Gamma-BCT DPD - RADMED fileRadioimunoensaio para a determinação quantitativa de deoxipiridinolina...

Gamma-BCT DPD

Radioimmunoassay for the quantitative determination of free Deoxypyridinoline (DPD) in urine

Dosage radioimmunologique pour la détermination quantitative de la déoxypyridinoline (DPD) libre dans l’urine

Radioimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von freien Desoxypyridinolin (DPD)-Crosslinks im Urin Radioimmunodosaggio per la determinazione quantitativa di desossipiridinolina (DPD) libera nell'urina Radioinmunoensayo para la determinación cuantitativa de deoxipiridinolina (DPD) en orina Radioimunoensaio para a determinação quantitativa de deoxipiridinolina livre (DPD) na urina

REF

AA-60F1 100

2

English .............................................................................................................................................................3 Français............................................................................................................................................................8 Deutsch..........................................................................................................................................................13 Italiano...........................................................................................................................................................19 Español ..........................................................................................................................................................24 Português.......................................................................................................................................................29

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Intended Use

For In Vitro Diagnostic Use

The IDS Gamma-BCT DPD kit is a coated tube 125I radioimmunoassay for the quantitative determination of free Deoxypyridinoline (DPD) crosslinks in urine. DPD has been shown to be a biochemical marker of bone resorption.

Summary and Explanation DPD is found mainly in Type 1 collagen of bone. After the collagen matrix is formed, the enzymic action of lysyl oxidase on amino acid lysine causes the formation of the covalent crosslink DPD. This crosslink, DPD, plays an important part in the structural role of collagen. In the process of bone degradation, DPD is released into the circulation and cleared by the kidney.

Method Description The Gamma-BCT DPD kit is a competitive radioimmunoassay utilising anti-DPD monoclonal antibody coated to the inner surface of a polystyrene tube. DPD in the sample competes with 125I-labelled DPD for the antibody. After incubation, the tubes are washed to remove unbound 125I-DPD and then counted. Bound radioactivity is inversely proportional to the concentration of DPD. DPD results are corrected for urinary concentration by creatinine.

Warnings and Precautions The Gamma-BCT DPD kit is for in vitro diagnostic use only and is not for internal use in humans or animals. This product must be used strictly in accordance with the instructions set out in the Package Insert. IDS Limited will not be held responsible for any loss or damage (except as required by statute) howsoever caused, arising out of non-compliance with the instructions provided.

CAUTION: this kit contains material of human and/or animal origin. Handle kit reagents as if capable of transmitting an infectious agent.

Appropriate precautions and good laboratory practices must be used in the storage, handling and disposal of the kit reagents. Disposal of kit reagents should be in accordance with local regulations.

Radioactive Materials 1. This kit contains radioactive material

(Iodine-125). Appropriate precautions and good laboratory practices must be used in storage, handling and disposal of material. Radioactive material must be received, acquired, possessed and used only by physicians, clinical laboratories or hospitals, and only for in vitro laboratory tests. Its receipt, acquisition, possession, use and transfer are subject to local regulations.

2. Store radioactive materials in the original container, in a specifically designated, properly labelled area. Access to radioactive materials must be limited to authorised personnel only.

3. Do not eat, drink, smoke or apply cosmetics in areas where radioactive materials are stored or handled. Do not pipette radioactive material by mouth.

4. Always wear a protective laboratory coat and disposable gloves when handling radioactive materials. Wash hands thoroughly afterwards.

5. Areas where spills occur should be wiped immediately with suitable absorbent material, which should then be disposed of as radioactive waste. The contaminated area should then be washed using an alkaline detergent or radiological decontamination solution.

6. Disposal of radioactive material should be in accordance with local regulations.

7. Persons under 18 should not be permitted to handle radioactive material or enter radioactive areas.

8. Radioactive areas must be kept clean. Use disposable or easily decontaminated laboratory ware and absorbent covers on laboratory bench surfaces to minimise contamination.

Sodium Azide Some reagents in this kit contain sodium azide as a preservative, which may react with lead, copper or brass plumbing to form highly explosive metal azides. On disposal, flush with large volumes of water to prevent azide build up.

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Preparation of Reagents Wash Solution WASHBUF SOLN : Prepare by adding the contents of each bottle of Wash Concentrate WASHBUF 20x to 950 mL of distilled or de-ionised water. Store at 2-8°C. All other reagents are supplied ready for use.

Reagents should be mixed by repeated inversion prior to use in the assay.

Shelf Life and Storage of Reagents This kit is stable until the stated expiry date if stored as specified. Upon receipt, store all reagents at 2-8°C.

DPD Calibrators CAL , Controls CTRL , and 125I-DPD Ag 125I are light sensitive. Avoid prolonged exposure to light, especially direct sunlight.

Indications of possible deterioration of kit reagents 1. The presence of abnormal particulate matter

in any of the reagents.

2. A decrease in the maximum binding.

3. A shift in the slope of the curve from its normal position.

Specimen Collection and Storage The Gamma-BCT DPD assay can be carried out using preservative free First Morning Void samples or 24 hour urine samples. Store urine samples at 2-8°C for up to 7 days. For longer term storage, freeze at -20°C. Do not subject samples to more than 5 freeze/thaw cycles. Avoid prolonged exposure to light, especially direct sunlight.

Procedure

Materials Provided

1. CAL 0 – CAL 6 - Calibrators ( REF AA-6001A - AA-6001E): DPD in phosphate buffer, 0.25 mL per bottle, 6 bottles per kit.

2. SORB - Antibody Coated Tubes ( REF AA-6002T): Anti-DPD coated tubes, 50 per bag, 2 bags per kit.

3. Ag 125I - 125I-DPD ( REF AA-6003): 125I-DPD in phosphate buffer containing BSA and 0.05% sodium azide. Radioactive content <259 kBq (7µCi) per bottle, 21mL per bottle.

4. CTRL 1 – CTRL 2 - Controls ( REF AA-6005A - AA-6005B): DPD in phosphate buffer, 0.25 mL per bottle, 2 bottles per kit.

5. BUF - Assay buffer ( REF AA-600B): Phosphate buffered saline containing BSA, Tween 20 and 0.05% sodium azide, 25 mL per bottle.

6. WASHBUF 20x - Wash Concentrate ( REF AC-WASHL): Phosphate buffered saline containing Tween, 50 mL per bottle.

Materials Required but not Provided 1. Disposable 12 x 75 mm plastic tubes.

2. Precision pipetting devices to deliver 50 µL, 100 µL and 450 µL.

3. Repeating pipette to deliver 200 µL and 4 mL, e.g. Eppendorf Multipipette 4780, or similar.

4. Vortex mixer.

5. Decanting rack, e.g. Nalgene 5970-0013+5979-0013.

6. Gamma counter capable of counting 125I.

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Sample Preparation Calibrators CAL , Controls CTRL and samples SPE

all require a 1:10 dilution before assay.

1. Prepare labelled plastic tubes, one for each Calibrator CAL , Control CTRL and sample SPE .

2. Add 50 µL of each Calibrator CAL , Control CTRL or sample SPE to appropriately labelled tubes.

3. Add 450 µL of Assay Buffer BUF to each tube. Vortex all tubes.

Assay Procedure Allow Antibody Coated Tubes SORB to come to room temperature before opening the bags.

The Wash Solution WASHBUF SOLN and 125I-DPD Ag 125I must be at 2-8°C.

1. Add 100 µL of each diluted Calibrator, Control or sample to appropriately labelled Antibody Coated Tubes SORB in duplicate. Pipette directly to the bottom of the tube. Addition of samples should be complete within 30 minutes to avoid assay drift.

2. Add 200 µL of 125I-DPD Ag 125I to all tubes including two additional tubes to be set aside as total counts (TC). Vortex gently without foaming and incubate for 2 hours at 2-8°C.

3. Decant supernatants and allow inverted tubes to drain on a pad of absorbent paper for 2 to 3 minutes. Tap inverted tubes on absorbent paper to remove remaining drops of liquid.

Add 4 mL of COLD (2-8°C) dilute Wash Solution WASHBUF SOLN to tubes. Immediately decant tubes.

It is important not to allow the tubes to soak in Wash Solution WASHBUF SOLN for longer than 1½ minutes.

A repeating pipette or dispenser is recommended for rapid dispense of the Wash Solution WASHBUF SOLN .

Each decanting rack should not contain more than 40 tubes and after draining, each rack should be washed separately, in turn. Dispense of Wash Solution WASHBUF SOLN

must be completed within 1½ minutes for each rack of tubes.

Allow inverted tubes to drain inverted on a pad of absorbent paper for 3 to 5 minutes. Tap inverted tubes on absorbent paper to remove remaining drops of liquid.

4. Count all tubes in a suitable gamma counter for at least 1 minute.

Quality Control The regular use of control samples at several analyte levels is advised to ensure day-to-day validity of results. Two kit controls are provided. In order to properly evaluate the performance of the assay IDS recommends that all laboratories include in each assay appropriately aliquoted and stored in-house urine pools in addition to the controls provided with the kit. The controls should be tested as unknowns. Quality Control charts should be maintained to follow the assay performance. To ensure good precision it is important that the detectors in multi-well counters are well matched and not contaminated.

Calculation of Results Calculate the percent binding (B/Bo%) of each Calibrator, Control and unknown sample as follows: B/Bo% = (mean counts) x 100 (mean counts for '0' Calibrator) Prepare a calibration curve on semi-log graph paper by plotting B/Bo% on the ordinate against concentration of DPD on the abscissa. Calculate B/Bo% for each unknown sample and read values off the curve in nM. Alternative data reduction techniques may be employed but users should confirm that the selected curve fit is appropriate and gives acceptable results. Smoothed spline or 4PL curve fits are recommended. Creatinine values for samples are required. Results obtained for DPD must be corrected for variations in urine concentration by dividing the DPD value (nM) by the creatinine value (mM). Final DPD results should be reported as nM DPD / mM Creatinine.

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Sample Assay Data This data is for illustration only and must not be used for the calculation of any sample result. Tube Description cpm Mean cpm B/Bo% Result

nM 1, 2 Total Counts 62567

63526 63047

3, 4 Calibrator 0 0 nM

16594 16651

16622 100%


14280 14724

14502 87.2%


11970 11842

11906 71.6%


7914 7602

7758 46.7%


4034 4076

4055 24.4%


1885 1945

1915 11.5%

15, 16 Sample 1

9921 9818

9870 18.0

17, 18 Sample 2

6711 6605

6658 43.2

Typical Calibration Curve This sample calibration curve is for illustration only.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1 10 100 1000

DPD nM

B/B

o

7

Limitations of Use 1. Samples suspected of containing analyte

concentrations in excess of the highest calibrator should be assayed in dilution.

2. Samples that contain appreciable background radioactivity should not be used. Any suspect samples should be screened for radioactivity before performing the assay. The sample should be stored until the radioactivity has decayed, or a further sample obtained.

3. As in the case of any diagnostic procedure results must be interpreted in conjunction with the patient's clinical presentation and other information available to the physician.

Expected Values The following ranges have been determined using the Gamma-BCT DPD kit and are provided for guidance only. Each laboratory should determine normal ranges for their local population. Values are nM DPD per mM creatinine. Normal Male Adults: 2.5 - 5.5 nM/mM (n=86) Normal Female Adults: 2.5 - 6.5 nM/mM (n=281)

Performance Data

Accuracy The Gamma-BCT DPD kit was compared against a recognised enzymeimmunoassay for the quantitative determination of DPD. A population of 86 samples, selected to represent a wide range of DPD [5.0-124.5 nM], were assayed by each method. Linear regression analysis was performed on the comparative data: IDS = 1.00(x) - 0.7; correlation coefficient (r) = 0.99

Sensitivity The sensitivity, defined as the concentration corresponding to the mean minus 2 standard deviations of 10 replicates of the zero calibrator, is <2 nM.

Precision Intra-assay (n=18) Inter-assay (n=31)

Mean nM % CV Mean nM % CV 18.5 5.3% 10.4 8.5% 41.9 3.9% 24.1 6.7% 163 4.0% 42.5 7.6%

- - 94.7 8.1%

Recovery Recovery was assessed by adding DPD to samples prior to assay. Sample conc. nM

DPD added

nM Measured

nM Expected

nM Recovery

% 11.5 20

40 32.1 51.8

31.5 51.5

102%101%

76.7 20 40

94.8 117.2

96.7 116.7

98% 100%

139.6 20 40

160.0 196.2

159.6 179.6

100%109%

Mean 102%

Linearity Linearity was assessed by diluting samples with buffer prior to assay.

Sample Measured

nM Expected

nM %

M/E A

A/2 A/4

23.3 11.9 5.8

11.7 5.8

102% 100%

B B/2 B/4

65.7 31.1 14.9

32.9 16.4

95% 91%

C C/2 C/4

150.4 80.0 40.6

75.2 37.6

106% 108%

Mean 100%

Specificity The specificity of the antiserum was assessed with the following analytes.

Analyte Cross-Reactivity Free DPD 100 %

Pyridinoline <1% Pyd / DPD peptides:

>1000 Dalton >3500 Dalton

<2.5% <2.5%

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Utilisation

Pour usage diagnostique in vitro

La trousse Gamma-BCT DPD d'IDS est un dosage radioimmunologique à l’iode 125, utilisant des tubes revêtus, pour la détermination quantitative de la déoxypyridinoline (DPD) libre dans l’urine. La DPD s'est avérée être un marqueur biochimique de la résorption osseuse.

Résumé et explication La DPD est retrouvée principalement dans le collagène osseux de type 1. Après la formation de la matrice de collagène, l'action enzymatique de la lysyl-oxydase sur l'acide aminé lysine provoque la formation de l'agent de pontage covalent, DPD. Cette molécule de pontage, la DPD, prend une part importante dans le rôle structural du collagène. Dans le processus de résorption osseuse, la DPD est relarguée dans la circulation et éliminée par le rein.

Description de la méthode La trousse Gamma-BCT DPD est un dosage radioimmunologique utilisant un anticorps monoclonal anti-DPD fixé sur la paroi d'un tube en polystyrène. La DPD de l'échantillon entre en compétition avec la DPD radiomarquée à l’iode 125 vis-à-vis de l'anticorps anti-DPD. Après une incubation, les tubes sont lavés pour éliminer la DPD radiomarquée non liée, puis sont comptés. La radioactivité de la fraction liée est inversement proportionnelle à la concentration de DPD. Les résultats de DPD sont corrigés pour la concentration urinaire par la créatinine.

Mises en garde et précautions La trousse Gamma-BCT DPD est pour l'usage diagnostique in vitro seulement et n'est pas pour l'usage interne chez les humains ou les animaux. Ce produit doit être employé strictement selon les instructions présentées dans la notice. IDS Limited ne pourra être tenue responsable d'aucune perte ou dommage (excepté selon les exigences du statut) quelle qu’en soit la cause, provenant du manque de conformité aux instructions fournies. PRÉCAUTION : Cette trousse contient des matériaux d’origine humaine ou animale et doit être manipulé comme s’il pouvait être porteur de maladies et les transmettre. Manipuler les réactifs de trousse comme si capable de transmettre un agent infectieux. Des précautions appropriées et les bonnes pratiques de laboratoire doivent être utilisées dans le stockage, la manipulation et la disposition des réactifs de

trousse. II faut se débarrasser des réactifs de trousse inutilisé en suivant les recommandations des autorités compétentes locales et la réglementation en vigueur.

Matériaux radioactifs 1. Cette trousse contient du matériel radioactif (Iode-

125). Des précautions appropriées et les bonnes pratiques en matière de laboratoire doivent être utilisées dans le stockage, la manipulation et la disposition du matériel. Ce matériel radioactif peut être reçu, acquis, possédé, utilisé par des médecins dans les hôpitaux, des laboratoires, uniquement pour l'analyse in vitro. Sa réception, son acquisition, sa possession, son utilisation et son transfert sont soumis aux lois et à la réglementation locale en vigueur.

2. Le matériel radioactif doit être gardé dans le récipient d'origine, dans un endroit spécialement prévu à cet effet. L'accès aux matériaux radioactifs doit être limité uniquement au personnel autorisé.

3. Ne pas manger, ni boire, fumer ou appliquer des cosmétiques dans les laboratoires où des produits radioactifs sont utilisés. Ne pas pipeter les solutions radioactives à la bouche.

4. Suivre les directives concernant les règles d'hygiène: Eviter le contact avec les substances radioactives en utilisant des gants jetables, des blouses de laboratoire et tout autre matériel de protection. Se laver les mains soigneusement après avoir manié les substances radioactives.

5. Les zones de déversement doivent être essuyées immédiatement avec le matériel absorbant approprié, qui doit alors être rejeté en tant que déchet radioactif. La zone contaminée doit être nettoyée en utilisant un détergent alcalin ou la solution de décontamination radiologique.

6. II faut se débarrasser du matériel radioactif inutilisé en suivant les recommandations des autorités compétentes locales et la réglementation en vigueur.

7. Les sujets de moins de 18 ans ne sont pas autorisés à manipuler les substances radioactives ni à pénétrer dans les zones radioactives.

8. Les zones contrôlées doivent être tenues dans un très grand état de propreté. II est habituellement possible d'éviter la contamination du laboratoire et de l'équipement en travaillant avec précaution, en utilisant des articles jetables ou facilement décontaminables, et en mettant du matériel absorbant sur les paillasses de laboratoire.

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Azide de sodium Certains réactifs contenus dans cette trousse renferment de l'azide de sodium. Ce sel peut réagir avec les installations sanitaires en plomb ou cuivre et former des azides métalliques extrêmement explosives. Pour évacuer ces réactifs, rincer à grande eau afin d'éviter les accumulations d'azide.

Preparation des réactifs Solution de lavage WASHBUF SOLN : On prépare la solution de travail en ajoutant le contenu de chaque flacon de solution concentrée de lavage WASHBUF 20x à 950 mL d’eau distillée ou désionisée. Conserver entre 2 et 8 °C. Tous autres réactifs sont fournis prêts à l’emploi. Les réactifs doivent être homogénéisés par inversions douces et répétées du flacon avant usage.

Conservation des réactifs Cette trousse est stable jusqu'à la date de péremption indiquée si conservée comme indiqué. Conserver la trousse entre 2 et 8 °C après réception. Les standards CAL et les contrôles CTRL de DPD et la DPD-125I Ag 125I sont sensibles à la lumière. Éviter toute exposition prolongée à la lumière, surtout la lumière du soleil directe.

Indices d’une détérioration des réactifs 1. Présence anormale de particules en

suspension dans l’un des réactifs. 2. Diminution de la liaison maximale. 3. Pente ou courbe d’étalonnage différente de

celles obtenue régulièrement.

Prélèvement et conservation des échantillons Le dosage Gamma-BCT DPD peut être réalisé avec les premières urines du matin ou échantillon d'urine des 24 heures, sans conservateur. Conserver les urines à 2-8°C pour un maximum de 7 jours. Pour un stockage prolongé, ils devront être conservés à -20°C minimum. Ne pas faire subir plus de 5 décongélations - recongélations. Eviter toute exposition prolongée à la lumière, surtout la lumière du soleil directe.

Procédure

Matériel fourni

1. CAL 0 – CAL 6 - Standards ( REF AA-6005A - AA-6005B): DPD dans un tampon phosphate, 0,25 mL par flacon, 6 flacons par trousse.

2. SORB - Tubes revêtus d'anticorps ( REF AA-6002T): Tubes revêtus d’anti-DPD, 50 par sachet, 2 sachets par trousse.

3. Ag 125I - DPD marquée à l’Iode 125 ( REF AA-6003): DPD marquée à l’Iode 125 dans un tampon phosphate BSA avec de l’azide de sodium à 0,05%. Chaque flacon a une activité < 259 kBq (7 µCi), 21 mL par flacon.

4. CTRL 1 – CTRL 2 - Contrôles ( REF AA-6005A - AA-6005B): DPD dans un tampon phosphate, 0,25 mL par flacon, 2 flacons par trousse.

5. BUF - Tampon de dosage ( REF AA-600B): Solution tampon saline contenant de la BSA, du Tween 20, et de l’azide de sodium à 0,05%. 25 mL par flacon.

6. WASHBUF 20x - Solution concentrée de lavage ( REF AC-WASHL): Solution tampon saline contenant du Tween 20, 50 mL par flacon.

Matériel nécessaire mais non fourni 1. Tubes en plastique, à usage unique, 12 x 75 mm. 2. Pipettes de précision à distribuer 50 µL, 100 µL

et 450 µL. 3. Distributeur automatique pour distribuer

200 µL et 4 mL, e.g. Eppendorf Multipipette 4780, ou équivalente.

4. Agitateur type Vortex. 5. Portoir de décantation, e.g. Nalgene 5970-

0013+5979-0013. 6. Compteur à scintillations gamma pouvant

mesurer l’iode 125.

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Préparation des échantillons Les standards CAL , les contrôles CTRL et les échantillons SPE doivent être dilués au 1:10 avant le dosage. 1. Préparer et identifier un tube en plastique, pour

chaque standard CAL , contrôle CTRL et échantillon SPE .

2. Ajouter 50 µL de chaque standard CAL , contrôle CTRL ou échantillon SPE dans le tube correspondant.

3. Ajouter 450 µL de tampon de dosage BUF dans chaque tube. Homogénéiser le contenu de tous les tubes à l’aide de l’agitateur type vortex.

Procédure de dosage Laisser les tubes revêtus de l'anticorps SORB à température ambiante avant d'ouvrir les sachets. La solution diluée de lavage WASHBUF SOLN et le DPD-125I Ag 125I doivent rester à 2-8°C. 1. Ajouter 100 µL de chaque standard dilué,

contrôle ou échantillon en double dans le tube revêtu anti-DPD SORB correspondant. Pipetter directement au fond du tube.

Cette étape doit être réalisée en 30 minutes pour éviter toute dérive.

2. Ajouter 200 µL de DPD-125I Ag 125I dans tous les tubes ainsi que dans 2 tubes supplémentaires non revêtus pour l’activité totale (AT). Mélanger doucement, sans produire de mousse, le contenu de tous les tubes à l’aide d’un vortex et incuber à 2-8°C pendant 2 heures

3. Décanter le surnageant et laisser retournés les tubes sur du papier absorbant pour éliminer les gouttes résiduelles pendant 2 à 3 minutes. Tapoter les tubes si nécessaire pour éliminer les gouttes résiduelles.

Ajouter 4 ml de solution diluée de lavage FROIDE (2-8°C) WASHBUF SOLN dans tous les tubes, exceptés ceux de l'activité totale (AT). Décanter immédiatement les tubes.

Note : Il est important de ne pas laisser les tubes plus de 90 secondes avec la solution de lavage WASHBUF SOLN . Un distributeur automatique est recommandé pour une distribution rapide de la solution de lavage WASHBUF SOLN . Chaque rack de tubes (maximum 40) doit être lavé et décanté séparément. Chaque étape de lavage doit être réalisée en moins de 90 secondes.

Laisser les tubes retournés sur du papier absorbant pour éliminer les gouttes résiduelles pendant 3 à 5 minutes. Tapoter les tubes si nécessaire pour éliminer les gouttes résiduelles.

4. Effectuer le comptage de tous les tubes dans un compteur gamma pendant au moins 1 minute.

Contrôle de qualité L'utilisation régulière des échantillons de contrôle à plusieurs niveaux d'analyte est conseillée pour assurer la validité des résultats d’un jour à l’autre. Deux contrôles de la trousse sont fournis. Afin de vérifier la qualité de la série de dosage, IDS recommande à tous les laboratoires d'inclure dans chaque série des échantillons d’urine qui auront été aliquotées et conservées, en plus des contrôles inclus dans la trousse. Les contrôles doivent être examinés comme des inconnus. Des tableaux de contrôle de qualité doivent être réalisés pour suivre la performance des dosages. Afin d’assurer une bonne précision, il est important que les détecteurs des compteurs multipuits soient bien contrôlés et ne soient pas contaminés.

Calcul des résultats Calculer le pourcentage de fixation (B/Bo%) de chaque standard, contrôle et échantillon inconnu de la façon suivante:

B/Bo% = (moyenne des CPM ) x 100 (moyenne des CPM Std '0')

Tracer la courbe standard sur papier semi-logarithmique en reportant les B/Bo% correspondant à chaque standard sur l’axe des ordonnées et leur concentration en DPD sur l’axe des abscisses. Calculer le B/Bo% correspondant à chaque échantillon inconnu et lire la concentration en nmol/L (nM) sur la courbe. D’autres techniques de traitement des données peuvent être employées, mais les utilisateurs devront s’assurer que la forme de la courbe sélectionnée est appropriée et offre des résultats acceptables. Il est recommandé de calculer les courbes en utilisant la fonction « smooth spline » ou 4PL. Les valeurs de créatinine sont exigées pour les échantillons. Les résultats obtenus pour la DPD doivent être corrigés pour les variations de la concentration en urine, en divisant la valeur de DPD (nM) par la valeur de créatinine (mM). Les résultats finaux de DPD sont exprimés en nM DPD / mM créatinine.

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Exemple de données de dosage Ces informations sont uniquement données à titre d’exemple et ne doivent pas être utilisées pour calculer des résultats d’échantillons.

Tube Description cpm Moyenne cpm B/Bo% Résultats nM

1, 2 Activité Totale

62567 63526

63047

3, 4 Standard 0 0 nM

16594 16651

16622 100%


14280 14724

14502 87,2%


11970 11842

11906 71,6%


7914 7602

7758 46,7%


4034 4076

4055 24,4%


1885 1945

1915 11,5%

15, 16 Echantillon 1

9921 9818

9870 18,0

17, 18 Echantillon 2

6711 6605

6658 43,2

Exemple de courbe standard Cette courbe standard ne doit être utilisée qu’à titre d’exemple.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1 10 100 1000

DPD nM

B/B

o

12

Limites du dosage 1. Les échantillons dont les concentrations en

DPD sont supérieures à celle du standard le plus concentré seront dilués et redosés. Les résultats obtenus seront calculés en tenant compte de la dilution.

2. On n’utilisera pas d’échantillons qui contiennent déjà une certaine quantité de radioactivité. On vérifiera les échantillons douteux avant d’effectuer le dosage. Les échantillons seront stockés jusqu’à ce que la radioactivité ait décrut ou qu’un nouvel échantillon est été obtenu.

3. Comme dans le cas de n'importe quelle procédure de diagnostic, des résultats doivent être interprétés en même temps que le contexte clinique et toute autre information du patient disponible par le médecin.

Valeurs attendues Les valeurs de référence ont été déterminées avec la trousse Gamma-BCT DPD et ne sont fournies ici qu’ à titre indicatif. Il est recommandé à chaque laboratoire d’établir ses propres valeurs normales. Les valeurs sont exprimées en nM DPD / mM créatinine. Hommes adultes normaux: 2,5-5,5 nM/mM (n=86) Femmes adultes normales: 2,5-6,5 nM/mM (n=281)

Caractéristiques du dosage

Exactitude La trousse Gamma-BCT DPD a été comparée à une technique de dosage immuno-enzymatique identifié pour la détermination quantitative de DPD. On a analysé une population de 86 échantillons, choisie pour représenter un éventail de DPD [5,0-124,5 nM], par chaque méthode. Les résultats ont été analysés par régression linéaire: IDS = 1,00(x) - 0,7; coefficient de corrélation (r) = 0,99.

Sensibilité La sensibilité, définie comme étant la concentration qui correspond à la moyenne des écarts types moins 2, effectuée sur 10 dosages du standard zéro, est < à 2 nM.

Précision Intra-essai (n=18) Inter-essai (n=31)

Moyenne nM % CV

Moyenne nM % CV

18,5 5,3% 10,4 8,5% 41,9 3,9% 24,1 6,7% 163 4,0% 42,5 7,6%

- - 94,7 8,1%

Test de surcharge Le pourcentage de récupération a été étudiée en ajoutant de la DPD à des échantillons avant de faire le dosage.

Echantillon nM

DPD ajoutée

nM Mesurée

nM Attendue

nM Récupération

% 11,5 20

40 32,1 51,8

31,5 51,5

102% 101%

76,7 2040

94,8 117,2

96,7 116,7

98% 100%

139,6 2040

160,0 196,2

159,6 179,6

100% 109%

Moyenne 102%

Test de parallélisme Le parallélisme a été étudié en diluant des échantillons avec du tampon avant de faire le dosage.

EchantillonMesuré

nM Attendue

nM %

M/A A

A/2 A/4

23,3 11,9 5,8

11,7 5,8

102%100%

B B/2 B/4

65,7 31,1 14,9

32,9 16,4

95%91%

C C/2 C/4

150,4 80,0 40,6

75,2 37,6

106%108%

Moyenne 100%

Spécificité La spécificité de l’antisérum a été étudiée en ajoutant aux échantillons des quantités connues des analytes suivantes.

Substance analyser Réaction croisée DPD libre 100 %

Pyridinoline <1% Peptides Pyd / DPD:


<2,5% <2,5%

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Verwendungszweck

Nur zur in-vitro Diagnostik

Der IDS Gamma-BCT DPD kit ist ein Coated Tube 125J Radioimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von freien Desoxypyridinolin (DPD)-Crosslinks im Urin. DPD ist ein biochemischer Marker für den Knochenabbau.

Zusammenfassung und Erklärung DPD wird hauptsächlich im Knochen-Kollagen vom Typ 1 gefunden. Nach der Bildung der Kollagen-Matrix bewirkt die enzymatische Reaktion der Lysyl-Oxidase mit der Aminosäure Lysin die Bildung von kovalenten DPD-Crosslinks. Diese DPD-Crosslinks sind ein wichtiger Bestandteil der Struktur von Kollagen. Während des Knochenabbaus wird DPD in den Blutkreislauf sezerniert und über die Nieren ausgeschieden.

Beschreibung der Methode Der Gamma-BCT DPD Kit ist ein kompetitiver Radioimmunoassay. Hierbei konkurriert radioaktiv markiertes (125J) DPD mit unmarkiertem DPD aus der Probe um die Bindungsstellen von an die Röhrchenwand gebundenen Anti-DPD-Antikörpern. Nach einer Inkubationszeit werden ungebundene Bestandteile aus den Röhrchen entfernt und die verbleibende Radioaktivität des an die Antikörper der Röhrchenwand gebundenen, radioaktiv markierten DPD in einem Gammacounter gemessen. Die gemessene Radioaktivität ist umgekehrt proportional zur DPD-Konzentration im Urin. Die DPD-Meßergebnisse werden auf den Kreatiningehalt des Urins bezogen.

Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen Der Gamma-BCT DPD Kit ist nur für In-Vitro Diagnostik und nicht zur inneren Anwendung an Mensch und Tier geeignet. Dieses Produkt darf nur wie in der mitgelieferten Anleitung beschrieben eingesetzt werden. IDS Limited kann nicht für einen eventuellen Verlust oder Schaden haftbar gemacht werden, der durch Nichtbeachtung der Instruktionen entsteht.

VORSICHT: Dieser Kit enthält Material menschlichen und/oder tierischen Ursprungs. Die Kitreagenzien behandeln, als ob sie zum übertragen eines Infektionserregers fähig sind. Angemessene Vorsichtsmaßnahmen und die Regeln der guten Laborpraxis müssen bei Lagerung, Gebrauch und Entsorgung der Kitreagenzien eingehalten werden. Die Entsorgung der Kitreagenzien sollte nach den örtlichen Vorschriften erfolgen.

Umgang mit radioaktivem Material 1. Dieser Kit enthält radioaktives Material (125J).

Angemessene Vorsichtsmaßnahmen und die Regeln der guten Laborpraxis müssen bei Lagerung, Gebrauch und Entsorgung des Materials eingehalten werden. Radioaktives Material darf nur von Ärzten, klinischen Labors oder Kliniken in Empfang genommen werden und nur für In-Vitro Tests verwendet werden.

Annahme, Kauf, Besitz, Verwendung und Weitergabe unterliegen den örtlichen Vorschriften.

2. Radioaktives Material ist im Originalbehälter in einem besonders ausgewiesenen, besonders gekennzeichneten Bereich zu lagern. Der Zugriff auf radioaktives Material darf nur durch dazu ermächtigtes Personal erfolgen.

3. In Bereichen, in denen radioaktives Material gelagert oder verwendet wird, ist essen, trinken, rauchen und verwenden von Kosmetika verboten. Radioaktives Material nicht mit dem Mund pipettieren.

4. Beim Umgang mit radioaktivem Material immer Labormantel und Einweghandschuhe tragen. Nach Abschluß der Arbeiten Hände sorgfältig waschen.

5. Verschüttetes Material sollte umgehend mit einem geeigneten saugfähigen Material aufgenommen werden, welches dann als radioaktiver Abfall entsorgt werden muß. Der kontaminierte Bereich sollte dazu mit einem alkalischen Reinigungsmittel oder einer Dekontaminationslösung gereinigt werden.

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6. Die Entsorgung radioaktiven Materials sollte nach den örtlichen Vorschriften erfolgen.

7. Personen unter 18 Jahren ist der Umgang mit radioaktivem Material oder das Betreten radioaktiver Bereiche zu untersagen.

8. Bereiche, in denen mit radioaktivem Material gearbeitet wird, müssen saubergehalten werden, Einwegmaterial oder leicht dekontaminierbare Materialien sowie absorbierende Schutzfolien für den Labortisch sind zu verwenden um Kontaminationen zu verringern.

Natriumazid Einige Reagenzien in diesem Kit enthalten Natriumazid als Konservierungsmittel, welches mit Blei, Kupfer oder Messing hochexplosive Metallazide bilden kann; Zum Beseitigen der Reagenzien mit viel Wasser nachspülen, um die Azidbildung zu vermeiden.

Präparation der Reagenzien Waschlösung WASHBUF SOLN : Jede Flasche Waschkonzentrat WASHBUF 20x mit 950 mL destilliertem Wasser verdünnen. Bei 2-8°C lagern. Alle anderen Reagenzien werden gebrauchsfertig geliefert.

Vor jedem Gebrauch Reagenzien durch mehrmaliges Wenden mischen.

Verfall und Lagerung der Reagenzien Der Kit ist bei vorschriftsgemäßer Lagerung bis zum Ablauf des Verfalldatums verwendbar. Nach Erhalt sind die Reagenzien bei 2-8°C zu lagern.

Die DPD-Kalibratoren CAL , Kontrollen CTRL und das radioaktiv markierte (125l) DPD Ag 125I sind lichtempfindlich und sollten daher dunkel gelagert werden. Direktes Sonnenlicht sollte vermieden werden.

Anzeichen für mögliche Unbrauchbarkeit der Kitreagenzien 1. Das Vorhandensein von anormalen

Feststoffteilchen in irgendwelchen der Reagenzien.

2. Eine Verringerung der maximalen Bindung.

3. Eine Verschiebung in der Steigung der Kurve aus ihrer Normalstellung.

Probenvorbereitung und -lagerung Der Gamma-BCT-DPD Assay kann mit dem ersten Morgenurin oder mit einem 24-Stunden-Urin durchgeführt werden. Die Urin-Proben können bei 2-8°C bis zu 7 Tage gelagert werden. Bei längeren Lagerzeiten müssen die Proben bei -20°C tiefgefroren werden. Proben nicht öfter als 5 mal auftauen und wieder einfrieren. Proben nicht über längere Zeit dem Licht, vor allem keinem direkten Sonnenlicht aussetzen.

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Testdurchführung

Im Kit enthaltenes Material

1. CAL 0 – CAL 6 - Kalibratoren ( REF AA-6001A - AA-6001E): DPD in Phosphatpuffer, 0.25 mL pro Flasche, 6 Flaschen pro Kit.

2. SORB - Antikörperbeschichtete Röhrchen ( REF AA-6002T): Anti-DPD beschichtete Röhrchen, 2 x 50 Stück pro Kit.

3. Ag 125I - 125J-DPD ( REF AA-6003): 125J-DPD in BSA-Phosphatpuffer mit 0,05% Natriumazid. Radioaktivität pro Flasche <259 kBq (7µCi), 21mL pro Flasche.

4. CTRL 1 – CTRL 2 - Kontrollen ( REF AA-6005A - AA-6005B): DPD in Phosphatpuffer, 0.25 mL pro Flasche, 2 Flaschen pro Kit.

5. BUF - Assay-Puffer ( REF AA-600B): Phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit BSA, Tween und 0,05% Natriumazid, 25 mL pro Flasche.

6. WASHBUF 20x - Waschkonzentrat ( REF AC-WASHL): Phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit Tween, 50 mL pro Flasche.

Benötigte, jedoch nicht mitgelieferte Materialien 1. 12 x 75 mm Einweg-Plastikröhrchen.

2. Präzisionspipetten für Volumina von 50 µL, 100 µL, 200 µL und 450 µL.

3. Mehrfachpipetten für Volumina von 4 mL., z.B. Eppendorf Multipipette 4780, oder ähnliche.

4. Vortex-Mischer.

5. Dekantiergestell, z.B. Nalgene 5970-0013+5979-0013.

6. Gammacounter für 125J.

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Vorbereitung der Proben Kalibratoren CAL , Kontrollen CTRL und Proben SPE müssen vor dem Einsatz im Assay 1:10 verdünnt werden.

1. Beschriftete Plastikröhrchen vorbereiten; eines pro Kalibrator CAL , Kontrolle CTRL und unbekannter Probe SPE .

2. 50 µL jedes Kalibrators CAL , Kontrolle CTRL oder Probe SPE in das passend beschriftete Röhrchen pipettieren.

3. 450 µL Assay-Puffer BUF jedem Röhrchen hinzufügen. Alle Röhrchen vortexen.

Assay-Verfahren Die antikörperbeschichteten Röhrchen SORB sollten vor dem Öffnen der Beutel Raumtemperatur angenommen haben.

Die Waschlösung WASHBUF SOLN und das 125J-DPD Ag 125I müssen eine Temperatur von 2-8°C haben.

1. Jeweils 100 µL der verdünnten Kalibratoren, Kontrollen oder Proben im Doppelansatz auf den Grund der entsprechenden antikörper-beschichteten Röhrchen SORB pipettieren. Die Zugabe der Proben sollte innerhalb von 30 Minuten abgeschlossen sein, um Assay-Drift zu vermeiden.

2. 200 µL 125J-DPD Ag 125I zu allen Röhrchen inklusive zweier zusätzlicher Röhrchen für die Totalaktivität pipettieren. Vorsichtig vortexen, um Schaumbildung zu vermeiden und 2 Stunden bei 2-8°C inkubieren.

3. Den Überstand abgießen und die Röhrchen umgedreht 2-3 Minuten auf einer saugfähigen Unterlage auslaufen lassen. Durch vorsichtiges Klopfen anhaftende Tropfen aus den Röhrchen entfernen.

4 mL kalte (2-8°C) verdünnte Waschlösung WASHBUF SOLN zu Röhrchen zufügen. Die Röhrchen sofort abgießen.

Die Röhrchen umgedreht 3-5 Minuten auf einer saugfähigen Unterlage auslaufen lassen. Durch vorsichtiges Klopfen anhaftende Tropfen aus den Röhrchen entfernen.

Dabei die Röhrchen nicht länger als 1,5 Minuten mit der Waschlösung WASHBUF SOLN stehen lassen und nach dem Dekantieren des

Überstandes für etwa 3-5 Minuten auslaufen lassen. Es wird empfohlen, einen Dispensor oder eine Multipette für eine schnelle Durchführung des Waschschrittes zu verwenden.

4. Alle Röhrchen in einem geeigneten Gammacounter für mindestens 1 Minute messen.

Qualitätskontrolle Es ist ratsam, regelmäßig Kontrollproben unterschiedlicher Konzentrationen einzusetzen, um sicherzustellen, dass man reproduzierbare Ergebnisse erzielt. Zwei Kontrollen werden zur Verfügung gestellt. Um eine ausreichende Qualitätskontrolle für den Immunoassay zu haben, empfiehlt IDS jedem Labor, zusätzlich zu den im Kit enthaltenen Kontrollen sorgfältig gelagerte und portionierte inhouse-Patientenpools mitzubestimmen. Die Kontrollen sollten wie unbekannte Proben behandelt werden. Um die Leistung des Assays zu überwachen, sollten Qualitätskontrolltabellen geführt werden. Zur Sicherstellung einer hohen Präzision ist es am wichtigsten, daß die Detektoren des Counters exakt justiert und nicht kontaminiert sind.

Ergebnisberechnung Berechnung der prozentualen Bindungen (B/Bo%) für jeden Kalibrator, Kontrolle und unbekannte Probe:

B/Bo% = (durchschnittliche Counts) x 100 (durchschnittliche Counts für "0" Kalibrator) Eine Eichkurve auf halb-logarithmischem Papier anlegen, indem B/Bo % auf der Ordinate gegen die DPD Konzentration auf der Abszisse aufgetragen wird. B/Bo % für jede unbekannte Probe berechnen und die Konzentration in nM an der Kurve ablesen. Alternative Umrechnungsmethoden können verwendet werden, allerdings sollte beachtet werden, ob der gewählte Kurvenverlauf geeignet ist und akzeptable Ergebnisse liefert. "Smoothed Spline" oder eine 4-Parameter Auswertung werden empfohlen. Es werden die Kreatinin Werte der Proben benötigt. Die für DPD erhaltenen Ergebnisse müssen korrigiert werden, da der Urin in seiner Konzentration schwankt. Daher müssen die DPD-Werte [nM] noch auf den Kreatininwert (mM) bezogen werden. Abschließend werden die DPD-Ergebnisse in nM DPD / mM Kreatinin angegeben.

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Beispieldaten Diese Daten dienen nur zur Illustration und sollten nicht für die Berechnung der Probenergebnisse verwendet werden. Röhrchen Beschreibung cpm Mittelwert cpm B/Bo% Ergebnis

nM 1, 2 Totalaktivität 62567

63526 63047

3, 4 Kalibrator 0 0 nM

16594 16651

16622 100%


14280 14724

14502 87,2%


11970 11842

11906 71,6%


7914 7602

7758 46,7%


4034 4076

4055 24,4%


1885 1945

1915 11,5%

15, 16 Probe 1

9921 9818

9870 18,0

17, 18 Probe 2

6711 6605

6658 43,2

Typische Eichkurve Diese Eichkurve dient nur als Beispiel zur Illustration.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1 10 100 1000

DPD nM

B/B

o

18

Gebrauchseinschränkungen 1. Proben, von denen anzunehmen ist, daß sie

eine höhere Konzentration als der höchste Standard aufweisen, sollten verdünnt untersucht werden.

2. Radioaktive Proben dürfen nicht verwendet werden. Eventuell radioaktive Proben müssen vor der Versuchsdurchführung daraufhin untersucht werden.

3. Eine radioaktive Probe sollte bis zum Abklingen der Radioaktivität gelagert oder stattdessen eine andere, nicht radioaktive Probe verwendet werden.

4. Die Ergebnisse sollten immer gemeinsam mit dem klinischem Bild und anderen für den Arzt zur Verfügung stehenden Informationen über den Patienten gedeutet werden.

Normalwerte Die folgenden Werte wurden mit dem Gamma-BCT DPD Kit bestimmt und sind nur als Richtlinie angeführt. Jedes Labor sollte seinen eigenen Normalbereich für die lokale Bevölkerung festlegen. Die Werte sind in nM DPD pro mM Kreatinin angegeben.

Erwachsene Männer: 2,5 - 5,5 nM/mM (n=86) Erwachsene Frauen: 2,5 - 6,5 nM/mM (n=281)

Daten zum Test

Richtigkeit Der Gamma-BCT DPD Kit wurde mit einem anerkannten Enzymimmunoassay für die quantitative Bestimmung von DPD verglichen. Eine Auswahl von 86 Proben wurde herangezogen, um einen großen Wertebereich von DPD [5,0-124,5 nM] durch jede Methode zu überprüfen. Lineare Regressionsanalyse wurde an den vergleichbaren Daten durchgeführt: IDS = 1,00(x) - 0,7; Korrelationskoeffizient (r) = 0,99

Sensitivität Die Sensitivität ist definiert als jene Konzentration, die dem Mittelwert minus 2 Standardabweichungen von 10 Doppelbestimmungen des Nullkalibrators entspricht. Sie wurde als <2 nM bestimmt.

Präzision

Intra-assay (n=18) Inter-assay (n=31) Mittelwert

nM % CV Mittelwert

nM % CV 18,5 5,3% 10,4 8,5% 41,9 3,9% 24,1 6,7% 163 4,0% 42,5 7,6%

- - 94,7 8,1%

Wiederfindung Die Wiederfindung wurde durch Zugabe von DPD vor Messung bestimmt.

Proben-konzentration

nM

DPD zugefügt

nM Gemessen

nM Erwartet

nM

Wieder-findung

% 11,5 20

40 32,1 51,8

31,5 51,5

102%101%

76,7 20 40

94,8 117,2

96,7 116,7

98%100%

139,6 20 40

160,0 196,2

159,6 179,6

100%109%

Mittelwert 102%

Linearität Die Linearität wurde durch Verdünnung der Proben mit Puffer vor Messung bestimmt.

Probe Gemessen

nM Erwartet

nM %

G/E A

A/2 A/4

23,3 11,9 5,8

11,7 5,8

102% 100%

B B/2 B/4

65,7 31,1 14,9

32,9 16,4

95% 91%

C C/2 C/4

150,4 80,0 40,6

75,2 37,6

106% 108%

Mittelwert 100%

Spezifität

Die Spezifität des Antiserums wurde mit den folgenden Analyten ermittelt.

Analyt Kreuzreaktivität Freies DPD 100 % Pyridinolin <1%

Pyd / DPD Peptide: >1000 Dalton >3500 Dalton

<2.5% <2.5%

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Uso Previsto

Per uso diagnostico in vitro

Il kit IDS Gamma-BCT DPD è un radioimmuno-dosaggio con 125I in provetta rivestita per la determinazione quantitativa di legami crociati di desossipiridinolina (DPD) libera nell'urina. È stato dimostrato che la DPD è un marker biochimico di riassorbimento osseo.

Sommario e spiegazione La DPD si trova principalmente nel collagene di Tipo 1 delle ossa. Dopo la formazione della matrice di collagene, l'azione enzimatica della lisil-ossidasi sull'amminoacido lisina provoca la formazione del legame crociato covalente DPD. Questo legame crociato, DPD, ha una funzione importante nel ruolo strutturale del collagene. Durante il processo di degradazione ossea, la DPD viene rilasciata nel sangue e viene eliminata dal rene.

Descrizione del metodo Il kit Gamma-BCT DPD è un radioimmunodosaggio competitivo che utilizza l'anticorpo monoclonale anti-DPD che riveste la superficie interna di una provetta in polistirene. La DPD presente nel campione compete per l'anticorpo con la DPD marcata con 125I. Dopo l'incubazione, le provette vengono lavate per rimuovere la 125I-DPD libera e poi sottoposte a conteggio. La radioattività delle particelle legate è inversamente proporzionale alla concentrazione di DPD. I risultati della DPD vengono corretti per tenere conto della concentrazione urinaria della creatinina.

Precauzioni e avvertenze Il kit Gamma-BCT DPD è esclusivamente per uso diagnostico in vitro e non è concepito per l’uso interno in esseri umani o animali. Questo prodotto va utilizzato in ottemperanza alle istruzioni per l'uso allegate. La IDS Limited non risponderà di eventuali perdite o danni (ad eccezione di quanto predisposto dalla legge), indipendentemente dalla loro natura, sorti dal non corretto utilizzo del kit in base alle istruzioni fornite. ATTENZIONE: il presente kit contiene materiali di origine umana e/o animale. I reagenti del kit vanno pertanto trattati come potenziali vettori di agenti infettivi. Per la conservazione, la manipolazione e lo smaltimento dei reagenti del kit è necessario

adottare le opportune precauzioni e attenersi alle corrette prassi di laboratorio. Lo smaltimento dei reagenti del kit va eseguito nel rispetto delle normative vigenti.

Materiali radioattivi 1. Il kit contiene materiale radioattivo (iodio-125). Per

la conservazione, la manipolazione e lo smaltimento del materiale radioattivo è necessario adottare le opportune precauzioni e attenersi alle corrette prassi di laboratorio. Il materiale radioattivo va acquistato, ricevuto, posseduto e utilizzato solo da parte di medici, laboratori clinici o ospedali, ed esclusivamente a scopo di analisi in vitro. L’acquisto, il ricevimento, il possesso, l’uso e il trasferimento di materiali radioattivi è soggetto alle disposizioni delle normative vigenti.

2. Il materiale radioattivo va conservato nel contenitore originale in locali appositi di un'area specificatamente designata. L'accesso ai materiali radioattivi deve essere limitato al solo personale autorizzato.

3. Non consumare cibi o bevande, fumare o applicare cosmetici nelle aree destinate alla conservazione e alla manipolazione dei materiali radioattivi. Non pipettare i materiali radioattivi con pipette a bocca.

4. Durante la manipolazione dei materiali radioattivi, indossare sempre un camice e dei guanti protettivi. Al termine delle operazioni, lavarsi sempre accuratamente le mani.

5. Nel caso di versamento di materiali radioattivi, pulire immediatamente le superfici contaminate con del materiale assorbente, che va quindi eliminato come rifiuto radioattivo. L'area contaminata va successivamente lavata con un detergente alcalino o con una soluzione per la decontaminazione dai materiali radioattivi.

6. Lo smaltimento dei materiali radioattivi va eseguito in ottemperanza alle normative vigenti a livello locale.

7. Il trasporto e la manipolazione dei materiali radioattivi non devono essere consentiti ai minori di 18 anni.

8. Le aree dedicate ai materiali radioattivi vanno tenute pulite. Per minimizzare la contaminazione, utilizzare contenitori e utensili di laboratorio monouso o facilmente decontaminabili. Dotare inoltre i banchi di laboratorio di coperture protettive assorbenti.

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Sodio azide Alcuni reagenti del kit contengono sodio azide come conservante. Tale sostanza può reagire con il piombo, il rame e l’ottone utilizzati nelle tubature di scarico, formando azoturi altamente esplosivi. Durante lo smaltimento attraverso i normali scarichi, per evitare l’accumulo di azoturi pericolosi, fare scorrere abbondanti volumi d’acqua.

Preparazione dei reagenti Soluzione di lavaggio WASHBUF SOLN : Aggiungere il contenuto di ogni flacone della Soluzione di lavaggio concentrata WASHBUF 20x

a 950 mL di acqua distillata o deionizzata. Conservare a 2-8 °C. Tutti gli altri reagenti sono forniti pronti per l’uso.

Prima dell’uso, i reagenti vanno miscelati capovolgendo ripetutamente i rispettivi flaconi.

Durata e conservazione dei reagenti Il presente kit, se correttamente conservato, è stabile fino alla data di scadenza indicata. Dopo il ricevimento, conservare tutti i reagenti a 2-8 °C.

I calibratori DPD CAL , i controlli CTRL e la 125I-DPD Ag 125I sono fotosensibili. Evitare l'esposizione prolungata alla luce, in particolar modo alla luce solare diretta.

Possibili segni di deterioramento dei reagenti del kit 1. Presenza di materia particolata anomala in

qualsiasi reagente. 2. Diminuzione della capacità di legame

massima. 3. Traslazione della pendenza della curva dalla

sua posizione normale.

Raccolta e conservazione dei campioni Il dosaggio Gamma-BCT DPD può essere eseguito utilizzando campioni delle prime urine del mattino o campioni di urina delle 24 ore senza conservante. Conservare i campioni di urina ad una temperatura compresa fra 2-8 °C per massimo 7 giorni. Per una conservazione più lunga, congelare i campioni a -20° C. Non sottoporre i campioni a più di 5 cicli di congelamento/scongelamento. Evitare l'esposizione prolungata alla luce, in particolar modo alla luce solare diretta.

Procedura

Materiali forniti

1. CAL 0 – CAL 6 Standard ( REF AA-6001A - AA-6001E): DPD in tampone fosfato, 0,25 mL per flacone, 6 flaconi per kit.

2. SORB - Provette rivestite di anticorpo ( REF AA-6002T): Provette rivestite di anti-DPD, 50 per sacca, 2 sacche per kit.

3. Ag 125I - 125I-DPD ( REF AA-6003): 125I-DPD in tampone fosfato contenente albumina del siero bovina e sodio azide allo 0,05%. Contenuto radioattivo <259 kBq (7µCi) per flacone, 21mL per flacone.

4. CTRL 1 – CTRL 2 - Controlli ( REF AA-6005A - AA-6005B): DPD in tampone fosfato, 0,25 mL per flacone, 2 flaconi per kit.

5. BUF - Tampone ( REF AA-600B): Soluzione salina tamponata al fosfato contenente albumina del siero bovina, Tween e sodio azide allo 0,05%, 25 mL per flacone.

6. WASHBUF 20x - Soluzione di lavaggio concentrata ( REF AC-WASHL): Soluzione salina tamponata al fosfato contenente Tween, 50 mL per flacone.

Materiali richiesti, ma non forniti 1. Provette monouso in plastica da 12 x 75 mm. 2. Pipette automatiche di precisione per

dispensare 50 µL, 100 µL e 450 µL. 3. Pipette a ripetizione (come Eppendorf

Multipipette 4780 o equivalenti) per dispensare 200 µL e 4 mL.

4. Agitatore vortex. 5. Rastrelliera per la decantazione (come Nalgene

5970-0013+5979-0013 o equivalente). 6. Contatore gamma per la rilevazione di 125I.

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Preparazione dei campioni I calibratori CAL , i controlli CTRL e i campioni SPE . richiedono una diluizione 1:10 prima del dosaggio.

1. Preparare le provette in plastica provviste di etichette, una per ciascun calibratore CAL , controllo CTRL e campione SPE .

2. Aggiungere 50 µL di standard CAL , controllo

CTRL e campione SPE , nelle relative provette.

3. Aggiungere in ciascuna provetta 450 µL di tampone per dosaggio BUF . Agitare con vortex tutte le provette.

Procedura del dosaggio Prima di aprire le sacche, consentire alle provette rivestite di anticorpo di raggiungere SORB la temperatura ambiente.

La soluzione di lavaggio WASHBUF SOLN e la 125I-DPD Ag 125I devono essere ad una temperatura compresa tra 2 e 8 °C.

1. Aggiungere 100 µL di ciascun calibratore, controllo o campione diluito alle provette in duplicato rivestite di anticorpo SORB con le adeguate etichette. Pipettare direttamente sul fondo della provetta. L'aggiunta dei campioni deve essere completata entro 30 minuti per evitare la deriva del dosaggio.

2. Aggiungere 200 µL di 125I-DPD Ag 125I a tutte le provette comprese due provette aggiuntive da mettere da parte per la conta totale (TC). Agitare con vortex delicatamente senza far formare schiuma e incubare per due ore a 2-8 °C.

3. Far decantare i supernatanti e lasciar sgocciolare le provette capovolte su un pezzo di carta assorbente per 2-3 minuti. Picchiettare le provette capovolte sulla carta assorbente per rimuovere le gocce di liquido residue. Aggiungere alle provette 4 mL di soluzione di lavaggio diluita FREDDA (2-8 °C) WASHBUF SOLN . Far decantare immediatamente le provette. È importante non lasciare le provette immerse nella soluzione di lavaggio WASHBUF SOLN per più di 1,5 minuti. Per dispensare velocemente la soluzione di lavaggio WASHBUF SOLN si raccomanda di utilizzare una pipetta a ripetizione o un dosatore. Ciascuna rastrelliera per la decantazione non deve contenere più di 40 provette e dopo lo sgocciolamento, ciascuna rastrelliera deve

essere lavata separatamente, una alla volta. La soluzione di lavaggio WASHBUF SOLN deve essere completamente dispensata entro 1,5 minuti per ciascuna rastrelliera di provette.

Far sgocciolare le provette capovolte su un pezzo di carta assorbente per 3-5 minuti. Picchiettare le provette capovolte sulla carta assorbente per rimuovere le gocce di liquido residue.

4. Sottoporre tutte le provette al conteggio mediante contatore gamma idoneo per almeno 1 minuto.

Controllo di qualità Per garantire la validità dei risultati nelle analisi di tutti i giorni, usare regolarmente dei campioni di controllo a diversa concentrazione di analita. Il kit fornisce due controlli che vanno analizzati come campioni sconosciuti. Per valutare adeguatamente le prestazioni del dosaggio IDS raccomanda che tutti i laboratori includano in ciascun dosaggio pool interni di urina appropriatamente suddivisi in aliquote e conservati in aggiunta ai controlli forniti con il kit. I valori ottenuti dagli controllo vanno inseriti in apposite tabelle di controllo della qualità, concepite per tracciare nel tempo il rendimento del metodo. A garanzia della precisione, è importante che i rivelatori dei contatori multipozzetto siano correttamente disposti e non contaminati.

Calcolo dei risultati Calcolare la percentuale di legame (B/Bo%) di ogni standard, controllo e campione in base alla seguente formula:

B/Bo% = (conteggi medi) x 100 (conteggi medi per Standard '0')

Tracciare una curva di calibrazione su carta semilogaritmica, ponendo B/Bo% in ordinata e le concentrazioni di DPD in ascissa. Calcolare B/Bo% per ciascun campione sconosciuto e leggere i valori dalla curva in nM. Per l’interpolazione dei dati è possibile utilizzati vari algoritmi di calcolo; l’operatore deve comunque sempre accertarsi che la curva scelta sia appropriata e che sia in grado di fornire risultati affidabili. Si consiglia l’uso di una curva spline approssimata o di una curva logistica a 4 parametri. Sono necessari i valori della creatinina per i campioni. I risultati ottenuti per la DPD devono essere corretti per tenere conto delle variazioni di concentrazione urinaria dividendo il valore della DPD (nM) per il valore della creatinina (mM). I risultati finali della DPD devono essere riportati come nM DPD / mM Creatinina.

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Dati esemplificativi del dosaggio I seguenti dati sono forniti unicamente a scopo esemplificativo e non vanno quindi utilizzati per il calcolo dei risultati dei campioni analizzati.

Provetta Descrizione cpm cpm medio B/Bo% Risultato nM

1, 2 Attività totale 62567 63526

63047


16594 16651

16622 100%


14280 14724

14502 87,2%


11970 11842

11906 71,6%


7914 7602

7758 46,7%


4034 4076

4055 24,4%


1885 1945

1915 11,5%

15, 16 Campione 1

9921 9818

9870 18,0

17, 18 Campione 2

6711 6605

6658 43,2

Curva di calibrazione tipica La seguente curva di calibrazione è fornita unicamente a titolo esemplificativo.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1 10 100 1000

DPD nM

B/B

o

23

Limitazioni d'uso 1. Qualora si sospetti che i campioni

contengano concentrazioni di analita superiori a quelle dello standard, sarà necessario diluirli.

2. I campioni con radioattività di fondo rilevabile non vanno utilizzati. I campioni eventualmente sospetti vanno sottoposti a screening per rilevarne l’eventuale radioattività prima di sottoporli ad analisi. In alternativa, è possibile riporre i campioni fino al raggiungimento di valori normali di radioattività, o prelevare e utilizzare nuovi campioni.

3. Come nel caso di qualsiasi procedura diagnostica, i risultati vanno interpretati unitamente ai dati clinici presenti nella cartella del paziente e ad altre informazioni a disposizione del medico.

Valori attesi I seguenti intervalli sono stati determinati utilizzando il kit Gamma-BCT DPD e sono forniti soltanto come guida. Ciascun laboratorio deve determinare gli intervalli normali per la popolazione locale. I valori sono in nM di DPD per mM di creatinina. Maschi adulti normali: 2,5 - 5,5 nM/mM (n=86) Donne adulte normali: 2,5 - 6,5 nM/mM (n=281)

Caratteristiche del dosaggio

Accuratezza Il kit Gamma-BCT DPD è stato confrontato con un immunodosaggio enzimatico riconosciuto per la determinazione quantitativa di DPD. Con ciascun metodo sono stati analizzati 86 campioni, selezionati per rappresentare un ampio intervallo di DPD [5,0-124,5 nM]. La regressione lineare è stata eseguita sui dati comparativi: IDS = 1,00(x) - 0,7; coefficiente di correlazione (r) = 0,99

Sensibilità La sensibilità, calcolata come la concentrazione corrispondente alla media meno 2 deviazioni standard di 10 replicati dello standard zero, è risultata <2 nM.

Precisione Intra-dosaggio (n=18) Inter-dosaggio (n=31) Media

nM % CV Media

nM % CV 18,5 5,3% 10,4 8,5% 41,9 3,9% 24,1 6,7% 163 4,0% 42,5 7,6%

- - 94,7 8,1%

Recupero Il recupero è stato valutato aggiungendo ai campioni DPD prima del dosaggio. Concentrazione del campione

nM

DPD aggiunta

nM

Osser-vata nM

AttesonM

Recu-pero%

11,5 20 40

32,1 51,8

31,5 51,5

102%101%

76,7 20 40

94,8 117,2

96,7 116,7

98%100%

139,6 20 40

160,0 196,2

159,6179,6

100%109%

Media 102%

Linearità La linearità è stata valutata diluendo i campioni con tampone prima del dosaggio.

Campioni Osservato

nM Atteso

nM %

O/A A

A/2 A/4

23,3 11,9 5,8

11,7 5,8

102% 100%

B B/2 B/4

65,7 31,1 14,9

32,9 16,4

95% 91%

C C/2 C/4

150,4 80,0 40,6

75,2 37,6

106% 108%

Media 100%

Specificità La specificità dell’antisiero è stata valutata con i seguenti analiti.

Analita Reattività crociata DPD libera 100 % Piridinolina <1%

Peptidi Piridinolina/DPD:


<2,5% <2,5%

24

Aplicaciones

Para utilización en el diagnóstico in vitro

El kit IDS Gamma-BCT DPD es un radioinmunoensayo de tubo recubierto de 125I para la determinación cuantitativa de enlaces cruzados (crosslinks) de deoxipiridinolina (DPD) libre, en orina. Se ha demostrado que la DPD es un marcador bioquímico de la reabsorción ósea.

Resumen y explicación La DPD se encuentra principalmente en el colágeno tipo 1 óseo. Después de formada la matriz de colágeno, la acción enzimática de la lisil oxidasa en el aminoácido lisina provoca la formación de los enlaces covalentes de la DPD. Este enlace cruzado de DPD, desempeña un papel importante en la función estructural del colágeno. En el proceso de degradación ósea, la DPD se libera a la circulación y se degrada en el riñón.

Descripción del método El kit Gamma-BCT DPD es un radioinmuno-ensayo competitivo que utiliza anticuerpo monoclonal anti-DPD adherido a la superficie interna de un tubo de poliestireno. La DPD de la muestra compite por el anticuerpo con la DPD marcada con 125I. Después de la incubación, se lavan los tubos para eliminar la 125I-DPD no unida y se realiza el contaje. La cantidad de radiactividad es inversamente proporcional a la concentración de DPD. Los resultados de DPD se corrigen para el cálculo de la concentración en orina por la creatinina.

Advertencias y precauciones El kit Gamma-BCT DPD está diseñado únicamente para su utilización en el diagnóstico in vitro, y no está destinado al uso interno en humanos o animales. Este producto debe utilizarse de acuerdo con las indicaciones incluidas en el manual de instrucciones. IDS Limited no se responsabilizará de ninguna pérdida o daño (salvo en los casos exigidos por la ley), independientemente de su causa, que se deriven del incumplimiento de estas instrucciones. PRECAUCIÓN: este kit contiene material del origen humano y/o animal (o ambos). La manipulación de los reactivos debe realizarse como si se tratase de material potencialmente infecioso.

Los reactivos del kit deben almacenarse, manejarse y eliminarse tomando las precauciones adecuadas y de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio. Los reactivos del kit deben eliminarse de conformidad conla normativa local.

Materiales radiactivos 1. Este kit contiene material radiactivo (yodo-125), el

cual debe almacenarse, manejarse y eliminarse tomando las precauciones adecuadas y de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio. El material radiactivo deberá recibirse, adquirirse y utilizarse únicamente por los facultativos, laboratorios clínicos u hospitales, y sólo para pruebas de laboratorio in vitro. La recepción, adquisición, almacenamiento, utilización y transferencia de este material está sometido a la normativa local.

2. Almacenar los materiales radiactivos en su envase original, y en un área destinada para este fin, debidamente señalizada. El acceso a los materiales radiactivos se limitará únicamente al personal autorizado.

3. No comer, beber, fumar o aplicarse cosméticos en áreas de almacenamiento o manipulación de materiales radiactivos. No pipetear material radiactivo con la boca.

4. Utilizar siempre bata de laboratorio y guantes desechables para la manipulación de los materiales radiactivos. A su finalización, lavarse las manos cuidadosamente.

5. Las áreas donde se produzca un derrame accidental deben limpiarse inmediatamente con material absorbente adecuado, yeliminarse como residuo radiactivo. El área contaminada debe limpiarse con un detergente alcalino o con una solución para descontaminación radiológica.

6. El material radiactivo debe eliminarse de conformidad con la normativa local.

7. No está permitida la manipulación del material radiactivo o la entrada en las áreas radiactivas a menores de 18 años. .

8. Es imprescindible mantener limpias las áreas radiactivas. Para reducir minimizar la contaminación, utilizar material de laboratorio desechables o de fácil descontaminación y cubrir las mesas de trabajo con papel absorbente.

25

Azida sódica Algunos de los reactivos de este kit contienen azida sódica como conservante, la cual puede reaccionar con las cañerías de plomo, cobre o bronce para formar azidas metálicas sumamente explosivas. Al desechar estos reactivos, enjuagar con abundante agua para impedir la acumulación de azidas.

Preparación de los reactivos Solución de lavado WASHBUF SOLN : Añadir el contenido de cada botella de concentrado para lavado WASHBUF 20x a 950 ml de agua destilada o desionizada. Conservar entre 2 y 8 °C. El resto de losreactivos se suministran listos para usar.

Los reactivos deben homogeneizarse invirtiéndolos varias veces antes de su utilización en el ensayo.

Vida media y conservación de los reactivos Si se conserva según las especificaciones, este kit es estable hasta la fecha de caducidad impresa en la etiqueta. A su recepción, conservar todos los reactivos entre 2 y 8 °C.

Los calibradores de DPD CAL , así como los controles

CTRL y la 125I-DPD Ag 125I son fotosensibles. Se debe evitar la exposición prolongada a la luz, especialmente a la luz solar directa.

Elementos indicativos de un posible deterioro de los reactivos del kit 1. Presencia de partículas anormales en

cualquier reactivo.

2. Una disminución de la unión máxima.

3. Desplazamiento en la pendiente de la curva respecto a su posición normal.

Recogida y conservación de las muestras El ensayo Gamma-BCT DPD puede realizarse utilizando muestras sin conservantes de la primera orina de la mañana o muestras de orina de 24 horas. Almacenar las muestras de orina entre 2-8 °C hasta 7 días. Para almacenamiento de larga duración, congelar a -20 °C. Las muestras no deben someterse a más de cinco ciclos de congelación/descongelación. Evitar una exposición prolongada a la luz, especialmente a la luz solar directa.

Procedimiento

Materiales suministrados

1. CAL 0 – CAL 6 Calibradores ( REF AA-6001A - AA-6001E): DPD en tampón fosfato, 6 viales, 0,25 ml por vial.

2. SORB - Tubos recubiertos de anticuerpos ( REF AA-6002T): Tubos recubiertos de anti-DPD, 50 por bolsa, 2 bolsas por kit.

3. Ag 125I - 125I-DPD ( REF AA-6003): DPD marcada con 125I en tampón fosfato que contiene BSA (albúmina sérica bovina) y azida sódica al 0,05%. Contenido de radiactividad <259 kBq (7 µCi) por vial , 21 ml por vial.

4. CTRL 1 – CTRL 2 - Controles ( REF AA-6005): DPD en tampón fosfato, 2 viales, 0,25 ml por vial.

5. BUF - Tampón ( REF AA-600B): Tampón fosfato que contiene BSA, Tween 20 y azida sódica al 0,05%, 25 ml porvial.

6. WASHBUF 20x - Solución de Lavado Concentrada ( REF AC-WASHL): Tampón fosfato que contiene Tween, 50 ml por vial.

Materiales necesarios que no se suministran 1. Tubos de plástico desechables de 12 x 75 mm.

2. Micropipetas de precisión para 50 µl, 100 µl y 450 µl.

3. Pipeta de repetición para 200 µl y 4 ml, por ej., Eppendorf Multicanal 4780 o similar.

4. Agitador vórtex.

5. Gradilla de decantación, por ej., Nalgene 5970-0013+5979-0013 o similar.

6. Contador gamma para 125I.

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Preparación de la muestra Los calibradores CAL , los controles CTRL y las muestras SPE requieren una dilución 1:10 previa al ensayo.

1. Rotular untubo de plástico para cada calibrador CAL , control CTRL y muestra SPE .

2. Añadir 50 µl de calibrador CAL , control CTRL o muestra SPE a analizar a cada uno de los tubos correspondientes.

3. Añadir 450 µl de tampón BUF a cada tubo. Agitar en vórtex todos los tubos.

Procedimiento de ensayo Antes de abrir las bolsas, esperar a que los tubos recubiertos de anticuerpos SORB alcancen la temperatura ambiente.

La solución de lavado WASHBUF SOLN y la 125I-DPD Ag 125I deben estar a 2-8 °C.

1. Añadir 100 µl de cada calibrador diluido, control o muestra a los tubos recubiertos de anticuerpos SORB (debidamente identificados) y por duplicado. Pipetear directamente en el fondo del tubo. La adición de las muestras debe realizarse en un tiempo no superior a 30 minutos para evitarretrasos por el pipeteo.

2. Añadir 200 µl de 125I-DPD Ag 125I a todos los tubos, incluyendo dos tubos adicionales que deberán apartarse como cuentas totales (CT). Agitar en vórtexcon cuidado evitando la formación de espuma, e incubar durante 2 horas a 2-8 °C.

3. Decantar los sobrenadantes y permitir el vaciado de los tubos situándolos en posición invertida sobre una hoja de papel absorbente durante 2 a 3 minutos. Golpear suavemente los tubos invertidos sobre papel absorbente para eliminar cualquier gota. Añadir 4 ml de solución de lavado diluida FRÍA (2-8 °C) WASHBUF SOLN a los tubos. Decantar los tubos inmediatamente. Es importante no dejar los tubos con la solución de lavado WASHBUF SOLN por un tiempo superior a 1,5 minutos. Se recomienda utilizar una pipeta de repetición o un dispensador para realizar un pipeteo rápido de la solución de lavado WASHBUF SOLN .

Cada gradilla de decantación no debería contener más de 40 tubos. Tras su vaciado, cada gradilla debería lavarse por separado.se La adición de la solución de lavado

WASHBUF SOLN debe realizarse en un tiempo inferior 1,5 minutos para cadagradilla de tubos. Permitir el vaciado de los tubos situándolos en posición invertida sobre una hoja de papel absorbente durante 3 a 5 minutos. Golpear suavemente los tubos invertidos sobre papel absorbente para eliminar cualquier gota

4. Contar todos los tubos en un contador gamma durante al menos 1 minuto.

Control de calidad Se recomienda el uso sistemático de muestras de control a diversas concentraciones del analito, para validar los resultados diarios. Se suministran dos controles en el kit, que deberán tratarse como si fueran muestras desconocidas. A fin de realizar una evaluación adecuada del funcionamiento del ensayo, IDS recomienda que todos los laboratorios incluyan en cada ensayo una muestra procedente de un pool de muestras de orina internas de cada laboratorio que han sido alicuotadas y almacenadas apropiadamente, además de los controles suministrados con el kit. Se deben conservar los resultados del control de calidad para observar el rendimiento del ensayo. Para garantizar la alta precisión, es importante que los detectores en los contadores multipocillos estén bien ajustados y no estén contaminados.

Cálculo de los resultados Calcular el porcentaje de unión (B/Bo %) de cada calibrador, control y muestra de la manera siguiente:

B/Bo% = (media de las cuentas) x 100 (media de las cuentas para Calibrador '0')

Dibujar una curva estándar en papel gráfico semilogarítmico, representando en el eje de ordenadas B/Bo % y en el eje de las abscisas la concentración de DPD. Calcular B/Bo % para cada muestra y extrapolar a partir de la curva los valores de las concentraciones en nM. Pueden emplearse técnicas alternativas de cálculo de datos, pero en ese caso los usuarios deberán confirmar que el ajuste de la curva seleccionada es el correcto y los resultados son aceptables. Se recomienda aplicar ajustes de curva suavizada SPLINE o 4PL. Se requieren los valores de creatinina de las muestras. Los resultados obtenidos para DPD deberían corregirse para las variaciones en la concentración de orina dividiendo el valor de DPD (nM) por el valor de creatinina (mM). Los resultados de DPD finales deben expresarse como nM de DPD / mM de creatinina.

27

Ejemplo de datos de un ensayo Estos datos son meramente ilustrativos y no deben utilizarse para el cálculo de ningún resultado de muestras.

Tubo Descripción cpm media de las cpm

B/Bo% Resultado nM

1, 2 Cuentas totales 62567 63526

63047

3, 4 Calibrador 0 0 nM

16594 16651

16622 100%


14280 14724

14502 87,2%


11970 11842

11906 71,6%


7914 7602

7758 46,7%


4034 4076

4055 24,4%


1885 1945

1915 11,5%

15, 16 Muestra 1

9921 9818

9870 18,0

17, 18 Muestra 2

6711 6605

6658 43,2

Curva de calibración típica Esta curva de calibración es un ejemplo meramente ilustrativo.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1 10 100 1000

DPD nM

B/B

o

28

Limitaciones de uso 1. Las muestras en las que se sospeche una

concentración del analito superior al del estándar más elevado deben diluirse para el ensayo.

2. No deben emplearse muestras que contengan radiactividad de fondo apreciable. Cualquier muestra sospechosa debe analizarse para descartar la presencia de radiactividad antes de realizar el ensayo. La muestra debe almacenarse hasta que haya decaído la radiactividad; o bien deberá obtenerse otra muestra.

3. Al igual que en cualquier procedimiento diagnóstico, los resultados deben interpretarse en el contexto del cuadro clínico del paciente y con el resto de información disponible al alcance del facultativo.

Valores esperados Los siguientes rangos se han determinado utilizando el kit Gamma-BCT DPD, y se suministran únicamente como guía. Cada laboratorio debe determinar los valores normales para la población local. Los valores se proporcionan en nM de DPD por mM de creatinina.

Valores normales para hombres adultos: 2,5 - 5,5 nM/mM (n=86) Valores normales para mujeres adultas:

2,5 - 6,5 nM/mM (n=281)

Datos sobre el diseño

Exactitud Se realizó una comparación del kit Gamma-BCT DPD frente a un enzimoinmunoensayo reconocido para la determinación cuantitativa de DPD. Para cada método se realizaron ensayos de una población de 86 muestras, seleccionadas para representar una amplia gama de valores de DPD [5,0-124,5 nM]. Se hizo un análisis de regresión linealpara la comparación de los datos: IDS = 1,00(x) - 0,7; coeficiente de correlación (r) = 0,99

Sensibilidad La sensibilidad, definida como la concentración correspondiente a la media menos 2 desviaciones estándar de 10 replicados del calibrador cero, es <2 nM.

Precisión Intraensayo (n=18) Interensayo (n=31)

Media nM % CV Media nM % CV 18,5 5,3% 10,4 8,5% 41,9 3,9% 24,1 6,7% 163 4,0% 42,5 7,6%

- - 94,7 8,1% Recuperación Se determinó la recuperación añadiendo DPD a las muestras antes del ensayo.

Conc. muestra

nM

DPD añadida

nM Medida

nM Esperada

nM Recuperación

% 11,5 20

40 32,1 51,8

31,5 51,5

102% 101%

76,7 20 40

94,8 117,2

96,7 116,7

98% 100%

139,6 20 40

160,0 196,2

159,6 179,6

100% 109%

Media 102%

Linealidad Se determinó la linealidad diluyendo muestras con tampón antes de su ensayo.

Muestra Medida

nM Esperada

nM %

M/E A

A/2 A/4

23,3 11,9 5,8

11,7 5,8

102% 100%

B B/2 B/4

65,7 31,1 14,9

32,9 16,4

95% 91%

C C/2 C/4

150,4 80,0 40,6

75,2 37,6

106% 108%

Media 100%

Especificidad Se determinó la especificidad del antisuero con los siguientes analitos.

Analito Reactividad cruzada DPD libre 100 %

Piridinolina <1% Pid / DPD péptidos:


<2,5% <2,5%

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Uso pretendido

Para diagnóstico "in vitro"

O kit Gamma-BCT DPD da IDS é constituído por um tubo revestido com 125I para radioimunoensaio com vista à determinação quantitativa de ligações cruzadas de deoxipiridinolina livre (DPD) na urina. Foi provado que a DPD é um marcador bioquímico da reabsorção óssea.

Resumo e explicação A DPD encontra-se principalmente no colagénio ósseo Tipo 1. Depois da matriz do colagénio se formar, a acção enzimática da lisil oxidase no aminoácido lisina provoca a formação da ligação cruzada covalente DPD. Esta ligação cruzada, DPD, desempenha uma função importante no papel estrutural do colagénio. No processo da degradação óssea, a DPD é libertada para a circulação e eliminada por via renal.

Descrição do método O kit Gamma-BCT DPD é um radioimunoensaio competitivo que utiliza um anti-corpo monoclonal anti-DPD ligado à superfície interna de um tubo de polistireno. A DPD que se encontra na amostra compete com a DPD marcada com 125I para o anti-corpo. Após o período de incubação, os tubos são lavados para remover a 125I-DPD livre e, em seguida, contados. A radioactividade ligada é inversamente proporcional à concentração de DPD. Os resultados de DPD são corrigidos para a concentração urinária de creatinina.

Avisos e precauções O kit Gamma-BCT DPD destina-se apenas ao diagnóstico in vitro e não para a utilização interna em seres humanos ou animais. Este produto deve ser estritamente utilizado de acordo com as instruções descritas no folheto informativo incluso. A IDS Limited não será responsabilizada por qualquer perda ou dano (excepto caso tenha sido determinado pelos estatutos) independentemente da sua causa, resultantes da falta de cumprimento das instruções fornecidas. ATENÇÃO: Este kit contém material de origem humana e/ou animal. Manuseie os reagentes do kit como se fossem passíveis de transmitir agentes infecciosos.

Devem ser tomadas precauções apropriadas e utilizadas práticas laboratoriais correctas no armazenamento, manuseamento e eliminação dos reagentes do kit. A eliminação dos reagentes do kit deve ser efectuada de acordo com os regulamentos locais.

Materiais radioactivos 1. Este kit contém material radioactivo (Iodo-125).

Devem ser tomadas as precauções apropriadas e utilizadas práticas laboratoriais correctas no armazenamento, manuseamento e eliminação do material. O material radioactivo só deve ser recebido, adquirido, possuído e utilizado por médicos, laboratórios clínicos ou hospitais, e apenas para testes laboratoriais in vitro. A sua recepção, aquisição, posse, utilização e transferência está sujeita aos regulamentos locais.

2. Armazene os materiais radioactivos na embalagem original, numa área adequadamente identificada e especificamente designada. O acesso aos materiais radioactivos deve estar limitado apenas ao pessoal autorizado.

3. Não coma, beba, fume ou aplique cosméticos em áreas onde são armazenados ou manuseados materiais radioactivos. Não pipete material radioactivo com a boca.

4. Vista sempre uma bata de laboratório protectora e utilize luvas descartáveis ao manusear materiais radioactivos. Em seguida, lave cuidadosamente as mãos.

5. As áreas onde tenha ocorrido derramamento devem ser lavadas imediatamente com material absorvente apropriado que deve em seguida ser eliminado como lixo radioactivo. A área contaminada deve depois ser lavada utilizando um detergente alcalino ou uma solução de descontaminação radiológica.

6. A eliminação do material radioactivo deve ser efectuada de acordo com os regulamentos locais.

7. Não deve ser permitido a pessoas com menos de 18 anos de idade manusear material radioactivo ou entrar em áreas radioactivas.

8. As áreas radioactivas devem ser mantidas limpas. Utilize produtos de laboratório descartáveis ou de fácil descontaminação e protecções absorventes nas superfícies da bancada do laboratório para minimizar a contaminação.

30

Azida de sódio Alguns reagentes neste kit contêm azida de sódio como conservante, a qual pode reagir com a canalização de chumbo, cobre ou bronze formando azidas de metal altamente explosivas. Ao eliminar, deite muita água para evitar a acumulação de azida.

Preparação de Reagentes Solução de lavagem WASHBUF SOLN : Adicionar o conteúdo de cada frasco de Concentrado de lavagem WASHBUF 20x a 950 mL de água destilada ou desionizada. Armazenar entre 2 º e 8 °C. Todos os outros reagentes são fornecidos prontos a utilizar.

Os reagentes devem ser misturados invertendo várias vezes antes de utilizar no ensaio.

Validade e armazenamento dos reagentes Este kit é estável até à data de validade indicada, caso seja armazenado de acordo com as especificações. Ao receber, armazene todos os reagentes entre 2 º e 8 °C.

Os calibradores de DPD CAL , controlos CTRL , e a 125I-DPD Ag 125I são sensíveis à luz. Deve evitar a exposição prolongada à luz, especialmente a luz solar directa.

Indicações de possível deterioração dos reagentes do kit 1. Presença de partículas anormais em qualquer

dos reagentes.

2. Uma redução na ligação máxima.

3. Um desvio do declive da curva. Recolha e armazenamento da amostra A análise Gamma-BCT DPD pode ser efectuada utilizando amostras sem conservantes da primeira urina da manhã ou urina de 24 horas. Armazenar as amostras de urina entre 2 º e 8 °C durante um período de 7 dias. No caso de um armazenamento mais prolongado, deve congelar as amostras a uma temperatura de –20 °C. Não deve sujeitar as amostras a mais de 5 ciclos de congelamento/descongelamento. Deve evitar a exposição prolongada à luz, especialmente a luz solar directa.

Procedimento

Materiais fornecidos

1. CAL 0 – CAL 6 - Calibradores ( REF AA-6001A - AA-6001E): DPD em tampão fosfato, 0,25 mL por frasco, 6 frascos por kit.

2. SORB - Tubos revestidos com anti-corpos ( REF AA-6002T): Tubos revestidos com anti-corpos anti-DPD, 50 unidades por embalagem, 2 embalagens por kit.

3. Ag 125I - 125I-DPD ( REF AA-6003): 125I-DPD em tampão fosfato contendo albumina de soro bovina e azida de sódio 0,05%. Conteúdo radioactivo <259 kBq (7µCi) por frasco, 21mL por frasco.

4. CTRL 1 – CTRL 2 - Controlos ( REF AA-6005): DPD em tampão fosfato, 0,25 mL por frasco, 2 frascos por kit.

5. BUF - Tampão ( REF AA-600B): Tampão fosfato salino contendo albumina de soro bovina, Tween e azida de sódio 0,05%, 25 mL por frasco.

6. WASHBUF 20x - Concentrado de lavagem ( REF AC-WASHL): Tampão fosfato salino contendo Tween, 50 mL por frasco.

Materiais necessários mas não fornecidos 1. Tubos de plástico descartáveis de 12 x 75 mm.

2. Dispositivos de pipetagem de precisão com capacidade para 50 µL, 100 µL e 450 µL.

3. Pipetas de repetição com capacidade para 200 µL e 4 mL, tais como por exemplo Eppendorf Multipipette 4780 ou semelhante.

4. Agitador Vórtex.

5. Suporte de decantação, por ex. Nalgene 5970-0013+5979-0013 ou semelhante.

6. Contador Gamma capaz de contar 125I.

31

Preparação da amostra Os calibradores CAL , controlos CTRL e amostras SPE necessitam todos de uma diluição de 1:10 antes da análise.

1. Preparar tubos de plástico rotulados, um para cada calibrador CAL , controlo CTRL e amostra SPE .

2. Adicionar 50 µL de cada calibrador CAL , controlo CTRL ou amostra SPE . ao tubo respectivo.

3. Adicionar 450 µL de tampão BUF a cada tubo. Agitar no vortex todos os tubos.

Procedimento do ensaio Deve deixar que os tubos revestidos com anti-corpos SORB atinjam a temperatura ambiente antes de abrir as embalagens.

A solução de lavagem WASHBUF SOLN e a 125I-DPD Ag 125I , devem estar entre 2 º e 8 °C.

1. Adicionar 100 µL de cada calibrador, controlo ou amostra diluídos aos tubos revestidos com anti-corpos SORB (devidamente rotulados) em duplicado. Pipetar directamente no fundo do tubo. A adição de amostras deve ser efectuada num prazo de 30 minutos de maneira a evitar que a análise seja posta em causa.

2. Adicionar 200 µL de 125I-DPD Ag 125I a todos os tubos incluindo a dois tubos adicionais que deverão ser postos de lado para actuarem como contagem total (CT). Deve agitar no vortex os tubos suavemente sem criar espuma e incubar durante um período de 2 horas, entre 2º e 8°C.

3. Decantar os sobrenadantes e deixar os tubos invertidos a drenar sobre papel absorvente durante 2 a 3 minutos. Deve bater levemente nos tubos invertidos enquanto eles se encontram sobre o papel absorvente de maneira a remover quaisquer gotas de líquido que ainda se possam encontrar dentro dos tubos.

Adicionar 4 mL de solução de lavagem diluída FRIA (entre 2º e 8°C) WASHBUF SOLN aos tubos. Deve decantar os tubos imediatamente.

É importante não deixar a solução de lavagem WASHBUF SOLN dentro dos tubos durante mais do que 1½ minutos.

Recomenda-se a utilização de uma pipeta ou distribuidor de repetição com vista à rápida eliminação da solução de lavagem WASHBUF SOLN .

Cada prateleira de decantação não deve conter mais de 40 tubos e após a drenagem, cada

prateleira deve ser lavada em separado. A eliminação da solução de lavagem WASHBUF SOLN deve ser efectuada num período não superior a 1½ minutos para cada prateleira de tubos.

Deve colocar os tubos invertidos sobre papel absorvente durante 3 a 5 minutos. Deve bater levemente nos tubos invertidos enquanto eles se encontram sobre o papel absorvente de maneira a remover quaisquer gotas de líquido que ainda se possam encontrar dentro dos tubos.

4. Proceda à contagem de todos os tubos num contador gamma adequado durante pelo menos 1 minuto.

Controlo de qualidade É aconselhada a utilização regular de amostras de controlo em diversos níveis analíticos para assegurar a validade diária dos resultados. Estão disponíveis dois kits de controlo. De maneira a avaliar devidamente a acção da análise, a IDS recomenda que todos os laboratórios incluam em cada análise colheitas de urina próprias devidamente alíquotadas e armazenadas para além dos controlos fornecidos juntamente com o kit. Os controlos devem ser testados como desconhecidos. Devem ser mantidos gráficos de controlo da qualidade para acompanhar o desempenho do ensaio. Para assegurar boa precisão é importante que os detectores nos contadores, com reservatórios múltiplos estejam, bem conjugados e não contaminados.

Cálculo dos resultados Calcule a percentagem de ligação (B/Bo%) de cada calibrador, controlo e amostras como se segue:

B/Bo% = (média da contagem) x 100 (média das contagens para calibrador '0')

Prepare uma curva de calibração em papel semi-logarítmico colocando B/Bo% no eixo das ordenadas e a concentração de DPD no eixo das abcissas. Calcule B/Bo% para cada amostra e extrapole os valores da curva em nM. Podem utilizar-se técnicas de redução de dados alternativas, mas os utilizadores devem confirmar se a adaptação da curva seleccionada é adequada e fornece resultados aceitáveis. São recomendados os ajustes da curva SPLINE ou 4PL. São necessários os valores da creatinina das amostras. Os resultados obtidos da DPD têm de ser corrigidos tendo em conta possíveis variações na concentração da urina, bastando para isso dividir o valor da DPD (nM) pelo valor da creatinina (mM). Os resultados finais da DPD devem ser relatados da seguinte maneira, nM DPD / mM Creatinina.

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Dados de exemplo Estes dados destinam-se apenas a ilustração e não devem ser utilizados para o cálculo de quaisquer resultados das amostras.

Tubo Descrição Cpm cpm Média B/Bo% Resultado nM

1, 2 Contagens Totais 62567 63526

63047


16594 16651

16622 100%


14280 14724

14502 87,2%


11970 11842

11906 71,6%


7914 7602

7758 46,7%


4034 4076

4055 24,4%


1885 1945

1915 11,5%

15, 16 Amostra 1

9921 9818

9870 18,0

17, 18 Amostra 2

6711 6605

6658 43,2

Curva de calibração típica Esta curva de calibração destina-se apenas a actuar como ilustração.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1 10 100 1000

DPD nM

B/B

o

33

Limitações de utilização 1. As amostras suspeitas de terem

concentrações analíticas superiores à do calibrador mais elevado devem ser diluídas.

2. As amostras que contêm radioactividade de fundo apreciável não devem ser utilizadas. Quaisquer amostras suspeitas devem ser submetidas a um rastreio de radioactividade antes do ensaio ser efectuado. A amostra deve ser armazenada até a radioactividade ter diminuído, ou deve ser obtida uma outra amostra.

3. Tal como acontece com qualquer procedimento de diagnóstico, os resultados devem ser interpretados em conjunto com a apresentação clínica do doente e outras informações de que o médico disponha.

Valores esperados Os seguintes valores foram determinados utilizando o kit Gamma-BCT DPD e são fornecidos apenas como referência. Cada laboratório deve determinar os valores normais para a população local. Os valores são nM DPD por mM creatinina.

Valores normais para Homens adultos: 2,5 - 5,5 nM/mM (n=86) Valores normais para Mulheres adultas: 2,5 - 6,5 nM/mM (n=281)

Características do Ensaio

Exactidão O kit Gamma-BCT DPD foi comparado com um imunoensaio reconhecido com vista à determinação quantitativa de DPD. Uma população de 86 amostras, seleccionadas para representar uma grande margem de DPD (5.0-124.5 nM), foram analisadas por cada método. A análise de regressão linear foi efectuada sobre os dados comparativos: IDS = 1,00(x) - 0,7; coeficiente de correlação (r) = 0,99

Sensibilidade A sensibilidade, definida como a concentração correspondente à média menos 2 desvios padrão de 10 repetições do calibrador zero, é <2 nM.

Precisão Intra-Ensaio (n=18) Inter-Ensaio (n=31)

Média nM % CV Média nM % CV 18,5 5,3% 10,4 8,5% 41,9 3,9% 24,1 6,7% 163 4,0% 42,5 7,6%

- - 94,7 8,1%

Recuperação A recuperação foi avaliada adicionando DPD às amostras antes do ensaio. Amostra

conc. nM

DPD adicionada

nM Medição

nM Esperados

nM

Recupera-ção %

11,5 20 40

32,1 51,8

31,5 51,5

102% 101%

76,7 20 40

94,8 117,2

96,7 116,7

98% 100%

139,6 20 40

160,0 196,2

159,6 179,6

100% 109%

Média 102%

Linearidade A linearidade foi avaliada diluindo as amostras com tampão antes do ensaio.

Amostra Medição

nM Esperados

nM %

M/E A

A/2 A/4

23,3 11,9 5,8

11,7 5,8

102% 100%

B B/2 B/4

65,7 31,1 14,9

32,9 16,4

95% 91%

C C/2 C/4

150,4 80,0 40,6

75,2 37,6

106% 108%

Média 100%

Especificidade A especificidade do anti-soro foi avaliada com os seguintes analitos.

Analito Reactividade Cruzada DPD Livre 100 %

Piridinolina <1% Peptidos Pyd / DPD:


<2,5% <2,5%

34

References • Bibliographie • Literatur • Riferimenti bibliografici • Bibliografía • Referências 1. Robins S., et al, J. Bone Miner. Res., 9, 1643-

1649, 1994. Doc: AA-60PL Issue: 7 25 April 2003

Procedure Summary Résumé du procédé Zusammenfassung des Testablaufes Procedura Resumen del procedimiento Resumo do procedimento

50 µL CAL / CTRL / SPE + 450 µL BUF

100 µL ➔➔➔➔ SORB

+ 200 µL Ag 125I

02:00 @ 2-8°C

+ 4 mL WASHBUF SOLN

00:01 γ I M M U N O D I A G N O S T I C • S Y S T E M S • L I M I T E D 1 0 D I D C O T W A Y • B O L D O N B U S I N E S S P A R K • B O L D O N • T Y N E & W E A R • N E 3 5 9 P D • U K T E L E P H O N E + 4 4 ( 0 ) 1 9 1 - 5 1 9 0 6 6 0 • F A X + 4 4 ( 0 ) 1 9 1 - 5 1 9 0 7 6 0 • E M A I L i d s @ i d s l t d . c o m • W E B w w w . i d s l t d . c o m

Gamma-BCT DPD - RADMED fileRadioimunoensaio para a determinação quantitativa de deoxipiridinolina...

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