muestra problema.

Fundamento Desnaturalización La estructura covalente de las proteínas posee un carácter informacional secuencial, que determina la estructura tridimensional biológicamente activa, terciaria o cuaternaria según la proteína. La función se ejerce mediante el reconocimiento molecular, el cual se establece en virtud de la disposición espacial de las cadenas laterales de determinados residuos de aminoácidos; por tanto, el nivel estructural terciario o cuaternario posee un carácter informacional-conformacion, que permite el funcionamiento de la proteína. La presencia de determinados agentes físicos o químicos provoca la ruptura de algunas interacciones no covalentes, y si están presentes, la de los puentes disulfuros y con ello se produce, en mayor o menor grado, la pérdida de la estructura tridimensional de la proteína y por ende su función. Este fenómeno se conoce como desnaturalización. Resulta oportuno precisar que la desnaturalización no afecta los enlaces peptídicos, por lo que se mantiene el nivel primario. Cuantificación En la prueba de Biuret el sulfato alcalino de cobre reacciona con compuestos que contienen dos o más enlaces peptídicos dando un complejo de coloración violeta, la intensidad del color obtenido es una medida del número de enlaces peptídicos. Las proteínas reaccionan con el reactivo de Folin-Ciocalteau para dar un complejo coloreado, el color que se forma es debido a la reacción del cobre alcalino con la proteína. La intensidad del color depende del número de aminoácidos aromáticos presentes y cambiará según la clase de proteína. Materiales

• 6 Tubos de ensayo • Pipeta graduada de 1 mL • Pipeta graduada de 5 mL • Termómetro • Vaso de precipitado de 250 mL • Gradilla • Malla de asbesto • Trípode • Espectrofotómetro

Reactivos

• Proteínas* (5g/L albúmina, caseína, gelatina) • Solución de clara de huevo** • Patrón de proteínas (solución de albúmina5 mg /mL). Prepárese fresco. • Patrón de proteína (solución de albúmina 0.2 mg/mL). Prepárese fresco. • Acido clorhídrico 1 M • Hidróxido de sodio 1 M • Acido nítrico (conc.).

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• Etanol 96% • Acetona • Reactivo de Biuret. (Disuelva 3 g de sulfato de cobre (CuSO4 . 5H2O) y 9 g de tartrato sódico

potásico en 500 mL de hidróxido de sodio 0.2 M; añada 5 g de yoduro potásico y complete hasta 1 L con hidróxido de sodio 0.2 M.)

• Solución alcalina de carbonato de sodio (Na2CO3 20 gl/L en NaOH 0.1 M). • Solución de sulfato de cobre-tartrato sódico potásico (5 gl/L CuSO4 . 5H2O en tartrato sódico potásico

10 g/L). Prepárese fresco mezclando las dos soluciones preparadas por separado. • 'Solución alcalina'. Prepárese el mismo día mezclando 50 mL de (1) y 1 mL de (2). • Reactivo de Folin-Ciocalteau. (Diluya el reactivo comercial con un volumen igual de agua, el mismo

día que se va a utilizar. Esta es una solución de tungstato de sodio y molibdato de sodio en ácido fosfórico y ácido clorhídrico.

*La caseína se disuelve en un poco de NaOH diluido y las otras proteínas en solución salina. ** diluir 1.0 mL de clara de huevo hasta 25mL con solución salina Procedimiento Experimento 1. Desnaturalización por calor y pH extremos En tres tubos de ensayo colocar 5 mL de solución proteínica, agregar en el primer tubo 0.5 mL de HCl, en el segundo 0.5 mL de NaOH y en el último 0.5 mL de agua. Colocar los tubos en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos y enfríe a temperatura ambiente. Ajustar los tubos ácidos y alcalinos hasta la neutralidad. Anotar sus observaciones. A 2 mL de la solución de proteína, agregar lentamente por las paredes del tubo 2 mL de HNO3 concentrado hasta que se formen dos capas; luego mezcle cuidadosamente los dos líquidos. Anotar sus observaciones. Realizar las pruebas para todas las proteínas. Experimento 2. Precipitación por solventes orgánicos A 2 mL de la solución de proteína, añadir 2 mL de etanol. Repetir el procedimiento pero adicionando 2 mL de acetona en lugar de etanol. Realizar las pruebas para todas las proteínas. Experimento 3. Prueba de Biuret A 3 mL de la solución de proteína (5 mg de albúmina/mL), añadir 4.5 mL del reactivo de Biuret, mezclar y calentar a 37 °C durante 10 minutos. Dejar enfriar y leer la absorbancia a 540 nm. Reportar los datos de la absorbancia de acuerdo a las concentraciones descritas en la Tabla 1. Determinar la concentración de proteínas de una muestra problema después de preparar una curva patrón (grafica de concentración vs absorbancia).

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Tabla 1. Absorbancia prueba de Biuret.

CONCENTRACION (mg/mL)

ABSORBANCIA ABSORBANCIA

1

2

3

4

5

Muestra Problema

Experimento 4. Método de Folin-Lowry para determinación de proteínas A 1 mL de la muestra (solución de albúmina 0.2 mg/mL) agregar 5 mL de 'solución alcalina'. Mezclar vigorosamente y dejar reposar a temperatura ambiente por 10 minutos o más. Agregar 0.5 mL de reactivo diluido de Folin-Ciocalteau en forma rápida y mezclando inmediatamente. Después de 30 minutos leer la absorbancia contra el blanco apropiado a 750 nm. Reportar los datos de la absorbancia de acuerdo a las concentraciones descritas en la tabla 2. Determinar la concentración de proteínas de una solución problema después de preparar una curva patrón (grafica de concentración vs absorbancia). Tabla 2. Absorbancia prueba de Folin

CONCENTRACION (mg/mL)

ABSORBANCIA ABSORBANCIA

0.04

0.08

0.12

0.16

0.20

Muestra Problema

Observaciones Comparar los métodos de cuantificación de Folin y Biuret.

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CINETICA ENZIMATICA Objetivos

1. Identificar los factores que afectan la actividad enzimática de la α-amilasa. 2. Determinar la actividad enzimática de la α-amilasa de acuerdo a las diferentes propiedades que

presentan los reactantes y productos de las reacciones catalizadas. Fundamento La cinética enzimática tiene por objeto el estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas, así como los factores que en ella influyen y los mecanismos por los cuales transcurren. La velocidad de las reacciones enzimáticas se puede medir por: - la cantidad de sustrato que desaparece en la unidad de tiempo - la cantidad de producto que aparece en la unidad de tiempo En esta práctica de laboratorio se comprobará la influencia de la concentración del sustrato (S), de la enzima (E), el pH y la temperatura (T) en la cinética de la enzima α-amilasa salival en su acción sobre los enlaces α1-4 del almidón. Al reaccionar el almidón con lugol se produce un color azul, y con base en la desaparición del almidón en la unidad de tiempo podemos estudiar el efecto que provocan en la cinética enzimática la variación de los factores que influyen en ella. Materiales

• 5 Tubos de ensayo • placa de porcelana con excavaduras • vasos de precipitado • baño de agua termostatado • cronómetro • pipeta graduada 1mL • pipeta 10mL • gotero

Reactivos

• Solución de la enzima* • Agua destilada. • Solución de almidón al 1%. • Cloruro de sodio 1% • Disoluciones tampón de pH 5.0; 6.8 y 8.0. • Reactivo de Lugol diluido (lugol:agua 1:2) • Hielo

*Solución de la enzima: Se prepara colectando 0.5 mL de saliva (previo enjuague de la boca con agua destilada) y diluyéndolo hasta 50 mL con agua destilada. ** Lugol: Se prepara disolviendo 1 g de iodo, 2 g de KI en 200 mL de agua destilada.

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Procedimiento Experimento 1. Estudio de la influencia de c(E)

1. Tomar 4 tubos de ensayo, etiquetarlos y añadir a cada uno 2 mL de solución de almidón, 1 mL de NaCl, 1 mL de Buffer (pH 6.8) y el volumen de agua reportado en la Tabla 3. Mezclar e incubar a 37°C.

2. Agregar el volumen de la solución de enzima reportado en la Tabla 3, mezclar, iniciar la lectura del tiempo e incubar inmediatamente.

3. Cada minuto ensayar en la placa con excavadura la reacción de la solución experimental con el Lugol: para ello sólo se debe que extraer con el gotero pequeñas cantidades de cada tubo de ensayo en reacción a una excavadura de la placa y luego adicionar una gota del reactivo de Lugol.

4. Registrar el tiempo que tarda cada uno de los tubos en no presentar reacción alguna con el reactivo de Lugol, la mezcla de las dos gotas debe quedar del color original del Lugol. Si desea puede adicionar en una excavadura unas gotas de agua y Lugol para tenerlo como solución de control.

Tabla 3. Experimento 1 cinética enzimática

Tubo Solución de almidón (mL)

Solución de NaCl (mL)

Buffer (mL)

Agua (mL)

Solución de enzima (mL)

1 2 1 1 0.4 0.1 2 2 1 1 0.3 0.2 3 2 1 1 0.2 0.3 4 2 1 1 0.1 0.4

El último reactivo que se debe agregar es la solución de enzima, de lo contrario la reacción comenzará y usted no tendrá en cuenta el tiempo transcurrido. Inmediatamente después de adicionar la solución de la enzima iniciar la lectura del tiempo.

Experimento 2. Estudio de la influencia del pH

1. Tomar 3 tubos de ensayo etiquetarlos y verter respectivamente 1 mL de las soluciones tampones de pH 5.0; 6.8 y 8.0, luego añadir a cada tubo 2 mL de la solución del almidón y 1 mL de NaCl (ver Tabla 4). Mezclar e incubar a 37°C

2. Añadir a cada tubo 2 mL de la solución de enzima, mezclar, iniciar la lectura del tiempo e incubar inmediatamente.

3. Ensayar la reacción con el Lugol según se indica en el trabajo experimental 1. 4. Registrar el tiempo que tarda cada uno de los tubos en no presentar reacción alguna con el reactivo

de Lugol. Tabla 4. Experimento 2 cinética enzimática

Tubo Buffer (pH)

Buffer (mL)

Solución de almidón (mL)



1 5.0 1 2 1 2 2 6.8 1 2 1 2 3 8.0 1 2 1 2

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Experimento 3. Estudio de la influencia de c(S)

1. Tomar 4 tubos de ensayo etiquetarlos y añadir a cada uno 0.5; 1.0; 1.5 y 2.0 mL de solución de almidón, 1 mL de NaCl, 1 mL de Buffer (pH 6.8) y el volumen de agua reportado en la Tabla 5. Mezclar e incubar a 37°C.

2. Añadir a cada tubo 0.5 mL de la solución de enzima, mezclar, iniciar la lectura del tiempo e incubar inmediatamente.



Tubo Solución de almidón (mL)


Buffer (mL)

Agua (mL)


1 0.5 1 1 1.5 0.5 2 1.0 1 1 1.0 0.5 3 1.5 1 1 0.5 0.5 4 2.0 1 1 0 0.5

Experimento 4. Estudio de la influencia de la temperatura

1. Tomar 4 tubos de ensayo etiquetarlos y añadir a cada uno 2mL de solución de almidón, 1 mL de NaCl, 1 mL de Buffer (pH 6.8). Mezclar e incubar de acuerdo a las temperaturas reportadas en la Tabla 6.

2. Añadir a cada tubo 2 mL de la solución de enzima, mezclar, iniciar la lectura del tiempo e incubar inmediatamente de acuerdo a las temperaturas reportadas en la Tabla 6.



Tubo Temperatura

(°C) Solución de almidón (mL)


Buffer (mL)


1 ≈ 0 2 1 1 2 2 ambiente 2 1 1 2 3 40 2 1 1 2 4 50 2 1 1 2

Observaciones Para graficar los datos de los diferentes experimentos, tenga en cuenta que la velocidad de reacción está dada como 1/t.

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EXTRACCIÓN DE ADN Objetivos:

1. Extraer e identificar una muestra de ADN de una muestra animal. 2. Observar la estructura fibrilar del ADN.

Fundamento El ADN es la mayor de las moléculas conocidas. Una hebra entera de ADN consta de millones de átomos. Al separarse de una célula, el ADN se rompe en múltiples fragmentos. En solución, esas hebras poseen una carga eléctrica levemente negativa, hecho que contribuye a crear una química fascinante. Por ejemplo, los iones salinos son atraídos hacia las cargas negativas del ADN, con el efecto de neutralizarlos, y ese fenómeno impide que los fragmentos separados de ADN se adhieran entre sí. Controlando las concentraciones de sales, los biólogos provocan que los fragmentos de ADN se dispersen o se aglomeren. Y en esto reside el secreto de la remoción del ADN celular. Materiales

• Mortero con Pistilo • 1 probeta de 100mL • 1 Erlenmeyer de 100mL • 1 Embudo • 1 Pipeta graduada de 1 mL • 1 Pipeta graduada de 10mL • 1 Beaker de 100mL • 1 Beaker de 250mL

• 1 Agitador de vidrio • 1 Mechero • 1 Placa • 1 Trípode • 1 Tubo de ensayo • 1 Pinza para tubo de ensayo • 1 Gradilla

Reactivos

• Agua destilada • NaCI 2M • NaHCO3 • Solución de SDS • Etanol (80-95%) • Reactivo de Difenilamina* • Solución Buffer**

*Reactivo de Difenilamina: 1g de difenilamina en 100 mL de ácido acético glacial y 2.5 mL de ácido sulfúrico concentrado ** Buffer: 120 mL de agua; 1.5g de NaCl; 5g de NaHCO3 y 5mL de jabón líquido. IMPORTANTE. Cada grupo debe traer: Hígado de pollo, Arena, Gasa, Jabón Líquido

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Procedimiento Experimento 1. Extracción de ADN

1. Triturar el hígado de pollo en un mortero. Añadir arena (poca) para que al triturar se puedan romper las membranas y queden los núcleos sueltos.

2. Añadir al triturado, 50 mL de agua. Remover hasta hacer una especie de papilla o puré. 3. Filtrar con la gasa, luego realizar un segundo filtrado para separar los restos de tejidos que hayan

quedado por romper. Si es necesario realizar un tercer filtrado. 4. Tomar 15 mL del filtrado y agregarlos a una probeta. 5. Añadir al filtrado 15 mL de cloruro sódico 2M. Con esto conseguimos producir el estallido de los

núcleos para que queden libres las fibras de cromatina. 6. Añadir 1 mL de SDS o de jabón líquido. La acción de este detergente es formar un complejo con las

proteínas y separarlas del ADN. Así quedará el ADN libre de las proteínas que tiene asociadas. 7. Añadir mediante una pipeta 15 mL de etanol frío*. Hay que hacerlo de forma que el alcohol resbale

por las paredes del vaso y se formen dos capas. 8. Esperar hasta observar el ADN en la interfase. 9. Introducir una varilla de vidrio e ir removiendo en la misma dirección. Sobre la varilla se van

adhiriendo unas fibras blancas, visibles a simple vista, que son el resultado de la agrupación de muchas fibras de ADN.

*previamente el etanol se debe mantener en baño de hielo. Experimento 2. Identificación de ADN. Reacción de difenilamina Tomar el ADN obtenido en el proceso anterior y resuspenderlo en 3 mL del buffer. Adicionar a esta solución 5 mL del reactivo de difenilamina (recién preparado). Calentar en un baño de agua hirviendo durante diez minutos, se debe obtener una solución de color azul.

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PIGMENTOS Objetivo:

1. Extraer pigmentos de muestras vegetales. 2. Identificar los pigmentos presentes en diferentes muestras vegetales empleando cromatografía en

papel. 3. Emplear la cromatografía en papel como técnica de separación de sustancias.

Fundamento Todas estas sustancias presentan un grado diferente de solubilidad en disolventes apolares, lo que permite su separación cuando una solución de las mismas asciende por capilaridad a través de una tira de papel poroso (papel de cromatografía) dispuesta verticalmente sobre una película de un disolvente (eluyente), ya que las más solubles se desplazarán a mayor velocidad, pues acompañarán fácilmente al disolvente a medida que éste asciende. Las menos solubles avanzarán menos en la tira de papel de cromatografía. Aparecerán, por tanto, varias bandas de diferentes colores (hasta siete o más, dependiendo del material utilizado) que estarán más o menos alejados de la disolución eluyente según la mayor o menor solubilidad de los pigmentos. Estas bandas poseerán diferente grosor, dependiendo de la abundancia del pigmento en la disolución. Los cloroplastos poseen una mezcla de pigmentos con diferentes colores: clorofila-a (verde intenso), clorofila-b (verde), carotenos (amarillo claro) y xantofilas (amarillo anaranjado) en diferentes proporciones. Materiales

• Mortero • Tubo de ensayo • Gradilla • Vaso de precipitado • Capilar o micropipeta (cuentagotas en su defecto) • Tira de papel cromatográfico Wathman o papel de filtro • Tijeras

Reactivos

• Solución de pigmentos • Etanol • Eter • Benceno

La solución de pigmentos se prepara a partir de hojas de espinaca y lechuga

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Procedimiento I. Solución de pigmentos

1. Colocar en un mortero trozos de hojas de espinacas lavadas (1 o 2 hojas), quitando las nerviaciones más gruesas, junto con aproximadamente 5 mL de etanol.

2. Triturar sin golpear hasta que el líquido adquiera una coloración verde intensa. 3. Separar la solución de pigmentos de los residuos de material vegetal.

II. Cromatografía

1. En una tira de papel de cromatografía o un papel de filtro (3cm x 15cm) poner con el capilar una línea de solución de pigmentos, repasar de 3 a 5 veces la línea espaciado en el tiempo con el fin de que vaya secándose el etanol y aumente la cantidad de pigmentos. El pigmento se pondrá siempre sobre la misma línea (se puede marcar con un lápiz), situado a unos 2 cm por encima del borde inferior del papel. Ver Figura 3 – a.

2. Colocar en un vaso se precipitado etanol hasta una altura de 0,3mm aproximadamente. 3. Poner el papel cromatográfico a lo largo en el vaso de precipitado con la mancha de pigmento a 1 cm

de la superficie del eluyente aproximadamente (el eluyente no debe tocar la muestra de pigmento del papel). Fijar el papel cromatográfico (de manera que quede vertical).

4. El solvente empezará a subir a través del papel de filtro por capilaridad, retirar el papel de filtro cuando falte 1cm para que llegue al extremo contrario.

5. Calcular el Factor de retención (rf) de cada pigmento.

Repetir el procedimiento reemplazando el etanol por éter y por una solución de benceno:etanol 1:1

El factor de retención (rf), se define como el cociente de dividir el recorrido de la sustancia por el del disolvente, o sea la distancia que media desde el origen hasta el centro de la mancha (X) dividida por la distancia que media desde el origen hasta el frente del disolvente (S). Rf = X/S. Figura 3 – b. Figura 3. Cromatografía en papel

a b

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BIBLIOGRAFIA

• DESHILANDO EL TEJIDO de la Vida. Revista Investigación y Ciencia. 1998. • FRAIS, Fiona. Practical biochemistry an introduction course. London. Ed. Butterworths. 1972. 159 p • ICONTEC. Norma Técnica Colombiana NTC 1000. Metrología. Sistema Internacional de unidades.

2004 • ICONTEC. Norma Técnica Colombiana NTC 1486. Documentación. Presentación de tesis, trabajos

de grados y otros trabajos de investigación. 2008. • NELSON, David L. and COX, Michael M. Lehninger principles of biochemistry [eds.] 4th.ed. New

York : W.H.Freeman 2005. xxv, 1119 p • PLUMMER, David. Bioquímica práctica. McGraw-Hill.1981 • UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA. Guías de laboratorio de Bioquímica básica. Facultad de

Ciencias. Departamento de Química. 2009 • UNIVERSIDAD PABLO DE OLAVIDE. Normas de seguridad. Laboratorio de Química Física

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ANEXO 1. GUIA PRESENTACION DE PREINFORMES E INFORMES Preinforme El preinforme se presentará en un cuaderno de laboratorio debe incluir:

• Título de la práctica • Objetivos • Marco teórico • Metodología (diagrama de flujo) • Normas de seguridad de los reactivos que se emplearan • Tablas para la recolección de datos (cada grupo la diseña)

Informe El informe se debe presentar en el cuaderno de laboratorio. El informe de laboratorio debe ser entregado en la siguiente práctica y debe ser sustentado por un integrante del grupo elegido al azar. Las tablas y figuras deben colocarse en la misma página en que se mencionan o en la siguiente. Para su numeración se utilizan números arábigos en orden consecutivo y no se debe emplear la abreviatura “No.” ni el signo “#”. El nombre de la tabla o figura se debe escribir en la parte superior de la misma. Toda tabla y/o figura se debe relacionar dentro del texto. El informe debe incluir:

• Titulo de la práctica: debe ir en letra mayúscula • Fecha de realización de la práctica • Nombre de los autores • Numero de grupo y subgrupo • Resumen: mínimo 5 líneas • Palabras clave: se plantean 5 a 8 palabras clave o frases que identifiquen los principales aspectos

del trabajo. • Introducción y objetivos: describir el planteamiento general del tema, dando la información necesaria

en forma concisa y precisa haciendo referencia solamente a la bibliografía directamente relacionada. No se deben incluir revisiones amplias de bibliografía (no se aceptan páginas de internet, ni repetir lo que está en la guía).

• Datos y cálculos: los datos que se colectan durante la práctica se deben ordenar en tablas (si es posible), asimismo los cálculos se deben presentar en forma ordenada.

• Análisis de resultados: deben presentarse de forma precisa incluyendo, si da a lugar tablas y figuras (las cuales dan origen al análisis y discusión de los resultados), la discusión debe estar enfocada a la interpretación de los datos experimentales. Se deben incluir los mecanismos de reacción.

• Conclusiones: deben estar respaldadas por los resultados y el análisis, una conclusión es clara, corta y concisa.

• Bibliografía: se deben referenciar los autores, titulo, volumen, país y año de publicación

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ANEXO 2. UNIDADES Y SIMBOLOS Los símbolos de las unidades que se trabajan con mayor frecuencia en el laboratorio de bioquímica se muestran en la Tabla 7. Tabla 7. Unidades del Sistema Internacional de Unidades

Magnitud Unidad Símbolo

Longitud centímetro cm Longitud milímetro mm Masa gramo g Cantidad de sustancia mol mol Volumen litro l, L Volumen mililitro ml, mL Temperatura grado Celsius °C Tiempo segundo s Tiempo minuto min Tiempo hora h

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ANEXO 3. DIAGRAMA DE FLUJO Un diagrama de flujo es una representación gráfica de la secuencia de pasos a realizar para producir un cierto resultado. Para elaborar un diagrama de flujo se utilizan diversos símbolos según el tipo de información que contengan.

A continuación se muestra un ejemplo sencillo de las conexiones que se pueden presentar:

NO

SI

Actividad 1

Actividad 2

Actividad 4

Decisión

Actividad 5

Actividad 3

ACTIVIDAD DECISIÓN

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Ejemplo 2 de un Diagrama de Flujo:

Agregar 40mL de solución problema a un

beacker

Agregar 10mg de reactivo X

(poco a poco)

Calentar (10 min a 30°C)

Decantar Agregar 20mL de

reactivo Y

Formación de precipitado

Separar fases Dejar enfriar

Agitar hasta disolver

NO SI

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