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Genetischer Modellorganismus
S. cerevisiae
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Literatur • Fred Sherman (2002): Getting started with yeast. Meth. Enzymol. 350,
3-41.#• Fred Sherman: An Introduction to the Genetics and Molecular Biology of the
Yeast Saccharomyces cerevisiae. (2001) http://dbb.urmc.rochester.edu/labs/sherman_f/yeast/index.html#
• Budding yeast for budding geneticists: A primer on the# Saccharomyces cerevisiae model system. Duina AA, # Miller ME, Keeney JB (2014). Genetics 197, 33-48#- Saccharomyces Genome Database (SGD): #
http://www.yeastgenome.org/#- Overview of diverse genome-wide technologies: Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond. B. Suter, D. Auerbach and I. Stagler, Biotechniques 40: 625-642 (2006).
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Teil I: Grundlagen der
Hefegenetik & -molekularbiologie
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Hefe: Grösse & Zellform # # Haploid cell #Diploid cell#
Volume (mm3) # #70 # 120#Diameter (mm) # # 4 # 5-6#
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Wieso benutzen wir Hefe als Modellorganismus?
• nicht pathogen #• schnelles Wachstum#• wachsen als Einzelzellen; erleichtert Replika-Plattierung
und Isolation von Mutanten#• hochflexibles DNA Transformationssystem#• stabile haploide & diploide Zellen erleichtern genetische
Analyse#• kleines Genom (1.2 x 107 Basenpaare), nur ~3.5x > E.coli!• sehr aktive homologe Rekombination#• 2-Hybrid, YACs machen Hefe zu einem wertvollen
Werkzeug, um Gene/Proteine/Funktionen aus anderen Organismen zu untersuchen
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einfache Kultivierung - wie Bakterien!
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Wachstumsmedien für Hefe:#Vollmedium
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Wachstumsmedien für Hefe:#Minimalmedium
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Wachstumsmedien für Hefe:#Supplemente für Minimalmedium
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Hefe-Lebenszyklus
Haploide Hefen existieren in zwei Mating-Typen: #
MATa oder MATα. # “Wilde” Hefen (aus der
Natur) sind homothallisch, d.h. sie wechseln in der haploiden Phase schnell den Mating-Typ und verschmelzen zu Diploiden.#
D.h. nur die diploide Phase im natürlichen Lebenszyklus ist stabil.#
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Hefelebenszyklus (cont.)#
Laborstämme sind heterothallisch durch eine Mutation im Gen für HO Recombinase. #
Diese Stämme sind sowohl als Haploide als auch als Diploide stabil. #
Der stabile haploide Zustand ist essentiell dafür, dass Hefe als Modellorganismus für Genetikexperimente
dienen kann.
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Änderung des Mating-Typs in Hefe HMLα HMRa
Mating Type (MAT) Locus
α
Transposition mediated by HO recombinase
HMLα HMRa a
Cassette Replaced
(Silent)
(Silent) (Silent)
(Silent)
• Homothallische Wildtyp-Hefen können schnell den Mating-Typ wechseln, führt zu schnellem Mating und Bildung diploider Zellen (SCHLECHT für genetische Experimente!)#
• In heterothallischen Hefen ist die HO Recombinase defekt. Das verhindert den Mating-Typ Wechsel, so dass die Zellen im jeweiligen Mating-Typ als Haploide stabil sind (GUT für genetische Experimente!)#
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Hefe Wachstum & Mating
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Sporulationsmedium für Hefe:
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Dissektionsmikroskop #für Tetraden
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Tetraden-Dissektion Zellwand des Ascus muss verdaut werden, #so dass die Sporen wie bei einem Kleeblatt#nebeinanderlieger, aber nicht auseinander#fallen
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Tetraden-Dissektion
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Tetraden-Dissektion: Resultat
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Isolation von temperatur-sensitiven (ts) Mutanten, um Funktion essentieller Gene zu
untersuchen#
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Beispiel: #Genetische Analyse des sekretorischen Weges
in Hefe
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Genetische Analyse des sekretorischen Weges in Hefe
Nobelpreis Randy Schekman, 2013
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Klonierung durch Komplementation#
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Gen/Protein-Nomenklatur in Hefe
• Gen: YFG1 (Your Favorite Gene 1)#• dominantes Allel: YFG1-1!• recessives Allel: yfg1-2!• Insertion: yfg1::LEU2!• Deletion: yfg1∆1#• Protein: Yfg1 or Yfg1p#• systematischer Name: YBR142W
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DNA Transformation & Rekombination
• extrem effizient in Hefe (>104 Transformanten/µg DNA) #• sowohl lineare als auch circuläre DNA kann eingeführt
und ins Genom rekombiniert werden#• selbstreplizierende Plasmide können ebenfalls
eingeführt werden#• es gibt mehrere Transformationsmöglichkeiten:## #Transformation von Spheroplasten## #Transformation mit Lithiumsalzen## #Transformation durch Elektroporation#
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Gen knock out & Deletion (non-essentielle Gene)#
knock out: Transformation mit auxotrophem Markergen mit flankierendenRegionen homolog zum Zielgen Selektion gegen das URA3 Gen führt zur Deletion
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5-FOA Selektion von Ura3- Zellen#
• Das URA3 Gen ist ein häufig benutzter selektierbarer Marker auf Hefe-Plasmiden#• Das URA3 Gen kodiert für Orotidine 5´- Phosphat
Decarboxylase (für Uracilbiosynthese).#• 5-fluoroorotic acid (5-FOA) wird in das toxische 5-
Fluorouracil umgesetzt durch Ura3 Protein.#• Deshalb werden Ura+ Zellen durch 5-FOA getötet,
während Ura- Zellen 5-FOA resistent sind. #
5-FOA
Ura+ tot :-(
Ura- lebend :-)
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Components of common yeast plasmid vectors
YIp YEp YCp
Plasmid features
E. coli genes or segments
ori, bla; tet + + +
Yeast genes or segments
URA3; HIS3; LEU2; TRP1; etc. + + +
2 µm-ori - + -
ARS1; ARS2; ARS3; etc. - - +
CEN3; CEN4; CEN11; etc. - - +
Host (yeast) markers
ura3-52; his3-Δ1; leu2-Δ1; etc. + + +
Stability ++ + +
Hefe-Plasmide
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Funktion von ARS & Centromer Sequenzen
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Identifikation von Autonomous Replicating Sequences (ARS)#
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Identifikation von Telomeren
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Yeast Artificial Chromosomes (YACs)#
Vector Type # #Length of DNA (kb)#Plasmid # # #20#Phage λ # # #25#Cosmid # # #45#P1 vector # # #100#BAC # # # #200#YAC # # # #1000#
Maximum Capacity of Vectors#
ARS, CEN, und TEL Elemente ermöglichen die stabile Gegenwart extrem langer, linearer DNA Fragmente in Hefe. Diese Konstrukte heissen Yeast Artificial Chromosomes (YACs). DNA Fragmente bis 1 Million Basenpaare können als YACs propagiert werden.#
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Teil II: Hefe-basierte funktionelle Genomik und Proteomik
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Das Hefe-Genomprojekt#• Hefegenom sequenziert in 1996 (1.2 x 107 bp)#• 16 Chromosomen (von 230k bp bis 2,352k bp)#• ~6,400 ORFs #• nur ~4% der Hefegene hat Introns (wenn, meist nur ein
kleines Intron zu Beginn der kodierenden Sequenz) #• kompaktes Genom, Gene repräsentieren ~70% der
Gesamtsequenz#• kaum repetitive DNA#
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Hefe-Proteinfunktion
(2000)
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Fortschritt in der Charakterisierung des Hefegenoms
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Hefe-Proteinfunktion • 2014: 5076 verifizierte offene Leserahmen #• # 745 nicht verifizierte (d.h. unklar, ob für Protein#
# # # # #kodieren)#ausserdem: ursprünglich wurden kleine Proteine # (weniger als 100aa) nicht berücksichtigt, #
# die scheinen aber durchaus eine Rolle zu spielen#
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Genomweite Analyse von Hefe-Genfunktion • Deletionsanalyse: ## #Knock out jedes nicht-essentiellen Hefegens## #Analyse der phänotypischen Konsequencen jedes #
k.o.s unter verschiedenen Wachstumsbedingungen## #komplettes k.o-Set (4800 for haploid set) # #
käuflich für $1500#• Protein-Überexpression:## #Analyse der Überexpression jedes einzelnen Gens
im Hefegenom.#• Genomweite Analyse der Genexpression:## #Microarrays ('Gen-Chips') um Transkriptionsregulation #
jedes Gens unter spezifischen Bedingungen zu # analysieren## #ß-galactosidase-Fusionen um Genexpression zu #
detektieren#
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#Proteinlokalisierung:##Epitop-Markierungen und GFP-Fusionen zu jedem Hefeprotein im Genom um subzelluläre Lokalisation zu untersuchen #
#Hefeprotein-Interaktionen: ## 2-Hybrid-Analyse und Glutathion-S-Transferase (GST) Fusionen um die Interaktionspartner jedes einzelnen Proteins zu identifizieren#
##
Genomweite Analyse von Hefe-Genfunktion
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Genomweite #GFP-
Fusionen #"Transposon hopping" in eine genomische Library von Hefe in E. coli
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GFP-markierte Proteine in Hefe!
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GFP-markierte Proteine in Hefe!
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Genomeweite LacZ-Fusionen & Epitop- Markierungen
durch Transposon - Mutagenese#
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Inaktivierung oder Deletion zweier Gene (rot und blau) in redundanten Funktionen führt zum Zelltod, Inaktivierung eines einzelnen Genes (rot oder blau) ist ohne Effekt.
Synthetische Lethalität
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Ein haploider Stamm mit einer spezifischen Mutation (rot) wird kombiniert mit der Deletions-Kollektion mit dem passenden Mating Typ (blau). Nach dem Mating werden die Diploiden sporuliert und die haploiden Nachkommen analysiert.#
#
Im Falle einer synthetisch lethalen Interaktion ist die Doppelmutante nicht lebensfähig.
Synthetisch lethaler#Screen #
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Genetisches Interaktionsnetzwerk, das synthetisch lethale Interaktionen zeigt, gefunden durch SGA analysis. 291 interactions & 204 genes shown [Science 294: 2364 (2001)].
Resultate eines Synthetic Genetic Array (SGA)
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(A) Fänger: Fängerprotein X fusioniert an DNA Bindedomäne (DBD) eines Transkriptionsfaktors. When allein exprimiert, aktiviert der Fänger keine Transkription, denn ihm fehlt die Transkriptions-Aktivatordomäne (AD)
(B) Beute: ein zweites Protein Y fusioniert an die Transkriptions-Aktivatordomäne (AD). Die AD-Y Fusion alleine aktiviert keine Transkription, denn es fehlt die DNA Bindedomäne (DBD).
(C) Co-Expression der interagierenden DBD-X und AD-Y Fusionsproteine rekonstituiert einen funktionierenden Transkriptionsaktivator. Das Reportergen wird aktiviert, und Protein-Protein Interaktion zwischen X und Y wird gemessen an Aktivität des Reporters. Reportergene: auxotrophe Marker(HIS3, ADE2), Farbmarker lacZ.
Hefe 2-Hybrid System
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Anwendungen des 2-Hybrid Assays#
• Test der Assoziation zweier Proteine, deren Interaktion aufgrund anderer Daten vermutet wird. #
• Definition der Domänen oder Aminosäuren die kritisch sind für die Interaktion zweier Proteine. #
• Screening von Libraries für Proteine, die mit einem spezifischen Protein interagieren.#
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Grosse 2-Hybrid Screens in Hefe mit Proteinen anderer Organismen#
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(A) Fänger: DNA-Bindedomäne fusioniert an ein Protein, das ein kleines Molekül binden kann, z. B. Dihyrofolat-Reductase (DHFR). Zusätzlich exprimiert jede Zelle ein Beute-Protein einer DNA Library fusioniert an eine Aktivatordomäne (AD).
(B) Ein Hybrid aus einem chemischen Molekül und Methotrexat wird zugegeben, welches die Plasmamembran durchdring und an DBD-DHFR über Methotrexat bindet. Der zweite Teil des Hybrids bleibt zugänglich.#
(C) Wenn AD-Beuteprotein an den zweiten Teil des Hybrids binden kann, wird ein funktioneller Transkriptionsfaktor rekonstituiert, und das Reportergen aktiviert.
Variation1: 2-Hybrid Screen mit kleinen Molekülen#
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(A) Fänger: Integrales Membranprotein X als Fusion zur C-terminalen Hälfte von Ubiquitin (C), gefolgt von einem Transkriptionsfaktor (L). Fusion des Transkriptionsfaktor an das Membranprotein verhindert dessen Transport in den Zellkern und Aktivierung des Reportergens. Beute: Interagierendes Protein Y fusioniert an die N-terminale Hälfte von Ubiquitin (N). #
(B) Wenn Beute & Fänger interagieren, reassoziieren die N- und C-terminalen Ubiquitinhälften und bilden Ubiquitin. Dieses wird von Ubiquitin-spezifischen Proteasen (UBP) im Zytosol erkannt und abgeschnitten. Dies setzt den Transkriptionsfaktor frei, der nun in den Zellkern wandern kann, und dort das Reportergen aktiviert.
Das 2-Hybridsystem für Membranproteine#
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Resourcen zur Charakterisierung eines Gens in Hefe#
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Teil III: Schlussbemerkungen
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Erbmaterial, das nicht den Mendelschen Regeln folgt:#
• Mitochondrien-Genom#– Mitochondriale DNA ~76kbp#– vererbt als zytoplasmatisches Element#– Hefe Mito-Genom enthält 9 Gene#
• Prionen#– infektiöse Proteine, die als zytoplasmatische,
infektöse Elemente weitergegeben werden#– In Hefe [PSI+] Faktor, eine veränderte Form des
Sup35 Proteins.#– Prionen in Säugern: Mad Cow Disease, Creutzfeld-
Jacob disease, Kuru.
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Hefe als Modellorganismus für fundamentale eukaryotische Prozesse
• Zellzyklus ##Lee Hartwell, 2001 Nobelpreis für Physiologie & Medizin#
Zusammenbau der mitotischen Spindel hängt ab von beendeter DNA Synthese#– START Konzept#– Identifizierung von Cdc28, der ersten cyclin-abhängigen Kinase#– weitere wesentliche Zellzykluskonzepte, Krebsentstehung, etc.#
• Sekretorischer Weg für Proteine ##Randy Schekman, 2013 Nobelpreis#
– Identifikation & Charakterisierung von Dutzenden von Genen involviert in Proteintransport durch den sekretorischen Weg#
• DNA Synthese, Transkription, Translation, Splicing, Signaltransduktion, Autophagy, etc.#
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Beispiele für Prozesse, die man nicht in Hefe untersuchen kann
• MicroRNAs gibt es nicht in Hefe (auch keinen RISC Komplex), d.h. microRNA Funktion kann nicht in Hefe untersucht werden, und silencing RNAs (siRNAs) können in Hefe nicht benutzt werden.#
• Hefe haben keine komplexen entwicklungsbiologischen Programme, und bilden keine komplexen Strukturen wie Organe