Master de Biotecnoloxìa 2011-12 1

Futuras aplicaciones

de las Cecropinas en la

Biotecnoloxìa Médica

Agnese Sannino

Master de Biotecnoloxìa 2011-12 2

Indice de contenidos

1. Teoría basica de los péptidos antimicrobianos.

2. Informaciones generales sobre la familia de las

Cecropinas.

3. Presentación de los diferentes tipos de

Cecropina.

4. Descripción de la acción de las Cecropinas.

5. Estudios en curso y Futuras aplicaciones en el

campo de la medicina.

6. Bibliografía .

Master de Biotecnoloxìa 2011-12 3

Péptidos antimicrobianos

Son proteínas de origen natural

que tienen propiedades antibióticas.

Estos péptidos han sido fabricados

por la naturaleza, para actuar

como medio de defensa en contra

de enfermedades producidas

por diversos microorganismos.

Master de Biotecnoloxìa 2011-12 4

Propriedades

Presentan actividad contra bacterias, hongos y virus. Existen una

gran cantidad de péptidos antimicrobianos así como una gran

variedad de fuentes. Los podemos encontrar en plantas, insectos,

virus y mamiferos. Se clasifican :

Por método de síntesis :

Por origen :

Ribosomal

No ribosomal

Mamìfero

Anfibio

Insecto

Planta

Virus

Bacteria

Master de Biotecnoloxìa 2011-12 5

Cecropinas • Familia de oligopéptidos inducibles antimicrobianos.

• Son derivadas de insectos, anfibios y mamìferos.

• Son activas contra bacterias Gram-positivas y Gram-negativas.

• Cecropinas de insectos varían en tamaño desde 35 a 39 residuos y son típicamente amidadas. Las otras , desde 31 a 39 a.a.

Se aislaron por primera

vez de la comùn

mariposa de la seda

Hyalophora cecropia:

Se producen en el interior del animal, dentro

de la hemolinfa. Tienen en común una considerable

homología en la estructura primaria.

Su síntesis es de tipo ribosomal.

Master de Biotecnoloxìa 2011-12 6

Características generales

• Los D-enantiómeros retienen la actividad antibacteriana.

• Los péptidos maduros (es decir, procesados) tienen una regiòn NH2-

terminal fuertemente básica y una región C-terminal màs hidrófoba.

• Preprocecropinas en insectos son de dos tipos: dípteros y

lepidópteros. Precursores de Dípteros ( ejemplificados por la

Drosophila melanogaster y D. virilis ) tienen una secuencia señal de

23 residuos que termina con un motivo tetrapeptídico conservado

(Gln-Ser/Thr-Glu/Gln-Ala) que es seguido inmediatamente por una

secuencia de ≈ 40 residuos, que codifica el péptido maduro.

• Los dominios maduros de cecropina en Drosophila típicamente:

comienzan con y terminan con un motivo conservado (13)

Gly-Trp-Leu-Lys-Lys Ala-Gln-Gln-Ala-Ala-Asn-Val-Ala-Ala-Thr-Ala-Arg-Gly

Master de Biotecnoloxìa 2011-12 7

Dependiendo del ambiente en el que estan, las Cecropinas pueden asumir

dos estructuras:

Random, que no es funcional ( agua ) Alfa elice, que es funcional ( en la matriz

celular o en ambiente hidrofòbico )

El objetivo de su actividad bactericida es la

membrana . Las cecropinas con frecuencia

actùan en sinergia.

Imàgines: http://me.stanford.edu/research/centers/ahpcrc/TA2Images_contd.html

1) 2)

Master de Biotecnoloxìa 2011-12 8

Los diferentes tipos de Cecropina

La mariposa Hyalophora

Cecropia silvestre produce

3 cecropinas diferentes,

llamadas tipo A, B y D.

Cecropinas A, B y D:

- Son péptidos lineales

- Son péptidos básicos

- Consisten en 35-37 residuos que muestran 62-65% de homología en la

secuencia principal.

La importancia del estudio de estos péptidos antimicrobianos se ve

reforzada por los fenómenos de resistencia a los antibióticos

convencionales (que se producen con mayor frecuencia), debido al uso

inadecuado de los mismos. Contra estos péptidos, de hecho, hasta ahora

no ha habido fenómenos de resistencia .

http://homepage.mac.com/wildlifeweb/invert

ebrate/moth/cecropia_moth/index.html

Master de Biotecnoloxìa 2011-12 9

Cecropina A

Compuesta de 37 aminoácidos. Mata las bacterias mediante la disipación del

gradiente iónico de la membrana o induciendo cambios en la expresión génica.

El anàlisis de la Cecropina A

por RMN bidimensional

confirmò que costaba de dos

segmentos α – elicoidales,

ambos de fuerte caracter

anfipatico, separados por un

triplete ( Ala- Gly- Pro )

flexible que actua como bisagra .

( Holak et al.,1988)

KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK-NH2

Master de Biotecnoloxìa 2011-12 10

Cecropina A como agente antifugal

The figure shows the effect of three

concentrations from a longer dilution series of

cecropin A, against the fungi S. cerevisiae

W308, D. uninucleata, G. candidum,

M. anisopliae and B. bassiana.

As a comparison we also show the growth

inhibition against the bacterial strain

E. cloacae β12.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0965174899000715

Master de Biotecnoloxìa 2011-12 11

Cecropina B Aumenta la actividad de los betalactámicos contra bacterias gram

negativas. Se ha demostrado que reduce significativamente la

actividad de E. coli y los niveles plasmáticos de endotoxina en un

modelo de rata de shock séptico.

Compuesta de 35 aminoàcidos.

Costa de dos segmentos α – elicoidales,

uno de los cuales mucho más pequeño

que el otro . Incluso aquí el triplete

AGP separa las dos hélices.

En condiciones todavía no

identificadas, promueve la reparación

de la membrana de la célula huésped.

KWKVFKKIEKMGRNIRNGIVKAGPAIAVLGEAKAL-NH2

http://www.anaspec.com/products/product.asp?id=30701

Master de Biotecnoloxìa 2011-12 12

Electron micrographs of

negatively stained E. coli

untreated and treated with

cecropin B.

http://www.biochemj.org/bj/341/0501/bj3410501.htm

Master de Biotecnoloxìa 2011-12 13

Cecropina D

Cecropina D es un cecropina mas grande, de hecho su secuencia es de

36 aminoácidos.

Aparece en la hemolinfa mucho

más tarde después de la infección

bacteriana que la cecropina A o B.

Tiene una potente actividad

antibacteriana sin actividad

hemolítica contra los glóbulos

rojos humanos.

WNPFKELEKVGQRVRDAVISAGPAVATVAQATALAK-NH2

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0305049199000152

Master de Biotecnoloxìa 2011-12 14

• Estas tres cecropinas, A, B y D, son productos de tres

diferentes genes que derivan de un ancestro común.

• Cecropinas aisladas de otros insectos han recibido varios

nombres ... bactericidin, sarcotoxin, etc. Todos estos péptidos

están estructuralmente relacionados.

• Las más estudiadas y actualmente las más relevantes son :

Cecropina AD, Cecropina P1 y Cecropina XJ.

Master de Biotecnoloxìa 2011-12 15

Cecropina AD

-Este péptido es un híbrido de cecropina A (1-11) y D (12-37).

-Esta proteína híbrida es hasta 25 veces más activa de la cecropina

D contra algunas bacterias y ligeramente más activa que la

cecropina A.

-Es 6 veces más activa que cecropina A contra Bacillus subtilis (1).

-Se ha notificado que esta Cecropina promueve la muerte celular por

apoptosis en células de carcinoma nasofaríngeo (2).

1) 2)

Master de Biotecnoloxìa 2011-12 16

Cecropina P1

• Este péptido no es de origen mamífero, de hecho es producido

por el parásito intestinal del cerdo, Ascaris suum (1) , y por el

paràsito humano Ascaris lumbricoides (2).

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005273699002011

1)

2)

Es bactericida contra una amplia gama de microorganismos:

Aeromonas hydrophila, Bacillus subtilis, Escherichia coli,

Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa,

Pseudomonas fluorescens,Pneumocystis carinii,

Saccharomyces cerevisiae.

Master de Biotecnoloxìa 2011-12 17

Cecropina XJ

• Es muy termoestable y tolera los ambientes que son muy ácidos,

básicos o salados.

• Tiene la capacidad de matar a el ampicilina-resistente

Staphylococcus aureus (a) y a el Staphylococcus enterica (b).

• También es resistente a la digestión de 24 horas por el jugo gástrico

artificial.

a) b)

Master de Biotecnoloxìa 2011-12 18

http://www.cmj.org/paper_journal/05/02/11/F050211_2.htm

Scanning electron micrographs of untreated and after treatment with

cecropinXJ of bacteria. A0, B0, C0, D0: bacterial cells incubated in absence of cecropin-XJ; A1, B1, C1, D1: bacterial cells incubated in

presence of cecropin-XJ for 10 minutes; A2, B2, C2, D2: bacterial cells incubated in presence of cecropin-XJ for 20 minutes. A0-A2: S. mutans;

B0-B2: L. acidophilus; C0-C2: A. viscosus; D0-D2: A. naeslundii.

Master de Biotecnoloxìa 2011-12 19

Función de la Cecropina • El sitio de acción de la actividad antimicrobiana es la membrana

celular.

• La Cecropina se pliega en su estructura final mientras que se adsorbe superficialmente en la superficie de la membrana. Las interacciones con regiones más profundas y hidrófobas de la bicapa parecen ser innecesarias para plegarse bien.

• El colesterol no impide la disipación de los gradientes iónicos por bajas concentraciones de péptido.

• Sólo en las vesículas, la acción de cecropina es dependiente de la concentración, creando:

- canales iónicos, si hay una baja proporción peptido/ lípido - poros, suficientemente grandes para pasar moléculas sonda, si hay una mayor proporciòn peptido/lípido.

• Es igualmente eficaz en vesículas aniónicas y neutrales, aunque vesículas aniónicas vinculan más péptido.

Master de Biotecnoloxìa 2011-12 20

La acción bactericida de las cecropinas se correlaciona con la permeabilización de la membrana, que es, de hecho, siempre seguida de citólisis irreversible y muerte de las

bacterias.

Análogos de estos péptidos

consistentes en todos

D enantiómeros son

activos como los naturales

La interacción de estas

moléculas con algunos

receptores quirales de

membrana parece excluido

Estos péptidos actúan

directamente mediante la

alteración de la membrana

de las células objetivo

Master de Biotecnoloxìa 2011-12 21

Todos las Cecropinas causan la formación de un poro

toroidal en la bicapa fosfolipídica:

El péptido se une a la membrana y cuando llega a el valor crítico

peptide / lipide 1:20 cambia su orientación :

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20403332

Master de Biotecnoloxìa 2011-12 22

Una excepción: Cecropina P1, para la cual se ha sugerido un

mecanismo de tipo "detergente“: los monómeros anfipáticos de α-

hélice rotan y mediante la inserción de los residuos hidrofóbicos en la

bicapa lipídica destruyen el empaquetamiento.

Master de Biotecnoloxìa 2011-12 23

Factores para la selectividad de las Cecropinas

:

.

1) La composición diferente de las membranas

Membranas bacterianas

son ricas en fosfolípidos aniónicos

como fosfatidilserina y fosfatidilglicerol;

esta determina entonces una

interacción electrostática del

péptido cargado positivamente

con la membrana misma, que

es la base del efecto posterior

de perturbación de la bicapa

Membranas eucariotas

( por ejemplo los hemocitos )

se caracterizan por un

elevado número de fosfolípidos

zwitteriónicos como fosfatidilcolina,

esfingomielina y

fosfatidiletanolamina;

también son ricos en colesterol,

ausente en las bacterias, que

parece inhibir la acción de estos

péptidos

2) El valor del potencial de membrana:

Un potencial más negativo en la célula, típico de las

células bacterianas (100-150 mV), facilita la

interacción de las cecropinas con la capa lipídica.

Master de Biotecnoloxìa 2011-12 24

Interacciòn con : Gram +

El péptido es,

probablemente, atraído

por los ácidos teicoicos y

teicuronicos y otros grupos

aniónicos que están

situados externamente a la

capa de peptidoglicano.

Gram –

El péptido interactúa con las

moléculas polianiónicas

de lipopolisacárido de la

membrana externa y es

entonces capaz de

hacerlo permeable o ser

recibido dentro.

Master de Biotecnoloxìa 2011-12 25

Las cecropinas inhiben la viabilidad y la proliferatiòn

de las células tumorales de vejiga

Background: La terapia del cáncer de vejiga.

Intravesical quimioterapia y la BCG- inmunoterapia se asocian con efectos

secundarios significativos. La toxicidad varía desde síntomas leves de cistitis hasta

la sepsis grave y tiene un impacto negativo en el cumplimiento del paciente. Por lo

tanto, la identificación de nuevos agentes intravesicales potentes es muy deseable

para reducir la toxicidad y mejorar los resultados a largo plazo.

Métodos:

El potencial antiproliferativo y citotóxico de las cecropinas A y B se cuantificó

mediante ensayos en cuatro líneas de células de cáncer de vejiga, así como en

líneas celulares de fibroblastos murinos y humanos.

Se empleò Microscopía electrónica de barrido (SEM) para visualizar los cambios

morfológicos inducidos por cecropina A y B

Resultados:

-Cecropina A y B inhiben la la proliferación celular del cáncer de vejiga y la viabilidad

de una manera dosis-dependiente.

-Benignos fibroblastos fueron significativamente menos o nada en absoluto

susceptibles a cecropina A y B.

Master de Biotecnoloxìa 2011-12 26

Conclusiones:

Cecropina A y B ejercen eficacia selectiva citotóxica y antiproliferativa en

células de cáncer de vejiga sin afectar los objetivos de origen benigno de

fibroblastos de ratón o humano. Ambos péptidos pueden ofrecer nuevas

estrategias terapéuticas para el tratamiento de cáncer de vejiga con

limitados efectos citotóxicos en las células benignas.

Cecropin B effect on

cell membranes of bladder

cancer cells

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18315881

Master de Biotecnoloxìa 2011-12 27

El péptido híbrido Cecropina-Melitina ejerce una acción leishmaniasicida.

Enfermedad causada por parásitos protozoarios

que pertenecen al género Leishmania y es

transmitida por la picadura de ciertas especies

de mosca de la arena.

El hìbrido Cecropina Melitina causa:

El daño de la bolsa flagelar de los paràsitos,

que después del tratamiento

está desprovisto de los microtúbulos.

Aumento de la permeabilidad de mebrana: provoca la

acumulación de prolina que afecta el gradiente de pH

y el potencial de membrana, los dos componentes

implicados en el mantenimiento de la capacidad

energética por la translocación de protones.

La acción del péptido en leishmaniasis es muy rápida

http://it.wikipedia.org/wiki/Leishmaniosi_umana

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1223672/

Master de Biotecnoloxìa 2011-12 28

Se ha demostrado una actividad específica de

tumoricida tanto de cecropina A como B de

mamíferos contra la leucèmia en mamìferos, linfoma

y el carcinoma de colon, así como el cáncer de

pulmón y cáncer gástrico. En vivo, la cecropina B

mejora la supervivencia de ratones portadores de

adenocarcinomas de colon .

Master de Biotecnoloxìa 2011-12 29

CONCLUSIONES

Las cecropinas son especialmente prometedores candidatos para la terapia contra el cáncer en los seres humanos porque demuestran varias características únicas:

1) Su selectividad para las células malignas y su actividad lítica potencialmente pronunciada contra las células tumorales de alto grado permite una terapia óptima in vivo con bajas concentraciones terapéuticas y efectos secundarios limitados.

2) Existe la hipótesis que el efecto anti-tumoral de las Cecropinas no puede ser alterado por el fenotipo MDR ( resistencia a múltiples fármacos ) observado en muchos tipos de cáncer.

3) Agentes clasicos quimioterapéuticos tales como mitomicina que son ampliamente usados para instilación intravesical son altamente inestables en la orina. Por el contrario, las Cecropinas son en gran parte resistentes contra la proteòlisis del suero y de la orina a causa de sus estructuras bioquímicas específicas, haciéndolas candidatas ideales para la teràpia de los tumores.

Master de Biotecnoloxìa 2011-12 30

Bibliografia

• J.P.N.Pathak , Insect immunity. 1999. Pag. 79- 93

• Andreas Vilcinskas, Insect Biotechnology. Pag 143- 159

• Paul T. Brey. Molecular Mechanisms of Immune Responses in Insects. 2006. Pag 87- 142.

• Hultmark, D., Engström, A., Bennich, H., Kapur, R., Boman, H.G. Insect immunity. Isolation and structure of cecropin D and four minor antibacterial components from Cecropia pupae. Eur J Biochem 1982; 127: 207-217.

• Alarcón, T., López-Hernández, S., Rivas, L., Andreu, D., López- Brea, M. In vitro activity of CA(1-8)M(1-48), a synthetic cecropin A-melitin hybrid peptide ; pag 137- 154

• Christensen, B., Fink, J., Merrifield, R.B., Mauzerall, D. Channel-forming properties of cecropins and related model compounds incorporated into planar lipid membranes. Proc Nat Acad Sci USA 1988; 85: 5072-5076 .

• Nos-Barberá, S., Portolés, M., Aprilla, A., Ubach, J., Andreu, D., Paterson, C.A. Effect of hybrid peptides of cecropin A and melitin in an experimental model of bacterial keratitis. Cornea 1997; 16: pag. 101-106.