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Génomique Microsporidienne
E. CORNILLOT
Laboratoire de Biologie des Protistes - UMR CNRS 6023Université Blaise Pascal - Clermont-Ferrand
Génomique des Microsporidies:Pourquoi?
Une biodiversité importante
Polar cap
Lammellar polaroplastVacuolar polaroplastExopsoreEndospore
Plasma membranePolar tubeNucleus
Deux grands types d’organisationdu génome
217 kpb
315 kpb
11
Encephal.cuniculi
15
18
16
2.8 Mpb
6.2 Mpb
15 Mpb
19 Mpb
Kpb
1900
1000
800
650
400
Spraguealophii
Nosemabombycis
Glugeaatherinae
Le génome d’E. cuniculinous a fourni :
Une carte physique et un outil, le KARD pour l’exploiter
11 consensus correspondant aux 11 chromosomessans les télomères et certaines séquences d’extrémité
Un protéome déduit à partir d’environ 2000 CDS
Un facteur de virulence : les ATP/ADP translocases
Une hypothèse sur le mitosome
But how to mesure genome evolution
Phylogeny : a fungi relationship=> a systematic approach=> a rapid evolution of the primary sequences
Chromosome backbone => a eukaryotic chromosome=> a parasite paradigm
Genome size reduction ongoing process=> the proteome evolution=> the minimal proteome
Reconstruction du métabolisme
HMGCoA PI PIP
Dolichyl-PP Isopentenyl-PP PIP2
Farnesyl-PP
GPI
Signal transduction(kinase C)
Glycerol-3PFatty acids
Acetate AcetylCoA
L-serine PalmitoylCoA
SphingosinePhospholipid
Anabolism
IP3 , DAG ?
The E. cuniculi metabolism
Parasites de poissons
Poissons hôtes
E. cuniculi
Mammifères
The E. cuniculi metabolism
Examples of potential Examples of potential EcEc proteins specific of mitochondrial proteins specific of mitochondrial oxidoreductionsoxidoreductions (1)(1)
Chromosome Mitochondrial-type Homologue with the YeastNo protein highest BLAST score homologue
1 ? thioredoxin-like (H-type) YPD3 Caenorhabditis el. 179 (39%) YD83 167 (40%)4 pyruvate pyruvate DHaseDHase E1 beta subE1 beta sub. PDHB Rickettsia pr. 752 (43%) PDB1 750 (51%) 6 14-kDa protein (ALR/ERV1 fam.) ALR Rattus no. 262 (46%) ERV1 257 (45%)9 pyruvate pyruvate DHaseDHase E1 alpha sub.E1 alpha sub. Schizosacch. po. 680 (46%) PDB2 653 (44%)
10 mitoch. glycerol-3P DHase GPDM Caenorhabditis el. 1117 (40%) GPDM 901 (36%)11 Mn superoxide dismutase SODM Bacillus c. 471 (48%) SODM
No evidence for hydogenosomal-type oxidoreductases and aldehyde dehydrogenase
- E1 binds TPP and catalyses pyruvate decarboxylation- Pea E1 has been assembled as a functional tetramer α2β2 in Pichia pastoris (Moreno et al., 2000)
E1
α2β2Pyruvate
CO2
S-acetyldihydro-
lipoamide?
Ferredoxin ?NAD+ ?
Acetyl-CoAsynthetase ?...
Genes encoding subunits of the E1 component of mitochondrial pyruvate E1 component of mitochondrial pyruvate dehydrogenasedehydrogenase complexcomplex
lipoamide(no E2, no E3)
The mitosome hypothesis
Examples of potential Examples of potential EcEc proteins specific of mitochondrial proteins specific of mitochondrial oxidoreductionsoxidoreductions (2)(2)
Homologues of mitochondrial- and cytosolic-type glycerolglycerol--33--P P dehydrogenasesdehydrogenases
GlycerolGlycerol-- 33--phosphate shuttlephosphate shuttle (mitochondrial re-oxidation of cytosolic NADH)
2H+ + ½ O2 H2O
NADH NAD+
GPDGPD--CC
DHAP Glycerol-3-P
GPDGPD--MM
b c1 Co xQNd ext
Nd inte -
NADH NAD+Cytosol
Mitochondrialmatrix
NADH NAD+
?
no evidence for NADH dehydrogenases, cyt. bc1 complex, cyt. c and cyt. oxidase complex
C
The mitosome hypothesis
Pyruvate Acetyl-CoA NADH NAD+
e- electron transport ? e-
Glycolysis
CYTOSOL GPDH-cytoAcetate? Glycerol-3-P
shuttle DHAP Glycerol-3-P
ferredoxin NAD(P)H Fdx ORPDH -E1
décarboxylation of pyruvate Fe2S2 SOD-Mn
Fe-S cluster biosynthesis
HSP70TIM 22
translocation andprotein folding
NifU / IscU, Nfs, frataxin
mito ABC transp.
Matrix pre-proteins fer cytosolic Fe-S proteins
ferritin
ERV1
GPDH- mito
CO2
ACS
MITOSOME
Katinka et al., Nature, 2001
The ATP/ADP translocasesparalogues
L’omique
Gradient de pH linéaire5 8MM (kDa)
200
11696
66
45
31
21
parasites récoltés dans le milieu de culture
élimination des débris cellulaires
1010 parasites purifiés
extraction en urée, thiourée, DTT, CHAPS, SDS
Soluble 1 (1,56 mg)
électrophorèse 2D
MALDI-TOF(acquisition, annotation,
identification automatisées)
+ LC-MS/MS
préparation robotiséedes échantillons
insoluble
extraction par NaOH
insoluble
extraction en
LaemmliSoluble 3(0,18 mg)
Soluble 2(0,72 mg)
LC-MS/MS
digestion trypsique
complète de l’échantillon
Stratégie d’extractions protéiques et d’identification par spectrométrie de masse
Approches haut débit: le protéome
Métabolisme(4.5 %)
Energie (4.0 %)
Croissance, division,
synthèse ADN (4.0 %)
Transcription (3.4 %)
Synthèse protéique (19.9 %)
Modification et devenir
des protéines (21.0 %)
Transport facilité (0.6 %)Transport
intracellulaire (6.3 %)
Organisation cellulaire et biogenèse
(6.3 %)
Communication cellulaire et
transduction du signal (1.1 %)
Survie, défense, mort et
vieillissement cellulaire (3.4 %)
Fonction inconnue (25.6 %)
177 protéines différentes identifiées réparties en 12 classes fonctionnelles :Approches haut débit: le protéome
Génomique comparée: étude l’appareil invasif
Encephalitozoon cuniculi
(chromosome VI)
Antonosporalocustae
(contig 605)
ptp1
06_0250
ptp2
06_0240 06_0230i06_026006_028006_1320
860 bp
1117 bpORF-A ORF-B
Encephalitozoon cuniculiLe génome minimum
KARDKARD--PFGE PFGE KKaryotype aryotype AAnd nd RRestriction estriction DDisplayisplay 2D2D--PFGEPFGE
1st dimension PFGE= molécular karyotype
In gel digestionand radioactive
labelling
2nd dimensionelectrophoresis
Autoradiography
Brugère et al.,Nucleic Acids Res., 2000
Régions chromosomiques sub-terminales chez E. cuniculi
karyotype C variant
Sub-terminal probes
Hybridizationreference MluI KARD
I XI
kpb
10
48.5
97
146
Régions chromosomiques sub-terminales chez E. cuniculi
II-
III -AD
-VD & F
VII
+IV
F
VIIIF
XID & F
X -- +
D & FC +IX
F C
I --C
VIFD CD
Régions chromosomiques sub-terminales chez E. cuniculi
Chromosome 6Chromosome 9Chromosome 3Chromosome 11Chromosome 2Chromosome 7Chromosome 10Chromosome 8Chromosome 4Chromosome 5Chromosome 1
0 50 100 150 200 250 kpb
Régions chromosomiques sub-terminales chez E. cuniculi
Chr. 1 1>1> rDNArDNA>>
<2<2 1>1><3<3
<1<1 2>2><3<3 4>4>
<4<4 4>4>
<5<5 4>4>
1<1< 1>1>
5>5><4<4 3>3>
<4<4 6>6>
<1<1
2>2>
22 6>6>
<6<6 7>7>
<<rDNArDNA
<6<6
<<rDNArDNA
Chr. 11Chr. 10Chr. 9
Chr. 8Chr. 7Chr. 6Chr. 5Chr. 4Chr. 3Chr. 2
5 kpb
Régions chromosomiques sub-terminales chez E. cuniculi
Ancrage des consensusaux unités ADNr
Régions sub-terminales:- organisation- relation avec le cœur codant
Sub-télomère Région sub-terminale
‘Cœur’ riche enséquences codantes
Régions chromosomiques sub-terminales chez E. cuniculi
Chr. 1 1>1> rDNArDNA>>
<2<2 1>1><3<3
<1<1 2>2><3<3 4>4>
<4<4 4>4>
<5<5 4>4>
<1<1 1>1>
5>5><4<4 3>3>
<4<4 6>6>
<1<1
2>2>
22 6>6>
<6<6 7>7>
<<rDNArDNA
<6<6
<<rDNArDNA
Chr. 11Chr. 10Chr. 9
Chr. 8Chr. 7Chr. 6Chr. 5Chr. 4Chr. 3Chr. 2
5 kpb
Régions chromosomiques sub-terminales chez E. cuniculi
Chromosome 1
Chromosome 4
Chromosome 8
1111
11
1166 77
22
11
REGIONALISATION STRUCTURALE ET FONCTIONNELLE DES EXTREMITES
CHROMOSOMIQUES
Sub telomeric region of 15 kbp encompassing one rDNA unit.Sub terminal region with a size varying between 10 and 23 kbp.
coding core of the chromosome
-
-
-+
D & F-
- +D & FC
+F C
--
D
bioinformatic analysis genetic analysis
chromosome structure
F
CFD
FD&F
C
D A
REGIONALISATION STRUCTURALE ET FONCTIONNELLE DES EXTREMITES
CHROMOSOMIQUES
Familles VIR
Plasmodium falciparum
Plasmodium vivax
Trypanosoma brucei
Pneumocystis carinii
Familles MSG
Familles RIF, STEVOR et VAR
Encephalitozoon cuniculi
Familles INTER
FACTEURS DE VIRULENCE : forte recombinaison homologue
Familles VSG
ADNr
REGIONALISATION STRUCTURALE ET FONCTIONNELLE DES EXTREMITES
CHROMOSOMIQUES
Région conservée
Région conservée
FORTE DYNAMIQUE
Région sub-télomèrique
Région sub-terminale
Cœur codant
T
FACTEURS DEVIRULENCE
FORT TAUX DE RECOMBINAISON HOMOLOGUE
EUCHROMATINE HETEROCHROMATINEjonction
REGIONALISATION STRUCTURALE ET FONCTIONNELLE DES EXTREMITES
CHROMOSOMIQUES
P2x5 P2X3 P1X2 P2X2 L Sc P2X1 P1X1 * Pop P2X4 P2X6**
Génome des microsporidies:Spraguea lophii
k1k1
i1i1
g1g1f1f1
e1e1
c1c1
b3b3
b1b1a1a1
a10
h1h1 o1
o3
n1
n3
n2
j1j1
j2j2
k3k3
i2i2
h3h3h4h4
i4i4
g2g2
g3g3
g4g4
g5g5g6g6
f2f2
f3f3
f4f4
f5f5
e2e2e3e3
e4e4
c2c2
b2b2
b4b4b5b5
b6b6b7b7
b8b8
b10b10b9b9
a5a5a6a6a7a7a8a8
a9a9
a2a2
l2
l1
d2d2
d3d3d4d4d5d5
d6d6
d7d7c4c4
o2k2k2
h2h2
i5i5
a11
k4k4
n4
m1
m2
Kbp
300
150
100
50
20
5
a3a3
a4a4
d1d1
c3c3 i3i3
i6i6
Génome des microsporidies:Spraguea lophii
Génome des microsporidies:Paranosema grylii
Génome des microsporidies:Paranosema
grylii
Origine du caryotype:
-Diplocayon-Noyaux haploïdes(4,5-4,7Mpb, 17 chromosomes)-Sous populations dans l’hôte
=> Recombinaisons ectopiques
• Glugea atherinae : une microsporidie parasite du poisson Atherinae boyeri
• séquençage d’environnementKpb
1900
1600
1000
800
650500
400
Zone 1
Zone 2
Zone 3
Zone 4
K1
K2
K14
K3K4
K5K6K7K8K9
K10
K16
K11K12K13
K15
K17K18
K19
A.
E.
D.
C.
B.
K3 K4 K3 K4
Génome des microsporidies:Glugea atherinae
Du génome minimum au protéome minimum
70
60
50
40
30
20
10
0-20 -10 0 10 20 30 40 50
Size comparaisons between E. cuniculi andS. cerevisiae orthologues (%) - n=350
Num
bero
f pro
tein
s
E. cuniculi:espèce type
pour le protéome minimum
Katinka et al., Nature, 2001
Multiple alignment treatment and protein description
Gap1 Gap2 Gap3 Gap4
E. cuniculi: espèce type pour le protéome minimum
-1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
axe 1 2.5216 ( 42.03 %)
axe
2 1
.469
9 ( 2
4.5
%)
type1
type2type3
type4
type5
gap
Cercle des corrélationsCLUSTER=5
FREQUENCY of organi sme
CAEEL29
ENCCU375
SCHPO19
OTHER41
E. cuniculi: espèce type pour le protéome minimum
ACP: cercle des corrélation
Association des variablesTypologie des individus
Classification Ascendante Hiérarchique
Equipe Parasitologie Moléculaire et CellulaireUMR 6023 CNRS – Université Blaise Pascal
C.P. Vivarès
Génomique Protéomique Tube Ultrastructure BiochimieComparée PolaireE. Cornillot C. Texier F. Delbac G. Prensier H. DeniseInterB Carte Structure Glycomique G. MéténierN. Dia D. Brosson V. Polonais V. Taupin Blastocystis
KARD N. bombycis Interactome H. El AlaouiL. Mansour J. Wang I. Warwziniak J. BataE. NasonovaSéquençageL. LavieL. Wang
BioinformatiqueG. Chakroun(Pôle Modélisation)
ACI CNRS ProtéomiqueAromagroup M. MazetPharmaplanta N. Carpentier