Glukozinolati - Ruđer Bošković Institutebib.irb.hr/datoteka/661490.MARINA_ZEKIC.docx · Web...

FAKULTET KEMIJSKOG INŽENJERSTVA I TEHNOLOGIJE

Marina Zekić

GLUKOZINOLATI ODABRANIH SAMONIKLIH BILJAKA PORODICE

BRASSICACEAE

DOKTORSKI RAD

Zagreb, 2013.

FACULTY OF CHEMICAL ENGINEERING AND TECHNOLOGY

Marina Zekić

GLUCOSINOLATES OF SELECTED WILD - GROWING BRASSICACEAE PLANTS

DOCTORAL THESIS

Zagreb, 2013.

FAKULTET KEMIJSKOG INŽENJERSTVA I TEHNOLOGIJE

Marina Zekić

GLUKOZINOLATI ODABRANIH SAMONIKLIH BILJAKA PORODICE

BRASSICACEAE

DOKTORSKI RAD

Mentori:Dr. sc. Irena Škorić, izv. prof.Dr. sc. Ani Radonić, izv. prof.

Zagreb, 2013.

FACULTY OF CHEMICAL ENGINEERING AND TECHNOLOGY

Marina Zekić

GLUCOSINOLATES OF SELECTED WILD - GROWING BRASSICACEAE PLANTS

DOCTORAL THESIS

Supervisors:Dr. sc. Irena Škorić, associate professorDr. sc. Ani Radonić, associate professor

Zagreb, 2013.

UDK: UDK: 582.683.2:615.28(043.3)Znanstveno područje: Prirodne znanosti

Znanstveno polje: KemijaZnanstvena grana: Organska kemija

Institucija: Sveučilište u Zagrebu, Fakultet kemijskog inženjerstva i tehnologije, Zavod za organsku kemiju

Mentori rada: dr. sc. Irena Škorić, izv. prof., FKIT, Zagrebdr. sc. Ani Radonić, izv. prof., KTF, Split

Broj stranica: 165Broj slika: 48

Broj tablica: 41Broj priloga: 1

Broj literaturnih referenci: 110Datum obrane:

Sastav povjerenstva za obranu: dr. sc. Marijana Hranjec, doc., FKIT, Zagreb

dr. sc. Danijela Ašperger, doc.,FKIT, Zagrebdr. sc. Igor Jerković, red. prof., KTF, Split

Rad je pohranjen u: Knjižnici Fakulteta kemijskog inženjerstva i tehnologije u Zagrebu, Marulićev trg 20; Nacionalnoj i sveučilišnoj biblioteci u Zagrebu, Hrvatske bratske zajednice bb; Biblioteci Sveučilišta u Rijeci, Dolac 1; Biblioteci Sveučilišta u Splitu, Ruđera Boškovića 31 i Biblioteci Sveučilišta u Osijeku, Trg sv. Trojstva 3.

Tema rada je odobrena na sjednici Fakultetskog vijeća Fakulteta kemijskog inženjerstva i

tehnologije u Zagrebu održanoj dana 24. rujna 2012. godine te potvrđena na sjednici Senata

Sveučilišta u Zagrebu održanoj dana 30. listopada 2012. godine.

SAŽETAK

U radu su određivani glukozinolati pet neistraženih ili nedovoljno istraženih samoniklih

biljaka porodice Brassicaceae. Istraživanjem je obuhvaćeno određivanje sadržaja ukupnih

glukozinolata, analiza pojedinačnih glukozinolata te ispitivanje antimikrobnog djelovanja

razgradnih produkata glukozinolata. Ukupni glukozinolati određeni su jednostavnom

spektrofotometrijskom metodom, tzv. fericijanid metodom. Rezultati mjerenja sadržaja

ukupnih glukozinolata su pokazali da sve ispitivane biljke sadrže glukozinolate, ali u

različitim količinama. Pojedinačni glukozinolati su određeni indirektnom metodom, preko

njihovih razgradnih produkata. Kemijski sastav i udio razgradnih produkata glukozinolata

izoliranih iz ispitivanih biljaka u velikoj je mjeri ovisio o metodi razgradnje i izolacije

razgradnih produkata. Kako bi se dobila što potpunija slika o sastavu i sadržaju ovih spojeva

u biljnom materijalu te time, indirektno, odredio profil glukozinolata, korištene su različite

metode razgradnje glukozinolata (toplinska razgradnja, endogena i egzogena hidroliza) i

različite metode izolacije razgradnih produkata (destilacija i ekstrakcija). Određivanjem

antimikrobnog djelovanja razgradnih produkata glukozinolata dvjema metodama, metodom

disk difuzije i određivanjem minimalne inhibicijske koncentracije (MIK metoda), dokazan je

antimikrobni potencijal ispitivanih biljaka.

Ključne riječi: Brassicaceae, glukozinolati, toplinska razgradnja, enzimska hidroliza,

antimikrobna aktivnost

ABSTRACT

In this thesis glucosinolates from five wild-growing unexplored or under - explored

Brassicaceae plants have been determined. The research included determination of total

glucosinolates, analysis of individual glucosinolates and testing of antimicrobial activity of

glucosinolate degradation products. Total glucosinolates are determined by using simple

spectrophotometric method, known also as ferricyanide method. The results of the

measurements of total glucosinolates have shown that all of the researched plants contain

glucosinolates but in different amounts. Individual glucosinolates were determined by using

indirect method, identifying their degradations products. Chemical composition and mass

fraction of glucosinolate degradation products isolated from researched plants depended

largely on the method of degradation and degradation products isolation. In order to obtain

more complete insight of composition and content of these compounds in plant material and

indirectly define glucosinolates profile, different methods of glucosinolate degradation

(thermal degradation, endogenous and exogenous hydrolysis) were used along with different

methods of isolation of degradation products (distillation and extraction). Antimicrobial

potential of researched plants have been proved by using two methods, disc diffusion and

MIC.

Keywords: Brassicaceae, glucosinolates, thermal degradation, enzymatic hydrolysis,

antimicrobial activity

Zahvale

POPIS KRATICA

ATCC američki kontrolni sojevi mikroorganizama (engl. American Type Culture

Collection)

DNK deoksiribonukleinska kiselina

ESP epitiospecifični protein

GC–MS plinska kromatografija – spektrometrija masa (engl. gas chromatography –

mass spectrometry)

GLS glukozinolat

HPLC/DAD tekućinska kromatografija visoke djelotvornosti uz detektor s nizom dioda

(engl. high-performance liquid chromatography - diode array detector)

ITC izotiocijanat

MIK minimalna inhibicijska koncentracija

NADPH nikotinamid-adenin-dinukleotid fosfat

NCCLS Nacionalni komitet za kliničke laboratorijske standarde (engl. National

Committee for Clinical Laboratory Standards)

NIRS bliska infracrvena spektroskopija (engl. near-infrared spectroscopy)

PAPS 3’-fosfoadenozin-5’-fosfosulfat

PMFST Prirodoslovno-matematički fakultet u Splitu

PTFOS Prehrambeno-tehnološki fakultet u Osijeku

R promjenjivi bočni lanac aglukonskog dijela glukozinolata

RI indeks zadržavanja (engl. retention index)

RNK ribonukleinska kiselina

TFP tiocijanat formirajući protein

UDPG uridin-difosfat-glukoza

SADRŽAJ

1. UVOD

2. OPĆI DIO

2.1. Glukozinolati 3

2.1.1. Kemijska struktura i nomenklatura glukozinolata 3

2.1.2. Tipovi glukozinolata 4

2.1.3. Biosinteza glukozinolata 18

2.1.4. Rasprostranjenost glukozinolata u biljnom svijetu 20

2.1.5. Sadržaj glukozinolata u biljkama 23

2.2. Sustav mirozinaza - glukozinolat 23

2.2.1. Neenzimska razgradnja glukozinolata 25

2.2.2. Enzimska razgradnja glukozinolata - hidroliza 27

2.2.2.1. Izotiocijanati 29

2.2.2.2. Nitrili 29

2.2.2.3. Tiocijanati 30

2.2.2.4. Indoli 30

2.3. Biološka aktivnost glukozinolata 32

2.3.1. Antikancerogeno djelovanje 32

2.3.2. Antioksidacijsko djelovanje 35

2.3.3. Antimikrobno i antifugalno djelovanje 35

2.3.4. Toksičnost i antinutritivni učinak glukozinolata 39

2.4. Analiza glukozinolata 39

2.4.1. Određivanje ukupnih glukozinolata 40

2.4.2. Određivanje pojedinačnih glukozinolata 41

2.4.3. Analiza razgradnih produkata glukozinolata 42

3. MATERIJALI I METODE

3.1. Biljni materijali 43

3.1.1. Karakteristike biljnih vrsta porodice Brassicaceae 43

3.1.1.1. Izbor i priprema uzorka 43

3.1.1.2. Jadranska rumenica 43

3.1.1.3. Streličasta grbica 44

3.1.1.4. Sredozemna rusomača 45

3.1.1.5. Nepravilna gorušika 46

3.1.1.6. Čunjasti repušac 47

3.1.2. Kemikalije i aparatura 48

3.2. Metode 50

3.2.1. Određivanje ukupnih glukozinolata 50

3.2.1.1. Priprava potrebnih otopina 50

3.2.1.2. Priprava umjerne krivulje 51

3.2.1.3. Ekstrakcija glukozinolata 52

3.2.1.4. Alkalna hidroliza i reakcija s fericijanidom 52

3.2.2. Priprava i izolacija razgradnih produkata glukozinolata 53

3.2.2.1. Toplinska razgradnja 53

3.2.2.2. Enzimska hidroliza 54

3.2.2.3. GC–MS analiza razgradnih produkata glukozinolata 56

3.2.3. Određivanje antim. aktivnosti razgradnih produkata glukozinolata 58

3.2.3.1. Metoda određivanja min. inhibicijske koncentracije 59

3.2.3.2. Metoda disk difuzije 60

4. REZULTATI

4.1. Ukupni glukozinolati 62

4.1.1. Umjerna krivulja 62

4.1.2. Sadržaj ukupnih glukozinolata 63

4.2. Razgradni produkti glukozinolata 66

4.2.1. Jadranska rumenica 66

4.2.2. Streličasta grbica 73

4.2.3. Sredozemna rusomača 79

4.2.4. Nepravilna gorušika 85

4.2.5. Čunjasti repušac 91

4.3. Antimikrobna aktivnost razgradnih produkata glukozinolata 97

5. RASPRAVA


5.2. Razgradni produkti glukozinolata 111

5.2.1. Jadranska rumenica 111

5.2.2. Streličasta grbica 118

5.2.3. Sredozemna rusomača 124

5.2.4. Nepravilna gorušika 130

5.2.5. Čunjasti repušac 135


6. ZAKLJUČCI


6.2. Pojedinačni glukozinolati 146


7. PRILOZI

7.1. Odabrani kromatogrami na HP – FFAP koloni 151

8. LITERATURA

ŽIVOTOPIS 164

1. UvodPosljednjih godina sve više se povećava svijest nutricionista, prehrambenih tehnologa ali, što

je možda najvažnije, i potrošača o vezi prehrane i zdravlja. Sve više istraživanja dokazuje

pozitivan utjecaj tvari prisutnih u voću i povrću, tzv. fitokemikalija, na zdravlje ljudi.

Biološki aktivni sekundarni metaboliti koji hrani biljnog podrijetla daju boju, aromu (miris i

okus), prirodnu toksičnost za štetnike i uglavnom imaju povoljan utjecaj na ljudsko zdravlje

nazivaju se fitokemikalije ili nutraceutici.1

Glukozinolati (tioglukozidi) su sekundarni biljni metaboliti koji se uz karotenoide,

fenolne spojeve (npr. flavonoide), kumarine i druge spojeve smatraju fitokemikalijama.

Počinju se intenzivno istraživati posljednjih 20-tak godina zbog svojih povoljnih bioloških

učinaka na zdravlje ljudi. Istraživanja su usmjerena ka određivanju sastava, količine,

raspodjele glukozinolata u biljkama, njihove fiziološke uloge te posebice potencijalnog

biološkog djelovanja. Značajnu ulogu pri tome imaju metode određivanja ukupnih i

pojedinačnih glukozinolata te produkata njihove razgradnje.

Sami glukozinolati su fiziološki neaktivni. Tek njihovom razgradnjom, koja može biti

enzimska ili neenzimska (kemijska, toplinska), oslobađaju se raznovrsni hlapljivi spojevi koji

pokazuju čitav niz bioloških aktivnosti: djeluju kao antioksidansi, antibakterijski, antivirusno,

protuupalno, jačaju imunološki sustav i omogućavaju stanični popravak.2

Glavni izvor glukozinolata u ljudskoj prehrani su kultivirane biljke iz porodice

Brassicaceae (kupus, brokula, prokula, cvjetača, rotkvica, rukola i brojne druge). Osim ovih

kultiviranih biljaka, koje su uglavnom dosta istražene, u biljnoj porodici Brassicaceae se

nalazi i brojno samoniklo bilje, karakteristično za naše područje, koje je nedovoljno istraženo

ili uopće nije istraženo.

U disertaciji će se istraživati glukozinolati prisutni u 5 neistraženih ili nedovoljno

istraženih samoniklih biljaka porodice Brassicaceae: jadranske rumenice (Aurinia leucadea

(Guss.) K. Koch ), streličaste grbice (Cardaria draba (L.) Desv.), sredozemne rusomače

(Capsella rubella Reut.), nepravilne gorušike (Calepina irregularis (Asso) Thell.) i čunjastog

repušca (Bunias erucago L.).

Korištenjem spektrofotometrijske metode, uobičajenog naziva fericijanid metoda,

odredit će se sadržaj ukupnih glukozinolata u biljkama. Pojedinačni glukozinolati odredit će

se indirektnom metodom analize glukozinolata koja se sastoji od njihove razgradnje

(toplinske i enzimske), izolacije nastalih razgradnih produkata različitim metodama te njihove

analize spregnutom tehnikom plinska kromatografija-spektrometrija masa (GC/MS).

Metodama disk-difuzije i određivanja minimalne inhibicijske koncentracije (MIK metoda)

ispitat će se antimikrobno djelovanje izoliranih razgradnih produkata glukozinolata.

Očekuje se da će korištenje različitih pristupa u analizi omogućiti potpuniji uvid u

sastav i udio razgradnih produkata glukozinolata te time doprinijeti proširivanju znanja o

sastavu i sadržaju glukozinolata u ovim, neistraženim ili nedovoljno istraženim, biljkama.

Nadalje, očekuje se da će rezultati antimikrobnog djelovanja razgradnih produkata

glukozinolata doprinijeti istraživanjima prirodnih spojeva u cjelini kao mogućih

antimikrobnih agensa te biti poticaj njihovoj upotrebi. Osim toga, istraživanje će omogućiti

odabir metodologije priprave uzoraka s najboljim antimikrobnim djelovanjem.

2. Opći dio

2.1. Glukozinolati

Glukozinolati su sekundarni biljni metaboliti koji se u živim organizmima sintetiziraju iz

aminokiselina. Pronađeni su u 16 porodica reda Capparales. Najveće količine glukozinolata

nalaze su u biljkama iz tri porodice ovog reda: Resedaceae, Capparaceae i Brassicaceae. Za

čovjeka je, možda, najznačajnija porodica Brassicaceae jer u nju spada većina kultiviranih

biljaka koje sadrže glukozinolate, a koje koristimo u svakodnevnoj prehrani.

Posljednjih godina glukozinolati i njihovi razgradni produkti postaju vrlo interesantni

istraživačima zbog svojih nutritivnih i antinutritivnih svojstava, karakteristične arome koju

daju povrću te biološke aktivnosti koju pokazuju njihovi razgradni produkti.

Sami glukozinolati su biološki neaktivni spojevi. Tek oštećenjem biljnog tkiva

prouzrokovanog raznim štetnicima, žetvom, industrijskom obradom hrane, sjeckanjem i

žvakanjem, glukozinolati dolaze u kontakt s endogenim enzimom mirozinazom pri čemu

nastupa njihova hidroliza i nastaje niz biološki aktivnih spojeva kao što su izotiocijanati,

nitrili, tiocijanati i oksazolidintioni. Neki od nastalih razgradnih produkata su štetni dok neki

posjeduju antioksidacijska, antimikrobna, antifugalna pa čak i antikancerogena svojstva.3

2.1.1. Kemijska struktura i nomenklatura glukozinolata

Prvi poznati glukozinolati, sinigrin i glukosinalbin, izolirani su iz sjemena crne i bijele

gorušice 1830. godine, što je označilo početak istraživanja ove skupine prirodnih organskih

spojeva. Na osnovu elementne analize te analize produkata njihove razgradnje Gadamer je

1897. godine predložio opću strukturnu formulu glukozinolata. Iako netočna, predložena

struktura se zadržala do 1956. godine kada su Ettlinger i Lundeen predložili novu, točnu,

strukturu i opisali prvu sintezu glukozinolata.3

Glukozinolati su grupa organskih aniona koji se iz biljaka izoliraju kao kalijeve i

natrijeve soli. Zajedničke strukturne karakteristike svojstvene svim glukozinolatima jesu da se

sastoje od -D-tioglukozidnog dijela, sulfatne skupine koja je preko C=N skupine vezana za

ostatak molekule (sulfoniranog oksima) i bočnog lanca (označenog s R u općoj strukturnoj

formuli) po kojem se glukozinolati međusobno razlikuju (Slika 1.). Bočni lanac glukozinolata

je promjenjiv i osnova je njihove strukturne raznolikosti te biološke aktivnosti produkata koji

nastaju njihovom enzimskom ili neenzimskom razgradnjom.

Slika 1. Opća struktura glukozinolata

Pri imenovanju glukozinolata najčešće se koriste trivijalna imena nastala od latinskog

imena biljke iz koje je glukozinolat prvi put izoliran i dodavanjem prefiksa ”gluko” i sufiksa

“in”. 1961. godine Ettlinger i Dateo predložili su današnju polusustavnu nomenklaturu po

kojoj se nazivu “glukozinolat” dodaje prefiks koji se odnosi na sustavnu nomenklaturu

bočnog lanca (R; npr. benzil glukozinolat).4

2.1.2. Tipovi glukozinolata

Do 2001. godine identificirano je oko 120 glukozinolata (Tablica 1).3 U međuvremenu su

intenzivirana istraživanja glukozinolata što je rezultiralo povećanjem broja identificiranih

struktura pa je danas poznato oko 200 glukozinolata.5,6,7

S obzirom na strukturne sličnosti bočnog lanca (R) glukozinolati se najjednostavnije mogu

podijeliti na alifatske, aromatske i heterocikličke (indolne) glukozinolate, koji su i najviše

istraživani.8 Detaljna strukturna podjela glukozinolata prikazana na sljedećim stranicama

(str.4.-12.) preuzeta je iz preglednih radova Faheya i sur. i Clarka.3,7 Brojčane oznake

pojedinih struktura odgovaraju rednim brojevima u Tablici 1. preuzetoj iz preglednog rada

Faheya i sur., a strukture bez brojčanih oznaka preuzete su iz preglednog rada Clarka.

A: Glukozinolati sa sumporom u bočnom lancu

metiltioalkil- metilsulfinilalkil- metilsulfonilalkil-__________________________________________________________n CH3S(CH2)n-X CH3SO(CH2)n-X CH3SO2(CH2)n-X__________________________________________________________

2 86 - -

3 95 73 82

4 84 64 76

5 94 72 81

6 88 67 78

7 87 66 -

8 92 69 80

9 89 68 79

10 85 65 77

11 - 74 -

12 - 63 -

__________________________________________________________

tiohidroksialkil- sulfinilhidroksialkil- sulfonilhidroksialkil-

S

OH

X

S

OH

X

S

OH

X

S

OH

X

OO

S

OH

X

S

OH

X

OO

O

O

35

34

33

32

37

36

tiooksoalkil- sulfiniloksoalkil-

S

O

X

S

O

X

O

XS

S

O

X

O

XS

OO

91

90

93

70

71

tioalken- sulfinilalken- sulfonilalken-

SX

SX

O

S X

S

O

O

X

SX

O

O

75

83 63

merkaptoalkil- cisteintioalkil-

HS

O

XSHO

O

NH2

X

disulfanil-

SX

OHO

HO

OH

HOH2C

S

SX

2

HO NS

S

O O

NH2H

X

NOH

OH

O

HO SS

O

NH2

X

B: Alifatski glukozinolati, C: Alifatski glukozinolati,

nerazgranatih bočnih lanaca razgranatih bočnih lanaca

X 16

X 108

X 13

X 102

X 20

X

X

X

X 56

X 61H

X 62

X

X 51

X 53

X 54

X 55

X 58

X 59

X

D: Olefinski glukozinolati:

razgranatih i nerazgranatih lanaca alkoholi

HO

OH

HO

OHX 107

X 60

X 12

X 52

X

X 100

X 101

X 19

X 18

38

X

X

24 a

X

24 b

X

X

X

E: Alifatski razgranati i F: Alifatski ketoni i esteri

nerazgranati alkoholi

HO

HO

HO

HO

HO

OH

X

OH

X

OH

X

OH

X

HO

XHO

X

HOX HO

X

OH

X

OH OH

OH OH

X

O

O

O

O

O

O

O

X 99

X 96

X 97

X 98

X 1

X 27

X 42

X 26

41 25

3930

57

1731

29

113

O

X

X

X

X

G: Aromatski glukozinolati

XX

MeO

X

OH

X

OH

X

HO

X

OMe

X

OMe

MeO

X X

OH

HO

X

OMe

MeO

X

OMe

MeO

MeO

X

HO

X

OH

MeO

104 46 21

22

32

45

49

14 15

44

114

4050

MeO

X

MeO

X

OH

HO

XX

HO

OMe

X

OH

HO

H: Benzoati

O

O

XO

O

Xn

9

O

O

X7

I: Indolni glukozinolati

N

H

X

N

H

XOMe

N

OH

X

N

H

XOH

N

OCCH3

X

N

OMe

XOMe

4348

282

N

OMe

X

47 N

OSO3

XOMe

112 _

n1 82 63 104 55 1176 1187 -

8 -

J: Glikozilirani glukozinolati

OOH

HOOH

X

O

109

OOHHO

HOO

4

X

Osim s obzirom na strukturne sličnosti bočnog lanca glukozinolati se mogu razlikovati

i prema supstituentima na glukonskom dijelu (npr. cimetni i benzoilni glukozinolati), a u

novije vrijeme se spominju i tzv. „seleno glukozinolati“ kod kojih je glukonski i aglukonski

dio molekule umjesto sumporom povezan selenom (Slika 2.)

O

O

O OHOH

HOS

H3CS

C

N

OSO3

-

O

OCH3

HO

H3CO

111

a) cimetni glukozinolati

O

HOOH

O

OHS

NOSO3H

S

O

b) benzoilni glukozinolati

O

HOOH

OH

OHSe

NOSO3H

c) seleno glukozinolati

Slika 2. Primjeri: a) cimetnog, b) benzoilnog i c) seleno glukozinolata

Najbrojniji glukozinolati su oni koji sadrže nerazgranate ili razgranate alifatske bočne

lance. Mnogi od njih u bočnom lancu sadrže dvostruke veze (olefini), hidroksilne ili

karbonilne skupine te kovalentno vezani sumpor. Najveća pojedinačna grupa (jedna trećina

svih glukozinolata) u bočnom lancu sadrži atom sumpora koji može biti različitog

oksidacijskog stupnja (primjerice metiltioalkil-, metilsulfinilalkil- ili metilsulfonilalkil-).

Mala grupa benzil glukozinolata sadrži dodatnu molekulu ugljikohidrata, ramnoze ili

arabinoze, glikozidno vezanu za aromatski prsten. Iako nije utvrđena funkcija tih

ugljikohidrata, zanimljivo je da su ovakvi glukozinolati prisutni u biljnim vrstama iz porodica

Moringaceae i Resedaceae široko korištenih zbog svojih farmakoloških svojstava. 9

Tablica 1. Sustavna nomenklatura i trivijalna imena glukozinolata identificiranih u

višim biljkama. Tablicom je obuhvaćeno 120 glukozinolata, koliko je bilo

poznato do 2001. godine (Fahey i sur.; 2001.). 3

Red. br.a Grupa b Sustavna nomenklatura Trivijalno ime

bočnog lanca (R) glukozinolata

1 F 3-Metoksikarbonilpropil- Glukoeripestrin

2 I 1-Acetil-indol-3-ilmetil- 1-Acetil-glukobrasicin

3 J 4-(4'-O-Acetil-α-L-ramnopiranoziloksi)benzil-

4 J 2-( α-L-Arabinopiranoziloksi)-2-feniletil

5 H 4-(Benzoiloksi)butil-

6 H 2-(Benzoiloksi)etil-

7 H 2-Benzoiloksi-1-etiletil- Glukobenzosisaustricin

8 H Benzoiloksimetil-

9 H 2-Benzoiloksi-1-metiletil- Glukobenzosisimbrin

10 H 3-(Benzoiloksi)propil- Glukomalkomiin

11 G Benzil- Glukotropeolin

12 D 3-Butenil- Glukonapin

13 B Butil-

14 G 3,4-Dihidroksibenzil- Glukomatronalin

15 G 3,4-Dimetoksibenzil-

16 B Etil- Glukolepidiin

17 E 1-Etil-2-hidroksietil- Glukosisaustricin

18 D 6-Heptenil-

19 D 5-Heksenil-

20 B Heksil-

21 G 2-Hidroksibenzil-

22 G 3-Hidroksibenzil- Glukolepigramin

23 G 4-Hidroksibenzil- (Gluko)sinalbin

24 a D (2R)-2-Hidroksi-3-butenil- Progoitrin

24 b D (2S)-2-Hidroksi-3-butenil- Epiprogoitrin

25 E 3-Hidroksibutil-

26 E 4-Hidroksibutil-

27 E 2-Hidroksietil-

28 I 4-Hidroksiindol-3-ilmetil- 4-Hidroksiglukobrasicin

29 E 2-Hidroksi-2-metilbutil- Glukokleomin

30 E 1-(Hidroksimetil)propil-

31 E 2-Hidroksi-2-metilpropil Glukokonringiin

32 A 3-Hidroksi-6-(metilsulfinil)heksil-

33 A 3-Hidroksi-5-(metilsulfinil)pentil-

34 A 3-Hidroksi-6-(metilsulfonil)heksil-

35 A 3-Hidroksi-5-(metilsulfonil)pentil-

36 A 3-Hidroksi-6-(metiltio)heksil-

37 A 3-Hidroksi-5-(metiltio)pentil-

38 D 2-Hidroksi-4-pentenil- (Gluko)napoleiferin

39 E 2-Hidroksipentil-

40 G (2R)-Hidroksi-2-feniletil- Glukobarbarin

41 E 2-Hidroksipropil-

42 E 3-Hidroksipropil-

43 I Indol-3-ilmetil- Glukobrasicin

44 G 2-Metoksibenzil-

45 G 3-Metoksibenzil- Glukolimnantin

46 G 4-Metoksibenzil- Glukoaubrietin

47 I 1-Metoksiindol-3-ilmetil- Neoglukobrasicin

48 I 4-Metoksiindol-3-ilmetil- 4-Metoksiglukobrasicin

49 G 2-(4-Metoksifenil)-2,2-dimetiletil

50 G 2-(4-Metoksifenil)-2-hidroksietil

51 B Metil- Glukokaparin

52 D 3-Metil-3-butenil-

53 C 1-Metilbutil-

54 C 2-Metilbutil-

55 C 3-Metilbutil-

56 C 1-Metiletil- Glukoputranjivin,

izopropil-

57 E 1-Metil-2-hidroksietil- Glukosisimbrin

58 C 3-Metilpentil-

59 C 4-Metilpentil-

60 D 2-Metil-2-propenil-

61 C 1-Metilpropil- Glukokohlearin,

Glukojiabutin, sec-butil-,

2-butil-

62 C 2-Metilpropil- Izobutil

63 A 4-Metilsulfinil-3-butenil- Glukorafenin

64 A 4-(Metilsulfinil)butil- Glukorafanin

65 A 10-(Metilsulfinil)decil- Glukokamelinin

66 A 7-(Metilsulfinil)heptil- Glukoibarin

67 A 6-(Metilsulfinil)heksil- Glukohesperin

68 A 9-(Metilsulfinil)nonil- Glukoarabin

69 A 8-(Metilsulfinil)oktil- Glukohirsutin

70 A 7-Metilsulfinil-3-oksoheptil-

71 A 8-Metilsulfinil-3-oksooctil-

72 A 5-(Metilsulfinil)pentil- Glukoalisin

73 A 3-(Metilsulfinil)propil- Glukoiberin

74 A 11-(Metilsulfinil)undecil-

75 A 4-Metilsulfonil-3-butenil-

76 A 4-(Metilsulfonil)butil- Glukoerisolin

77 A 10-(Metilsulfonil)decil-

78 A 6-(Metilsulfonil)heksil-

79 A 9-(Metilsulfonil)nonil-

80 A 8-(Metilsulfonil)oktil

81 A 5-(Metilsulfonil)pentil-

82 A 3-(Metilsulfonil)propil- Glukoheirolin

83 A 4-Metiltio-3-butenil- Dehidroerucin

84 A 4-(Metiltio)butil- Glukoerucin

85 A 10-(Metiltio)decil-

86 A 2-(Metiltio)etil- Glukoviorilin

87 A 7-(Metiltio)heptil-

88 A 6-(Metiltio)heksil- Glukoleskverelin

89 A 9-(Metiltio)nonil-

90 A 7-Metiltio-3oksoheptil-

91 A 6-Metiltio-3-oksoheksil-

92 A 8-(Metiltio)oktil-

93 A 8-Metiltio-3-oksooktil-

94 A 5-(Metiltio)pentil- Glukoberteroin

95 A 3-(Metiltio)propil- Glukoiberverin

96 F 4-Oksoheptil- Glukokapangulin;

glukopangulin

97 F 5-Oksoheptil Glukonorkapasalin

98 F 5-Oksooktil- Glukokapasalin

99 F 4-Oksopentil-

100 D 1-Pentenil-

101 D 4-Pentenil- Glukobrasikanapin

102 B Pentil-

103 G Fenil-

104 G 4-Fenilbutil-

105 G 2-Feniletil- Glukonasturtiin; fenetil-

106 G 3-Fenilpropil-

107 D 2-Propenil- Sinigrin; alil-

108 B Propil-

109 J 2-(α-L-Ramnopiranoziloksi)benzil-

110 J 4-(α-L-Ramnopiranoziloksi)benzil-

111 J 4-Metilsulfinilbut-3-enil-6-sinapoil-β-D-1-

tioglukozid

112 I 1-Sulfo-indol-3-ilmetil- Glukobrasicin-1-sulfat

113 E 4,5,6,7-Tetrahidroksidecil-

114 G 3,4,5-Trimetoksibenzil-

115 c "izo"-Heptil-

116 c "izo"-Heksil-

117 H 5-(Benzoiloksi)pentil-

118 H 6-(Benzoiloksi)heksil-

119 d 3-O-Apiozilglukomatronalin

120 d 3-O-Apiosilglukomatronalin 3,4-dimetoksibenzoil

ester

a Brojevima označene strukture prikazane su na str. 4.-12. b Klasifikacija glukozinolata na osnovu strukturne sličnosti (str. 4.-12.). c Strukture nisu okarakterizirane u potpunosti. d Identifikacija ovih spojeva navedena je u publikaciji Larsena i suradnika (1992).10

2.1.3. Biosinteza glukozinolata

Biosinteza glukozinolata se istražuje od 60-tih godina 20. stoljeća i do danas je poznata većina

međuprodukata, enzima i gena koji sudjeluju u biosintezi. Istraživanja provedena na model

biljci Arabidopsis thaliana omogućila su napredak i olakšala istraživanja. Kjaer i Conti su

predpostavili da su aminokiseline prekursori (preteče) aglikonskog dijela molekule

glukozinolata, što su temeljili na sličnosti između ugljikovog skeleta nekih aminokiselina i

glukozinolata.11 Njihova hipoteza je dokazana korištenjem različitih, radioktivnim izotopima

obilježenih spojeva (1H, 14C, 15N ili 35S), odnosno njihovim unošenjem u biljke i procjenom

učinkovitosti kao prekursora na temelju ugradnje izotopa u molekulu glukozinolata.

Smatra se da su proteinske aminokiseline alanin, metionin, valin, leucin i izoleucin

prekursori alifatskih glukozinolata, fenilalanin i tirozin aromatskih, a triptofan indolnih

glukozinolata.8 Naročito veliki broj glukozinolata nastaje brojnim metaboličkim

transformacijama metionina kao aminokiselinskog prekursora ovih spojeva.

Biosinteza glukozinolata iz aminokiselina može se podijeliti u tri neovisna stupnja.

Glukozinolati se s obzirom na biosintetsko podrijetlo mogu podijeliti na glukozinolate nastale

iz uobičajenih aminokiselina i glukozinolate nastale iz aminokiselina modificiranih

produljenjem bočnog lanca. Modifikacija aminokiseline sastoji se od produljenja (elongacije)

lanca alifatske ili aromatske aminokiseline umetanjem metilenske skupine u njihove bočne

lance, što predstavlja prvi stupanj u biosintezi. U modifikaciju aminokiselina su uključeni

različiti enzimi. Početna aminokiselina se deaminira stvarajući odgovarajuću 2-okso kiselinu.

Slijedi kondenzacija s acetil-CoA, izomerizacija i na kraju oksidacija i dekarboksilacija pri

čemu nastaje 2-okso kiselina s jednom metilenskom skupinom više od početne aminokiseline.

Ovi koraci se mogu ponavljati, a rezultat svakog, dodatnog, elongacijskog kruga je okso-

kiselina s jednom metilenskom skupinom više.12

Drugi stupanj je metabolička modifikacija aminokiseline, ili njenog derivata

produljenog lanca, koja se odvija preko niza međuprodukata koji su identični za sve

glukozinolate (Slika 3.). Prvi korak u tom procesu je pretvorba aminokiseline u aldoksim koju

kataliziraju različiti enzimi (npr. citokrom P450 monooksigenaze, flavin ovisne

monooksigenaze i peroksidaze). Međuprodukti između aldoksima i tiohidroksimata još uvijek

nisu identificirani. Predpostavlja se da su to nitro spoj (nastao oksidacijom aldoksima) i S-

alkiltiohidroksimat (akceptor sumpora najvjerojatnije iz cisteina). S-alkiltiohidroksimat se

cijepa i nastaje tiohidroksimat, a reakciju katalizira enzim CS liaza. Konačni korak drugog

stupnja biosinteze je glukozilacija i nastajanje desulfoglukozinolata te sulfatacija do

glukozinolata.4,12

Nastali osnovni glukozinolat podliježe nizu daljnjih sekundarnih modifikacija bočnog

lanca (R) koje uključuju reakcije oksidacije, hidroksilacije, alkenilacije, acilacije ili

esterifikacije. Bočni lanac glukozinolata koji potječu od aminokiseline metionina posebno je

sklon daljnim modifikacijama kao što su postupna oksidacija atoma sumpora u

metiltioalkilnom bočnom lancu u metilsulfinilalkil ili metilsulfonilalakil. Metilsulfinilalkil

bočni lanci mogu se dalje modificirati oksidacijskim cijepanjem u alkenil i hidroksialkenil

lance. Ove reakcije su biološki i biokemijski važne jer utječu na smjer hidrolize glukozinolata

i aktivnost razgradnih produkata hidrolize. 4,12

Sposobnost biosinteze glukozinolata korištena je uspješno kao taksonomski važan

marker u rješavanju filogenetskih problema.13-16 Tako je, primjerice, prisustvo metil

glukozinolata, koji nije pronađen kod Brassicaceae vrsta, karakteristično za srodne

Capparaceae vrste, dok su glukozinolati sa glikoziliranom R skupinom nađeni samo u biljnim

vrstama iz porodica Resedaceae i Moringaceae. Iako je ideja o specifičnosti prisustva

pojedinih glukozinolata kod različitih taksona intrigantna, ovaj pristup nije naročito razrađen.9

R COOHCH

NH2

NADPH+, O2 C

NOH

HNADPH+, O2R CH2 C

NOH

HR CH2

O

cistein C

NOH

R CH2S CH2 COOHCH

NH2

C

NOH

R CH2SH

aminokiselina aldoksimnitro spoj

S-alkiltiohidroksimat tiohidroksimat

UDPG C

NOH

R CH2S Glu PAPS

C

NO

R CH2S Glu

SO3-

desulfoglukozinolat glukozinolat

Slika 3. Pojednostavljena opća shema 2. stupnja biosinteze glukozinolata

(R, promjenjivi bočni lanac; NADPH, nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat;

UDPG, uridin-difosfat-glukoza; PAPS, 3'-fosfoadenozin-5'-fosfosulfat)

2.1.4. Rasprostranjenost glukozinolata u biljnom svijetu

Glukozinolati su identificirani u 16 botaničkih porodica reda Capparales, posebice u

porodicama Rosedaceae, Capparaceae i Brassicaceae, gdje su prisutni u relativno visokim

koncentracijama (Tablica 2.).

Tablica 2. Porodice kod kojih je utvrđena prisutnost glukozinolata (Fahey i sur..; 2001.)3

Brojčane oznake glukozinolata (treći stupac) odgovaraju rednim brojevima u

Tablici 1.

Porodica Grupa glukozinolata Glukozinolati

Bataceae I 28, 43

Brassicaceae A-J 1, 5-20, 22-26, 28-48,

50, 51, 53-69, 72-84, 86-

89, 91-95, 99-107, 111,

112, 114

Bretschneideraceae E, G 14, 31

Capparaceae A, B, C, D, E, F, G, I 12,13, 23, 24, 28, 29, 43,

47, 48, 51, 52, 54, 56,

73, 96-98, 107, 108

Caricaceae G 11

Euphorbiaceae C, E 26, 29, 56

Gyrostemonaceae C 61, 62

Limnanthaceae E, G 31, 45

Moringaceae C, E, G, J 3, 11, 23, 31, 56, 61, 62,

110

Pentadiplandraceae G 11, 49

Phytolaccaceae C, E, G 11, 22, 23, 29, 61

Pittosporaceae G 23

Resedaceae E, G, I, J 4, 11, 21-23, 31, 40, 43,

47, 105,109

Salvadoraceae C, G 11, 23, 56

Tovariaceae C 2, 11, 43, 47, 56

Tropaeolaceae B, C, E, G 11, 16, 23, 31, 46, 56,

61, 62

Među više od 350 rodova i 3000 vrsta koje sadrži porodica Brassicaceae rod Brassica je

najviše ispitivan jer sadrži veliki broj vrsta koje ljudi konzumiraju u svakodnevnoj prehrani

(Tablica 3.).

Tablica 3. Uobičajeni glukozinolati u povrću roda Brassica

Trivijalno ime glukozinolata Sustavna nomenklatura bočnog lanca (R)

Alifatski glukozinolati

Glukoiberin 3-(metilsulfinil)propil

Progoitrin 2-hidroksi-3-butenil

Sinigrin 2-propenil

Glukonapoleiferin 2-hidroksi-4-pentenil

Glukorafanin 4-(metilsulfinil)butil

Glukoalisin 5-(metilsulfinil)pentil

Glukokaparin metil

Glukobrasikanapin 4-pentenil

Glukokeirolin 3-(metilsulfonil)propil

Glukoiberverin 3-(metiltio)propil

Glukonapin 3-butenil

Indolni glukozinolati

4-Hidroksiglukobrasicin 4-hidroksiindol-3-ilmetil

Glukobrasicin indol-3-ilmetil

4-Metoksiglukobrasicin 4-metoksiindol-3-ilmetil

Neoglukobrasicin 1-metoksiindol-3-ilmetil

Aromatski glukozinolati

Glukosinalbin p-hidroksibenzil

Glukotropaeolin benzil

Glukonasturtin 2-feniletil

2.1.5. Sadržaj glukozinolata u biljkama

Glukozinolati se nalaze u svim djelovima biljke, ali u različitim koncentracijama i oblicima.

U većini biljaka su u najvećoj koncentraciji prisutni u sjemenu. Sadržaj glukozinolata u nekim

dijelovima biljki roda Brassica iznosi oko 1% s obzirom na masu suhe tvari, mada sadržaj

može biti promjenjiv i dostići čak 10% u sjemenu.17-19 Najčešće biljka sadrži 2-5 različita

glukozinolata, međutim može ih biti i znatno više, primjerice u lišću i sjemenu više podvrsta

biljke Arabidopsis thaliana identificirana su čak 34 različita glukozinolata.7,20-22 Koncentracija

i vrsta glukozinolata u biljci ovise o biljnoj vrsti i starosti, dijelu biljke iz kojeg su izolirani,

prisutnosti štetnika, nutrijentima, klimi i ostalim uvjetima za vrijeme rasta biljke.12

2.2. Sustav mirozinaza-glukozinolat

Poznato je da sve biljke koje sadrže glukozinolate sadrže i enzime koji ih hidroliziraju -

mirozinaze. Mirozinaza je trivijalno ime za tioglukozid-glukohidrolazu (EC 3.2.3.1) enzim,

točnije grupu enzima, koji kataliziraju hidrolizu glukozinolata. Kinetika enzimske reakcije

razlikuje se od vrste do vrste, pa čak i unutar pojedine vrste (budući da se i u istoj vrsti može

naći više formi ovog enzima).23

Osim biljnih postoje gljivične24,25 i bakterijske26a mirozinaze. Priroda i specifičnosti

bakterijskih tioglukozidaza manje je istraživana od biljnih, ali su među njima ipak uočene

neke razlike. Primjerice, smatra se da askorbat inhibira bakterijsku tioglukozidazu (npr. u

sojevima Paracolobacterium i Enterobacter) dok je kod biljnih enzima upravo askorbat

aktivator.26b,27 Glukozinolate unesene u organizam u obliku kuhane hrane (npr. kuhano

povrće) tj. bez prisustva aktivne mirozinaze, može hidrolizirati β-glukozidaza iz crijevne

flore.12

Prisustvo mirozinaza u biljkama ustanovljeno je 1840. godine kada je A. Bussy

proučavajući glukozinolate biljke B. nigra otkrio ''albuminu sličnu'' supstancu koja sudjeluje u

hidrolizi glukozinolata sinigrina. Nakon toga je aktivnost mirozinaze detektirana u svim

istraživanim biljkama koje sadrže glukozinolate.28

O unutarstaničnoj lokalizaciji mirozinaze, posebice u odnosu na lokalizaciju

glukozinolata, raspravljalo se godinama. U početku se smatralo da je mirozinaza

najvjerojatnije smještena u tzv. "mirozinskim stanicama". Te su stanice nađene u sjemenu,

parenhinskom tkivu, epidermu i u zaštitnim stanicama. Brojni ih autori smatraju značajnima s

taksonomskog stajališta pa pojava i raspored mirozinskih stanica služi kao jedan od kriterija

za klasifikaciju biljaka reda Capparales.

Podaci o lokalizaciji glukozinolata u vakuolama dobiveni subcelularnim

frakcioniranjem mirozinskih stanica korijena hrena poslužili su autorima Lüthy i Matile 1984.

godine za tzv. the mustard oil bomb hypothesis.29 Prema toj hipotezi glukozinolati se nalaze u

mirozinskim zrncima mirozinskih stanica, a mirozinaza u citoplazmi - čime se objašnjava

zašto se glukozinolati hidroliziraju tek kad se biljno tkivo ošteti. Kasnijim radovima je ova

teorija dijelom pobijena. Utvrđeno je da se enzimi nalaze u unutrašnjosti mirozinskih zrnaca,

glavnih organela mirozinskih stanica, a glukozinolati u proteinskim tijelima (vakuolama) u

nemirozinskim stanicama. Zajedničko obima teorijama je da se glukozinolati i mirozinaze

nalaze odvojeni.30

Oštećenjem biljnih stanica (npr. sjeckanjem, žvakanjem) glukozinolati i enzim dolaze

u kontakt te nastupa hidroliza glukozinolata. U reakciji hidrolize cijepa se veza sumpor -

glukoza (tioglukozidna veza) u molekuli glukozinolata te se oslobađaju glukoza, sulfat i

aglikon. Oslobođeni aglikon je nestabilan te se spontano pregrađuje dajući različite razgradne

produkte odgovorne za karakterističan okus i miris ovih biljaka.

Razgradni produkti glukozinolata pokazuju niz bioloških aktivnosti od antimikrobnog,

antioksidacijskog do antikancerogenog djelovanja. Smatra se da glukozinolati i njihovi

razgradni produkti djeluju i kao dio obrambenog mehanizma biljke protiv napada insekata te

da se djeluju kao fagostimulatori. Budući da su toksični za neke insekte istražuje se

mogućnost njihova korištenja kao prirodnih pesticida. Tome u prilog ide i njihovo

alelopatsko djelovanje.3,4,12

2.2.1. Neenzimska razgradnja glukozinolata

Glukozinolati se razgrađuju na sastavne dijelove hidrolizom, enzimskom ili kemijskom, ali i

pod utjecajem povišene temperature (toplinski). Kemijskom (neenzimskom) razgradnjom

glukozinolata nastaju različiti produkti ovisno o uvjetima. Tako, pri povišenoj temperaturi i u

jako kiselim uvjetima glukozinolati se razgrađuju na karboksilnu kiselinu i glukozu, a u

lužnatim uvjetima nastaju aminokiseline i tioglukoza. Gadamer (1897.) je bio jedan od prvih

znanstvenika koji je na prop-2-en-1-il glukozinolatu (sinigrinu) istraživao kemijsku

razgradnju glukozinolata (Slika 4.).

Obnovljeni interes za glukozinolate doveo je do izolacije sulforafena i odgovarajućeg

nitrila iz sjemena rotkvice (Schmid i Karrer, 1948. ). Početni glukozinolat, 4-

(metilsulfinil)but-3-enil glukozinolat, pročišćen je i preveden u srebrov derivat te razgrađen sa

natrijevim tiosulfatom što je rezultiralo nastajanjem 4-(metilsulfinil)but-3-enil-izotiocijanata, i

u manjoj količini odgovarajućeg nitrila. Slično, pronađeno je da srebrov derivat benzil

glukozinolata kiselom ili alkalnom hidrolizom daje 2-fenilacetonitril (Schmid i Karrer,

1948.).

O

H

HO

H

S

OH

H

HO

H

OH

H NOSO3-K+

KOH (aq)

gorušičino ulje,alilnitril, NH3

BaCl2 BaSO4+S+KCl+

CN COOHHCl (aq)

glukoza+K(NH4)SO4+ (NH4)2S + H2N

NH2

Ba(OH)2 (aq)BaSO4 + Ba-kompleks NH3

AgNO3 (aq)

AgS

NOSO3-Ag+

CN

NCS

+ AgS

+ AgS

H2S

Na2S2O3

Slika 4. Kemijska razgradnja prop-2-en-1-il glukozinolata (preuzeto i prilagođeno iz

Bones & Rositer, 2006.)31

S obzirom na važnost glukozinolata u ljudskoj prehrani, posebno s obzirom na njihovo

antikancerogeno djelovanje, nedovoljan je broj radova koji se odnosi na istraživanje toplinske

razgradnje glukozinolata. MacLeod i sur. (1981.) su proučavali toplinsku razgradnju

glukozinolata pri različitim temperaturama kolona i injektora plinskog kromatografa.

Njihovo istraživanje je jedno od prvih koje je pokazalo da izotiocijanati nastaju i neenzimski.

Naime, pronađeno je da se na temperaturi od 200 °C prop-2-en-1-il glukozinolat razgradio

dajući 44% nitrila i 32% izotiocijanata, dok se benzil glukozinolat razgradio dajući 63%

nitrila i 13% izotiocijanata. Istraživanjem toplinske razgradnje indolnih glukozinolata

(Slominski i Campbell, 1988., 1989.) je zabilježeno uglavnom nastajanje tiocijanata i

indolilacetonitrila za razliku od razgradnje endogenom hidrolizom (autolizom) kojom

uglavnom nastaju tiocijanati i karbinoli, a tek u maloj količini indolilacetonitrili.31

2.2.2. Enzimska razgradnja glukozinolata - hidroliza

Enzimsku razgradnju glukozinolata katalizira enzim mirozinaza pri čemu nastaju glukoza -

glukon i nestabilni međuprodukt - aglukon. Aglukon se spontano pregrađuje pri čemu nastaju

različiti razgradni produkti (Slika 5.). Vrsta razgradnih produkata ovisi o strukturi bočnog

lanca, prisustvu kofaktora i uvjetima hidrolize. Produkti hidrolitičke razgradnje glukozinolata

značajno doprinose tipičnoj aromi povrća roda Brassica. Glukozinolati se često nazivaju i

prekursorima izotiocijanata i tiocijanata, spojeva koji sadrže sumpor te nitrila i indola,

spojeva koji ne sadrže sumpor u svojoj strukturi. Pri tom su izotiocijanati i indoli najpoznatiji

biološki aktivni spojevi koji nastaju enzimskom hidrolizom glukozinolata.

Pri pH 7 dolazi do Lössenove pregradnje i kao glavni razgradni produkti nastaju

reaktivni, hlapljivi i mirisni izotiocijanati. Pri pH < 4 glavni razgradni produkti su nitrili. U

prisustvu fero-iona (Fe2+) nitrili su glavni razgradni produkti pri svim pH vrijednostima.

Nastajanje tiocijanata je također moguće, a ono ovisi o strukturi bočnog lanca aglukona (npr.

alil, benzil). Ako je u bočnom lancu aglukona prisutna terminalna dvostruka veza, u prisustvu

Fe2+- iona i epitiospecifičnog proteina, nastaju epitionitrili. Alifatski glukozinolati koji imaju

sumpor u bočnom lancu hidrolizom daju izotiocijanate i nitrile.8

Slika 5. Opća shema hidrolize glukozinolata i strukture glavnih razgradnih produkata

( preuzeto i prilagođeno iz Rask i sur., 2000. )28

2.2.2.1. Izotiocijanati

Izotiocijanati (ITC; R-N=C=S) su se tijekom povijesti smatrali ''normalnim'' produktima

hidrolize glukozinolata. Radi se o hlapljivim spojevima, jakog mirisa i arome. Primjerice,

propenil-izotiocijanati su odgovorni za karakterističnu aromu gorušice i hrena pa se ponekad

navedeni izotiocijanati nazivaju ''gorušičinim uljem''. Nastajanje izotiocijanata zahtijeva

trenutnu Lösenovu pregradnju nestabilnog aglukonskog međuprodukta u R-N=C=S

konfiguraciju. Izotiocijanati koji sadrže β-hidroksilnu skupinu su nestabilni i spontanom

intramolekulskom reakcijom tvore cikličke tionske spojeve – oksazolidin-2-tione. U

metabolizmu čovjeka izotiocijanati se vežu na glutation uz pomoć enzima glutation–S-

transferaze i dalje metaboliziraju do merkaptanske kiseline. Količina izotiocijanata nastalih iz

glukozinolata varira i djelomično ovisi o pripremi i postupanju s biljkom. Zbog svoje

toksičnosti izotiocijanati su mogući kandidati za upotrebu kao pesticidi.32

2.2.2.2. Nitrili

Nastajanje nitrila (R-C≡N, poznatih i kao organski cijanidi) ne zahtijeva pregradnju

međuprodukta već samo gubitak sumpora iz molekule. Nastajanje nitrila favorizirano je nad

izotiocijanatima pri nižim pH vrijednostima ( 4), a prisustvo Fe2+ ili tiolnih spojeva također

povećava mogućnost nastanka nitrila. Epitonitrili nastaju pri istim uvjetima kao i nitrili, ali

samo iz glukozinolata koji imaju terminalnu dvostruku vezu u bočnom (R) lancu i uz

prisustvo epitospecifičnog proteina (ESP) i Fe2+ iona.4,32 Kada je prisutan, ESP usmjerava

mirozinazom kataliziranu hidrolizu glukozinolata na način da umjesto izglednog nastajanja

izotiocijanata nastaju ili nitrili ili epitionitrili. Točan mehanizam kako do toga dolazi nije još

poznat.33

Epitiospecifični proteini su izolirani, pročišćeni i identificirani iz različitih

Brassicaceae vrsta kao što su B. napus, B. oleracea i A. thaliana. 34-38 Međutim, važno je

napomenuti da nemaju svi ekotipovi iste biljne vrste funkcionalni ESP pa su tako unutar A.

thaliana vrste identificirani različiti ekotipovi od kojih je u nekima pronađena, a u nekima ne

ESP aktivnost.

2.2.2.3. Tiocijanati

Faktori koji kontroliraju nastajanje tiocijanata (RSCN) nisu dovoljno istraženi. Smatra se da

je za nastajanje tiocijanata uz mirozinazu potrebno prisustvo još jednog enzima, tzv. tiocijanat

formirajućeg proteina (TFP). Poznato je da tiocijanati nastaju iz glukozinolata koji imaju

specifične bočne lance (R) kao što su 2-propenil, benzil i 4-(metiltio)butil glukozinolati.

Dokazi upućuju da je tiocijanatni anion rezonantni hibrid s nabojem lokaliziranim na S atomu

(-S-C=N) ili na dušikovom atomu (S=C=N-).4,32

Nastajanje tiocijanata iz glukozinolata zabilježeno je samo u nekoliko biljaka i

ograničeno je na tri glukozinolata - erucin, glukotropeolin i sinigrin.31 Nedavno je TFP

identificiran u vrsti Lepidium sativum, ali su informacije o njegovom načinu djelovanja i

lokalizaciji još uvijek vrlo ograničene.39

2.2.2.4. Indoli

Indolni spojevi nastaju, zajedno s tiocijanatima, hidrolizom indolnih glukozinolata.

Glukobrasicin (indol-3-ilmetil glukozinolat) je najzastupljeniji indolni glukozinolat u povrću

roda Brassica. Shema enzimske hidrolize glukobrasicina (Slika 6.) predstavlja model za opću

shemu razgradnje indolnih glukozinolata (Gmelin i Vitanen 1959.,1962.). U toj je shemi

pretpostavljeno nastajanje nestabilnog intermedijera izotiocijanatne strukture, što su kasnije

podržali i drugi autori. Predpostavlja se da indol-3-ilmetanol nastaje iz nestabilnog

izotiocijanata. Struktura nastalih produkata ovisi o uvjetima hidrolize, pa tako pri pH 7 kao

produkt pregradnje nastalih izotiocijanata nastaje tiocijanatni ion dok pri kiselijim pH nastaju

indol-3-ilacetonitril i sumpor. Karakteristika hidrolize glukobrasicina je nastajanje indol-3-

ilaskorbigena ako je prisutna askorbinska kiselina. 40

N

H

C

S

N

glukoza

OSO3-

GLUKOBRASICIN

pH 3-4

pH 7

N

H

CN

indol-3-ilacetonitril

+ glukoza, S, HSO4-

N

H

N C S

indol-3-ilmetil-izotiocijanat

- SCN -

+ glukoza, HSO4 -

N

H

CH2OH

indol-3-ilmetanol

askorbinska kiselina

- CH2OH

N

H

N

H

3,3,-diindolilmetan

N

H

O

O

OH

indol-3-ilaskorbigen

H2O

HHO

O

OH

Slika 6. Shema enzimske hidrolize indolnog glukozinolata glukobrasicina

(preuzeto i prilagođeno iz Delonga, 2001.)40

2.3. Biološka aktivnost glukozinolata

Glukozinolati su kemijski stabilni i biološki neaktivni spojevi sve dok su u biljnim stanicama

odvojeni od ostalih sastojaka. Oštećenjem tkiva dolazi do kontakta između enzima mirozinaze

i glukozinolata što dovodi do hidrolize glukozinolata čime nastaje niz biološki aktivnih

produkata kao što su izotiocijanati, nitrili, oksazolidintioni. Glukozinolati i njihovi razgradni

produkti su vrlo zanimljivi zbog svojih nutritivnih i antinutritivnih svojstava, antifugalnih i

antibakteriskih svojstava, antikancerogenih svojstava te zbog karakteristične arome koje daju

povrća.3,41

2.3.1. Antikancerogeno djelovanje

Mnogobrojne epidemiološke studije pokazale su smanjenu pojavu karcinoma kod ljudi koji

konzumiraju kupusnjače.42 Mehanizam preventivnog djelovanja razgradnih produkata

glukozinolata još nije potpuno razjašnjen. Istraživanja pokazuju da modificiraju aktivnost

enzima Faze I i Faze II što predstavlja prvu obrambenu liniju organizma od kancerogenih

tvari. Osim toga, inhibiraju rast stanica tumora i stimuliraju apoptozu (programiranu smrt

stanica). Procesi kancerogeneze koji su regulirani enzimima Faze I i Faze II se uglavnom

odvijaju u jetri i mukozi crijeva.43

Enzimi Faze I (enzimi citokrom P450) djeluju na način da povećavaju reaktivnost

tvari topljivih u mastima stvarajući od toksičnih polaznih molekula još toksičnije. Ovi enzimi

mijenjaju prokancerogene molekule, uglavnom reakcijama oksidacije i redukcije, ali i

hidrolizom, do hidrofobnih molekula. Tim reakcijama nastaju vrlo reaktivni intermedijeri koji

oštećuju DNK i RNK. Razgradni produkti glukozinolata inhibiraju aktivnost ovih enzima.

Enzimi Faze II (glutation-S-transferaza, aldehid reduktaza, S-metil-transferaza, N-

acetil-transferaza) povećavaju topljivost u vodi i izlučivanje štetnih molekula iz tijela. Ovi

enzimi djeluju na način da konvertiraju kancerogene tvari reakcijama konjugacije s

ligandima, pripajanja sulfatnih skupina, acetiliranja i metiliranja u nereaktivne metabolite

koje ljudski organizam lako izluči. Razgradni produkti glukozinolata povećavaju aktivnost

enzima Faze II.44

Kemoprotektivni učinci razgradnih produkata glukozinolata su dobro poznati i opisani

u brojnim radovima (Tablica 4.). Pronađeno je da su hidrolitički produkti metilsulfinil

glukozinolata najpotentniji induktori enzima Faze II koji detoksificiraju karcinogene. U

skladu s tim su brojne studije provedene na sulforafanu (4-(metisulfinil)butil-izotiocijanatu) i

7-(metilsulfinil)heptil-izotiocijanatu. Pozitivne učinke su također pokazali i razgradni

produkti aromatskih glukozinolata, posebice fenil-, benzil- i 2-feniletil-izotiocijanat, a od

razgradnih produkata indolnih glukozinolata je najviše istraživano djelovanje indol-3-

karbinola, razgradnog produkta glukobrasicina.

Tablica 4. Popis radova koji opisuju kemoprotektivne učinke razgradnih produkata

glukozinolata (preuzeto i prilagođeno iz Vig i sur., 2009.)44

alil-izotiocijanat

K. Xu, P.J. Thornalley: Biochem. Pharm 60 (2000), 221-231.

S. K. Srivastava, D. Xiao i sur..: Carcinogenesis 24 (2003),1665-1670.

D. Xiao, S. K. Srivastava i sur.: Carcinogenesis 24 (2003), 891-897.

C. Manesh, G. Kuttan: Phytomedicine 12 (2005), 487-493.

benzil-izotiocijanat

W. G. Kirlin, J. Cai i sur.: J. Nutr., 129 (1999), 1827-1835.

C. Bonnesen, I. Eggleston i sur.: Cancer Res. 61 (2001), 6120-6130.

V. W. Lui, A. L. Wentzel i sur.: Carcinogenesis 24 (2003),1705-1712.

S. K. Srivastava, S. V. Singh: Carcinogenesis 25 (2004), 1701-1709.

Y. Kuroiwa, A. Nishikawa i sur.: Cancer Lett. 241 (2006), 275-280.

indol-3-karbinol

C. M. Cover, S. J. Hsieh i sur.: Cancer Res. 59 (1999), 1244-1251.

4-(metisulfinil)butil-izotiocijanat

P.Rosea, Q. Huangbd i sur.: Toxicol. Appl. Pharmacol. 209 (2005), 105-113.

L. Gamet-Payrastre, P. Li i sur.: Cancer Res .60 (2000), 1426-1433.

K. Singletary, C. MacDonald: Cancer Lett. 155 (2000), 47-54.

F. L. Chung, C. C. Conaway i sur.: Carcinogenesis 21 (2000), 2287-2291.

C. Bonnesen, I. Eggleston i sur.: Cancer Res. 61 (2001), 6120-6130.

C. Fimognari, M. Nusse i sur.: Carcinogenesis 23 (2002), 581-586.

J. W. Fahey, X. Haristoy i sur.: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99 (2002), 7610-7615.

I. Misiewicz, K. Skupinska i sur.: Oncol. Rep. 10 (2003), 2045-2050.

B. R. Kim, R. Hu i sur.: Cancer Res. 63 (2003),7520-7525.

V. Singh, D. Xiao i sur.: Carcinogenesis 25 (2004), 83-90.

D. Gingras, M. Gendron i sur.: Cancer Lett. 203 (2004), 35-43.

L. Wang, D. Liu i sur.: Int. J. Oncol. 24 (2004), 187-192.

Y. Kuroiwa, A. Nishikawa i sur.: Cancer Lett. 241 (2006), 275-280.

7-(metilsulfinil)heptil-izotiocijanat

P.Rosea, Q. Huangbd i sur.: Toxicol. Appl. Pharmacol. 209 (2005), 105-113.

fenil-izotiocijanat

C. Manesh, G. Kuttan: Phytomedicine 12 (2005), 487-493.

2-feniletil-izotiocijanat

M. A. Morse, C. X. Wang i sur.: Cancer Res. 49 (1989), 549-553.

Y. Zhang, T. W. Kensler i sur.: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 991 (1994), 3147-3150.

J. W. Chiao, F. Chung i sur.: Int. J. Oncol. 16 (2000), 1215-1219.

F. L. Chung, C. C. Conaway i sur.: Carcinogenesis 21 (2000), 2287-2291.

D. Xiao, S. V. Singh: Cancer Res. 62 (2002), 3615-3619.

Y. R. Chen, J. Han i sur.: J. Biol. Chem. 277 (2002), 39334-39342.

W. S. Jeong, I. W. Kim i sur.: Pharmaceut. Res. 21 (2004), 661-670.

C. R. Johnson, J. Chun i sur.: J. Pharmacol. Exp. Ther. 309 (2004), 452-461.

J. M. Pullar, S. J. Thomson i sur.: Carcinogenesis 25 (2004), 765-772.

X. Wu, F. Kassie i sur.: Mutat. Res. 589 (2005), 81-102.

fenilbenzil-izotiocijanat

K. S. Satyan, N. Swamy i sur.: Gynecol. Oncol. 103 (2006), 261-270.

R. Yu, S. Mandlekar i sur.: Cancer Res. 58 (1998), 402-408.

fenilmetil-izotiocijanat

R. Yu, S. Mandlekar i sur.: Cancer Res. 58 (1998), 402-408.

2.3.2. Antioksidacijsko djelovanje

S obzirom da ne blokiraju slobodne radikale direktno, već se njihova antioksidacijska

aktivnost temelji na modificiranju aktivnosti enzima metabolizma (enzimi Faze I i Faze II),

razgradni produkti glukozinolata se smatraju indirektnim antioksidansima. Geni za enzime

Faze II sadrže specifične sekvence DNK koji se nazivaju elementi antioksidacijskog

odgovora. Razgradni produkti glukozinolata povećavaju aktivnost enzima Faze II tako što

povećavaju transkripciju gena koji sadrže elemente antioksidacijskog odgovora.44

Zbog reaktivnosti centralnog ugljikovog atoma N=C=S skupine, koji može brzo

reagirati sa sumporovim, dušikovim i kisikovim nukleofilima, izotiocijanati predstavljaju

snažne elektrofile. Unatoč tome, vrlo je malo radova koji pokazuju da ovi spojevi djeluju kao

direktni antioksidansi.45

2.3.3. Antimikrobno i antifugalno djelovanje

U brojnim radovima je ispitivan učinak intaktnih glukozinolata i produkata njihove

razgradnje na različite mikroorganizme: bakterije, kvasce i gljivice (Tablica 5., Tablica 6. ).

U svim je radovima potvrđena fiziološka neaktivnost glukozinolata, ali štetna i čak toksična

aktivnost njihovih produkata razgradnje.

Uočeno je da su hlapljivi izotiocijanati učinkovitiji prema kvascima nego prema Gram

pozitivnim i Gram negativnim bakterijama i gljivicama46 te da produkti razgradnje

glukozinolata sa sumporom u bočnom lancu pokazuju izraženije fungitoksične učinke nego

alkenilni, hidroksialkenilni i aromatski spojevi.47

Tablica 5. Popis radova koji opisuju fungicidne učinke razgradnih produkata

glukozinolata (preuzeto i prilagođeno iz Vig i sur., 2009.)

alil-izotiocijanat

W. J. Hooker, J. Walker i sur.: Am. J. Bot. 30 (1943), 632-637.

J. R. Greenhalgh, N. D. Mitchell: New Phytol. 77 (1976), 391-398.

H. S. Mayton, C. Oliver i sur.: Phytopathology 86 (1996), 267-271.

U. Smolinska, M. Horbowicz: J. Phytopathol. 147 (1999), 119-124.

M. Sarwar , J. A. Kirkegaard i sur.: Plan. Soil 201 (1998), 103-112.

C. Olivier, S. F. Vaughn i sur.: J. Chem. Ecol. 2 (1999), 2687-2701.

W. C. Chung, J. W. Huang i sur.: Can. J. Plant Pathol. 25 (2003), 285-294.

S. Sanchi, S. Odorizzi i sur.: Acta Hortic. 698 (2005), 287-292.

J. A. Lewis, G. C. Papavizas: Phytopathology 61 (1971), 208-214.

R. F. Mithen, B. G. Lewis i sur.: Trans. Br. Mycol. Soc. 87 (1986), 433-440.

R. P. Schreiner, R. T. Koide: New Phytol. 123 (1993), 99-105.

A. C. Sexton, J. A. Kirkegaard i sur.: Australas. Plant Pathol. 28 (1999), 95-102.

alil-izotiocijanat : benzil-izotiocijanat : 2-feniletil-izotiocijanat : fenil- izotiocijanat = 1 : 3,5 : 5,3 : 9,6

R. Troncoso, C. Espinoza i sur.: Food Res. Int. 38 (2005), 701-708.

M. Sarwar , J. A. Kirkegaard i sur.: Plant Soil 201 (1998), 103-112.

U. Smolinska, M. J. Morra i sur.: Plant Dis. 87 (2003), 407-412.

benzil-izotiocijanat

L. Drobnica, M. Zemanova i sur.: Appl. Microbiol. 15 (1967), 701-709.

M. Mari, R. Iori i sur.: Ann. Appl. Biol. 123 (1993), 155-164.

L. M. Manici, L. Lazzeri i sur.: J. Agric. Food Chem. 45 (1997), 2768-2773.

U. Smolinska, M. Horbowicz: J. Phytopathol. 147 (1999), 119-124.


butenil-izotiocijanat

W. J. Hooker, J. C. Walker i sur.: Am. J. Bot. 30 (1943), 632-637.

W. C. Chung, J. W. Huang i sur.: Can. J. Plant. 25 (2003), 285-294.

4-(metiltio)butil-izotiocijanat

L. M. Manici, L. Lazzeri i sur.: Pest Manage. Sci. 56 (2000), 921-926.

3-(metilsulfinil)propil-izotiocijanat

L. M. Manici, L. Lazzeri i sur.: J. Agric. Food Chem. 45 (1997), 2768-2773.

L. M. Manici, L. Lazzeri i sur.: Pest Manage. Sci. 56 (2000), 921-926.

4-(metilsulfinil)butil-izotiocijanat

M. Mari, R. Iori i sur.: Plant Pathol. 45 (1996), 753-760.

3-indolilacetonitril

E. E. Smissman, S. D. Beck i sur.: Science 133 (1961), 462.

feniletil-izotiocijanat

G. W. Dawson, K. J. Doughty i sur.: Pest. Sci. 39 (1993), 271-278.

J. F. Angus: Plant Soil 162 (1994), 107-112.


p-hidroksibenzil-izotiocijanat

G. R. Fenwick, R. K. Heaney i sur.: Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 18 (1983), 123-201.

5- viniloksazolidin-2-tion

U. Smolinska, G. R. Knudsen i sur.: Plant Dis. 81 (1997), 288-292.

Tablica 6. Popis radova koji opisuju baktericidne učinke razgradnih produkata

glukozinolata (preuzeto i prilagođeno iz Vig i sur., 2009.)

alil-izotiocijanat

K. Isshiki, K. Tokuoka i sur.: Biosci. Boitechnol. Biochem. 56 (1992), 1476-1477.

P. J. Delaquis, P. L. Sholberg: J. Food Prot. 60 (1997), 943-947.

C. M. Lin, J. Kim i sur.: J. Food Prot. 63 (2000), 25-30.

C. M. Park , P. J. Taormina i sur.: Int. J. Food Microbiol. 56 (2000), 13-20.

D. Nadarajah, J. H. Han i sur.: Int. J. Food Microbiol. 99 (2005), 257-267.

p-hidroksibenzil-izotiocijanat

A. Ekanayake, J. J. Kester i sur.: Acta Hort. 709 (2006), 101-108.

metil-izotiocijanat

C. M. Lin, J. Kim i sur.: J. Food Prot. 63 (2000), 25-30.

4-(metilsulfinil)butil-izotiocijanat

J. W. Fahey, X. Haristoy i sur.: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99 (2002), 7610-7615.

X. Haristoy, K. Angioi-Duprez i sur.: Antimicrob. Agents Chemother. 47 (2003), 3982-3984.

X. Haristoy, J. W. Fahey i sur.: Planta Med. 71 (2005), 326-330.

fenil-izotiocijanat

G. D. Bending, S. D. Lincoln: Soil Biol. Biochem. 32 (2000), 1261-1269.

oksazolidin-2-tioni

A. Rutkowski, M. Bjelecka i sur.: Can. Inst. Food Sci. Technol. J. 5 (1972), 67-71.

E. Schnug, J. Ceynowa: J. Agron. Crop Sci. 165 (1990), 319-328.

2.3.4. Toksičnost i antinutritivni učinak glukozinolata

U početku glukozinolati su istraživani zbog svojih potencijalno antinutritivnih i štetnih

učinaka pa su stoga uklanjani iz stočne hrane (kontroliranim uzgojem i preradom biljnog

materijala). Prva istraživanja glukozinolata bila su usmjerena na goitrogene učinke razgradnih

produkata glukozinolata kod životinja hranjenih sačmom uljane repice. Naime, hidrolizom β-

hidroksialkenil glukozinolata (npr. progoitrina i epiprogoitrina) nastaju β-hidroksialkenil-

izotiocijanati koji spontano cikliziraju dajući oksazolidin-2-tione, spojeve poznate po

goitrogenom učinku. Goitrogeni spojevi inhibiraju funkciju štitnjače uzrokujući njenu atrofiju

i gušavost. Tako 5-viniloksazolidin-2-tion (goitrin) pokazuje štetne i toksične učinke

(usporeni rast životinja te toksični učinak na štitnjaču i jetru). Danas se za ishranu životinja

uzgajaju uglavnom sorte uljane repice sa niskim sadržajem glukozinolata.48

S obzirom na istraživanja o negativnom utjecaju glukozinolata na zdravlje životinja

proizlazi da bi i ljudi trebali voditi računa o konzumiranim dozama glukozinolata i njihovih

razgradnih produkata jer veza između doze i utjecaja ovih spojeva na zdravlje nije jasno

definirana. Dnevni unos glukozinolata prehranom varira od 12 do 300 mg pri čemu nisu

zabilježeni slučajevi negativnog djelovanja glukozinolata i njihovih razgradnih produkata na

zdravlje ljudi, dapače, ne može se isključiti njihov pozitivan utjecaj.49,50 Međutim, potrebno je

voditi računa o dozama prilikom uzimanja različitih nadomjestaka hrane i dodataka prehrani

kako se ne bi uzimale doze koje bi imale negativan učinak po ljudsko zdravlje. Na primjer,

indol-3-karbinol može i inhibirati i potaknuti kancerogenezu.51 Također je utvrđeno i da

benzil- i alil- izotiocijanati imaju i antikancerogeno djelovanje, ali i genotoksično i

potencijalno kancerogeno djelovanje.52

2.4. Analiza glukozinolata

Složena kemijska struktura glukozinolata i prisutnost više glukozinolata u istoj biljci zahtijeva

raznolik analitički pristup njihovom određivanju. Naime, sve korištene metode imaju i

prednosti i mane pa se preporučuje da se ispitivanja ne zasnivaju na rezultatima samo jedne

već više metoda kako bi se dobio što potpuniji uvid u kemijski sastav i sadržaj glukozinolata

u analiziranim biljkama.

Analitičke metode koje se koriste za analizu glukozinolata mogu se podijeliti na:

metode određivanja ukupnih glukozinolata,

metode određivanja pojedinačnih glukozinolata:

- određivanje pojedinačnih intaktnih (nepromijenjenih) glukozinolata

- određivanje pojedinačnih desulfoglukozinolata

metode određivanja razgradnih produkata glukozinolata

2.4.1. Određivanje ukupnih glukozinolata

Za određivanje ukupnih glukozinolata u literaturi se najčešće navode kolorimetrijske metode

kao što su: tiourea metoda,53 timol metoda,54 paladij metoda 55 ili fericijanid metoda.56 Većina

ovih metoda su jednostavne i brze spektroskopske metode koje se i danas koriste bez

značajnih modifikacija.

Osim ovih navode se i brojne metode određivanja ukupnih glukozinolata temeljene

na fizikalno-kemijskim osobinama tioglukozidne molekule glukozinolata. Naime, budući da

hidrolizom glukozinolata nastaju glukoza, sulfatni ion te različiti aglukoni, udio ukupnih

glukozinolata se može odrediti preko udjela oslobođenog sulfata, glukoze te pojedinačnih

aglukona.

Tzv. timol metoda koji se koristi za određivanje saharida daje uvid u sadržaj ukupnih

glukozinolata u uzorcima hrane. Temelji se na djelovanju jakih kiselina (najčešće sumporne

kiseline) na ugljikohidrate što dovodi do dehidratacije i zatvaranja prstena te formiranja

furaldehide. Crveno obojeni produkt je rezultat reakcije kondenzacije između derivata

furaldehida i timola. Ovaj test daje pozitivne rezultate i sa slobodnim i vezanim

ugljikohidratima.57

Paladij metoda (ili paladij klorid metoda) je također spektrofotometrijska metoda

određivanja sadržaja ukupnih glukozinolata. Kao i timol i fericijanid metoda, ova metoda je

brza i jednostavna neenzimska metoda koja se temelji na spektrofotometrijskom određivanju

obojenog kompleksa nastalog reakcijom glukozinolata i paladijevog klorida.55

Tzv. glukoza metode se koriste za određivanje hidrolizom oslobođene glukoze. Kod

ovih metoda se mora uzeti u obzir i moguće prisustvo endogene glukoze pa se zbog toga radi

prethodno pročišćavanje čime se utjecaj endogene glukoze na određivanje glukozinolata

eliminira.57

U literaturi je opisano i nekoliko gravimetrijskih i titrimetrijskih metoda za

određivanje sulfatnih iona oslobođenih hidrolizom glukozinolata mirozinazom. Jedna od njih

se temelji na taloženju sulfata sa barijevim kloridom, a zaostali barij se mjeri emisijskom

spektroskopijom s X-zrakama.42

U novije vrijeme se koristi i bliska infracrvena spektroskopija (NIRS) koja predstavlja

nedestruktivnu tehniku analize u kojoj se signali O-H, C-H i N-H skupina dovodi u vezu sa

ukupnim sadržajem glukozinolata u ispitivanom uzorku.58 Upotreba ove tehnike omogućava

određivanjem širokog raspona glukozinolata za razliku od glukoza testa koji omogućava samo

eliminaciju genotipova koji sadrže glukozinolate iznad određene količine.57

U novije vrijeme mjerenje sadržaja ukupnih glukozinolata gubi na aktualnosti zbog

velikog napretka analitičkih metoda određivanja pojedinačnih glukozinolata iz kojih se

dobivaju puno korisnije informacije o ovim spojevima.12

2.4.2. Određivanje pojedinačnih glukozinolata

Za analizu pojedinačnih glukozinolata, bilo intaktnih ili desulfoglukozinolata, danas

istraživači gotovo isključivo koriste visokodjelotvornu tekućinsku kromatografiju (HPLC) u

kombinaciji s različitim detektorima. Najčešće korištena metoda detekcije je ultraljubičasta

(UV) spektroskopija, dok najviše podataka za identifikaciju i određivanje strukture

glukozinolata daje masena spektroskopija (MS).

U prošlosti, analiza intaktnih glukozinolata nije bila moguća, već je vršena hidroliza

čime su dobiveni spojevi pogodniji za kromatografska razdvajanja. Započelo se plinskom

kromatografijom produkata razgradnje glukozinolata,59,60 zatim je uslijedila plinska

kromatografija desulfatiranih i sililiranih derivata glukozinolata,61,62 visokodjelotvorna

tekućinska kromatografija intaktnih glukozinolata,63,64 visokodjelotvorna tekućinska

kromatografija desulfoglukozinolata 65,66 te elektrofereza.42,57

Jedan od najvećih problema u analizi pojedinačnih glukozinolata je nedostatak čistih

glukozinolata koji se mogu koristiti kao kromatografski standardi. Samo dva glukozinolata su

komercijalno dostupna: sinigrin (2-propenil glukozinolat), koji nije prikladan kao standard jer

je prisutan u većini biljaka iz porodice Brassicaceae i glukotropeolin (benzil glukozinolat),

koji obično nije prisutan u biljkama porodice Brassicaceae te je zbog toga najčešće korišteni

unutarnji standard.12, 57

S obzirom na ionsku strukturu intaktni glukozinolati se ne mogu direktno određivati

plinskom kromatografijom već ih je potrebno derivatizirati, odnosno prevesti u hlapljive

derivate desulfoglukozinolata.57

2.4.3. Analiza razgradnih produkata glukozinolata

Iako se plinska kromatografija razgradnih produkata glukozinolata u posljednje vrijeme manje

koristi u analizi glukozinolata, još uvijek je dosta zastupljena kada su predmet istraživanja i

razgradni produkti glukozinolata a ne samo glukozinolati. Naime, primjena HPLC-a u

istraživanjima razgradnih produkata glukozinolata je ograničena s obzirom na hlapljivost

većine razgradnih spojeva, a osim toga tiocijanti i nitrili se ne mogu detektirati

spektrometrijski. Analiza izotiocijanata i nitrila, glavnih produkata razgradnje glukozinolata,

provodi se plinskom kromatografijom (GC) najčešće u kombinaciji sa masenom

spektrometrijom kao metodom detekcije (vezani sustav GC/MS). Iako je GC/MS metoda vrlo

osjetljiva, poteškoće u kvantitativnoj i kvalitativnoj analizi može uzrokovati slaba hlapljivost

nekih spojeva ili njihova nestabilnost pri povišenim temperaturama. Primjerice, 4-

(metilsulfinil)butil-izotiocijanat (sulforafan) je podložan toplinskoj razgradnji u 3-butenil-

izotiocijanat.12,57

3. Materijali i metode3.1.Biljni materijali

3.1.1. Karakteristike biljnih vrsta porodice Brassicaceae

Porodica Brassicaceae (kupusnjače, ranije Crucifereae-krstašice) ima oko 3500 biljnih vrsta

koje su prirodno rasprostranjene u umjerenom klimatskom području sjeverne polutke i to

pretežno na Sredozemlju. Unutar porodice postoji veliki broj endemičnih rodova i biljnih

vrsta. Biljke iz porodice Brassicaceae su jednogodišnje, dvogodišnje ili višegodišnje zeljaste

biljke, polugrmovi i grmovi. Stabljika im može biti uspravna, polegnuta ili različito usmjerena

u odnosu na tlo. Neke vrste na stabljici imaju naizmjenično raspoređene listove koji su

uglavnom jednostavni i različitih oblika, sa i bez peteljke. Pravilni dvospolni cvjetovi građeni

su na osnovi broja 4: imaju 4 lapa, 4 latice, 4 duža (unutarnja) i 2 kraća (vanjska) prašnika.

Cvjetovi mogu biti skupljeni u cvatove ili pojedinačni. Ocvijeće može biti dvostruko (čaška i

vjenčić) ili jednostavno. Plodnica je jednogradna ili dvogradna, s najčešće dosta sjemenih

zametaka. Plodovi su uglavnom komuške različitog oblika.67,68

3.1.1.1. Izbor i priprema uzorka

U disertaciji su istraživani glukozinolati prisutni u 5 samoniklih biljaka porodice

Brassicaceae: jadranske rumenice (Aurinia leucadea (Guss.) K. Koch ), streličaste grbice

(Cardaria draba (L.) Desv.), sredozemne rusomače (Capsella rubella Reut.), nepravilne

gorušike (Calepina irregularis ( Asso) Thell.) i čunjastog repušca (Bunias erucago L.). Biljni

materijal je sabran na području park šume Marjan u razdoblju od ožujka do svibnja 2011.

godine. U istraživanju je korišten svježi i suhi biljni materijal i to čitava biljka (svi nadzemni

dijelovi, list, stabljika, cvijet i sjeme). Biljke su sušene na zraku, u mračnoj prostoriji i pri

sobnoj temperaturi.

3.1.1.2. Jadranska rumenica

Jadranska rumenica (Slika 7.) je polugrmovita biljka, busenasta i bijelo pustenasta,

razgranatih i odrvenjelih izdanaka na čijim se vršcima nalaze čuperci listova. Stabljike su

visoke do 30 cm s više izmjeničnih listova i cvjetova koji čine grozdove. Na kratke stapke

nastavljaju se veliki, zlatnožuti cvjetovi. Časka je otvorena, lapovi su dugi i strše, a latice su

klinaste. Sjemenke su okruglaste, spljoštene i crvenosmeđe. Ova endemična biljka raste na

obalnom području Apeninskog i Balkanskog poluotoka. U Hrvatskoj je rasprostranjena uz

obalu i na većini otoka, a raste uglavnom u pukotinama stijena.67

Slika 7. Aurinia leucadea (Guss.) K: Koch, jadranska rumenica

3.1.1.3. Streličasta grbica

Streličasta grbica (Slika 8.) je trajna i snažna zeljasta biljka koja naraste 20-50 cm u visinu.

Ima izdužen i pri vrhu jako razgranjeni korijen. Cvjetovi su sitni s bijelim laticama, ugodna

mirisa, oblikovani u zbijene prividno štitaste cvatove, koji se kasnije izduže. Streličasta grbica

raste na suhim i toplim neobrađenim mjestima, uz puteve, po korovištima i željezničkim

nasipima. U planinama dopire i do 2000 m nadmorske visine. Raširena je u svim krajevima

naše zemlje.68

Slika 8. Cardaria draba (L.) Desv, streličasta grbica

3.1.1.4. Sredozemna rusomača

Sredozemna rusomača (Slika 9.) je dvogodišnja, rjeđe jednogodišnja kupusnjača, 20-50 cm

visoka. Stabljika joj je uspravna, ponekad u gornjem dijelu slabo razgranjena. Na stabljici su

listovi malobrojni, naizmjenični, uski i sjedeći; oni pri vrhu obuhvaćaju stabljiku. Sredozemna

rusomača je jedan od najraširenijih korova, nalazimo je posvuda, osobito na ruderalnom tlu,

uz puteve i livade. U sjevernoj Dalmaciji se ova biljka jede. Zovu je ''šurlin'', a kuhaju je sa

slaninom.68

Slika 9. Capsella rubella Reut., sredozemna rusomača

3.1.1.5. Nepravilna gorušika

Nepravilna gorušika (Slika 10.) je jednogodišnja ili dvogodišnja kupusnjača, do 50 cm

visoka, s tankim bjelkastim, vretenastim korijenom. Bijeli cvjetići s laticama nejednake

veličine složeni su u grozdaste cvatove. Plodovi su jajasti, a sadrže po jednu okruglu, glatku,

bjelkastu sjemenku. Gorušika raste po poljima, uz puteve, po nasipima, točilima, ruderalnim

mjestima te kao korov po vinogradima. Osobito je raširena na vapnenastom tlu.68

Slika 10. Calepina irregularis (Asso) Thell., nepravilna gorušika

3.1.1.6. Čunjasti repušac

Čunjasti repušac (Slika 11.) je do 60 cm visoka dvogodišnja kupusnjača. Stabljika joj je

uspravna i razgranata, u donjem dijelu hrapava i ljubičasto nahukana. Žuti cvjetovi stoje na

dugim dršcima u dosta rahlim grozdovima na krajevima stabljike i ogranaka. Plodovi su

nepravilnog oblika sa 3-4 pretinca te 4 brida na kojima se nalaze zupčasto izrezana krilca.68

Slika 11. Bunias erucago L., čunjasti repušac

3.1.2. Kemikalije i aparatura

Određivanje ukupnih glukozinolata

Kemikalije:

octena kiselina, Gram-mol d.o.o., Zagreb, Hrvatska

natrijev acetat, Gram-mol d.o.o., Zagreb, Hrvatska

olovov acetat, Alfa Aesar, Karlsruhe, Germany

barijev acetat, Kemika, Zagreb, Hrvatska

natrijev-sulfat, bezvodni, p.a., Kemika, Zagreb, Hrvatska

NaOH, p.a., Kemika, Zagreb, Hrvatska

monobazični natrijev fosfat, Merck, Darmstadt, Germany

dibazični natrijev fosfat, Kemika, Zagreb, Hrvatska

K3Fe(CN)6, Kemika, Zagreb, Hrvatska

konc. HCl (37% , w/v), T. T. T., Sveta Nedelja, Hrvatska

polivinilpolipirolidon, Kokot Argo, Zagreb, Hrvatska

sinigrin monohidrat, Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Germany

Aparatura:

analitička vaga - Wigger Hauser

UV/VIS spektrofotometar Lambda EZ 201, PerkinElmer

Određivanje razgradnih produkata glukozinolata

Kemikalije:

pentan, p.a., Kemika, Zagreb, Hrvatska

natrijev-sulfat, bezvodni, p.a., Kemika, Zagreb, Hrvatska

diklormetan, p.a. Kemika, Zagreb, Hrvatska

enzim mirozinaza, (tioglukozidaza izolirana iz sjemena bijele gorušice),

Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Germany

Aparatura:

aparatura za vodenu destilaciju (modificirana aparatura po Clevengeru)

rotacijski vakuum uparivač- Heidolph Laborota 4000 Efficient

centrifuga - Tehtnica centric 322 A

analitička vaga - Wigger Hauser

tehnička vaga - Kern 572

plinski kromatograf Agilent Technologies GC 7890 A u kombinaciji s

spektrometrom masa MS 5975 C i računalom

Određivanje antimikrobne aktivnosti razgradnih produkata glukozinolata

Kemikalije:

etanol,oko 96 %-tni p.a., Gram-mol d.o.o., Zagreb, Hrvatska

Mueller-Hintonov hranjivi agar, Becton Dickinson, SAD

Sabouraud dekstrozni agar, Becton Dickinson, SAD

diskovi od filter papira promjera 6 mm, Becton Dickinson, SAD

3.2. Metode

3.2.1. Određivanje ukupnih glukozinolata

Za određivanje ukupnih glukozinolata korištena je jednostavna i brza spektrofotometrijska

metoda uobičajenog naziva fericijanid metoda. Metoda je neenzimska, a temelji se na alkalnoj

razgradnji (hidrolizi) glukozinolata i redukciji heksacijanoferata(III) nastalim razgradnim

produktom, 1-tioglukozom.

2 C6H11O5S- + 2 Fe(CN)63- C6H11O5SSO5H11C6 + 2 Fe(CN)6

4-

Kako je heksacijanoferat(III) kromogeni spoj moguće je njegovom redukcijom

spektrofotometrijski odrediti sadržaj glukozinolata u biljnom materijalu. Redukciju

heksacijanoferata(III) prati promjena boje od početne svijetlo žute ka intenzivno žutoj.

Sadržaj ukupnih glukozinolata određuje se iz izmjerene apsorbancije uzorka pri 420 nm

koristeći standardnu umjernu krivulju.56

3.2.1.1. Priprava potrebnih otopina

Acetatni pufer (0,1 M, pH 4,2)

Za pripremu 100 mL acetatnog pufera potrebno je 36,8 mL otopine A i 13,2 mL otopine B,

koja se razrijedi do ukupnog volumena od 100 mL. Otopina je pripremljena u odmjernoj

tikvici.

otopina A - 0,2 M octena kiselina: pripremljena je otapanjem 1,15 mL octene kiseline

u 100 mL destilirane vode

otopina B - 0,2 M natrijev acetat: pripremljen je otapanjem 1,64 g natrijevog acetata u

100 mL destilirane vode

Olovov/barijev acetat (0,5 M)

Otopina olovovog i barijevog acetata koncentracije 0,5 M pripremljena je tako da je u

odmjernoj tikvici od 100 mL otopljeno 18,95 g olovovog acetata × 3 H20 u 60 mL destilirane

vode te u nastalu otopinu dodano 12,77 g barijevog acetata. Nakon što se barijev acetat otopio

otopina je razrijeđena do ukupnog volumena od 100 mL.

Natrijev hidroksid (2 M)

U odmjernoj tikvici od 100 mL otopljeno je 8 g NaOH u 80 mL destilirane vode i tikvica je

nadopunjena do volumena od 100 mL.

Natrij-fosfatni pufer (0,1 M, pH 7,0)

Za pripremu 1 L otopine potrebno je 195 mL otopine A i 305 mL otopine B, koja se u

odmjernoj tikvici razrijede do ukupnog volumena od 1 L.

otopina A – 0,2 M monobazični natrijev fosfat: pripremljen je otapanjem 13,9 g

monobazičnog natrijevog fosfata u 1 L destilirane vode

otopina B – 0,2 M dibazični natrijev fosfat: pripremljen je otapanjem 35,85 g

Na2HPO4 × 12 H2O u 500 mL destilirane vode

Kalijev fericijanid (K3Fe(CN)6, 2 mM)

Kalijev fericijanid je pripremljen otapanjem 329 mg K3Fe(CN)6 u 500 mL fosfatnog pufera

(0,2 M, pH 7).

3.2.1.2. Priprava umjerne krivulje

Kao standard za pripremu umjerne krivulje korišten je sinigrin monohidrat. Hidroliza

sinigrina provedena je s 2 M NaOH. U tu svrhu je izvagano je 5 mg sinigrina koji je otopljen

u 1 mL destilirane vode te je u dobivenu otopinu dodano 1000 μL 2 M NaOH. Otopina je

promiješana i ostavljena na sobnoj temperaturi 30 minuta. Zatim je u otopinu dodano 170 μL

koncentrirane HCl (37%-tne). Konačna koncentracija osnovne otopine (tzv. "stock" otopine)

sinigrin monohidrata, pripremljene na opisani način, je 2,3041 mg/mL. Iz osnovne otopine

uzeto je od 0 do 500 μL i u svaku epruvetu je dodano fosfatnog pufera do konačnog volumena

od 500 μL. U svaku epruvetu je zatim dodano 500 μL kalijevog fericijanida, smjesa je

temeljito promiješana i centrifugirana na 4000 okretaja 3 minute. Nakon centrifugiranja,

sakupljen je bistri, gornji sloj iz kiveta, tzv. supernatant, i izmjerena je apsorbancija pri 420

nm.69

3.2.1.3. Ekstrakcija glukozinolata

Na zraku osušeni biljni materijal usitnjenjen je mljevenjem u mlincu za kavu i 500 mg uzorka

je stavljeno u staklenu epruvetu. Zatim je u biljni materijal pipetirano 7,5 mL skoro vrijućeg

acetatnog pufera (0,1 M, pH 4,2). Smjesa je držana u vrijućoj vodenoj kupelji 15 minuta.

Poslije hlađenja u smjesu je dodano 1,5 mL otopine olovov/barijevog acetata i temeljito

izmiješano. Zatim je u smjesu dodano 0,4 g netopljivog polivinilpolipirolidona, smjesa je

izmiješana i ostavljena na sobnoj temperaturi 15 minuta. Nakon toga dodano je i 1,5 mL

otopine natrijevog sulfata uz miješanje. Dobivena smjesa je centrifugirana 10 minuta na 4000

okretaja i potom je sakupljen supernatant.

Slijepa proba je pripremljena na isti način samo bez dodatka uzorka, odnosno biljnog

materijala.69

3.2.1.4. Alkalna hidroliza i reakcija s fericijanidom

Određivanje sadržaja ukupnih glukozinolata provedeno je na sljedeći način:

1. Pomiješano je 0,9 mL supernatanta (ispitivani uzorak i slijepa proba odvojeno) s 0,9

mL 2 M NaOH; dobivena smjesa je ostavljena na sobnoj temperaturi 30 minuta, a

nakon toga je dodano 0,150 mL koncentrirane HCl (37%) za neutralizaciju reakcijske

smjese, pH je provjeren pH papirom.

2. Rezultirajuća smjesa je centrifugirana 10 minuta na 4000 okretaja. Zatim je uzeto 0,5

mL supernatanta i pomiješano s jednakim volumenom kalijevog fericijanida (2 mM)

pripremljenog u fosfatnom puferu (0,1 M, pH 7).

3. Rezultirajuća otopina je temeljito izmiješana, centrifugirana 3 minute na 4000

okretaja, a potom je izmjerena apsorbancija supernatanta na 420 nm unutar 15 sekunda

u odnosu na slijepu probu.69

3.2.2. Priprava i izolacija razgradnih produkata glukozinolata

Za određivanje sastava glukozinolata korištena je indirektna metoda analize koja se sastoji u

razgradnji glukozinolata, izolaciji hlapljivih razgradnih produkata i njihovoj identifikaciji.

Korištenjem različitih pristupa u analizi (toplinska razgradnja ili enzimska hidroliza te

izolacija razgradnih produkata destilacijom ili ekstrakcijom) dobiven je potpuniji uvid u

sastav glukozinolata ispitivanih biljaka.

3.2.2.1. Toplinska razgradnja

Iz literature je poznato da su glukozinolati toplinski nestabilni spojevi te da kuhanjem (temp.

100 °C) biljnog materijala dolazi do njihove razgradnje. Razgradni produkti glukozinolata su

hlapljivi spojevi tako da je korištenjem modificirane aparature po Clevengeru provedena

istovremena toplinska razgradnja glukozinolata i izolacija oslobođenih hlapljivih produkata.

Priprava destilata

Iz svježeg biljnog materijala su vodenom destilacijom u modificiranoj aparaturi po

Clevengeru (Slika 12.) izolirani razgradni produkti glukozinolata. Biljni materijal je stavljen u

okruglu tikvicu od 2000 mL u koju je dodano oko 1000 mL destilirane vode. U središnji dio

aparature je prije početka destilacije osim vode dodano i otapalo za ekstrakciju - pentan.

Destilacija je trajala 2,5 sata. Hlapljivi spojevi (zajedno s vodenom parom) su se uzdizali kroz

postrane cijevi modificirane aparature po Clevenger-u do hladila gdje su se kondenzirali i

sakupljali u središnjem dijelu aparature. Destilat, sakupljen u središnjem dijelu aparature, je

nakon završene destilacije prenesen u lijevak za odjeljivanje te su hlapljivi spojevi pažljivo

odvojeni od vodenog sloja. Dodatkom male količine bezvodnog natrijevog sulfata (sredstvo

za sušenje) uklonjeni su zaostali tragovi vode. Svi uzorci (smjese hlapljivih spojeva) su

čuvani u hermetički zatvorenim bočicama u hladnjaku pri temperaturi –20 ˚C do daljne

analize. Na ovaj način pripravljen uzorak razgradnih produkata glukozinolata u daljnjem

tekstu će se nazivati destilat.

1. tikvica s okruglim dnom

2. povratno hladilo

3. prostor za prihvat destilata

4. kalota za zagrijavanje

5. reostat

Slika 12. Modificirana aparatura po Clevenger-u

3.2.2.2. Enzimska hidroliza

Enzimska hidroliza glukozinolata vršena je na dva načina, pomoću endogene (u biljci

prisutne) mirozinaze i egzogene mirozinaze (komercijalni enzim izoliran iz sjemena bijele

gorušice). Izolacija oslobođenih hlapljivih razgradnih produkata izvršena je ekstrakcijom

organskim otapalom. Uobičajeni naziv za hidrolizu glukozinolata endogenom mirozinazom je

autoliza, pa će se, radi jednostavnosti, u daljnjem tekstu uzorak razgradnih produkata

glukozinolata dobiven autolizom nazivati autolizat. Također, radi jednostavnosti, uzorak

razgradnih produkata glukozinolata dobiven egzogenom hidrolizom u daljnjem tekstu će se

nazivati hidrolizat.

Priprava autolizata

Svježi biljni materijal usitnjen je mljevenjem, stavljen u okruglu tikvicu od 2000 mL u koju je

zatim dodano oko 1000 mL destilirane vode. Tako pripremljena smjesa je začepljena i

ostavljena preko noći u termostatiranoj vodenoj kupelji pri temp. 25±2 °C. Zatim je smjesa,

radi uklanjanja biljnog materijala, filtrirana preko gaze u Erlenmeyerovu tikvicu u koju je

dodano 50 mL diklormetana. Diskontinuirana ekstrakcija (Slika 13.) je provedena miješanjem

pomoću magnetne miješalice u trajanju od pola sata. Po završetku smjesa je prenesena u

lijevak za odjeljivanje, donji diklormetanski sloj je odijeljen te centrifugiran na 3000 okr/min

u trajanju od 15 min. Nakon centrifugiranja zaostala voda je uklonjena kapaljkom i združena s

ostatkom vodenog dijela u lijevku za odjeljivanje. Diklormetanski ekstrakt je prenesen u

manju tikvicu, a združeni vodeni slojevi su još jednom ekstrahirani s 50 mL diklormetana na

prethodno opisan način. Združeni diklormetanski ekstrakt je potom osušen dodatkom

bezvodnog natrijevog sulfata. Nakon jednog sata smjesa je odekantirana, a diklormetan je

uklonjen otparavanjem pomoću rotacijskog vakuum uparivača (Slika 14.). Nakon uparavanja

uzorak je prebačen u izvaganu bočicu, hermetički zatvoren i ostavljen u hladnjaku pri

temperaturi –20 ˚C do daljnje analize.

Priprava hidrolizata

Suhi biljni materijal usitnjen je mljevenjem, prenesen u Erlenmeyerovu tikvicu sa oko 400

mL vrijuće vode te kuhan 5 min. Na taj način je inaktivirana endogena mirozinza, a

istovremeno su i ekstrahirani intaktni glukozinolati. Nakon što se smjesa u tikvici ohladila (na

sobnu temperaturu) dodano je 6,3 mg mirozinaze i ostavljena je preko noći u termostatiranoj

vodenoj kupelji pri temp. 25±2 °C. Zatim je smjesa, radi uklanjanja biljnog materijala,

filtrirana preko gaze u Erlenmeyerovu tikvicu u koju je dodano 50 mL diklormetana.

Ekstrakcija razgradnih produkata glukozinolata provedena je na isti način kao i kod priprave

autolizata. Nakon uparavanja uzorak je prebačen u izvaganu bočicu, hermetički zatvoren i

ostavljen u hladnjaku pri temperaturi –20 ˚C do daljnje analize.

Slika 13. Ekstrakcija biljnog materijala Slika 14. Rotacijski vakuum uparivač

3.2.2.3. GC-MS analiza razgradnih produkata glukozinolata

Kvalitativna i kvantitativna analiza hlapljivih razgradnih, odnosno hidrolitičkih, produkata

glukozinolata provedena je vezanim sustavom plinska kromatografija-spektrometrija masa

(GC/MS) korištenjem dviju kapilarnih kolona sa stacionarnim fazama različite polarnosti

(Slika 15.). Svi dobiveni uzorci hlapljivih spojeva analizirani su na nepolarnoj HP-5 i

polarnoj HP-FFAP kapilarnoj koloni proizvođača Hewlett Packard.

Slika 15. Vezani sustav plinska kromatografija-masena spektrometrija (GC-MS)

HP-5 kolona

Nepolarna kapilarna kolona sastava: 5% difenil- i 95% dimetilpolisiliksan; 30 m x

0,25 mm; debljina sloja stacionarne faze 0,20 μm.

Plin nositelj je helij protoka 1 mL/min; omjer cijepanja 1:50, temperatura injektora

250 °C; temperatura detektora 280 °C; energija ionizacije 70 eV.

Temperatura peći je programirana kako slijedi: 3 min pri 70 °C, zatim zagrijavanje od

70 do 200 °C brzinom 3 °C/min i 18 min pri 200 °C.

HP-FFAP kolona

Polarna kapilarna kolona sastava: modificirani polietilen-glikol; 50 m x 0,32 mm;

debljina sloja stacionarne faze 0,52 μm.

Plin nositelj je helij protoka 1ml/min; omjer cijepanja 1:50, temperatura injektora 250 0C; temperatura detektora 280 0C; energija ionizacije 70 eV.

Temperatura peći je programirana kako slijedi: 3,5 min na 70 0C, zatim 70-180 0C s

porastom od 4 0C / min i 18 min na 180 0C.

Identifikacija pojedinačnih, nepoznatih spojeva provedena je usporedbom njihovih

indeksa zadržavanja i spektara masa s onima iz literature i/ili baze indeksa zadržavanja i

spektara masa Zavoda za organsku kemiju, kao i usporedbom njihovih spektara masa sa

spektrima masa iz komercijalne banke spektara masa (Wiley 275 MS library i NIST02).

Relativni udio pojedinačnih spojeva u uzorcima određen je iz površina njihovih eluacijskih

kromatografskih krivulja (pikova).

Za svaki uzorak analiziran vezanim sustavom GC-MS dobiveni su sljedeći rezultati:

kromatogram ukupne ionske struje,

vrijeme zadržavanja svake komponente (koja je na kromatogramu

predstavljena pikom),

relativni udio pojedine komponente izražen u postocima (udio površine pika u

ukupnoj površini),

naziv spoja ili spojeva čiji je spektar najsličniji spektru nepoznate komponente

(sličnost uspoređenih spektara izražava se u postotcima).

3.2.3. Određivanje antimikrobne aktivnosti razgradnih produkata glukozinolata

Testiranje antimikrobnog učinka svih uzoraka hlapljivih razgradnih, odnosno hidrolitičkih,

produkata glukozinolata provedeno je in vitro na različitim vrstama mikroorganizama koji

imaju epidemiološki značaj. Istraživanje je provedeno dvjema metodama, metodom disk

difuzije i metodom minimalne inhibitorne koncentracije.

Priprema uzoraka

Prije ispitivanja antimikrobnog djelovanja pripremljene su otopine svih uzoraka razgradnih

produkata glukozinolata u koncentraciji 10 mg/mL. Otopine su pripremljene vaganjem

odgovarajuće mase uzorka u staklene bočice s teflonskim čepom i otapanjem u 96%-tnom

etanolu. Na taj način dobivene su osnovne otopine (tzv. “stock” otopine) koje su do

ispitivanja čuvane u hladnjaku pri temperaturi od –20 C.

U testu su korišteni sljedeći mikroorganizmi:

Gram-pozitivne bakterije: Bacillus cereus, Enterococcus faecalis,

Staphylococcus aureus

Gram-negativne bakterije: Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa

Gljivice: Candida albicans, Penicillium sp., Rhizopus stolonifer

3.2.3.1. Metoda određivanja minimalne inhibicijske koncentracije

Dilucijskim metodama određuje se minimalna inhibicijska koncentracija koja se definira kao

najniža koncentracija ispitivanog uzorka koja sprječava vidljiv rast mikroorganizma. Može se

izvoditi na tekućoj ili čvrstoj podlozi, tako da se ispitivani uzorak serijski razrjeđuje,

inkorporira u bakteriološku podlogu i zatim se u nju, ili na nju, inokulira ispitivani soj

bakterije. Nakon inkubacije od 18 do 24 sata na 35-37 °C gleda se prisutnost zamućenja

(bujona) ili porast kolonija (na čvrstoj podlozi). Koncentracija ispitivanog uzorka, koja se

nalazi u prvoj podlozi (u nizu), u kojoj nema porasta bakterija, naziva se minimalna

inhibicijska koncentracija i izražava se u mg/mL ili µg/mL. Dilucijska metoda se može

izvoditi kao mikrodilucija ako se izvodi u mikrotitar pločicama ili kao makrodilucija ako se

izvodi u nizu epruveta. Danas se uglavnom primjenjuje mikrodilucijska metoda, jer je

jednostavnija za izvođenje, a zbog manjeg utroška podloge, i jeftinija.

U ovom radu ispitivanje je vršeno mikrodilucijskom metodom u bujonu. Uzorci za

testiranje pripremljeni su otapanjem u 96 %-tnom etanolu u koncentraciji od 10 mg/mL.

Određivanje minimalne inhibicijske koncentracije (MIK) vršeno je metodom serije

razrjeđenja u mikrotitarskim pločicama sa 96 čašica. Bakterije su kultivirane na Mueller-

Hintonovom hranjivom agaru pri 37 °C, a gljivice na Sabouraud dekstroznom agaru pri 30

°C. Kao pozitivna kontrola korišteni su antibiotici ampicilin i gentamicin (za bakterije) i

amphotericin B (za gljivice). Njihove MIK vrijednosti određene su korištenjem E-testa. E-test

predstavlja kombinaciju dilucijske i difuzijske metode. Ispitivani soj inokulira se na Mueller-

Hintonov hranjivi agar kao za disk-difuzijski test, zatim se nanose E-test trake s

predefiniranim gradijentom koncentracija antibiotika, koji se prenosi s trake na krutu podlogu.

Nakon inkubacije od 18-24 sata očitava se MIK na temelju veličine inhibicijske zone

(µg/mL).

3.2.3.2. Metoda disk-difuzije

Antibiogram je kvalitativni test, vrlo dobro standardiziran za gotovo sve brzorastuće aerobne i

fakultativno anaerobne bakterije, i u općoj je primjeni u većini mikrobioloških laboratorija.

Najčešće se izvodi kao disk-difuzija, što je bio slučaj i u ovom istraživanju. Diskovi od filter-

papira promjera 6 mm postavljeni su na odgovarajuće krute hranjive podloge na koje su

prethodno inokulirane čiste kulture bakterija i gljivica približne koncentracije 106 / mL. U tu

svrhu korištene su Petrijeve zdjelice promjera 10 cm s 10 mL Mueller-Hintonovog hranjivog

agara. Osnovna otopina pripremljena je otapanjem uzoraka u 96 %-tnom etanolu u

koncentraciji od 10 mg/mL. Na svaku hranjivu podlogu postavljena su tri diska s 10 ili 25 μL

osnovne otopine, što predstavlja 100 odnosno 250 g uzorka. Sve Petrijeve zdjelice

inkubirane su pri 37 °C tijekom 24 sata (za bakterije) i pri 28 °C tijekom 48 sati (za

filamentozne gljivice). Po završetku inkubacije izmjerene su zone inhibicije rasta

mikroorganizama, a promjer zone inhibicije izražen je u milimetrima. Kao pozitivna kontrola

korišteni su standardni antibiotski diskovi koji sadrže ampicilin (30µg) odnosno gentamicin

(15µg) za bakteije i amphotericin B (10µg) za gljivice.

4. RezultatiPrethodna istraživanja

Ovaj rad je nastavak istraživanja glukozinolata, odnosno njihovih razgradnih produkata,

izoliranih iz kultiviranih i samoniklih biljaka porodice Brassicaceae, koja se u laboratoriju

Zavoda za organsku kemiju Kemijsko-tehnološkog fakulteta Sveučilišta u Splitu, provode

posljednjih godina (od 2005. godine).70-78

Istraživanja su započeta analizom profila hlapljivih spojeva ukrasne biljke snježak

dobivenih metodama toplinske razgradnje i endogene enzimske hidrolize.70 Glavni hlapljivi

spojevi bili su produkti razgradnje glukozinolata. Prisustvo glukozinolata, analizom njihovih

razgradnih produkata, ustanovljeno je i u raznim kultiviranim, jestivim, biljkama kao što su

rotkva i rokula, samoniklim biljkama (ljekovita češnjača, izverugana gromotulja, strižuša,

grbica), endemskoj biljci jadranskoj rumenici i stenoendemskoj velebitskoj degeniji.71-78 Pri

tom su, s ciljem dobivanja potpunijih podataka, primjenjivane različite metode razgradnje

glukozinolata: toplinska razgradnja, hidroliza endogenom odnosno egzogenom mirozinazom.

Izolacija razgradnih produkata glukozinolata također je vršena na različite načine,

destilacijom i/ili ekstrakcijom organskim otapalom. Analiza dobivenih hlapljivih razgradnih

produkata glukozinolata provedena je metodom plinske kromatografije uz detekciju

spektrometrijom masa. Ispitivanja su proširena i na određivanje antimikrobnog djelovanja

razgradnih produkata glukozinolata pri čemu su korištene dvije metode, disk difuzija i metoda

određivanja minimalne inhibitorne koncentracije, tzv. MIK metoda.75-78 U suradnji sa

znanstvenicima iz Italije, Kanade i Francuske istraživani su desulfoglukozinolati jadranske

rumenice i to tekućinskom kromatografijom visoke djelotvornosti uz detektor s nizom dioda

(HPLC/DAD).78

4.1. Ukupni glukozinolati

Sadržaj ukupnih glukozinolata pet samoniklih biljaka iz porodice Brassicaceae određen je

fericijanid metodom. Rezultati mjerenja predstavljaju koncentraciju (mg mL-1) ukupnih

glukozinolata koja je izračunata iz očitanih apsorbancija ekstrakata glukozinolata

pripremljenih kako je opisano pod 3.2.1.2. koristeći umjernu krivulju standarda – sinigrina

(Tablica 7.). Umjerna krivulja predstavlja ovisnost apsorbancije otopina sinigrina o

koncentraciji.

4.1.1. Umjerna krivulja

Otopine sinigrina različite koncentracije pripremljene su kako je opisano pod 3.2.1.1.. Svakoj

otopini izmjerena je apsorbancija pri 420 nm, a ovisnost apsorbancije o koncentraciji

prikazana je grafički (Slika 16.).

Tablica 7. Vrijednosti apsorbancija otopina sinigrina različite koncentracije

Apsorbancija (A) Koncentracija (c/mg mL-1)

1,027 0

0,688 0,230

0,286 0,691

0,258 0,922

0,226 1,152

Primjer proračuna koncentracije

Iz osnovne otopine sinigrina početne koncentracije 2,3041 mg/mL uzeto je 100 μL,

dopunjeno s 400 μL fosfatnog pufera i 500 μL kalij-fericijanida.

Korištenjem izraza

c1V1 = c2V2

izračunata je koncentracija otopine sinigrinau sustavu, odnosno u kiveti, za

spektrofotometrijsko mjerenje:

2,3041 mg/mL x 0,1 mL = c2 x 1 mL

c2 = 0,230 mg/mL

Slika 16. Umjerna krivulja sinigrina

4.1.2. Sadržaj ukupnih glukozinolata

Određivanje koncentracije ukupnih glukozinolata u ekstraktima istraživanih biljaka

provedeno je kako je opisano pod 3.2.1.3.. Mjerenja su ponovljena tri puta, tj. priprema

ekstrakta glukozinolata za svaku istraživanu biljku ponovljena je tri puta i svakom ekstraktu je

izmjerena apsorbancija pri 420 nm. Rezultati su prikazani u Tablicama 8.-10..

Tablica 8. Vrijednosti apsorbancija ekstrakata glukozinolata pet istraživanih biljaka

APSORBANCIJA

Streličasta

grbica

Sredozemna

rusomača

Jadranska

rumenica

Nepravilna

gorušika

Čunjasti

repušac

0,965 0,944 0,907 0,911 0,966

0,951 0,930 0,934 0,916 0,989

0,944 0,945 0,945 0,936 1,039

SREDNJA VRIJEDNOST APSORBANCIJE

0,953 0,940 0,929 0,921 0,998

Tablica 9. Koncentracija glukozinolata očitana iz umjerne krivulje

Apsorbancija (A) Koncentracija (mg mL-1)

Streličasta grbica 0,953 0,045

Sredozemna rusomača 0,940 0,055

Jadranska rumenica 0,929 0,058

Nepravilna gorušika 0,921 0,061

Čunjasti repušac 0,998 0,022

Primjer proračuna sadržaja ukupnih glukozinolata za streličastu grbicu

U uzorku volumena 1,0 mL korištenjem umjerne krivulje određena je koncentracija

koja iznosi 0,045 mg/mL. Uzorak je pripremljen iz 0,5 mL otopine glukozinolata te

slijedi:

0,045 mg --------- 1,0 mL

X mg --------- 0,5 mL

X = 0,023 mg/mL

Kako je 0,5 mL supernatanta uzeto iz otopine volumena 1,950 mL otopine slijedi:

0,023 mg --------- 0,5 mL

X mg --------- 1,950 mL

X = 0,088 mg u 1,950 mL

Budući da je svih 0,088 mg glukozinolata sadržano u 0,9 mL otopine uzete iz 10,5 mL

početne otopine glukozinolata slijedi:

0,088 mg---------0,9 mL

X mg---------10,5 mL

X = 1,027 mg glukozinolata u 10,5 mL otopine

10,5 mL otopine glukozinolata pripravljeno je iz 500 mg biljnog materijala pa iz

navedenog slijedi:

1,027 mg---------500 mg

X mg--------1000 mg

X = 2,054 mg glukozinolata u 1,0 g biljnog materijala

odnosno, sadržaj glukozinolata (%) = (2,054 mg / 1000 mg) x 100 = 0,205 %

Na isti način su dobiveni rezultati za ostale biljke.

Tablica 10. Koncentracija ukupnih glukozinolata u istraživanim biljkama

Streličasta

grbica

Sredozemn

a rusomača

Jadranska

rumenica

Nepravilna

gorušika

Čunjasti

repušac

Koncentracija (mg/g biljnog

materijala)2,054 2,503 2,639 2,776 1,001

Sadržaj glukozinolata

(%)0,205 0,250 0,264 0,278 0,100

4.2. Razgradni produkti glukozinolata

Hlapljivi spojevi i razgradni produkti glukozinolata izolirani su iz ispitivanih biljaka na tri

načina: vodenom destilacijom u modificiranoj aparaturi po Clevengeru (destilat),

ekstrakcijom nakon hidrolize endogenom mirozinazom (autolizat) te ekstrakcijom nakon

hidrolize egzogenom mirozinazom (hidrolizat). Postupak pripreme uzoraka opisan je u

poglavljima 3.2.2.1. i 3.2.2.2.. Svi uzorci analizirani su vezanim sustavom plinska

kromatografija-spektrometrija masa na dvije kolone (HP-5 i HP FFAP). Rezultati su prikazani

tabelarno (Tablice 11.-25.) a identificirani spojevi poredani su u tablicama prema redoslijedu

eluiranja s kolone HP-5. U radu su prikazani ogledni primjeri kromatograma (Slike 17.-31.)

ukupne ionske struje za uzorke hlapljivih razgradnih, odnosno hidrolitičkih, produkata

glukozinolata. Maseni udio pojedinih sastojaka u uzorcima izražen je u postocima i

predstavlja udio površine pika tog sastojka u ukupnoj površini (površina svih pikova na

kromatogramu).

4.2.1. Jadranska rumenica

Tablica 11. Kemijski sastav i udio hlapljivih spojeva u destilatu jadranske rumenice

______________________________________________________________________

Red. Spoj RIa) Maseni udio

broj HP-5/HP-FFAP (%)

_______________________________________________________________________

1. (E)-heks-2-en-1-alb " / 1338 5,7

2. (Z)-heks-3-en-1-olb " / - 1,0

3. heks-5-enonitrila " / 1476 28,8

4. etil-izotiocijanata " / - 3,6

5. 1,3-dimetilbenzenb " / - 0,9

6. sec-butil-izotiocijanata 938 / - 3,1

7. 5-metilheksanonitrila 950 / - 0,1

8. benzaldehidb 969 / - 0,1

9. heptanonitrila 985 / 1533 0,3

10. but-3-en-1-il-izotiocijanata,b 989 / 1590 18,8

11. (E,E)-hepta-2,4-dienalb 1018 / - 0,1

12. pent-4-en-1-il-izotiocijanat 1088 / 1679 11,3

13. 4,5-epitiopentanonitrila 1133 / 2137 6,7

14. benzenacetonitrila,b 1149 / 2112 5,1

15. etilbenzaldehidb 1172 / 1869 0,6

16. 5-(metiltio)pentanonitrila 1210 / - 0,5

(erucin nitril)

17. β-ciklocitralb 1228 / - 0,2

18. 5,6-epitioheksanonitrila 1256 / 2325 5,5

19. 6-(metiltio)heksanonitrila 1326 / 2283 5,5

(berteroin nitril)

20. (E)-β-jononb 1492 / - 0,7

21. 5-(metiltio)pentil-izotiocijanata 1558 / - 0,3

(berteroin)

22. tetradekanalb 1724 / - 1,3

_______________________________________________________________

Ukupno identificirano (%) 96,60

Iskorištenje (%) 0,009

Značenje simbola u tablici (kao i u svim sljedećim tablicama) je:a) - indeks zadržavanja na koloni HP-5, odnosno HP-FFAP

-, spoj nije detektiran

tr., trag (<0,1 %)

*, točan izomer nije identificiran

", RI izvan granica C8-C22 n-alkanaa Spoj identificiran usporedbom spektara masa i indeksa zadržavanja s onima iz literature i/ili

domaće baze Zavoda za organsku kemiju b Spoj identificiran uz pomoć usporedbom spektra masa s Wiley 275 i NIST02 bazama

podataka

Tablica 12. Kemijski sastav i udio hlapljivih spojeva u autolizatu jadranske rumenice

______________________________________________________________________



_______________________________________________________________________

1. (E)-heks-2-en-1-alb " / 1338 0,3

2. (Z)-heks-3-en-1-olb " / - 1,5



5. heptanonitrila 985 / - tr.


11. pent-4-en-1-il-izotiocijanata 1088 / 1679 2,0

12. 4,5-epitiopentanonitrila 1133 / 2137 50,0

13. benzenacetonitrila,b 1149 / 2112 0,9

14. 5,6-epitioheksanonitrila 1256 / 2325 18,5

15. eugenolb 1369 / 2404 0,7

16. 5-(metiltio)pentil-izotiocijanata 1558 / - 0,2

(berteroin)


________________________________________________________________



Tablica 13. Kemijski sastav i udio hlapljivih spojeva u hidrolizatu jadranske rumenice

______________________________________________________________________



_______________________________________________________________________




4. pent-4-en-1-il-izotiocijanata 1088 / 1679 15,3

5. 5-(metilsulfinil)pentil-izotiocijanata 1890 / - 9,5

(alisin)

6. heksadekanska kiselinab 1968 / 1,2

(palmitinska kis.)

_____________________________________________________________________



Slika 17. Kromatogram ukupne ionske struje za uzorak destilata jadranske

rumenice i spektar masa heks-5-enonitrila na koloni HP-5

Slika 18. Kromatogram ukupne ionske struje za uzorak autolizata jadranske

rumenice i spektar masa 4,5-epitiopentanonitrila na koloni HP-5

Slika 19. Kromatogram ukupne ionske struje za uzorak hidrolizata jadranske

rumenice i spektar masa but-3-en-1-il-izotiocijanata na koloni HP-5

4.2.2. Streličasta grbica

Tablica 14. Kemijski sastav i udio hlapljivih spojeva u destilatu streličaste grbice

______________________________________________________________________



_______________________________________________________________________

1. (E)-heks-2-en-1-alb " / 1338 0,7

2. (Z)-heks-3-en-1-olb " / - 0,2

3. izobutil-izotiocijanata 959 / - 0,1

4. fenilacetaldehidb 1053 / - 0,1

5. etilbenzaldehidb 1171 / - 0,2


(erucin nitril)

7. 3-(metiltio)propil-izotiocijanata 1321 / - 0,1

(iberverin)

8. 4-(metiltio)butil-izotiocijanata 1450 / 2371 96,4

(erucin)

9. (E)-β-jononb 1492 / - 0,6

10. diizobutilftalatb 1878 / - 0,3

________________________________________________________________



Tablica 15. Kemijski sastav i udio hlapljivih spojeva u autolizatu streličaste grbice

______________________________________________________________________



_______________________________________________________________________

1. (E)-heks-2-en-1-alb " / - 2,6

2. (Z)-heks-3-en-1-olb " / - 9,6

3. etil-izotiocijanata " / 1331 26,5

4. cikloheksanonb 901 / - 0,4



7. 4-(metiltio)butil-izotiocijanata 1450 / - 0,5

(erucin)

8. 4-(metilsulfinil)butil-izotiocijanata 1792 /- 57,3

(sulforafan)

________________________________________________________________



Tablica 16. Kemijski sastav i udio hlapljivih spojeva u hidrolizatu streličaste grbice

______________________________________________________________________



_______________________________________________________________________


2. heksanska kiselinab 974 / - 0,1

(kapronska kiselina)

3. S-metil-(metiltio)sulfinatb 985 / - 0,2


5. (E)-heks-2-enska kiselinab 1017 / - tr.

6. fenilacetaldehidb 1053 / - tr.

7. S-metil-(metiltio)sulfonatb 1038 / - tr.

8. p-krezolb 1087 / - 0,1


(erucin nitril)

10. 4-hidroksibenzaldehidb 1383 / - 0,1

11. vanilinb 1421 / - 0,2

12. 4-(metiltio)butil-izotiocijanata 1450 / 2371 2,3

(erucin)

13. 4-hidroksifenilacetonitrila,b 1540 / - 7,2

(sinalbin nitril)

14. 5-(metilsulfinil)pentanonitrila 1545 / 2420 4,5

(sulforafan nitril)

15. 5,6,7,7a-tetrahidro-4,4,7a-trimetil- 1558 / - 0,4

-2(4H)-benzofuranonb

16. 4-(metilsulfinil)butil-izotiocijanata 1792 / - 69,2

(sulforafan)

17. 4-(metilsulfonil)butil-izotiocijanata 1866 / - 5,0

(erisolin)


_____________________________________________________________________



Slika 20. Kromatogram ukupne ionske struje za uzorak destilata streličaste

grbice i spektar masa erucina na koloni HP-5

Slika 21. Kromatogram ukupne ionske struje za uzorak autolizata streličaste

grbice i spektar masa sulforafana na koloni HP-5

Slika 22. Kromatogram ukupne ionske struje za uzorak hidrolizata streličaste

grbice i spektar masa erisolina na koloni HP-5

4.2.3. Sredozemna rusomača

Tablica 17. Kemijski sastav i udio hlapljivih spojeva u destilatu sredozemne rusomače

______________________________________________________________________



_______________________________________________________________________

1. (E)-heks-2-en-1-alb " / 1338 3,4

2. (Z)-heks-3-en-1-olb " / 1478 6,6

3. (E)-heks-2-en-1-olb " / 1478 1,5

4. alil-izotiocijanata,b " / - 6,3

5. 3,4-epitiobutanonitrila " / 1488 67,8


7. dimetil-trisulfidb 978 / 1517 2,3



10. 3-metilbutil-izotiocijanata 1066 / 1562 0,8

11. nonanalb 1109 / - 0,9

12. 4-metilpentil-izotiocijanata 1170 / 1678 0,5

13. β-ciklocitralb 1227 / 1771 0,3

14. 3-(metiltio)propil-izotiocijanata 1321 / 2183 0,5

(iberverin)

15. (E)-β-jononb 1492 / 2111 0,9


17. 10-(metiltio)dekanonitrila 1748 / - 0,9

18. 11-(metiltio)undekanonitrila 1854 / - 0,9


20. 9-(metiltio)nonil-izotiocijanata 1988 / - 0,2

________________________________________________________________



Tablica 18. Kemijski sastav i udio hlapljivih spojeva u autolizatu sredozemne rusomače

______________________________________________________________________



_______________________________________________________________________

1. (E)-heks-2-en-1-alb " / - 1,7

2. (Z)-heks-3-en-1-olb " / - 2,7




6. α-pinenb 940 / 1127 3,2

7. kamfenb 956 / - 0,6

8. heptenalb 961 / 1451 1,2

9. dimetil-trisulfidb 978 / - 0,2

10. but-3-en-1-il-izotiocijanata,b 989 / - 0,3

11. (E,E)-hepta-2,4-dien-1-alb 1018 / 1600 0,3

12. 1,8-cineolb 1038 / - 0,5

13. undekanb 1103 / - 0,4

14. nonanalb 1109 / - 0,3

15. dodekanb 1204 / - 0,4

16. 1,3-di-tert-butil benzenb 1260 / 1547 0,9

17. (E)-dek-2-en-1-alb 1270 / - 2,2

18. (E,Z)- deka-2,4-dien-1-alb 1300 / 1918 0,4

19. (E,E)- deka-2,4-dien-1-alb 1325 / 1969 0,9

20. dibutilftalatb 1974 / - 1,5

________________________________________________________________



Tablica 19. Kemijski sastav i udio hlapljivih spojeva u hidrolizatu sredozemne rusomače

______________________________________________________________________



_______________________________________________________________________




4. heptenalb 961 / - 0,9

5. nonadekanb 1061 / - 1,1

6. undekanb 1103 / - 0,4

7. 1,3-di-tert-butil benzenb 1260 / - 2,7

8. (E)-β-jononb 1492 / - 0,5

9. 5,6,7,7a-tetrahidro- 1538 / - 3,6

2-(4H)-benzofuranonb

10. 1,2-difeniletandionb 1823 / - 4,4

11. dibutilftalatb 1974 / - 0,3

________________________________________________________________


Iskorištenje (mg/kg) 0,563

Slika 23. Kromatogram ukupne ionske struje za uzorak destilata sredozemne rusomače i

spektar masa alil-izotiocijanata na koloni HP-5

Slika 24. Kromatogram ukupne ionske struje za uzorak autolizata sredozemne rusomače

i spektar masa 3,4-epitiobutanonitrila na koloni HP-5

Slika 25. Kromatogram ukupne ionske struje za uzorak hidrolizata sredozmne rusomače

i spektar masa etil-izotiocijanata na koloni HP-5

4.2.4. Nepravilna gorušika

Tablica 20. Kemijski sastav i udio hlapljivih spojeva u destilatu nepravilne gorušike

______________________________________________________________________



_______________________________________________________________________

1. (E)-heks-2-en-1-alb " / 1338 0,2

2. (Z)-heks-3-en-1-olb " / 1478 1,3


4. 1,8-cineolb 1038 / 1319 0,1

5. 4-(metiltio)butanonitrila 1092 / 1956 0,2

(iberverin nitril)

6. etilbenzaldehidb 1171 / 1869 0,1


(iberverin)

8. benzil-izotiocijanata 1376 / - 0,1

9. 4-(metiltio)butil-izotiocijanata 1450 / - 0,2

(erucin)

10. (E)-β-jononb 1492 / 2111 0,4


________________________________________________________________



Tablica 21. Kemijski sastav i udio hlapljivih spojeva u autolizatu nepravilne gorušike

______________________________________________________________________



_______________________________________________________________________

1. (E)-heks-2-en-1-alb " / 1338 0,6

2. (Z)-heks-3-en-1-olb " / 1478 8,2




(iberverin nitril)


(iberverin)

7. (E)-β-jononb 1492 / - 0,2

8. 3-(metilsulfinil)propil-izotiocijanata 1643 / - 40,0

(iberin)

9. 3-(metilsulfonil)propil-izotiocijanata 1710 / - 0,6

(heirolin)

________________________________________________________________



Tablica 22. Kemijski sastav i udio hlapljivih spojeva u hidrolizatu nepravilne gorušike

______________________________________________________________________



_______________________________________________________________________

1. 3,4-epitiobutanonitrila " / - 0,7

2. heptenalb 964 / - 1,3

3. (E,E)-hepta-2,4-dien-1-alb 1018 / - 2,2

4. 1,8-cineolb 1038 / 1319 2,1


(iberverin nitril)

6. (E)-dek-2-en-1-alb 1270 / - 3,0


(iberverin)

8. 3-(metilsulfinil)propil-izotiocijanata 1643 / - 16,7

(iberin)

9. 3-(metilsulfonil)propil-izotiocijanata 1710 / - 7,9

(heirolin)

________________________________________________________________



Slika 26. Kromatogram ukupne ionske struje za uzorak destilata nepravilne

gorušike i spektar masa iberverina na koloni HP-5

Slika 27. Kromatogram ukupne ionske struje za uzorak autolizata nepravilne

gorušike i spektar masa iberina na koloni HP-5

Slika 28. Kromatogram ukupne ionske struje za uzorak hidrolizata nepravilne

gorušike i spektar masa heirolina na koloni HP-5

4.2.5. Čunjasti repušac

Tablica 23. Kemijski sastav i udio hlapljivih spojeva u destilatu čunjastog repušca

______________________________________________________________________



_______________________________________________________________________

1. (E)-heks-2-en-1-alb " / 1338 7,5

2. (Z)-heks-3-en-1-olb " / 1478 13,1

3. (E)-heks-2-en-1-olb " / - 19,9


5. benzaldehidb 969 / - 0,4

6. dimetil-trisulfidb 978 / 1517 1,5

7. heptanonitrila 985 / - 0,3


9. (E,E)-hepta-2,4-dien-1-alb 1018 / - 0,3


11. nonanalb 1109 / - 0,2

12. benzenacetonitrila,b 1149 / - 0,1

13. 5-(metiltio)pent-4-enonitril*a 1193 / 2120 10,1


(erucin nitril)

15. 5-(metiltio)pent-4-enonitril* a 1227 / 2239 8,3

16. dekanolb 1283 / - 0,7

17. undekanalb 1313 / - 2,9

18. 4-vinil-2-metoksi-fenolb 1326 / 2449 5,1

19. dodekanalb 1416 / - 0,4

20. 4-(metiltio)but-3-en-1-il-izotiocijanat* a 1425 / - 1,8

21. 4-(metiltio)butil-izotiocijanat a 1450 / 2371 14,7

(erucin)

22. (E)-β-jononb 1492 / - 2,6

23. tridekanalb 1518 / - 0,7

________________________________________________________________



Tablica 24. Kemijski sastav i udio hlapljivih spojeva u autolizatu čunjastog repušca

______________________________________________________________________



_______________________________________________________________________

1. (Z)-heks-3-en-1-olb " / 1478 22,4


3. dimetil-trisulfidb 978 / - 0,5

4. but-3-en-1-il-izotiocijanata,b 989 / - 0,8

5. nonadekanb 1061 / - 0,4

6. undekanb 1103 / - 0,9

7. 5-(metiltio)pent-4-enonitril* a 1227 / 2239 1,7

8. 1,3-bis (1,1-dimetiletil)-benzenb 1260 / - 0,5

9. (E)-β-jononb 1492 / - 0,5

10. 2,4-bis (1,1-dimetiletil)-fenolb 1527 / - 0,5

11. 4-(metiltio)but-3-en-1-il-izotiocijanat* a 1768 / - 8,0

________________________________________________________________



Tablica 25. Kemijski sastav i udio hlapljivih spojeva u hidrolizatu čunjastog repušca

______________________________________________________________________



_______________________________________________________________________

1. but-3-en-1-il-izotiocijanata,b 989 / 1590 tr.

2. 2,6-bis (1,1-dimetiletil)-fenolb 1521 / - 8,2

3. 4-hidroksifenilacetonitrila,b 1540 / - 87,9

(sinalbin nitril)

________________________________________________________________



Slika 29. Kromatogram ukupne ionske struje za uzorak destilata čunjastog

repušca i spektar masa 5-(metiltio)pent-4-enonitrila na koloni HP-5

Slika 30. Kromatogram ukupne ionske struje za uzorak autolizata čunjastog

repušca i spektar masa 4-(metiltio)but-3-en-1-il-izotiocijanata na koloni

HP-5

Slika 31. Kromatogram ukupne ionske struje za uzorak hidrolizata čunjastog

repušca i spektar masa sinalbin nitrila na koloni HP-5

4.3. Antimikrobna aktivnost razgradnih produkata glukozinolata

Antimikrobna aktivnost razgradnih produkata glukozinolata određena je metodom disk-

difuzije i metodom određivanja minimalne inhibitorne koncentracije (MIK) (Tablice 27.-36.).

U radu su korišteni kontrolni laboratorijski sojevi mikroorganizama ATCC (engl. American

Type Culture Collection), mikroorganizmi nabavljeni od Prehrambeno-tehnološkog fakulteta

u Osijeku (PTFOS) i Prirodoslovno-matematičkog fakulteta u Splitu (PMFST) te klinički

izolati mikroorganizama Zavoda za javno zdravstvo iz Osijeka (Tablica 26.).

Tablica 26. Mikroorganizmi korišteni za ispitivanje antimikrobne aktivnosti

Mikroorganizmi Sojevi

Gram pozitivne bakterije

Bacillus cereus ATCC 11778, klinički izolat

Enterococcus faecalis ATCC 29212, klinički izolat

Staphylococcus aureus ATCC 25923, PTFOS

Gram negativne bakterije

Escherichia coli PMFST 982, klinički izolat

Klebsiella pneumoniae PMFST 011, PTFOS

Pseudomonas aeruginosa PMFST 014, PTFOS

Gljivice

Candida albicans ATCC 6275, PTFOS

Penicillium sp. PMFST 3725, PTFOS

Rhizopus stolonifer PMFST 3833, klinički izolat

Tablica 27. Antimikrobno djelovanje razgradnih produkata jadranske rumenice određeno metodom minimalne inhibitorne koncentracije (MIK)

127


Razgradni produkti

glukozinolataStandardni antibiotici

Destilat*

(µg/mL)

Autolizat

(mg/mL)

Hidrolizat*

(µg/mL)

Ampicillin

(µg/mL)

Gentamicin

(µg/mL)


Bacillus cereus ATCC 11778*, klinički izolat 32,0 1,5 16,0 0,50 4,0

Enterococcus faecalis ATCC 29212*, klinički izolat 16,0 3,0 32,0 0,64 4,0

Staphylococcus aureus ATCC 25923*, PTFOS 32,0 1,5 16,0 0,25 1,2


Escherichia coli PMFST 982*, klinički izolat 32,0 3,0 32,0

Klebsiella pneumoniae PMFST 011*, PTFOS 32,0 3,0 32,0

Pseudomonas aeruginosa PMFST 014*, PTFOS 8,0 1,5 16,0

GljiviceAmphotericin B

(µg/mL)

Candida albicans ATCC 6275*, PTFOS 2,0 1,5 16,0 1,0

Penicillium sp. PMFST 3725*, PTFOS 8,0 1,5 32,0 4,0

Rhizopus stolonifer PMFST 3833*, klinički izolat 2,0 1,5 16,0 2,0

Tablica 28. Antimikrobno djelovanje razgradnih produkata jadranske rumenice određeno metodom disk difuzije


Razgradni produkti


Destilat*

(250 µg/disk)

Autolizat

(100 µg/disk)

Hidrolizat*

(250 µg/disk)

Ampicillin

(30 µg/disk)

Gentamicin

(15 µg/disk)






Escherichia coli PMFST 982*, klinički izolat 19,7 9,5 19,3 6,0 21,5

Klebsiella pneumoniae PMFST 011*, PTFOS 18,5 10,5 18,1 6,0 19,3

Pseudomonas aeruginosa PMFST 014*, PTFOS 15,2 10,0 15,4 6,0 15,4


(10 µg/disk)




128

Tablica 29. Antimikrobno djelovanje razgradnih produkata streličaste grbice određeno metodom minimalne inhibitorne koncentracije (MIK)


Razgradni produkti


Destilat

(mg/mL)

Autolizat

(mg/mL)

Hidrolizat*

(µg/mL)

Ampicillin

(µg/mL)

Gentamicin

(µg/mL)






Escherichia coli PMFST 982*, klinički izolat 1,5 1,5 128,0

Klebsiella pneumoniae PMFST 011*, PTFOS 1,5 1,5 128,0

Pseudomonas aeruginosa PMFST 014*, PTFOS 1,5 1,5 128,0


(µg/mL)




129

Tablica 30. Antimikrobno djelovanje razgradnih produkata streličaste grbice određeno metodom disk difuzije


Razgradni produkti


Destilat

(100 µg/disk)

Autolizat

(100 µg/disk)

Hidrolizat*

(250 µg/disk)

Ampicillin

(30 µg/disk)

Gentamicin

(15 µg/disk)






Escherichia coli PMFST 982*, klinički izolat 13,0 10,5 14,6 6,0 21,5

Klebsiella pneumoniae PMFST 011*, PTFOS 12,25 9,5 15,3 6,0 19,3

Pseudomonas aeruginosa PMFST 014*, PTFOS 12,0 8,0 12,3 6,0 15,4


(10 µg/disk)


Penicillium sp. PMFST 3725*, klinički izolat 9,25 8,5 18,1 17,2


130

Tablica 31. Antimikrobno djelovanje razgradnih produkata sredozemne rusomače određeno metodom minimalne inhibitorne koncentracije (MIK)


Razgradni produkti


Destilat

(mg/mL)

Autolizat

(mg/mL)

Hidrolizat

(mg/mL)

Ampicillin

(µg/mL)

Gentamicin

(µg/mL)


Bacillus cereus klinički izolat 1,5 1,5 1,5 0,50 4,0

Enterococcus faecalis klinički izolat 3,0 3,0 3,0 0,64 4,0

Staphylococcus aureus PTFOS 1,5 1,5 1,5 0,25 1,2


Escherichia coli klinički izolat 1,5 1,5 3,0

Klebsiella pneumoniae PTFOS 0,75 0,75 1,5

Pseudomonas aeruginosa PTFOS 1,5 1,5 1,5


(µg/mL)

Candida albicans PTFOS 1,5 1,5 1,5 1,0

Penicillium sp. klinički izolat 1,5 1,5 3,0 4,0

Rhizopus stolonifer klinički izolat 1,5 1,5 1,5 2,0

131

Tablica 32. Antimikrobno djelovanje razgradnih produkata sredozemne rusomače određeno metodom disk difuzije

132


Razgradni produkti


Destilat

(100 µg/disk)

Autolizat

(100 µg/disk)

Hidrolizat

(100 µg/disk)

Ampicillin

(30 µg/disk)

Gentamicin

(15 µg/disk)






Escherichia coli klinički izolat 11,25 9,25 9,63 6,0 21,5

Klebsiella pneumoniae PTFOS 0 9,75 9,75 6,0 19,3

Pseudomonas aeruginosa PTFOS 8,5 10,25 8,5 6,0 15,4


(10 µg/disk)




Tablica 33. Antimikrobno djelovanje razgradnih produkata nepravilne gorušike određeno metodom minimalne inhibitorne koncentracije (MIK)


Razgradni produkti


Destilat

(mg/mL)

Autolizat

(mg/mL)

Hidrolizat

(mg/mL)

Ampicillin

(µg/mL)

Gentamicin

(µg/mL)










(µg/mL)




133

Tablica 34. Antimikrobno djelovanje razgradnih produkata nepravilne gorušike određeno metodom disk difuzije


Razgradni produkti


Destilat

(100 µg/disk)

Autolizat

(100 µg/disk)

Hidrolizat

(100 µg/disk)

Ampicillin

(30 µg/disk)

Gentamicin

(15 µg/disk)






Escherichia coli klinički izolat 0 9,75 8,25 6,0 21,5

Klebsiella pneumoniae PTFOS 14,0 0 8,5 6,0 19,3

Pseudomonas aeruginosa PTFOS 12,5 9,5 9,0 6,0 15,4


(10 µg/disk)



Rhizopus stolonifer klinički izolat 0 9,75 8,25 19,0

134

Tablica 35. Antimikrobno djelovanje razgradnih produkata čunjastog repušca određeno metodom minimalne inhibitorne koncentracije (MIK)


Razgradni produkti


Destilat

(mg/mL)

Autolizat

(mg/mL)

Hidrolizat

(mg/mL)

Ampicillin

(µg/mL)

Gentamicin

(µg/mL)










(µg/mL)




135

Tablica 36. Antimikrobno djelovanje razgradnih produkata čunjastog repušca određeno metodom disk difuzije


Razgradni produkti


Destilat

(100 µg/disk)

Autolizat

(100 µg/disk)

Hidrolizat

(100 µg/disk)

Ampicillin

(30 µg/disk)

Gentamicin

(15 µg/disk)




Staphylococcus aureus PTFOS 11,5 12,0 0 26,5 18,3


Escherichia coli klinički izolat 11,0 11,63 8,75 6,0 21,5

Klebsiella pneumoniae PTFOS 10,5 10,25 9,0 6,0 19,3

Pseudomonas aeruginosa PTFOS 0 11,0 9,0 6,0 15,4


(10 µg/disk)




136

5. Rasprava

U ovom radu istraživani su glukozinolati pet neistraženih ili nedovoljno istraženih

samoniklih biljaka porodice Brassicaceae: jadranske rumenice (Aurinia leucadea (Guss.) K.

Koch), streličaste grbice (Cardaria draba (L.) Desv.), sredozemne rusomače (Capsella

rubella Reut.), nepravilne gorušike (Calepina irregularis (Asso) Thell.) i čunjastog repušca

(Bunias erucago L.). Ove biljke su rasprostranjene u mediteranskom dijelu Hrvatske, a

sabrane su na području Splita (park šuma Marjan).

Određivanje sadržaja ukupnih glukozinolata bio je prvi korak u istraživanju kojim je

dokazana prisutnost ove grupa spojeva i određen njihov udio u ispitivanim biljkama. U

nastavku istraživanja identificirani su pojedinačni glukozinolati pri čemu je korištena

indirektna metoda analize u kojoj se preko razgradnih produkata glukozinolata zaključuje o

prisustvu njihovih nehlapljivih preteča - glukozinolata. Indirektna metoda analize

glukozinolata sastoji se od enzimske hidrolize ili neenzimske razgradnje glukozinolata,

izolacije hlapljivih razgradnih produkata klasičnim laboratorijskim metodama (destilacija,

ekstrakcija) i njihove analize spregnutim sustavom plinska kromatografija - spektrometrija

masa. U ovom radu provedena je toplinska razgradnja i enzimska, endogena i egzogena,

hidroliza glukozinolata. Istraživanje je zaokruženo ispitivanjem antimikrobne aktivnosti

uzoraka razgradnih produkata glukozinolata dobivenih toplinskom razgradnjom i enzimskom

hidrolizom pri čemu su korištene dvije metode, metoda disk difuzije i metoda minimalne

inhibicijske koncentracije.


Iako određivanje sadržaja ukupnih glukozinolata gubi na aktualnosti napretkom

instrumentnih analitičkih metoda određivanja pojedinačnih glukozinolata, ipak je poželjno,

posebice ako se radi o dosad neistraživanom biljnom materijalu. Naime, određivanje sadržaja

ukupnih glukozinolata brzim i jednostavnim metodama služi kao prvi pokazatelj prisustva

ovih spojeva u biljnom materijalu i polazna točka u cijelovitom istraživanju.

U ovom radu je za određivanje sadržaja ukupnih glukozinolata korištena jednostavna

spektrofotometrijska metoda poznata kao fericijanid metoda. Metoda se temelji na alkalnoj

hidrolizi glukozinolata nakon koje slijedi reakcija oslobođene 1-tioglukoze s fericijanidom.

Zbog kromogenosti fericijanida reakciju je moguće pratiti spektrofotometrijski. Da bi se

odredio sadržaj glukozinolata u biljnom materijalu potrebno je koristiti čiste glukozinolate

koji služe kao standardi za pripremu umjerne krivulje. To su najčešće glukozinolati sinigrin i

glukotropeolin. U ovom je radu kao standard korišten sinigrin.

Odabrana metoda je prvotno razvijena za određivanje sadržaja ukupnih glukozinolata

u uljanoj repici.56 Ovim istraživanjem je pokazano da je primjenjiva i na druge biljke koje

sadrže glukozinolate, što je dodatno potvrđeno nedavnim istraživanjem Petersona i

suradnika79 koji su metodu neznatno modificirali i validirali na povrću roda Brassica.

Metoda je brza, relativno jednostavna, a oprema jeftina. Budući da je neenzimska ne javljaju

se problemi koji se tiču aktivnosti i čistoće enzima. Inkubacijski period je relativno kratak (30

min), a reagensi su jednostavni i sigurni (stabilni, neotrovni). Dobiveni rezultati su

reproducibilni.

Postupak određivanja sadržaja ukupnih glukozinolata može se podijeliti u tri dijela:

priprema otopina standarda (sinigrina) različitih koncentracija, mjerenje apsorbancija

tih otopina te formiranje umjerne krivulje,

ekstrakcija glukozinolata iz biljnog materijala,

alkalna razgradnja glukozinolata, reakcija fericijanida s nastalim razgradnim

produktima glukozinolata te mjerenje apsorbancije rezultirajućih otopina.56, 69

Prilikom svakog od ovih koraka potrebno je obratiti pažnju na potencijalne probleme

koji se mogu javiti. Primjerice, biljni materijal sadrži čitav niz različitih prirodnih spojeva

(fenolne spojeve, ugljikohidrate, proteine, itd.) koji mogu predstavljati smetnju u određivanju

glukozinolata na opisani način pa ih treba ukloniti iz ekstrakta glukozinolata prije hidrolize.

Fenolni spojevi se lako oksidiraju te se "natječu" s 1-tioglukozom u redukciji fericijanida.

Zbog toga se uklanjaju iz ekstrakta adsorpcijom na polivinilpolipirolidonu. Proteini prisutni u

biljnom materijalu čine ekstrakt mutnim što otežava daljnje spektrofotometrijsko određivanje,

pa ih je potrebno ukloniti taloženjem sa olovov/barijevim acetatom.

Također, postoje praktični razlozi zbog kojih se alkalna hidroliza glukozinolata i

redukcija fericijanida oslobođenom 1-tioglukozom moraju provesti u dva odvojena koraka.

Poznato je da se fericijanid reducira s hidroksidom, pa, iako je ta reakcija spora, pri visokim

pH može interferirati s reakcijom redukcije fericijanida s 1-tioglukozom. Još je važniji utjecaj

ostalih spojeva prisutnih u realnom uzorku kakav je biljni materijal, npr. reducirajući šećeri se

u alkalnom mediju razgrađuju na manje molekule koje reagiraju s fericijanidom. Tako je

poznato da u alkalnom mediju razgradni produkti glukoze brzo reagiraju s fericijanidom.

Nadalje, 1-tioglukoza koja nastaje alkalnom razgradnjom glukozinolata podliježe daljnoj

razgradnji, a nastali produkti također reagiraju s fericijanidom. Da bi se izbjegle navedene

smetnje nakon alkalne hidrolize glukozinolata reakcijska smjesa se neutralizira dodatkom

konc. HCl. Tek se tada u neutralnu otopinu razgradnih produkata dodaje neutralna otopina

fericijanida. Ovakav postupak se naziva "pH preokret" (od engl. pH switch).56 Miješanjem

otopine razgradnih produkata glukozinolata i otopine fericijanida dolazi do redukcije

fericijanida što je vidljivo po promjeni boje rezultirajuće otopine od svijetlo žute ka

intenzivno žutoj, a prati se spektrofotometrijski pri 420 nm.

Rezultati određivanja sadržaja ukupnih glukozinolata iz nadzemnih dijelova pet

samoniklih biljaka porodice Brassicaceae prikazani su u Tablici 10. Sadržaj glukozinolata

naveden u tablici (izražen u % i mg/g biljnog materijala) određen je grafički pomoću umjerne

krivulje za sinigrin (Slika 16.). Iz rezultata je vidljivo da, u skladu s očekivanjima, sve

istraživane biljke sadrže glukozinolate, ali u različitim količinama. Glukozinolatima

najbogatija biljka je nepravilna gorušika (0,278 % ili 2,776 mg/g biljnog materijala ), slijede

jadranska rumenica (0,264 % ili 2,639 mg/g biljnog materijala), sredozemna rusomača (0,250

% ili 2,503 mg/g biljnog materijala), streličasta grbica (0,205 % ili 2,054 mg/g biljnog

materijala) i, glukozinolatima najsiromašniji, čunjasti repušac (0,100 % ili 1,001 mg/g biljnog

materijala).

Pregledom literature nisu pronađeni radovi u kojima je određivan sadržaj ukupnih

glukozinolata u cjelokupnom biljnom materijalu (svi nadzemni dijelovi, list, stabljika, cvijet i

sjeme) ispitivanih biljaka, što je bio predmet istraživanja ovog rada. Jedino su Daxenbichler i

sur. odredili sadržaj ukupnih glukozinolata u sjemenu streličaste grbice (pregledni rad iz

1991. godine).60

.


5.2.1. Jadranska rumenica

S obzirom da je jadranska rumenica endemična biljka s područja Apeninskog i Balkanskog

poluotoka, ne iznenađuje što je slabo istražena. Tako su Daxenbichler i suradnici istraživali

kemijski sastav glukozinolata u sjemenu dviju biljaka iz roda Aurinia, A. saxatilis i A.

saxatilis ssp. orientalis. Identificirali su 4 glukozinolata u sjemenu A. saxatilis i 6

glukozinolata u sjemenu A. saxatilis ssp. orientalis. Glukozinolati zajednički u obje biljke su

glukoberteroin, glukonapin i glukobrasikanapin, u podvrsti orientalis identificirani su još i

glukoalisin, glukođiabutin, glukoerucin, a u A. saxatilis glukoiberin.60 U Zavodu za organsku

kemiju KTF-a istraživani su glukozinolati dviju hrvatskih biljaka iz roda Aurinia, izverugane

gromotulje (A. sinuata) i jadranske rumenice (A. leucadea). Na temelju rezultata GC/MS

analiza razgradnih produkata glukozinolata Blažević i suradnici su u obje biljke identificirali

7 istih glukozinolata: glukoalisin, glukonapin, glukođiabutin, glukobrasikanapin,

glukotropeolin, glukoerucin i glukoberteroin. U biljci A. sinuata identificiran je još

glukoleskverelin, a u biljci A. leucadea glukorafanin.76,78

U ovom radu istraživani su glukozinolati jadranske rumenice (A. leucadea) pri čemu je

za njihovu identifikaciju korišena indirektna metoda koja se sastoji od toplinske ili enzimske

razgradnje glukozinolata, izolacije hlapljivih razgradnih produkata destilacijom ili

ekstrakcijom te njihove identifikacije spregnutom tehnikom plinska kromatografija-

spektrometrija masa (GC/MS). Glukozinolati jadranske rumenice identificirani na temelju

GC/MS analiza njihovih razgradnih produkata (Tablice 11.-13.) prikazani su u Tablici 37.

Ukupno je identificirano 10 glukozinolata: glukobrasikanapin, glukonapin, glukoberteroin,

glukotropeolin, glukolepidiin, glukođiabutin, glukoerucin, heksil glukozinolat, 4-metilpentil

glukozinolat i glukoalisin. Sedam identificiranih glukozinolata istovjetno je onima

identificiranim u biljci A. leucadea i navedenim u radu Blaževića i suradnika.78 U ovom radu

su osim navedenih glukozinolata identificirani još i 4-metilpentil glukozinolat, heksil

glukozinolat i glukolepidiin, dok glukorafanin nije identificiran u uzorcima dobivenim na

opisani način.

Najviše glukozinolata je identificirano u destilatu u kojem su identificirani razgradni

produkti svih glukozinolata osim glukoalisina. Alisin (5-(metilsulfinil)pentil-izotiocijanat),

razgradni produkt glukoalisina je strukturni analog sulforafana (4-(metilsulfinil)butil-

izotiocijanat) za kojeg je poznato da je termolabilan.80,81 Toplinska nestabilnost alisina

vjerojatno je razlog zbog kojeg ovaj spoj nije identificiran u destilatu. Najzastupljeniji

glukozinolat u destilatu je glukobrasikanapin čiji razgradni produkti heks-5-enonotril (28,8

%), pent-4-en-1-il-izotiocijanat (11,3 %) i 5,6-epitioheksanonitril (5,5 %) čine 45,6 %

masenog udjela u uzorku (Slika 32.). Heks-5-enonitril je ujedno i glavni pojedinačni sastojak

destilata jadranske rumenice. Drugi po zastupljenosti je glukonapin (Slika 33.) jer su u uzorku

kao količinski značajni sastojci identificirani njegovi razgradni produkti but-3-en-1-il-

izotiocijanat (18,8 %) i 4,5-epitiopentanonitril (6,7 %). Pent-4-enonitril, koji također može

nastati razgradnjom glukonapina, nije identificiran u destilatu, ali ni u autolizatu i hidrolizatu

jadranske rumenice. Osim navedenih spojeva u destilatu identificirani su još i: 6-

(metiltio)heksanonitril (5,5 %) i 5-(metiltio)pentil-izotiocijanat (0,3 %) - razgradni produkti

glukoberteroina, benzenacetonitril (5,1 %) - razgradni produkt glukotropeolina, etil-

izotiocijanat (3,6 %) - razgradni produkt glukolepidiina, sec-butil-izotiocijanat (3,1 %) -

razgradni produkt glukođiabutina, 5-(metiltio)pentanonitril (0,5 %) - razgradni produkt

glukoerucina, heptanonitril (0,3 %) - razgradni produkt heksil glukozinolata i 5-

metilheksanonitril (0,1 %) - razgradni produkt 4-metilpentil glukozinolata.

U autolizatu jadranske rumenice identificirano je 9 razgradnih produkata

glukozinolata, a time, indirektno i 6 glukozinolata: glukonapin, glukobrasikanapin,

glukođiabutin, glukotropeolin, glukoberteroin i heksil glukozinolat. Glavni sastojci ovog

uzorka su epitionitrili 4,5-epitiopentanonitril (50,0 %) i 5,6-epitioheksanonitril (18,5 %), a

slijede but-3-en-1-il-izotiocijanat (16,2 %) i pent-4-en-1-il-izotiocijanat (2,0 %). Navedeni

spojevi nastaju razgradnjom glukonapina i glukobrasikanapina. Ostali razgradni produkti

glukozinolata identificirani u autolizatu su: heks-5-enonitril (1,4 %), također razgradni

produkt glukobrasikanapina, sec-butil-izotiocijanat (1,0 %), razgradni produkt

glukođiabutina, benzenacetonitril (0,9 %), razgradni produkt glukotropeolina, 5-(metiltio)-

pentil-izotiocijanat (0,2 %), razgradni produkt glukoberteroina i heptanonitril (tr.), razgradni

produkt heksil glukozinolata. Iz navedenog je vidljivo da su u autolizatu najzastupljeniji

razgradni produkti glukonapina (ukupno 66,2 %) i glukobrasikanapina (21,9 %).

O

H

HO

H

OH

H

HO

H

OH

H

SC

N

O3SO-

GLUKOBRASIKANAPIN

C

N

O3SO-

HSO4-

Lossenovapregradnja

NC

S

+ S

pent-4-en-1-il-izotiocijanat

HSO4-

pH 7

CN

CN

heks-5-enonitril

S

5,6-epitioheksanonitril

ESP, Fe2+

mirozinaza D-glukoza

HS

Slika 32. Shematski prikaz razgradnje glukobrasikanapina

Razgradnim produktima glukozinolata, odnosno glukozinolatima, najsiromašniji je

hidrolizat jadranske rumenice. U hidrolizatu je identificirano 5 spojeva koji nastaju

razgradnjom 4 glukozinolata: glukonapina, glukobrasikanapina, glukoalisina i glukođiabutina.

Glavni sastojak ovog uzorka je but-3-en-1-il-izotiocijanat (71,8 %), razgradni produkt

glukonapina, a slijede pent-4-en-1-il-izotiocijanat (15,3 %) i heks-5-enonitril (0,9 %),

razgradni produkti glukobrasikanapina, 5-(metilsulfinil)pentil-izotiocijanat (9,5 %), razgradni

produkt glukoalisina i sec-butil-izotiocijanat (1,3 %), razgradni produkt glukođiabutina. Kao i

u autolizatu i u hidrolizatu najzastupljeniji su razgradni produkti glukonapina (71,8 % ) i

glukobrasikanapina (16,2 %).

Za razliku od uzorka hlapljivih spojeva izoliranog vodenom destilacijom i uzorka

hlapljivih spojeva izoliranog ekstrakcijom nakon djelovanja egzogene mirozinaze, uzorak

hlapljivih spojeva izoliran ekstrakcijom nakon djelovanja endogene mirozinaze sadrži

epitionitrile u velikom postotku (68,5 %). Poznato je da je nastanak epitionitrila posljedica

prisustva epitiospecifičnog proteina (ESP) koji se nalazi u biljnom materijalu te da su za

njegovu aktivnost potrebni Fe2+ ioni.82 Također je poznato da je ESP relativno osjetljiv na

toplinu u usporedbi sa enzimom mirozinazom, i čak kratko kuhanje ga inaktivira, dok

mirozinaza u istim uvjetima ostaje aktivna (Matusheski i sur., 2003, 2004).83,84 Stoga je bilo za

očekivati da će sadržaj epitionitrila u destilatu biti nizak (12,2 %). U hidrolizatu epitionitrili

uopće nisu identificirani što se, znajući da je za pripravu hidrolizata korišten suhi biljni

materijal, a za ostala dva uzorka svježi, može objasniti sušenjem biljnog materijala čime je

vjerojatno umanjena aktivnost ESP-a prisutnog u biljnom materijalu. Usporedbom kemijskog

sastava destilata i hidrolizata može se zaključiti da je ESP vjerojatno osjetljiviji na sušenje

nego na toplinu. Naime, epitionitrili su, iako u manjoj količini, identificirani u destilatu, gdje

je svježi biljni materijal kuhan 2,5 sata. U hidrolizatu epitionitrili nisu identificirani iako je

suhi biljni materijal, radi inaktiviranja endogene mirozinaze, kuhan 5 minuta.

Osim spojeva sa sumporom i/ili dušikom u uzorcima su u malom postotku

identificirani i neki drugi spojevi. To su uglavnom alifatski spojevi (alkoholi, karbonili,

kiseline) za koje se smatra da potječu od katabolizma masnih kiselina te aromatski spojevi

(alkoholi, karbonili) koji najvjerovatnije potječu od katabolizma cimetne kiseline.72,73 Tako su

u destilatu i autolizatu identificirani (E)-heks-2-en-1-al i (Z)-heks-3-en-1-ol, tzv. "lisni"

aldehid i alkohol, benzaldehid, (E,E)-hepta-2,4-dienal, etilbenzaldehid, aldehid miristinske

kiseline, β-ciklocitral, (E)-β-jonon i eugenol. U hidrolizatu je, iz ove grupe spojeva,

identificirana samo heksadekanska kiselina (palmitinska kiselina).

Razlike u kvalitativnom i kvantitativnom sastavu istraženih uzoraka hlapljivih spojeva

posljedica su različitog načina priprave uzoraka, tj. toplinske razgradnje i enzimske hidrolize

nehlapljivih prekursora, budući da su glavne komponente sva 3 uzorka sumporovi i/ili

dušikovi spojevi koji potječu od razgradnje glukozinolata. Ukupni maseni udio ovih spojeva

najmanji je u destilatu (89,6 %), u autolizatu je 90,2 %, a najveći udio ovih spojeva sadrži

hidrolizat (98,8 %). Glavni glukozinolati jadranske rumenice su glukonapin i

glukobrasikanapin koji su identificirani u svim uzorcima bez obzira na način njihove priprave.

O

H

HO

H

OH

H

HO

H

OH

H

SC

N

O3SO-

GLUKONAPIN

HSC

N

O3SO-

HSO4-

Lossenovapregradnja

NC

S

+ S

but-3-en-1-il-izotiocijanat

HSO4-

pH 7

CN

CN

pent-4-enonitril

S

4,5-epitiopentanonitril

ESP, Fe2+


Slika 33. Shematski prikaz razgradnje glukonapina

Tablica 37. Glukozinolati jadranske rumenice

glukozinolat razgradni produkti glukozinolatadestilat autolizat hidrolizat

glukobrasikanapin 5,6-epitioheksanonitril (5,5 %)pent-4-en-1-il-itc (11,3 %)heks-5-enonitril (28,8 %)

5,6-epitioheksanonitril (18,5 %)pent-4-en-1-il-itc (2,0 %)heks-5-enonitril (1,4 %)

/pent-4-en-1-il-itc (15,3 %)heks-5-enonitril (0,9 %)

glukonapin but-3-en-1-il-itc (18,8 %)4,5-epitiopentanonitril (6,7 %)

but-3-en-1-il-itc (16,2 %)4,5-epitiopentanonitril (50,0 %)

but-3-en-1-il-itc (71,8 %)/

glukoberteroin 5-(metiltio)pentil-itc (0,3 %)6-(metiltio)heksanonitril (5,5 %)

5-(metiltio)pentil- itc (0,2 %)/

//

glukotropeolin benzenacetonitril (5,1 %) benzenacetonitril (0,9 %) /

glukolepidiin etil-itc (3,6 %) / /glukođiabutin sec-butil-itc (3,1 %) sec-butil-itc (1,0 %) sec-butil-itc (1,3 %)glukoerucin 5-(metiltio)pentanonitril (0,5 %) / /heksil glukozinolat heptanonitril (0,3 %) heptanonitril (tr.) /4-metilpentil glukozinolat 5-metilheksanonitril (0,1 %) / /glukoalisin / / 5-(metilsulfinil)pentil-itc (9,5 %)

Kratice: itc-izotiocijanat

147

5.2.2. Streličasta grbica

Posljednjih godina objavljeno je nekoliko radova u kojima je istraživan sastav i sadržaj

glukozinolata i njihovih razgradnih produkata u biljci Cardaria draba. U preglednom radu

iz 1991. godine Daxenbichler i suradnici navode 5 razgradnih produkata glukozinolata

identificiranih u sjemenu streličaste grbice jugoslavenskog podrijetla: 4-

(metilsulfinil)butil-izotiocijanat (trivijalnog imena sulforafan), 4-(metilsulfonil)butil-

izotiocijanat (erisolin), 4-(metiltio)butil-izotiocijanat (erucin), alil-izotiocijanat i 4-

hidroksibenzil-izotiocijanat (sinalbin).60 Fahey i suradnici navode 9 glukozinolata

identificiranih u streličastoj grbici: glukonapin, n-butil-glukozinolat, glukosinalbin, sec-

butil-glukozinolat, glukorafanin, glukoerisolin, glukoerucin, glukobrasikanapin i sinigrin.3

Afsharypuor i Jamali iz suhog biljnog materijala iranske streličaste grbice destilacijom

nakon autolize (hidrolize endogenom mirozinazom) izoliraju i identificiraju 3-butenil-

izotiocijanat, sulforafan i izobutil-izotiocijanat.85 Više autora je identificiralo glukosinalbin

u cvjetovima ove biljke 86,87, a Powell i suradnici HPLC analizom u lišću C. draba

potvrđuju prisustvo glukorafanina i glukosinalbina.88 U nekim radovima razmatran je

utjecaj sadržaja glukozinolata, kao obrambenih parametara biljke, na njenu široku

rasprostranjenost .89,90

U ovom radu su glukozinlati streličaste grbice (Tablica 38.) identificirani na

temelju rezultata GC/MS analize njihovih razgradnih produkata dobivenih toplinskom

razgradnjom i enzimskom (endogenom i egzogenom) hidrolizom (Tablice 14.-16.), a dio

rezultata je veći objavljen.77 Ukupno je identificirano 8 glukozinolata: glukolepidiin,

izobutil glukozinolat, glukoerucin, glukoiberverin, glukonapin, glukorafanin, glukosinalbin

i glukoerisolin.

U destilatu su identificirana 3 glukozinolata: izobutil glukozinolat, glukoerucin i

glukoiberverin. Glavni razgradni produkti glukozinolata, ujedno i glavni sastojci ovog

uzorka su 4-(metiltio)butil-izotiocijanat (96,4%) trivijalnog imena erucin i 5-

(metiltio)pentanonitril (0,7 %), trivijalno erucin-nitril. Erucin i erucin-nitril su razgradni

produkti 4-(metiltio)butil glukozinolata trivijalnog imena glukoerucin (Slika 34.).91,92

Ostali razgradni produkti glukozinolata, izobutil-izotiocijanat - razgradni produkt izobutil

glukozinolata i 3-(metiltio)propil-izotiocijanat - razgradni produkt glukoiberverina,

prisutni su u uzorku u vrlo malim količinama (0,1 % ).

148

O

H

HO

H

OH

H

HO

H

OH

H

SC

N-O3SO

S

GLUKOERUCIN

HSC

N

O3SO-

S

HSO4-

Lossenovapregradnja

SN

CS

SC

N+ S

(erucin)4-(metiltio)butil-izotiocijanat

5-(metiltio)pentanononitril(erucin nitril)

HSO4-

pH 7


CNS

S

4-(metiltio)butil-tiocijanat(erucin-tiocijanat)

Slika 34. Shematski prikaz razgradnje glukoerucina

149

U autolizatu streličaste grbice identificirani su razgradni produkti 5 glukozinolata:

glukolepidiina, izobutil glukozinolata, glukoerucina, glukonapina i glukorafanina.

Nazastupljeniji glukozinolat u uzorku je glukorafanin (Slika 35.) čiji razgradni produkt 4-

(metilsulfinil)butil-izotiocijanat, trivijalno sulforafan, čini 57,3 % masenog udjela

ukupnog uzorka. Nitril, 5-(metilsulfinil)pentanonitril ili sulforafan nitril, koji je također

razgradni produkt glukorafanina, u ovom uzorku nije identificiran. Drugi po zastupljenosti

je etil-izotiocijanat (26,5 %), razgradni produkt glukolepidiina. Osim navedenih, u manjim

postocima su identificirani još but-3-en-1-il-izotiocijanat (1,4 %), razgradni produkt

glukonapina, izobutil-izotiocijanat (0,6 %), razgradni produkt izobutil glukozinolata i 4-

(metiltio)butil-izotiocijanat (0,5 %), razgradni produkt glukoerucina.

Najveći broj razgradnih produkata glukozinolata, a time i glukozinolata,

identificiran je u hidrolizatu streličaste grbice. Identificirano je 6 glukozinolata: izobutil

glukozinolat, glukoerucin, glukonapin, glukorafanin, glukosinalbin i glukoerisolin. Kao i u

autolizatu i u ovom uzorku je najzastupljeniji glukorafanin (Slika 35.) sa svojim

razgradnim produktima 4-(metilsulfinil)butil-izotiocijanatom - sulforafanom (69,2 %) i 5-

(metilsulfinil)pentanonitrilom - sulforafan nitrilom (4,5 %). Identificirani su i 4-

hidroksifenilacetonitril (7,2 %), razgradni produkt glukosinalbina, 4-(metilsulfonil)butil-

izotiocijanat (5,0 %), razgradni produkt glukoerisolina, 4-(metiltio)butil-izotiocijanat (2,3

%) i 5-(metiltio)pentanonitril (0,7 %), razgradni produkti glukoerucina i izobutil-

izotiocijanat (0,2 %), razgradni produkt izobutil glukozinolata.

Usporedbom uzoraka na prvi pogled je uočljiva razlika u sastavu i sadržaju

razgradnih produkata glukozinolata, odnosno glukozinolata, između destilata i ostala dva

uzorka. Porijeklo but-3-en-1-il-izotiocijanata u autolizatu i hidrolizatu (1,4 % odnosno 2,0

%) je upitno. Taj izotiocijanat može nastati razgradnjom glukozinolata glukonapina

(upitnik u Tablici 38.), međutim neki autori pretpostavljaju da ovaj spoj nastaje

toplinskom razgradnjom sulforafana. U prilog toj pretpostavci idu i dobiveni rezultati.

Naime, glavni razgradni produkt glukozinolata identificiran u autolizatu i hidrolizatu je

sulforafan koji nije identificiran u destilatu. S obzirom na termolabilnost ovog spoja to je

očekivano. Međutim u autolizatu je identificiran but-3-en-1-il-izotiocijanat, a u hidrolizatu

još i S-metil-(metiltio)sulfinat i S-metil-(metiltio)sulfonat za koje Yin i sur. navode da

vjerojatno nastaju toplinskom razgradnjom sulforafana.80 Chiang i suradnici su, po prvi

put, identificirali but-3-en-1-il-izotiocijanat kao glavni produkt toplinske razgradnje

150

sulforafana koji nastaje tijekom GC/MS analize.81 Kako but-3-en-1-il-izotiocijanat nije

identificiran u destilatu, već samo u autolizatu i hidrolizatu, vjerojatno je nastao

toplinskom razgradnjom sulforafana. Zbog toga je teško ustvrditi da je jedan od

glukozinolata streličaste grbice i glukonapin.

U sva tri uzorka razgradni produkti glukozinolata prevladavaju, pa tako u destilatu

čine 97,3 %, u autolizatu 86,3 %, a u hidrolizatu 91,3 % uzorka. Glavni glukozinolat u

destilatu je glukoerucin (97,1 %), a u autolizatu i hidrolizatu glukorafanin (57,3 %,

odnosno 73,7 %). Ostali spojevi su uobičajeni sastojci ovakvih uzoraka kao npr. (E)-heks-

2-en-1-al i (Z)-heks-3-en-1-ol, tzv. lisni aldehid i alkohol koji su karakteristični

predstavnici "zelenih mirisnih nota", a identificirani su u nešto većim količinama u

uzorcima dobivenim iz svježeg biljnog materijala (destilat i autolizat). Ostali hlapljivi

spojevi identificirani su u ovim uzorcima u zanemarivim količinama.

151

O

H

HO

H

OH

H

HO

H

OH

H

SC

N

O3SO

S

HSC

N

O3SO

S

HSO4

SN

CS

SC

N

HSO4

O

O

OO

-

GLUKORAFANIN

-

-

Lossenovapregradnja

+ S

(sulforafan)4-(metilsulfinil)butil-izotiocijanat

5-(metilsulfinil)pentanonitril(sulforafan nitril)

-

pH 7


Slika 35. Shematski prikaz razgradnje glukorafanina

152

Tablica 38. Glukozinolati streličaste grbice

Kratice: itc-izotiocijanat


glukoerucin 5-(metiltio)pentanonitril (0,7 %)4-(metiltio)butil-itc (96,4 %)

/4-(metiltio)butil-itc (0,5 %)

5-(metiltio)pentanonitril (0,7 %)4-(metiltio)butil-itc (2,3 %)

izobutil glukozinolat izobutil-itc (0,1 %) izobutil-itc (0,6 %) izobutil-itc (0,2 %)glukoiberverin 3-(metiltio)propil-itc (0,1 %) / /glukorafanin /

/4-(metilsulfinil)butil-itc (57,3 %)/

4-(metilsulfinil)butil-itc (69,2 %)5-(metilsulfinil)pentanonitril (4,5 %)

glukolepidiin / etil-itc (26,5 %) /glukonapin ? / but-3-en-1-il-itc (1,4 %) but-3-en-1-il-itc (2,0 %)glukosinalbin / / 4-hidroksifenilacetonitril (7,2 %)glukoerisolin / / 4-(metilsulfonil)butil-itc (5,0 %)

153

5.2.3. Sredozemna rusomača

Sredozemna rusomača pripada rodu Capsella koji sadrži samo 3 biljne vrste: Capsella

rubella, Capsella bursa-pastoris i Capsella grandiflora. Zanimljivost biljki ovog roda je

da su genetski usko povezane sa model biljkom Arabidopsis thaliana.93 Genetsku

raznolikost unutar i između populacija biljnih vrsta Capsella rubella i Capsella bursa

pastoris proučavali su Caullet i suradnici.94 Pregledom literature nisu pronađeni radovi u

kojima je istraživan kemijski sastav i sadržaj glukozinolata u sredozemnoj rusomači

(Capsella rubella). Fahey i suradnici u svom preglednom radu iz 2001. godine navode 8

glukozinolata izoliranih iz pastirske torbice (Capsella bursa-pastoris), biljke koja je vrlo

slična sredozemnoj rusomači i pripada istom rodu. To su 4-hidroksibenzil, 2-hidroksi-3-

butenil, 9-(metilsulfinil)nonil, 10-(metilsulfinil)decil, 4-(metiltio)butil, 3-(metiltio)propil,

4-pentenil i alil glukozinolat.3 Vaughn i Berhow su iz sjemena pastirske torbice

ekstrakcijom organskim otapalom nakon autolize izolirali i identificirali tri izotiocijanata:

but-3-en-1-il-izotiocijanat (razgradni produkt glukonapina) kao glavni spoj te tragove 9-

(metilsulfinil)nonil-izotiocijanata i 10-(metilsulfinil)decil-izotiocijanata, razgradnih

produkata glukoarabina i glukokamelinina.95

Glukozinolati sredozemne rusomače identificirani na temelju GC/MS analiza

njihovih razgradnih produkata (Tablice 17.-19.) prikazani su u Tablici 39. Identificirano je

9 glukozinolata: sinigrin, glukolepidiin, glukonapin, 3-metilbutil glukozinolat, 4-

metilpentil glukozinolat, 9-(metiltio)nonil glukozinolat, 10-(metiltio)decil glukozinolat,

glukoiberverin i izobutil glukozinolat. U usporedbi sa glukozinolatima pastirske torbice,

sredozemna rusomača sadrži samo dva od, u gornjim radovima, navedenih glukozinolata -

alil glukozinolat ili sinigrin (iz rada Faheya i sur.) i glukonapin (iz rada Vaughna i

Berhowa). Dok je sinigrin glavni glukozinolat sredozemne rusomače istraživane u ovom

radu, glukonapin je identificiran preko svog razgradnog produkta but-3-en-1-il-

izotiocijanata u destilatu i autolizatu, ali u vrlo malim količinama.

Najviše glukozinolata identificirano je u destilatu (8) u kojem su identificirani

razgradni produkti svih glukozinolata osim glukolepidiina. Najzastupljeniji glukozinolat u

destilatu je alil glukozinolat (sinigrin; Slika 36.) čiji razgradni produkti 3,4-

epitiobutanonitril (67,8 %) i alil-izotiocijanat (6,3 %) čine 74,1 % ukupnog uzorka.

Navedeni razgradni produkti alil glukozinolata su ujedno i jedini spojevi koji su

154

identificirani u sva tri analizirana uzorka. Alil nitril i alil-tiocijanat koji također mogu

nastati razgradnjom sinigrina u ovom uzorku nisu identificirani. Poznato je da se alil-

izotiocijanat toplinski razgrađuje pri čemu nastaje čitav niz spojeva. Te spojeve su

identificirali Chen i Ho koji su vodenu otopinu alil-izotiocijanata zagrijavali uz refluks pri

100 °C sat vremena te potom ekstrahirali razgradne produkte sa diklormetanom. GC/MS

analiza je pokazala da su toplinskom razgradnjom alil-izotiocijanata nastali: dialil-sulfid,

dialil-disulfid, dialil-trisulfid, dialil-tetrasulfid, alil-tiocijanat, 3H-1,2-ditiolen, 2-vinil-4H-

1,3-ditiin, 4H-1,2,3-tritiin i 5-metil-1,2,3,4-tetratian.96 Navedeni spojevi nisu identificirani

u ovom uzorku iako je uzorak pripremljen na gotovo identičan način tj. kuhanjem biljnog

materijala pri 100 °C 2,5 sata. Ostali razgradni produkti glukozinolata, identificirani u

destilatu, prisutni su vrlo malim količinama (<1,0 %). To su: 9-(metiltio)nonil-izotiocijanat

(0,2 %) i 10-(metiltio)dekanonitril (0,9 %), razgradni produkti 9-(metiltio)nonil

glukozinolata, 11-(metiltio)undekanonitril (0,9 %), razgradni produkt 10-(metiltio)decil

glukozinolata, 3-metilbutil-izotiocijanat (0,8 %), razgradni produkt 3-metilbutil

glukozinolata, but-3-en-1-il-izotiocijanat (0,7 %), razgradni produkt glukonapina, 4-

metilpentil-izotiocijanat (0,5 %), razgradni produkt 4-metilpentil glukozinolata, 3-

(metiltio)propil-izotiocijanat (0,5 %), razgradni produkt glukoiberverina i izobutil-

izotiocijanat (0,1 %), razgradni produkt izobutil-glukozinolata.

U autolizatu sredozemne rusomače identificirana su 4 spoja koji su razgradni

produkti 3 glukozinolata: glukonapina, sinigrina i glukolepidiina. Glavni sastojci ovog

uzorka su upravo razgradni produkti glukozinolata 3,4-epitiobutanonitril (44,1 %), etil-

izotiocijanat (29,4 %) i alil-izotiocijanat (4,0 %). Kao i u destilatu, i u autolizatu, je

najzastupljeniji glukozinolat sinigrin; njegovi razradni produkti čine 48,1 % od ukupnog

uzorka. Za razliku od destilata, u ovom uzorku identificiran je i etil-izotiocijanat, razgradni

produkt glukolepidiina. Odgovarajući nitril, propanonitril, koji može nastati razgradnjom

glukolepidiina, je vrlo hlapljiv spoj pa zbog toga vjerojatno nije identificiran u ovom

uzorku, ali ni u jednom uzorku hlapljivih spojeva izoliranih iz istraživanih biljaka. But-3-

en-1-il-izotiocijanat, razgradni produkt glukonapina, prisutan je u vrlo maloj količini (0,3

%).

155

O

H

HO

H

OH

H

HO

H

OH

H

SC

N-O3SO

SINIGRIN

HSC

N

O3SO-

HSO4-

Lossenovapregradnja

NC

S

CN

+ S

alil-izotiocijanat

alil nitril

HSO4-

pH 7


3,4-epitiobutanonitril

CNS

ESP, Fe2+

S CN

alil-tiocijanat

Slika 36. Shematski prikaz razgradnje sinigrina

156

U hidrolizatu su identificirani razgradni produkti samo 2 glukozinolata, sinigrina i

glukolepidiina. Glavni sastojak ovog uzorka je etil-izotiocijanat (57,8 %), razgradni

produkt glukolepidiina (Slika 37.), a slijede 3,4-epitiobutanonitril (15,6 %) i alil-

izotiocijanat (2,4 %), razgradni produkti alil glukozinolata. Ovi spojevi čine 75,8 %

ukupnog uzorka.

Interesantno je da je glavni razgradni produkt sinigrina u svim uzorcima

sredozemne rusomače 3,4-epitiobutanonitril, a ne alil-izotiocijanat (Slika 36.). U skladu s

navedenim su rezultati istraživanja Kyunga i sur. koji su identificirali 3,4-

epitiobutanonitril, kao glavni hidrolitički produkt sinigrina u hidrolizatu svježeg kupusa.97

Nadalje, opadajući udio 3,4-epitiobutanonitrila u destilatu, autolizatu i hidrolizatu (67,8 %,

44,1 %, 15,6 %) u skladu je s prethodno iznesenom predpostavkom da je ESP vjerojatno

osjetljiviji na utjecaj sušenja nego topline.

Jedini glukozinolat identificiran u svim uzorcima sredozemne rusomače (destilatu,

autolizatu i hidrolizatu) je alil glukozinolat ili sinigrin. Autolizat i hidrolizat kvalitativno su

vrlo slični, sadrže iste razgradne produkte glukozinolata, odnosno glukozinolate, sinigrin i

glukolepidiin. U kvantitativnom pogledu u autolizatu prevladava sinigrin, a u hidrolizatu

glukolepidiin.

157

O

H

HO

H

OH

H

HO

H

OH

H

SC

N

O3SO-

GLUKOLEPIDIIN

HSC

N

O3SO-

HSO4-

Lossenovapregradnja

NC

S

+ S

etil-izotiocijanat

HSO4-

pH 7

CN

propanonitril


Slika 37. Shematski prikaz razgradnje glukolepidiina

158


sinigrin alil-itc (6,3 %)3,4-epitiobutanonitril (67,8 %)

alil-itc (4,0 %)3,4-epitiobutanonitril (44,1 %)

alil-itc (2,4 %)3,4-epitiobutanonitril (15,6 %)

9-(metiltio)nonil glukozinolat

9-(metiltio)nonil-itc (0,2 %)10-(metiltio)dekanonitril (0,9 %)

//

//

10-(metiltio)decil glukozinolat

11-(metiltio)undekanonitril (0,9 %) / /

3-metilbutil glukozinolat 3-metilbutil-itc (0,8 %) / /glukonapin but-3-en-1-il-itc (0,7 %) but-3-en-1-il-itc (0,3 %) /4-metilpentil glukozinolat 4-metilpentil-itc (0,5 %) / /glukoiberverin 3-(metiltio)propil-itc (0,5 %) / /izobutil glukozinolat izobutil-itc (0,1 %) / /glukolepidiin / etil-itc (29,4 %) etil-itc (57,8 %)

Tablica 39. Glukozinolati sredozemne rusomače

Kratice: itc-izotiocijanati

159

5.2.4. Nepravilna gorušika

Pregledom literature ustanovljeno je da je nepravilna gorušika (Calepina irregularis) slabo

istražena biljka. U preglednom radu iz 1991. godine Daxenbichler i sur. navode da su u

sjemenu nepravilne gorušike jugoslavenskog podrijetla identificirali 3-(metilsulfinil)propil-

izotiocijanat (razgradni produkt glukoiberina) i 3-(metilsulfonil)propil-izotiocijanat

(razgradni produkt glukoheirolina).60 U literaturi nisu pronađeni radovi u kojima se

istražuje kemijski sastav i sadržaj glukozinolata u čitavoj biljci, što je bio predmet ovog

istraživanja.

U ovom istraživanju indirektnom metodom, GC/MS analizom različitih uzoraka

razgradnih produkata glukozinolata (Tablice 20.-22.) identificirano je 7 glukozinolata

nepravilne gorušike: glukoiberverin, glukoiberin, glukoheirolin, glukolepidiin, sinigrin,

glukoerucin i glukotropeolin (Tablica 40.). Uspoređujući dobivene rezultate sa onima iz

rada Daxenbichlera i sur. treba istaknuti da spomenuti autori u sjemenu biljke nisu

identificirali razgradni produkt glukoiberverina, 3-(metiltio)propil-izotiocijanat, koji je

najzastupljeniji sastojak sva tri uzorka hlapljivih spojeva.

U destilatu nepravilne gorušike identificirano je 5 spojeva koji su razgradni

produkti 4 glukozinolata: sinigrina, glukoiberverina, glukotropeolina i glukoerucina.

Gotovo čitav uzorak sačinjavaju razgradni produkti glukoiberverina (95,8 %; Slika 38.)

Naime, glavni sastojak ovog uzorka hlapljivih spojeva je 3-(metiltio)propil-izotiocijanat

(95,6 %), razgradni produkt glukoiberverina. U uzorku je identificiran i nitril koji nastaje

razgradnjom glukoiberverina, 4-(metiltio)butanonitril (0,2 %). Ostali razgradni produkti

glukozinolata, 4-(metiltio)butil-izotiocijanat (0,2 %), razgradni produkt glukoerucina,

benzil-izotiocijanat (0,1 %), razgradni produkt glukotropeolina i 3,4-epitiobutanonitril (0,1

%), razgradni produkt sinigrina, identificirani su u uzorku u vrlo malim količinama.

U autolizatu nepravilne gorušike identificirano je 6 spojeva koji su razgradni

produkti 5 glukozinolata: sinigrina, glukoiberverina, glukolepidiina, glukoiberina i

glukoheirolina. Glavni razgradni produkti glukozinolata su 3-(metiltio)propil-izotiocijanat

(41,0 %) i 3-(metilsulfinil)propil-izotiocijanat (40,0 %), razgradni produkti glukoiberverina

i glukoiberina. Ostali razgradni produkti glukozinolata, identificirani u uzorku u malim

količinama, su: etil-izotiocijanat (5,7 %), razgradni produkt glukolepidiina, 4-

160

(metiltio)butanonitril (0,8 %), razgradni produkt glukoiberverina, 3-(metilsulfonil)propil-

izotiocijanat (0,6 %), razgradni produkt glukoheirolina i 3,4-epitiobutanonitril (0,4 %),

razgradni produkt sinigrina. Glavni glukozinolati autolizata nepravilne gorušike su

glukoiberverin i glukoiberin čiji razgradni produkti čine 81,8 % ukupnog uzorka hlapljivih

spojeva.

U hidrolizatu nepravilne gorušike identificirano je 5 spojeva koji su razgradni

produkti 4 glukozinolata: sinigrina, glukoiberverina, glukoiberina i glukoheirolina. Glavni

sastojak uzorka je 3-(metiltio)propil-izotiocijanat (57,8 %), razgradni produkt

glukoiberverina. Odgovarajući nitril, 4-(metiltio)butanonitril, također je identificiran u

ovom uzorku (8,2 %). Količinski značajni sastojci su i 3-(metilsulfinil)propil-izotiocijanat

(16,7 %) i 3-(metilsulfonil)propil-izotiocijanat (7,9 %), razgradni produkti glukoiberina i

glukoheirolina. Razgradni produkti navedenih glukozinolata čine 90,6 % ukupnog

hidrolizata.

Glavni glukozinolati hrvatske nepravilne gorušike, identificirani indirektnom

metodom su glukoiberverin i glukoiberin. Glukoiberverin je glavni glukozinolat u svim

uzorcima, a njegov razgradni produkt 3-(metiltio)propil-izotiocijanat je glavni sastojak

svih uzoraka hlapljivih spojeva. Interesantno je da u destilatu nisu identificirani razgradni

produkti glukoiberina (Slika 39.) i glukoheirolina, identificirani u autolizatu i hidrolizatu.

Izostanak 3-(metilsulfinil)propil-izotiocijanata (iberina) u destilatu se može objasniti

njegovim strukturnim karakteristikama. Iberin je strukturni analog 4-(metilsulfinil)butil-

izotiocijanata (sulforafana), za kojeg je poznato da je termolabilan,80,81 pa je moguće da je i

iberin termolabilan spoj. Također, u destilatu nije identificiran ni 3-(metilsulfonil)propil-

izotiocijanat (heirolin), koji je po strukturi vrlo sličan iberinu (razlika je u stupnju

oksidacije sumpora u bočnom lancu).

U sva tri uzorka hlapljivih spojeva nepravilne gorušike prevladavaju razgradni

produkti glukozinolata koji čine 96,2 % destilata, 88,5 % autolizata i 91,3 % hidrolizata.

Ostali hlapljivi spojevi identificirani u ovim uzorcima ne sadrže S i/ili N u strukturi, a

među njima se ističu (E)- heks-2-en-1-al i (Z)- heks-3-en-1-ol, tzv. lisni aldehid i alkohol,

koji su identificirani u uzorcima pripravljenim iz svježeg biljnog materijala.

161

O

H

HO

H

OH

H

HO

H

OH

H

SC

N

O3SO-

GLUKOIBERVERIN

HSC

N

O3SO-

HSO4-

Lossenovapregradnja

S NC

SS C

N+ S

(iberverin)3-(metiltio)prop-1-il-izotiocijanat 4-(metiltio)butanononitril

(iberverin nitril)

HSO4-

pH 7

S

S


Slika 38. Shematski prikaz razgradnje glukoiberverina

162

O

H

HO

H

OH

H

HO

H

OH

H

SC

N

O3SO

S

HSC

N

O3SO

S

HSO4

S NC

S

S CN

HSO4

O

O

O O

-

GLUKOIBERIN

-

-

Lossenovapregradnja

+ S

(iberin)3-(metilsulfinil)propill-izotiocijanat 4-(metilsulfinil)butanonitril

(iberin nitril)

-pH 7


Slika 39. Shematski prikaz razgradnje glukoiberina

163


glukoiberverin 3-(metiltio)propil-itc (95,6 %)4-(metiltio)butanonitril (0,2 %)

3-(metiltio)propil-itc (41,0 %)4-(metiltio)butanonitril (0,8 %)

3-(metiltio)propil-itc (57,8 %)4-(metiltio)butanonitril (8,2 %)

glukoerucin 4-(metiltio)butil-itc (0,2 %) / /sinigrin 3,4-epitiobutanonitril (0,1 %) 3,4-epitiobutanonitril (0,4 %) 3,4-epitiobutanonitril (0,7 %)glukotropeolin benzil-itc (0,1 %) / /

glukoiberin / 3-(metilsulfinil)propil-itc (40,0 %) 3-(metilsulfinil)propil-itc (16,7 %)glukolepidiin / etil-itc (5,7 %) /glukoheirolin / 3-(metilsulfonil)propil-itc (0,6 %) 3-(metilsulfonil)propil-itc (7,9 %)

Tablica 40. Glukozinolati nepravilne gorušike

Kratice: itc-izotiocijanati

164

5.2.5. Čunjasti repušac

Čunjasti repušac je, općenito, slabo istražena biljna vrsta. Genetsku raznolikost između

jedine dvije priznate biljne vrste pripadnice roda Bunias, Bunias erucago i Bunias

orientalis, proučavali su Greilhuber i Obermayer.98 Pregledom literature nisu pronađeni

radovi u kojima je proučavan kemijski sastav i sadržaj glukozinolata u ovoj biljci.

Daxenbichler i suradnici su u sjemenu biljke Bunias orientalis (turska rukola) turskog

podrijetla identificirali 4-(metilsulfinil)butil-izotiocijanat (razgradni produkt

glukorafanina), 4-(metilsulfinil)but-3-enil-izotiocijanat (razgradni produkt glukorafenina),

4-hidroksibenzil-izotiocijanat (razgradni produkt glukosinalbina) i izopropil-izotiocijanat

(razgradni produkt glukoputranjivina).60 Bennet i sur. su utvrdili da su glukosinalbin i

glukorafenin dominantni glukozinolati u svim tkivima biljke Bunias orientalis.99

U ovom radu su, po prvi put, istraživani glukozinolati čunjastog repušca.

Indirektnom metodom, preko njihovih razgradnih produkata (Tablice 23.-25.),

identificirano je 8 glukozinolata: glukođiabutin, heksil glukozinolat, glukonapin,

glukotropeolin, glukodehidroerucin, glukoerucin, glukolepidiin i glukosinalbin (Tablica

41.). U usporedbi sa glukozinolatima turske rukole, identificiranim u gore navedenim

radovima, može se uočiti da je sličnost između ispitivanih biljaka mala. Jedini zajednički

glukozinolat je glukosinalbin, koji je dominantan u turskoj rukoli, a u hrvatskom

čunjastom repušcu je identificiran samo u hidrolizatu, koji gotovo da se i sastoji samo od

njegovog razgradnog produkta, dok u druga 2 uzorka hlapljivih spojeva uopće nije

identificiran. Zanimljivo je da su sva 3 uzorka čunjastog repušca vrlo različita.

U destilatu čunjastog repušca su identificirani razgradni produkti svih glukozinolata

osim glukolepidiina i glukosinalbina. Upravo razgradni produkti tih glukozinolata su

najzastupljeniji spojevi u autolizatu (etil-izotiocijanat, 61,3 %) i hidrolizatu (sinalbin nitril

87,9 %). Iako je, u usporedbi s autolizatom i hidrolizatom, u destilatu identificiran najveći

broj razgradnih produkata glukozinolata (9), njihov ukupni maseni udio u uzorku je

najmanji (39,6 %). U uzorku su najzastupljeniji razgradni produkti glukodehidroerucina

(Slika 40.): (E)- i (Z)-izomeri 5-(metiltio)pent-4-enonitrila (10,1 % i 8,3 %) i 4-

(metiltio)but-3-en-1-il-izotiocijanat (1,8 %). Iako točan izomer ovog spoja nije utvrđen

najvjerojatnije se radi o (Z)-izomeru jer je (E)-izomer 4-(metiltio)but-3-en-1-il-

izotiocijanata poznat kao naročito nestabilan spoj čijim raspadom nastaju različiti 3-

165

supstituirani 2-tioksopirolidini i ditiokarbamati koji nisu identificirani u ovom

istraživanju.100,101

O

H

HO

H

OH

H

HO

H

OH

H

SC

N-O3SO

S

GLUKODEHIDROERUCIN

HSC

N

O3SO-

S

HSO4-

Lossenovapregradnja

SN

CS

SC

N+ S

(dehidroerucin)4-(metiltio)but-3-en-1-il-izotiocijanat

5-(metilsulfinil)pent-4-enonitril(dehidroerucin nitril)

HSO4-

pH 7


Slika 40. Shematski prikaz razgradnje glukodehidroerucina

166

Drugi po zastupljenosti je glukoerucin sa razgradnim produktima 4-(metiltio)butil-

izotiocijanatom (14,7 %) i 5-(metiltio)pentanonitrilom (2,2 %). Pojedinačno gledano 4-

(metiltio)butil-izotiocijanat je glavni razgradni produkt glukozinolata identificiran u

destilatu čunjastog repušca. Razgradni produkti glukonapina (but-3-en-1-il-izotiocijanat,

1,9 %), heksil glukozinolata (heptanonitril, 0,3 %), glukođiabutina (sec-butil-izotiocijanat,

0,2 %) i glukotropeolina (benzenacetonitril, 0,1 %) su identificirani u malim količinama.

U autolizatu identificirani su razgradni produkti (4 spoja) 3 glukozinolata:

glukonapina, glukodehidroerucina i glukolepidiina. Glavni sastojak ovog uzorka je etil-

izotiocijanat (61,3 %), razgradni produkt glukolepidiina. U uzorku su, u znatno manjim

količinama, identificirani razgradni produkti glukodehidroerucina, 4-(metiltio)but-3-en-1-

il-izotiocijanat (8,0 %) i 5-(metiltio)pent-4-enonitril (1,7 %) čiji točni izomeri nisu

određeni te but-3-en-1-il-izotiocijanat (0,8 %), razgradni produkt glukonapina.102

Osim spojeva sa sumporom i/ili dušikom u destilatu i autolizatu su identificirani i

drugi spojevi. Uglavnom se radi o alifatskim alkoholima i karbonilima za koje se smatra da

potječu od katabolizma masnih kiselina, a koji su u visokom postotku zastupljeni u

destilatu.72,73 Takozvani lisni alkoholi (Z)-heks-3-en-1-ol i (E)-heks-2-en-1-ol,

karakteristični za svježi biljni materijal, su kvantitativno značajni sastojci destilata

(ukupno 33,0 %) i autolizata (22,4 %). U destilatu je identificiran i "lisni" aldehid, (E)-

heks-2-en-1-al (7,5 %), pa je ukupni udio ovih spojeva u destilatu vrlo visok (40,5 %) i

nadmašuje ukupni udio razgradnih produkata glukozinolata (39,6 %). Ovakav odnos udjela

razgradnih produkata glukozinolata i navedenih "zelenih mirisnih spojeva" je posebnost

destilata čunjastog repušca. U destilatima ostalih istraživanih biljaka prevladavaju

razgradni produkti glukozinolata. Odnos njihovog udjela i jedinog identificiranog "lisnog"

alkohola u autolizatu čunjastog repušca je uobičajen tj. prevladavaju razgradni produkti

glukozinolata (71,8 %). Ostali spojevi identificirani u destilatu i autolizatu su uobičajeni

sastojci ove vrste hlapljivih izolata (alkoholi, karbonili, fenilpropanski derivati i dr.) i

zastupljeni su u manjem postotku.

U hidrolizatu čunjastog repušca identificirani su razgradni produkti samo 2

glukozinolata, glukosinalbina i glukonapina. 4-Hidroksibenzenacetonitril, razgradni

produkt glukosinalbina je glavni sastojak ovog uzorka (87,9 %). But-3-en-1-il-

izotiocijanat, razgradni produkt glukonapina, identificiran je u tragovima (<0,1 %).

167

Razgradnjom glukosinalbina (Slika 41.) može nastati i 4-hidroksibenzil-izotiocijanat, ali

ovaj spoj nije identificiran u uzorku.103 Za razliku od destilata, hidrolizat čunjastog repušca

je kvalitativno siromašan uzorak. Naime, u hidrolizatu su identificirana samo 2 spoja, oba

razgradna produkta glukozinolata, ali je njihov udio u uzorku najveći (87,9 %).

O

H

HO

H

OH

H

HO

H

OH

H

SC

N

O3SO-

HSC

N

O3SO-

HSO4-

Lossenovapregradnja

+ S

HSO4-

pH 7

OH

OH

N C S

HO

GLUKOSINALBIN

C

HO

N

4-hidroksibenzenacetonitril (sinalbin nitril)

4-hidroksibenzil-izotiocijanat (sinalbin)

mirozinazaD-glukoza

Slika 41. Shematski prikaz razgradnje glukosinalbina

168


glukodehidroerucin 4-(metiltio)but-3-en-1-il-itc* (1,8 %)5-(metiltio)pent-4-enonitril* (10,1 %)5-(metiltio)pent-4-enonitril* (8,3 %)

4-(metiltio)but-3-en-1-il-itc* (8,0 %)/5-(metiltio)pent-4-enonitril* (1,7 %)

///

glukoerucin 4-(metiltio)butil-itc (14,7 %)5-(metiltio)pentanonitril (2,2 %)

//

//

glukonapin but-3-en-1-il-itc (1,9 %) but-3-en-1-il-itc (0,8 %) but-3-en-1-il-itc (tr.)

heksil glukozinolat heptanonitril (0,3 %) / /glukođiabutin sec-butil-itc (0,2 %) / /glukotropeolin benzenacetonitril (0,1 %) / /glukolepidiin / etil-itc (61,3 %) /glukosinalbin / / 4-hidroksibenzenacetonitril (87,9 %) Tablica 41. Glukozinolati čunjastog repušca

Kratice: itc-izotiocijanat, tr.- trag (< 0,1 %),*- točan izomer nije identificiran

169


Biljke i biljni pripravci imaju sve veću ulogu u modernoj medicini. Strukturna raznolikost

njihovih sekundarnih metabolita omogućava široku biološku aktivnost biljnih derivata.

Antimikrobno aktivni spojevi iz biljaka inhibiraju mikroorganizme kroz različite

mehanizme pa mogu poslužiti u kliničkom tretmanu infekcija uzrokovanih rezistentnim

mikroorganizmima. Naime, zbog genetske sposobnosti mikroorganizama da steknu i

prenesu otpornost na antibiotike njihova rezistentnost postaje globalni zdravstveni problem

21. stoljeća. Stoga postoji potreba za razvijanjem dodatne fitokemijske strategije koja će

istraživanjem antimikrobnih agensa biljnog porijekla pripomoći u rješavanju ovog

rastućeg zdravstvenog problema.104

Istraživanja su pokazala da razgradni produkti glukozinolata pokazuju

antimikrobnu aktivnost dok njihovi prekursori, intaktni glukozinolati nisu biološki aktivni.

Testiranjem antimikrobne aktivnosti čistih spojeva utvrđeno je da najveću aktivnost

pokazuju izotiocijanati dok su nitrili slabije aktivni.105,106 Wilson i suradnici u svom radu

ističu ovisnost rezultata o metodi ispitivanja kao i o vrsti korištenog soja mikroorganizma

što otežava usporedbu rezultata sa onima iz drugih radova. Također, ovim istraživanjem je

utvrđeno da osjetljivost bakterija na antimikrobno djelovanje ne ovisi toliko o tome jesu li

Gram-pozitivne ili Gram-negativne, već njihova osjetljivost prvenstveno ovisi o vrsti same

bakterije.107

U ovom radu ispitana je antimikrobna aktivnost razgradnih produkata glukozinolata

pet samoniklih biljaka porodice Brassicaceae: jadranske rumenice, streličaste grbice,

sredozemne rusomače, nepravilne gorušike i čunjastog repušca. Uzorci razgradnih

produkata glukozinolata dobiveni su toplinskom razgradnjom glukozinolata (destilat),

endogenom enzimskom hidrolizom (autolizat) i egzogenom enzimskom hidrolizom

(hidrolizat). Antimikrobna aktivnost uzoraka ispitana je metodom disk difuzije i metodom

određivanja minimalne inhibicijske koncentracije (tzv. MIK metodom) prema

preporukama američkog Nacionalnog komiteta za kliničke laboratorijske standarde,

NCCLS, (engl. National Committee for Clinical Laboratory Standards). Ispitivanja su

vršena na tri Gram-pozitivne, tri Gram-negativne bakterije i tri fungalna mikroorganizma.

170

Smatra se da je minimalna inhibicijska koncentracija (u daljnjem tekstu MIK

vrijednost) jednaka ili manja od 0,5 mg/mL karakteristična za supstance sa izraženom

antimikrobnom aktivnošću, MIK vrijednosti u rasponu 0,6-1,5 mg/mL se tretiraju kao

aktivnost srednjeg intenziteta dok supstance sa većim MIK vrijednostima nemaju

antimikrobni značaj.108

Rezultati dobiveni disk-difuzijom izražavaju se kao promjer zone inhibicije u

milimetrima. Smatra se da je soj neosjetljiv ukoliko je zona inhibicije manja od 8 mm,

osjetljiv ukoliko je zona inhibicije 9-14 mm, jako osjetljiv za promjere od 15-19 mm i

ekstremno osjetljiv za promjere veće od 20 mm.109

Rezultati testiranja antimikrobne aktivnosti dobiveni metodom određivanja

minimalne inhibicijske koncentracije (MIK metodom) i metodom disk difuzije, kao i

aktivnosti standardnih antibiotika korištenih kao pozitivne kontrole, prikazani su u

Tablicama 27.-36.

Iako su aktivnosti uzoraka slabije u usporedbi sa pozitivnom kontrolom, odnosno

rezultatima antibiotika, ne treba zaboraviti da ispitivani uzorci predstavljaju smjese

spojeva. Iz istog razloga je teško govoriti o spoju koji je odgovoran za antimikrobnu

aktivnost uzorka, posebno kada ona za uzorke sličnog kemijskog sastava varira. Razlog

tome može biti i određeni omjer spojeva u uzorku koji je odgovoran za dobru antimikrobnu

aktivnost uzorka.110 Naravno, ne smije se zaboraviti ni činjenica da su ispitivanja vršena in

vitro. Da bi se u potpunosti utvrdio antimikrobni potencijal ispitivanih uzoraka i njihovih

aktivnih komponenti neophodno je uzeti u obzir i procese apsorpcije i metabolizma pod

djelovanjem probavnih enzima i crijevne mikloflore, transport putem krvotoka,

konjugaciju i izlučivanje.

Jadranska rumenica

Prema dobivenim MIK vrijednostima autolizat jadranske rumenice pokazuje znatno slabiju

antimikrobnu aktivnost u odnosu na destilat i hidrolizat. Velika razlika u antimikrobnoj

aktivnosti uzoraka sličnog kemijskog sastava može se objasniti činjenicom da u

ispitivanjima za uzorak autolizata nisu korišteni isti sojevi mikroorganizama kao za destilat

171

i hidrolizat, čiji su rezultati prethodno objavljeni.78 Dobiveni rezultati su u skladu sa

istraživanjima Wilsona i suradnika koja pokazuju da je osjetljivost mikroorganizama na

antimikrobno djelovanje često diktirana upravo vrstom soja.106 I prema rezultatima disk-

difuzije autolizat pokazuje slabiju antimikrobnu aktivnost u odnosu na preostala dva

uzorka, međutim razlog može biti i manja koncentracija testiranog uzorka (100 µg/mL -

autolizat, 250 µg/mL - destilat i hidrolizat).

MIK vrijednosti destilata jadranske rumenice za Gram-pozitivne i Gram-negativne

bakterije se kreću od 8,0 do 32,0 µg/mL pri čemu se po osjetljivosti ističe Pseudomonas

aeruginosa (8,0 µg/mL). Rezultati nisu u potpunosti u skladu sa onima dobivenim disk-

difuzijom. Iako su se svi sojevi bakterija pokazali jako do ekstremno osjetljivi upravo je

Pseudomonas aeruginosa u testiranju ovom metodom pokazala najmanju osjetljivost.

Antifugalna aktivnost destilata je veoma izražena i iznosi samo 2,0 µg/mL (Candida

albicans, Rhisopus stolonifer), odnosno 8,0 µg/mL (Penicilium sp.), što je u skladu sa

dobivenim rezultatima disk-difuzije.

MIK vrijednosti autolizata pokazuju antimikrobnu aktivnost koja za bakterije varira

od srednjeg intenziteta do neznatne aktivnosti (1,5-3,0 mg/mL). Rezultati disk-difuzije su

nešto bolji, svi ispitivani sojevi su pokazali osjetljivost. Antifugalna aktivnost uzorka je

srednjeg intenziteta i iznosi 1,5 mg/mL za sva tri ispitivana soja što je u skladu sa

rezultatima disk difuzije.

MIK vrijednosti hidrolizata pokazuju izraženu antimikrobnu aktivnost koja je slična

za sve sojeve ispitivanih mikroorganizama(16,0-32,0 µg/mL). Dobiveni rezultati su u

skladu sa onima disk-difuzije.

Streličasta grbica

Prema rezultatima MIK vrijednosti, kao i kod jadranske rumenice, postoji velika razlika u

antimikrobnoj aktivnosti pojedinih uzoraka. Hidrolizat, koji je testiran sa istim sojevima

mikroorganizama kao i destilat i hidrolizat jadranske rumenice, i čiji su rezultati objavljeni

u prethodnom radu, pokazuje izraženiju aktivnost od ostala dva uzorka.77 Također, kao i

kod uzoraka jadranske rumenice, i ovdje su korištene različite koncentracije testiranih

172

uzoraka što treba uzeti u obzir kod usporedbe dobivenih rezultata disk-difuzije (hidrolizat

- 250 µg/mL, destilat i autolizat - 100µg/mL).

MIK vrijednosti destilata za većinu sojeva pokazuju srednju aktivnost (0,75-1,5

mg/mL) izuzev za sojeve C. albicans (0,375 mg/mL), koji pokazuje izraženu osjetljivost, i

E. faecalis (3,0 mg/mL) koji je najrezistentniji soj. Prema rezultatima disk-difuzije svi

ispitivani sojevi pokazuju osjetljivost, a najveća je za R. stolonifer i E. coli (promjer zone

inhibicije 13 mm), a najmanja za Penicillium sp.(zona inhibicije 9,25 mm).

Prema dobivenim MIK vrijednostima autolizat streličaste grbice pokazuje gotovo

jednaku antimikrobnu aktivnost naspram svih ispitivanih sojeva kao destilat, s razlikom što

je kod ovog uzorka osjetljivost C. albicans slabija (1,5 mg/mL). Rezultati disk-difuzije se

donekle razlikuju. Prema izmjerenim promjerima zona inhibicije ispitivani sojevi

mikroorganizma su se pokazali osjetljivima (9,25-11,5 mm) izuzev sojeva S. aureus, P.

aeruginosa i Penicillium sp. čija je osjetljivost neznatna (8-8,5 mm).

Prema MIK vrijednostima hidrolizat pokazuje izraženu antimikrobnu aktivnost

(64,0-128 µg/mL) prema svim ispitivanim sojevima. Nešto slabije rezultate pokazala je

metoda disk-difuzije prema kojoj su najosjetljiviji fungalni sojevi (16,5-18,4 mm).

Sredozemna rusomača

Prema rezultatima mikrodilucijske metode ispitivani uzorci sredozemne rusomače

pokazuju uglavnom antimikrobnu aktivnost srednjeg intenziteta (0,75-1,5 mg/mL) izuzev

soja E. faecalis koji je rezistentan na antimikrobno djelovanje sva tri uzorka (3,0 mg/mL).

Na uzorak hidrolizata, koji je općenito pokazao najslabije antimikrobno djelovanje,

rezistentni su još i E. coli i Penicillium sp. Rezultati nisu u potpunosti u skladu sa onima

disk-difuzije. Iako se većina sojeva pokazala osjetljivima na djelovanje ispitivanih uzoraka

postoje određene razlike u odnosu na dobivene MIK vrijednosti. Tako K. pneumoniae, koja

je prema rezultatima MIK metode bila vrlo osjetljiva prema svim uzorcima (MIK

vrijednosti 0,75-1,5), ne pokazuje osjetljivost prema destilatu, dok je E. faecalis osjetljiv

prema svim uzorcima (8,25-11,5 mm). Također, E. coli i Penicillium sp., koji su prema

173

rezultatima mikrodilucijske metode bili rezistentni prema hidrolizatu (MIK 3,0), ovdje su

pokazali osjetljivost.

Nepravilna gorušika

Prema dobivenim MIK vrijednostima destilat pokazuje antimikrobnu aktivnost srednjeg

inteziteta prema svim mikroorganizmima, autolizat prema bakterijama a hidrolizat,

općenito, pokazuje slabu antimikrobnu aktivnost. Autolizat i hidrolizat pokazuju slabu

antifungalnu aktivnost, a osjetljivost prema njima pokazuje samo R. stolonifer (1,5

mg/mL), dok su ostala dva fungalna soja rezistentna. E. faecalis je rezistentan na

antimikrobno djelovanje sva tri uzorka.

Za razliku od rezultata mikrodilucije disk-difuzija pokazuje nešto drugačije

rezultate. Izuzev soja E. coli, koji nije pokazao osjetljivost prema destilatu, i soja K.

pneumoniae, koji nije bio osjetljiv na djelovanje autolizata, svi ostali ispitivani bakterijski

sojevi pokazali su osjetljivost na sva tri uzorka. Fungalni mikroorganizmi su također

pokazali osjetljivost na sva tri uzorka, izuzev soja R. stolonifer koji je rezistentan prema

destilatu. Općenito, svi mikroorganizmi pokazali su najveću osjetljivost prema destilatu

nepravilne gorušike.

Čunjasti repušac

Prema dobivenim MIK vrijednostima destilat i autolizat čunjastog repušca pokazuju

antimikrobnu aktivnost srednjeg intenziteta prema svim mikroorganizmima, osim prema E.

faecalis koji je rezistentan na antimikrobno djelovanje sva tri uzorka. Hidrolizat pokazuje

općenito slabo antimikrobno djelovanje. Navedeni rezultati nisu u potpunosti u skladu sa

onima disk-difuzije. Iako se većina sojeva pokazala osjetljivima na djelovanje ispitivanih

uzoraka, postoje određene razlike u odnosu na dobivene MIK vrijednosti. Tako je soj E.

faecalis, koji je prema rezultatima MIK metode rezistentan, pokazao osjetljivost prema

svim uzorcima (8,75-12,75 mm).

174

6. Zaključci

175


Za određivanje ukupnih glukozinolata pet samoniklih biljaka iz porodice

Brassicaceae, jadranske rumenice, streličaste grbice, sredozemne rusomače,

nepravilne gorušike i čunjastog repušca, korištena je brza i jednostavna

spektrofotometrijska metoda uobičajenog naziva fericijanid metoda.

Iako je metoda izvorno razvijena za određivanje sadržaja glukozinolata u uljanoj

repici rezultati ovog istraživanja su pokazali da je primjenjiva i na samonikle biljke

porodice Brassicaceae.

Dobiveni rezultati predstavljaju prvi korak u istraživanju glukozinolata jer ukazuju

na prisustvo ove grupe spojeva u neistraženim ili nedovoljno istraženim

samoniklim biljkama porodice Brassicaceae.

U skladu s očekivanjima, sve istraživane biljke sadrže glukozinolate, ali u

različitim količinama. Glukozinolatima najbogatija biljka je nepravilna gorušika,

slijede jadranska rumenica, sredozemna rusomača, streličasta grbica i

glukozinolatima najsiromašniji čunjasti repušac.

Sadržaj ukupnih glukozinolata je po prvi put određen u suhom biljnom materijalu

(čitava biljka - svi nadzemni dijelovi, list, stabljika, cvijet i sjeme) navedenih

samoniklih biljaka.

145


Kemijski sastav i udio razgradnih produkata glukozinolata izoliranih iz ispitivanih

biljaka u velikoj mjeri ovisi o metodi izolacije. Kako bi se dobila što potpunija slika

o sastavu i sadržaju ovih spojeva u biljnom materijalu te time, indirektno, odredio

profil njihovih nehlapljivih preteča - glukozinolata, korištene su različite metode

razgradnje glukozinolata (toplinska razgradnja, endogena i egzogena hidroliza) i

različite metode izolacije razgradnih produkata (destilacija i ekstrakcija).

Razlike u kvalitativnom i kvantitativnom sastavu istraženih uzoraka hlapljivih

spojeva posljedica su različitog načina priprave uzoraka, tj. toplinske razgradnje i

enzimske hidrolize nehlapljivih prekursora, budući da su glavne komponente svih

uzoraka hlapljivih spojeva sumporovi i/ili dušikovi spojevi koji potječu od

razgradnje glukozinolata.

Osim spojeva sa sumporom i/ili dušikom u uzorcima su, uglavnom u manjem

postotku, identificirani i drugi spojevi. To su najčešće alifatski alkoholi i karbonili

za koje se smatra da potječu od katabolizma masnih kiselina te aromatski hlapljivi

spojevi (alkoholi, karbonili) koji najvjerovatnije potječu od katabolizma cimetne

kiseline.

Jadranska rumenica

U uzorcima jadranske rumenice identificirani su razgradni produkti 10

glukozinolata: glukonapina, glukobrasikanapina, glukoberteroina, glukoerucina,

glukoalisina, glukođiabutina, glukolepidiina, 4-metilpentil glukozinolata, heksil

glukozinolata i glukotropeolina.

Glavni glukozinolati jadranske rumenice su glukonapin i glukobrasikanapin, a

identificirani su na temelju svojih razgradnih produkata koji su kvantitativno

najznačajniji spojevi u sva 3 uzorka jadranske rumenice.

146

Najviše glukozinolata je identificirano u destilatu u kojem su identificirani

razgradni produkti gotovo svih glukozinolata, dok je glukozinolatima

najsiromašniji hidrolizat.

Autolizat ima visok udio epitionitrila koji su u manjoj količini identificirani i u

destilatu, ali ne i u hidrolizatu. To je vjerojatno posljedica veće osjetljivosti

epitiospecifičnog proteina, odgovornog za nastanak epitionitrila, na utjecaj sušenja

nego topline.

Streličasta grbica

U uzorcima streličaste grbice identificirani su razgradni produkti 8 glukozinolata:

glukoerucina, glukorafanina, izobutil glukozinolata, glukoiberverina, glukonapina,

glukolepidiina, glukosinalbina i glukoerisolina.

Kvantitativno najznačajniji sastojci destilata su razgradni produkti glukoerucina,

dok su u autolizatu i hidrolizatu najzastupljeniji razgradni produkti glukorafanina.

Sulforafan, koji nastaje razgradnjom glukorafanina, je najzastupljeniji spoj u

autolizatu i hidrolizatu streličaste grbice. Zbog svoje termolabilnosti očekivano nije

identificiran u destilatu.

Sredozemna rusomača

U uzorcima sredozemne rusomače identificirani su razgradni produkti 9

glukozinolata: sinigrina, glukolepidiina, glukoiberverina, glukonapina, izobutil

glukozinolata, 3-metilbutil glukozinolata, 4-metilpentil glukozinolata i 9-

(metiltio)nonil glukozinolata.

Najviše glukozinolata identificirano je u destilatu u kojem su identificirani

razgradni produkti svih navedenih glukozinolata osim glukolepidiina.

147

Jedini glukozinolat identificiran u svim uzorcima streličaste grbice je sinigrin.

Kvantitativno najznačajniji spojevi u destilatu i autolizatu su razgradni produkti

sinigrina. U hidrolizatu je najzastupljeniji etil-izotiocijanat, razgradni produkt

glukolepidiina.

Autolizat i hidrolizat kvalitativno su vrlo slični, sadrže iste razgradne produkte

glukozinolata, odnosno glukozinolate, sinigrin i glukolepidiin.

Nepravilna gorušika

U uzorcima nepravilne gorušike identificirani su razgradni produkti 7

glukozinolata: glukoiberverina, glukoiberina, glukoheirolina, glukolepidiina,

sinigrina, glukoerucina i glukotropeolina.

Glavni glukozinolati nepravilne gorušike su glukoiberverin i glukoiberin.

Kvantitativno najznačajniji spojevi u destilatu su razgradni produkti

glukoiberverina koji čine gotovo cijeli uzorak. Razgradni produkti glukoiberverina

su najzastupljeniji spojevi i u hidrolizatu.

U autolizatu su, u otprilike jednakom omjeru, zastupljeni razgradni produkti dvaju

glukozinolata glukoiberverina i glukoiberina.

Čunjasti repušac

U uzorcima čunjastog repušca identificirani su razgradni produkti 8 glukozinolata:

glukodehidroerucina, glukoerucina, glukolepidiina, glukosinalbina, glukođiabutina,

heksil glukozinolata, glukonapina i glukotropeolina.

Destilat, autolizat i hidrolizat čunjastog repušca se kvalitativno i kvantitativno vrlo

razlikuju.

148

Najviše glukozinolata identificirano je u destilatu u kojem su identificirani

razgradni produkti svih navedenih glukozinolata osim glukolepidiina i

glukosinalbina. Upravo razgradni produkti tih glukozinolata su najzastupljeniji u

autolizatu (glukolepidiin) i hidrolizatu (glukosinalbin).

Kvantitativno najznačajniji razgradni produkti glukozinolata u destilatu su

razgradni produkti glukodehidroerucina i glukoerucina.

Specifičnost destilata čunjastog repušca je visoki udio tzv. lisnih alkohola i

aldehida ("zelenih mirisnih spojeva") koji nadmašuje ukupni udio razgradnih

produkata glukozinolata. Naime u destilatima ostalih istraživanih biljaka, kao i u

svim uzorcima hlapljivih spojeva, prevladavaju razgradni produkti glukozinolata.


149

Antimikrobna aktivnost razgradnih produkata glukozinolata dobivenih toplinskom

razgradnjom (destilat), endogenom hidrolizom (autolizat) i egzogenom hidrolizom

(hidrolizat) ispitana je korištenjem dvije metode: disk–difuzijom i određivanjem

minimalne inhibitorne koncentracije (MIK metodom).

U testu su korištene Gram-pozitivne bakterije (Bacillus cereus, Enterococcus

faecalis, Staphylococcus aureus), Gram-negativne bakterije (Klebsiella

pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) i gljivice (Candida

albicans, Penicillium sp., Rhizopus stolonifer).

Svi ispitivani uzorci pokazali su antimikrobnu aktivnost. Pojedinačna neslaganja

rezultata dobivenih disk-difuzijom i određivanjem minimalne inhibitorne

koncentracije mogu se objasniti ovisnošću rezultata o metodi ispitivanja kao i o

vrsti korištenog soja mikroorganizma, što je ranije dokumentirano.107

Iako su aktivnosti uzoraka slabije u usporedbi sa pozitivnom kontrolom, ne treba

zaboraviti da ispitivani uzorci predstavljaju smjese spojeva. Iz istog razloga je teško

govoriti o spoju koji je odgovoran za antimikrobnu aktivnost uzorka, posebno kada

ona, za uzorke sličnog kemijskog sastava, varira. Razlog tome može biti određeni

omjer spojeva u uzorku koji je odgovoran za dobru antimikrobnu aktivnost

uzorka.110

.

150

7. Prilozi

7.1. Odabrani kromatogrami na HP-FFAP koloni

151

Slika 42. Kromatogram ukupne ionske struje za uzorak autolizata jadranske rumenice na

koloni HP-FFAP

152

Slika 43. Kromatogram ukupne ionske struje za uzorak hidrolizata jadranske rumenice na

koloni HP-FFAP

153

Slika 44. Kromatogram ukupne ionske struje za uzorak destilata streličaste grbice na

koloni HP-FFAP

154

Slika 45. Kromatogram ukupne ionske struje za uzorak destilata sredozemne rusomače na

koloni HP-FFAP

155

Slika 46. Kromatogram ukupne ionske struje za uzorak hidrolizata sredozemne rusomače

na koloni HP-FFAP

156

Slika 47. Kromatogram ukupne ionske struje za uzorak destilata nepravilne gorušike

na koloni HP-FFAP

157

Slika 48. Kromatogram ukupne ionske struje za uzorak autolizata nepravilne gorušike

na koloni HP-FFAP

158

8. Literatura

159

1. A. Radonić: Izolacija i identifikacija slobodnih i glikozidno vezanih hlapljivih

spojeva iz smrike (Juniperus oxycedrus L.), Magistarski rad, Kemijsko-tehnološki

fakultet Sveučilišta u Splitu, 2000.

2. http://www.medicina.hr/nutricionizam/clanci/fitokemikalije_u_sluzbi_zdravlja.htm

3. J. W. Fahey, A. T. Zalcmann, P. Talalay: Phytochemistry. 56 (2001), 5-51.

4. B. A. Halkier: Glucosinolates in Naturally Occurring Glycosides, R. Ikan (ed.),

John Wiley & Sons, Chichester, 1999, p. 193.-195.

5. R. N. Bennet, F. A. Mellon, P. A. Kroon: J. Agric. Food Chem. 52 (2004), 428-

438.

6. N. Bellostas, A. D. Sørensen, J. C. Sørensen, H. Sørensen: Adv. Bot. Res. 45

(2007), 369-415.

7. D. B. Clarke: Anal. Methods 2 (2010), 310-325.

8. N. Agerbirk, C. E. Olsen: Phytochemistry 77 (2012), 16-45.

9. M. Dekić: Fitohemijsko ispitivanje odabranih biljnih vrsta familija Geraniaceae i

Brassicaceae, Doktorska disertacija, Univerzitet u Nišu, 2011.

10. L. M. Larsen, J. K. Nielsen, H. Sørensen: Entomol. Exp. Appl. 64 (1992), 49-55.

11. A. Kjaer, J. Conti: Acta Chem. Scand. 8 (1954), 295-298.

12. R. Verkerk, M. Dekker: Glucosinolates in Bioactive Compounds in Foods, J.

Gilbert and H. Z. Senyuva (ed.), Blackwell Publishing, 2008, Oxford, p. 31-40.

13. J. E. Rodman, In: D. A. Young, D.S. Seigler (Eds.): Phytochemistry & Angiosp.

Phylog., Praeger, New York, 1981, p. 43.

14. J. E. Rodman: Syst. Bot. 16 (1991), a) 598-618., b) 619-629.

15. R. Mithen, B. G. Lewis, R. K. Heaney, G.R. Fenwick: Phytochemistry 26 (1987),

1969-1973.

16. J. E. Rodman, R. A. Price, K. Karol, E. Conti, K. J. Sytsma, J. D. Palmer: Ann. MO

Bot. Gard. 80 (1993), 686-699.

17. E. A. S. Rosa, R. K. Heaney, G. R. Fenwick, C. A. M. Portas: Hort. Rev. 19 (1997),

99-215.

18. M. M. Kushad, A.F. Brown, A.C. Kurlich, J. A. Juvik, B. P. Klein, M. A. Wallig,

E. H. Jefery: J. Agric. Food Chem. 47 (1999), 1541-1548.

19. M. W. Farnham, K. K. Stephenson, J. W. Fahey: J. Am. Soc. Hortic. Sci. 125

(2000), 482-488.

160

20. L. R. Hogge, D. W. Reed, E. W. Underhill, G. W. Haughn: J. Chromatogr. 26

(1988), 551-556.

21. G. W. Haughn, L. Davin, M. Giblin, E. W. Underhill: Plant Physiol. 97 (1991),

217-226.

22. D. J. Kliebenstein, J. Kroyman, P. Brown, A. Figuth, D. Pedersen, J. Gershenzon,

T. Mitchell-Olds: Plant Physiol. 126 (2001), 811-825.

23. D. C. James, J. T. Rossiter: Physiol. Plant. 82 (1991), 163-170.

24. E. T. Reese, R. C. Clapp, M. Mandels: Arch. Biochem. Biophys. 75 (1958), 228-

242.

25. M. Ohtsuru, T. Hata: Agricul. Biol. Chem. 36 (1972), 2495-2503.

26. N. Tani, M. Ohtsuru, T. Hata: Agric. Biol. Chem. 38 (1974), a)1623-1630., b) 1617-

1622.

27. E. L. Oginsky, A. E. Stein, M. A. Greer: Soc. Exp. Biol. Med. Proc. 119 (1965),

360-364.

28. L. Rask, E. Andreasson, B. Ekbom, S. Eriksson, B. Ponoppidan, J. Meijer: Plant

Mol. Biol. 42 (2000), 93-113.

29. B. Lüthy, Ph. Matile: Biochem. Physiol. Pflanzen 179 (1984), 5-12.

30. M. Hara, Y. Fujii, Y. Sasada, T. Kuboi: Plant Cell Physiol. 41 (2000), 1102-9.

31. A. M. Bones, J. T., Rossiter: Phytochemistry 67 (2006), 1053-1067.

32. J. Brown, M. J. Morra : Glucosinolates Containing Seed Meal as a Soil Amendment

to Control Plant Pests, National Renewable Energy Laboratory, USA, 2000-2002,

p. 3-7.

33. R. Kissen, J. T. Rossiter, A. M. Bones: Phytochem. Rev. 8 (2009), 69-86.

34. R. Bernardi, A. Negri, S. Ronchi, S. Palmieri: FEBS Lett. 467 (2000), 296-298.

35. H. L. Foo, L. M. Gronning, L. Goodenough, A. M. Bones, B.-E. Danielsen, D. A.

Whiting, J. T. Rossiter: FEBS Lett. 468 (2000), 243-246.

36. N. V. Matusheski, R. Swarup, J. A. Juvik, R. Mithen, M. J. Bennett, E. H. Jeffery:

J. Agric. Food Chem. 54 (2006), 2069-2076).

37. V. Lambrix, M. Reichelt, T. Mitchell-Olds, D. J. Kliebenstein, J. Gershenzon:

Plant Cell 12 (2001), 2793-2807.

38. M. D. Zabala, M. Grant, A. M. Bones, R. Bennet, Y. S. Lim, R. Kissen, J. T.

Rossiter: Phytochemistry 66 (2005), 859-867.

39. M. Burow, A. Bergner, J. Gershenzon, U. Wittstock; Plant. Mol. Biol. 63 (2007),

49-61.

161

40. K. Delonga: Tioglukozidi glukozinolati u povrću porodice Cruciferae, prirodni

izvor biološki aktivnih spojeva, Doktorska disertacija, Prehrambeno-biotehnološki

fakultet Sveučilišta u Zagrebu, 2001.

41. R. E. Mithen, M. Dekker, R. Verkerk, S. Rabot, I. T. Johnson: J. Sci. Food Agr. 80

(2000), 967-984.

42. D. A. Moreno, M. Carvajal, C. López-Berenguer, C. García-Viguera: J. Pharm.

Biomed. Anal. 41 (2006), 1508-1522.

43. T. K. Smith, R. Mithen, I.T. Johnson: Carcinogenesis 24 (2003), 491-495.

44. A. P. Vig, G. Rampal, T. S. Thind, S. Arora: LWT 42 (2009), 1561-1572.

45. L. Valgimigli, R. Iori: Environ. Mol. Mutagen. 50 (2009), 222-237.

46. F. A. Hashem, M. M. Saleh: Phytotherapy Res. 13 (1999), 329-32.

47. L. M. Manici, L. Lazzeri, S. Palmieri: J. Agric. Food Chem. 45 (1997), 2768-2773.

48. D. Pajkin Tučkar: Primjena tekućinske kromatografije visoke djelotvornosti

(HPLC), UV/VIS i fluorescentne spektroskopije za utvrđivanje udjela i strukture

glukozinolata sjemena uljane repice (Brassica napus L) i njihovih produkata

hidrolize, Magistarski rad, Prehrambeno-biotehnološki fakultet Sveučilišta u

Zagrebu, 2000.

49. E. Ciska, H. Kozlowska: Eur. Food Res. Technol. 212 (2001), 582-587.

50. M. Kopjar, D. Šubarić, V. Piližota: Hrana u zdravlju i bolesti 1 (2012), 22-35.

51. G. Stoner, B. Casto, S. Ralston, C. Roebuck, C. Pereira, C. Bailey: Carcinogenesis

23 (2002), 265-272.

52. F. Kassie, S. Knassmuller: Chem. Biol. Interact. 127 (2000), 163-180.

53. L. R. Wetter, C. G. Youngs: J. Am. Oil Chem. Soc. 53 (1976), 162-164.

54. D. R. DeClercq, J. K. Daun : J. Am. Oil Chem. Soc. 66 (1989), 788-791.

55. Y. Hu, H. Liang, Y. Qipeng, Y. Hong: Nat. Prod. Res. 24 (2010), 1195-1205.

56. J. Jezek, B. G. D. Haggett, A. Atkinson, D. M. Rawson: J. Agric. Food Chem. 47

(1999), 4669-4674.

57. A. Śmiechowska, A. Bartoszek, J. Namieśnik: Crit. Rev. Anal. Chem. 40 (2010)

202-216.

58. R. Font, M. Del Río-Celestino, E. Cartea, A. De Haro-Bailón: Phytochemistry 66

(2005), 175-185.

59. G. F. Spencer, M. E. Daxenbichler: J. Sci. Food Agric. 31 (1980), 359-367.

60. M. E. Daxenbichler, G. F. Spencer, D. G. Carlson, G. B. Rose, A. M. Brinker, R.

G. Powell: Phytochemistry 30 (1991) 2623-2638.

162

61. E. W. Underhill, D. F. Kirkland: J. Chromatogr. 57 (1971), 47-54.

62. M. Reichelt, P. D. Brown, B. Schneider, N. J. Oldham, E. Stauber, J. tokuhisa, D. J.

Kliebenstein, T. Mitchell-Olds, J. Gershenzon: Phytochemistry 59 (2002), 663-671.

63. O. Olsen, H. Sørensen: J. Chromatogr. 197 (1980), 199-205.

64. N. Kaushik, A. Agnihotri: Chromatographia 49 (1999), 281-284.

65. E. A. S. Rosa, A. S. Rodrigues: HortScience 36 (2001), 56-59.

66. K. Oerlemans, D. M. Barrett, C. B. Suades, R. Verkerk, M. Dekker: Food

Chemistry 95 (2006) 19-29.

67. A. Šahini: Istraživanje flavonoida u vrstama Aurinia leucadea (Guss.) C. Koch i

Aurinia sinuata (L.) Griseb., Diplomski rad, Farmaceutsko-biokemijski fakultet

Sveučilišta u Zagrebu, 2001.

68. Lj. Grlić: Enciklopedija samoniklog jestivog bilja, Delo, Ljubljana, 1986.

69. H. P. S. Makkar, P. Siddhuraju, K. Becker: Glucosinolates in Methods in

Molecular Biology, vol. 393: Plant Secondary Metabolites, Humana Press Inc.,

Totowa, 2007, p. 55-60.

70. J. Mastelić, I. Blažević, I. Jerković: Croat. Chem. Acta 79 (2006), 591-597.

71. I. Blažević, J. Mastelić: Food Chem. 113 (2009), 96-102.

72. I. Blažević, J. Mastelić: Flavour Fragr. J. 23 (2008), 278-285.

73. I. Blažević, J. Mastelić: Croat. Chem. Acta 81 (2008), 607-613.

74. J. Mastelić, I. Blažević, I. Kosalec: Chem. Biodiversity 7 (2010), 2755-2765.

75. I. Blažević, A. Radonić, J. Mastelić, M. Zekić, M. Skočibušić, A. Maravić: Chem.

Biodiversity 7 (2010), 2023-2034.

76. I. Blažević, A. Radonić, J. Mastelić, M. Zekić, M. Skočibušić, A. Maravić: Food

Chem. 121 (2010), 1020-1028.

77. A. Radonić, I. Blažević, J. Mastelić, M. Zekić, M. Skočibušić, A. Maravić: Chem.

Biodiversity 8 (2011), 1170-1181.

78. I. Blažević, A. Radonić, M. Skočibušić, G. R. De Nicola, S. Montaut, R. Iori, P.

Rollin, J. Mastelić, M. Zekić, A. Maravić: Chem. Biodiversity 8 (2011), 2310-2321.

79. C. M. Gallaher, D. D. Gallaher, S. Peterson: J. Agric. Food Chem 60 (2012), 1358-

1362.

80. Y. Jin, M. Wang, R. T. Rosen, C.-T. Ho: J. Agric. Food Chem. 47 (1999), 3121-

3123.

81. W.C. K. Chiang, D. J. Pusateri, R. E. A. Leitz: J. Agric. Food Chem. 46 (1998),

1018-1021.

163

82. U. Wittstock, M. Burow: IUBMB Life 59 (2007), 744-751.

83. N. V. Matusheski, J. A. Juvik, E. H. Jeffery: FASEB J. 17 (2003), A377-A378.

84. N. V. Matusheski, J. A. Juvik, E. H. Jeffery: Phytochemistry 65 (2004), 1273-1281.

85. S. Afsharypuor, M.Jamali: J. Ess. Oil Res. 18 (2006), 674-675.

86. A. Fréchard, N. Fabre, S. Hannedouche, I. Fourasté: Fitoterapia 73 (2002), 177-

178.

87. F. Senatore, D. Rigano, A. Grasia, A. Randazzo: Biochem. Syst. Ecol. 31 (2003),

1205-1207.

88. E. E. Powell, G. A. Hill, B. H. J. Juurlink, D. J. Carrier: J. Chem. Technol.

Biotechnol. 80 (2005), 985-991.

89. H. Buschmann, P. J. Edwards, H. Dietz: J. Ecol. 93 (2005), 322-334.

90. C. Müller, N. Martens: E. E. 19 (2005), 533-550.

91. A. A. Al-Gendy, G. B. Lockwood: Flavour Fragr. J. 18 (2003), 148-152.

92. B. Holst, G. Williamson: Nat. Prod. Rep. 21 (2004), 425-447.

93. T. L. P. Couvreur, A. Franke, I. A. Al-Shehbaz, F. T. Bakker, M. A. Koch, K.

Mummenhoff: Mol. Biol. Evol. 27 (2010), 55-71.

94. M. L. C. Caullet, F. Pernin, C. Poncet, V. Le Corre: Am. J. Bot. 98 (2011), 176-179.

95. S. F. Vaughn, M. A. Berhow: Ind. Crop. Prod. 21 (2005), 193-202.

96. C.-W Chen, C.-T. Ho: J. Agric. Food Chem. 46 (1998), 220-223.

97. K. H. Kyung, H. P. Fleming, C. T. Young, C. A. Haney: J. Food Sci. 60 (1995),

157-159.

98. J. Greilhuber, R. Obermayer: Plant Syst. Evol. 218 (1999), 1-4.

100. R. N. Bennet, E. A. S. Rosa, F. A. Mellon, P. A. Kroon: J. Agric. Food Chem. 54

(2006), 4005-4015.

101. I. Blažević: Slobodni, glukozinolatno i glikozidno vezani hlapljivi spojevi biljaka

porodice Brassicaceae, Doktorska disertacija, Prirodoslono-matematički fakultet

Sveučilišta u Zagrebu, 2009.

102. Y. Uda, Y. Ozawa, T. Ohshima, S. Kawakishi: Agric. Biol. Chem. 54 (1990), 613-

617.

103. S. Montaut, J. Barillari, R. Iori, P. Rollin: Phytochemistry 71 (2010), 6-12.

104. D. Paunović, T. Šolević Knudsen, M. Krivokapić, B. Zlatković, M. Antić: Hem.

Ind. 66 (2012), 29-32.

105. M. Khoobchandani, B. K. Ojeswi, N. Ganesh, M. M. Srivastava, S. Gabbanini, R.

Matera, R. Iori, L. Valgimigli: Food Chem. 120 (2010), 217-224.

164

106. A. Aires, V. R. Mota, M. J. Saavedra, E. A. S. Rosa, R. N. Bennet: J. Appl.

Microbiol. 106 (2009), 2086-2095.

107. A. E. Wilson, M. Bergaentzle, F. Bindler, E. Marchioni, A. Lintz: Food Control

30 (2013), 318-324.

108. A. Sartoratto, A. L. M. Machado, C. Delarmelina, G. M. Figueira, M. C. T.

Duarte, V. L. G. Rehder: Braz. J. Microbiol. 35 (2004), 275-280.

109. A. G. Ponce, R. Fritz, C. E. Del Valle, S. I. Roura: LWT-Food Sci. Technol. 36

(2003), 679-684.

110. K. Góralska, M. Dynowska: Mikol. Lek. 19 (2012), 12-16.

165

ŽIVOTOPIS

Marina Zekić je rođena 04.12.1977. godine u Ludwigshafenu u Njemačkoj. Završila je II.

jezičnu gimnaziju u Splitu te potom upisala Kemijsko-tehnološki fakultet u Splitu.

Diplomirala je 07.02.2005. godine sa temom "Kemijski sastav i antioksidacijska svojstva

isparljivih spojeva iz bosiljka (Ocimum basilicum L.). Od 05.12.2005. do 01.09.2007.

godine zaposlena je u Ministarstvu obrane Republike Hrvatske gdje je završila časničku

školu i stekla čin poručnice atomsko-biološko-kemijske obrane. Od 01.09.2007. godine

zaposlena je na Kemijsko-tehnološkom fakultetu u Splitu kao asistent na Zavodu za

organsku kemiju gdje je uključena u rad na znanstveno-istraživačkom projektu "Eterična

ulja i arome - biološki aktivni spojevi i njihove modifikacije" (011-0982929-1329; voditelj:

dr. sc. Ani Radonić, izv.prof.).

Poslijediplomski znanstveni studij "Inženjerska kemija" pri Fakultetu kemijskog

inženjerstva i tehnologije Sveučilišta u Zagrebu, upisala je 11. rujna 2007. godine te je

odslušala i s odličnim uspjehom položila sve kolegije predviđene nastavnim planom

doktorskog studija. U proteklom razdoblju završila je eksperimentalni dio svog doktorskog

rada u kojem istražuje grupu prirodnih organskih spojeva (sekundarnih metabolita) tzv.

glukozinolate u samoniklim biljkama porodice Brassicaceae koje rastu na području Splita i

okolice.

Nastavna djelatnost

Sudjeluje u nastavnom procesu kao voditelj vježbi iz kolegija "Organska kemija I" i

"Organska kemija II" na integriranom preddiplomskom i diplomskom studiju farmacije. U

sklopu nastavne aktivnosti pomagala je pri izradi većeg broja završnih i diplomskih radova

te je angažirana na čuvanju pismenih ispita kolegija Zavoda za organsku kemiju.

Znanstvena djelatnost

Objavila je kao koautor četiri znanstvena rada u časopisima koje indeksira CC, te jedan

rad u zborniku radova s međunarodnog znanstvenog skupa. Do sada je sudjelovala, s

posterskim izlaganjima, na jednom međunarodnom i dva domaća znanstvena skupa.

166

Znanstveni radovi u časopisima koji su registrirani u CC-u:

1. I. Blažević, A. Radonić, M. Skočibušić, G. R. De Nicola, S. Montaut, R. Iori, P. Rollin, J. Mastelić, M. Zekić, A. Maravić, Glucosinolate Profiling and Antimicrobial Screening of Aurinia leucadea (Brassicaceae), Chemistry & biodiversity 8 (2011) 2310-2321.

2. A. Radonić, I. Blažević, J. Mastelić, M. Zekić, M. Skočibušić, A. Maravić, Phytochemical Analysis and Antimicrobial Activity of Cardaria draba L. Desv. volatiles, Chemistry & biodiversity 8 (2011) 1170-1181.

3. I. Blažević, A. Radonić, J. Mastelić, M. Zekić, M. Skočibušić, A. Maravić, Hedge Mustard (Sisymbrium officinale): Chemical Diversity of Volatiles and Their Antimicrobial Activity, Chemistry & biodiversity 7 (2010) 2023-2034.

4. I. Blažević, A. Radonić, J. Mastelić, M. Zekić, M. Skočibušić, A. Maravić, Glucosinolates, glycosidically bound volatiles and antimicrobial activity of Aurinia sinuata (Brassicaceae), Food chemistry 121 (2010) 1020-1028.

Znanstveni rad u zborniku radova s međunarodnog znanstvenog skupa1. M. Zekić, A. Radonić, I. Blažević, J. Mastelić, S. Bilić, Glucosinolate hydrolysis

products from Brassicaceae plants, XIII. Ružička days "Today science-tomorrow industry", Proceedings, Osijek, Croatia, 2011.

Sudjelovanje na domaćim znanstvenim skupovima

1. M. Zekić, A. Radonić, M. Veršić, J. Mastelić, Razgradni produkti glukozinolata jadranske rumenice (Aurinia leucadea (Guss.) C. Koch), XXI. hrvatski skup kemičara i kemijskih inženjera, 19.-22. travnja 2009., Split, Hrvatska.

2. M. Zekić, A. Radonić, Određivanje ukupnih glukozinolata jednostavnom fericijanid metodom, XXIII. hrvatski skup kemičara i kemijskih inženjera, 21.-24. travnja 2013., Osijek, Hrvatska.

Sudjelovanje na međunarodnim znanstvenim skupovima

1. M. Zekić, A. Radonić, I. Blažević, J. Mastelić, S. Bilić, Glucosinolte hydrolysis products from Brassicaceae plants, 13th Ružička days - "Today science - tomorrow industry", 16-17 rujna 2010, Vukovar, Croatia.

167

http://bib.irb.hr/prikazi-rad?&rad=502299




Glukozinolati - Ruđer Bošković Institutebib.irb.hr/datoteka/661490.MARINA_ZEKIC.docx · Web...

Documents

Transcript of Glukozinolati - Ruđer Bošković Institutebib.irb.hr/datoteka/661490.MARINA_ZEKIC.docx · Web...