Genômica: Aplicações Clínicas

Prof. Dra. Neuza Lopes - 2013P&D Grupo Fleury/InCor- HCFMUSP

Projeto Gemona Humano

Objetivos• Determinar a sequência

de todos os nucleotídeos do DNA humano, identificar e localizar os genes.

Genoma é constanteFenótipo é dinâmico, muda constantemente

registra a história da vida – papel do RNA

O fenótipo depende do meio ambiente e de suas interações com o genótipo.

Mudança de Paradigma

Genoma

mRNA ncRNA

Proteínas

Variação Normal ou PatológicaAmbiente

Variação em seqüência Variação estrutural Variação química na cromatina

Epigenômica

Genômica

Transcriptômica

Proteômica

Dogma Central

DOENÇAS COM COMPONENTE GENÉTICO

Identificação do defeito genético

Diagnóstico

Medicina preventiva

Farmacogenética

Terapêutica

Análise do fluxo da informação celular pela pesquisa genômica

Sequenciamento de DNA: princípios

• Sequenciamento de DNA: metodologia que revolucionou a medicina diagnóstica

• Sequencia de bases permite prever manifestações do indivíduo

• Diagnósticos precoces permitem melhor tratamento e qualidade de vida

• Diagnósticos moleculares são mais precisos

Gerações de Seqüenciadores

3ª Geração (single molecule)

Single Molecule Real Time –SMRT

(Pacific Bioscience)

HeliScope (Helicos Bioscience)

454 (Roche)

2ª Geração(amplificação clonal)

SOLiD (Life Technologies)

HiSeq2000, HiSeq2500, MiSeqIllumina

Ion Torrent- PGM, Proton(Life Technologies)

GridION-Oxford Nanopore

4ª Geração (Post-Light)

1ª Geração(clonagem) Sanger

•Informação em grande escala

•Custo baixo

•Grande Processamento

Sequenciamento de Próxima Geração (Next Generation Sequencing - NGS)

Venter, 2010 - Nature

2001: Human Genome Project2.7G$, 11 years

2001: Celera100M$, 3 years

2007: 4541M$, 3 months

2008: ABI SOLiD60K$, 2 weeks

2009: Illumina, Helicos40-50K$ 2010: 5K$,

a few days?2012: 1000 <24 hrs?

Captura de Exons

Captura de 180.000 exons codificantesCaptura de 541 exons de micro RNAs

- Estima-se o exoma humano em 35 a 40 Mb (aproximadamente 1 % do genoma total)

- Estima-se que 90% das doenças mendelianas tem como causa variações em exons

Exoma

Objetivos para sequenciamento genômicoExemplo

Sequenciamento de novo

Sequenciamento genômico Sequenciamento de >1000 genomas deinfluenza

DNA de org. extinto NeanderthalMetagenomica Intestino humano

Resequencia-mento

Genomas completos Indivíduos humanosRegiões genômicas Detecção de rearranjos ou regiões

associados à doenças

Mutações somáticas Em câncerTranscriptoma mRNA Definir regulação da transcrição

Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)RNAs não codificadores Identificar e quantificar microRNAs

Epigenética Padrão de Methilação Avaliar padrão de metilação em câncer

Personal Genome Machine – Ion Torrent (life technologies)

Three types of semiconductor chips:314 – 20Mb316 - 200Mb318 – 1Gb

Read length depends on base composition 200-250bp (200cycles)System is enabled for Paired End 2x100cyclesThe fastest sequencing system on the market.Recommendation:Resequencing applications which require fast turnaround of samples

- Amplicons (PCR products)- Small and medium size genomes- Custom DNA capture applications

How it works:

H+ ion is released during base incorporation. Individual polymerases attached to beads are positioned in tiny wells that rest on a tiny pH meter.

Ion Proton System

- Human genome in one day- Cost of reagents $1000 per run- Error rate around 1.2%- Human Genome, RNAseq, ChIPseq

Ion Proton Chip I – 10Gb(Whole Exome capture experiments)

Ion Proton Chip II – 100GbWhole human Genome resequencing

Biotecnologia

Genômica, transcriptômica, proteômica, lipidômica, ômicas

- Bioinformática, quimioinformática, neuroinformática

- Biologia computacional- Algoritmos - Análise estatística de dados biológicos- Biologia digital- Biologia de sistemas- Data mining

Text mining

GWAS Genome Wide Association Studies

• Genotipagem de milhares de SNPs utilizando microarranjos da Illumina

• Modelo de Arquitetura Alélica para doenças Complexas – CD/CV – Common Disease/Common Variability ?

Indicação

• Detecção de mutações gênicas e de polimorfismos

• Detecção de Expressão gênica em diferentes tecidos sob condições normais e anormais

• Sequenciamento do DNA e genotipagem

Microarray Processing sequence

Published Genome-Wide Associations through 06/2011,

1,449 published GWA at p≤5x10-8 for 237 traits

NHGRI GWA Catalogwww.genome.gov/GWAStudies

Não está assim tão claro!

Ambiente e epigenéticaVariação fenotípica

normal

Modificado de:

?

Oncologia molecular

• Genes do câncer• Fatores genéticos no câncer• Terapia gênica• Aplicações no diagnóstico• Triagem genética• Prognóstico

PCR em tempo real

• Auxilia a identificação de diferentes subtipos deleucemias – translocações cromossômicasenvolvendo pontos de quebra recorrentes eespecíficos no DNA genômico

Farmacogenética

• Medicina Personalizada já é uma realidade

Herceptina - Só é efetiva num subgrupo de cancer de mama com amplificação do protooncogene neu/ herbB

primeira droga no mercado que necessita de um teste genético antes de ser usada!

Farmacogenética - Varfarina

Farmacogenética - Clopidogrel

Farmacogenética - Estatinas

Functionalrs4149056

Microbiologia molecular

• Detecção laboratorial de patógenos• Patogenia das doenças• Epidemiologia dos distúrbios infecciosos

– Identificação – Resistência a drogas– Evolução e taxonomia

Diagnóstico molecular – meningite e penuemonia bacteriana

Testes genéticos comerciaisMiocardiopatia Hipertrófica

Painel de genes testados varia conforme a empresa

Mais simples: 10 genes

Mais completos: 28 genes

Identificação da mutação em 30-62% dos casos

Resultado negativo ≠ ausência da doença

PROJETO EPIGENOMA HUMANOInstituto Sanger (britânico) e empresa Epigenomics (alemã) -

2005

•Pretende esclarecer como fatores ambientais (dieta e estresse) podem interferir no funcionamento dos genes?

•Como o estilo de vida aciona ou silencia os genes?•Como gêmeos idênticos (mesmo genoma) manifestam doenças diversas, como esquizofrenia, diabetes ou câncer?

•A metilação do DNA é influenciada pela alimentação →suplementação de vit B12,

ácido fólico e betaína → ricos em grupo metil → desativação gênica

DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS GENÉTICAS MÉTODOS DE RASTREAMENTO

• Ampla variação de técnicas • Vantagens e desvantagens dos métodos• Limitações e sensibilidade dos métodos

Avanços tecnológicos e redução de custos podem tornar novas técnicas de diagnóstico aliadas poderosas e acessíveis na prevenção e no

tratamento de doenças genéticas

Futuro

Avanços na Medicina

• Preventiva

• Diagnóstico (específico, sensível, efetivo e seguro)

• Tratamento (desenhos de fármacos específicos)

- Identificação de vírus respiratórios por painel em array de baixa densidade – 18 agentes avaliados em conjunto

- Avaliação de mutações em tumores sólidos (pulmão) para resposta à quimioterapia (EGFR / KRAS / BRAF)

- Variantes HPV

- Painéis de Leucemia – qualitativos e quantitativos

- Genética Molecular

- Avaliação de cepas bacterianas

- Quantificação e Genotipagem HIV

Onde estamos na era pós-genômica no Grupo Fleury

Perspectivas

• Analitos avaliados em conjunto• Volume crescente de informação • Interpretação conjunta com diversas áreas• Tecnologias robustas• Reavaliação da ponte desenvolvimento-

aplicação• Remodelagem mercado saúde

• aplicações rápidas• Novos clientes