Fundaments de Biocatalis

Biotransformaciones-BiocatalisisConceptos básicos

Dr. SinisterraDr. Alcántara

Biotransformations GroupFaculty of Pharmacy

Universidad Complutensewww.biotransformaciones.com

Fermentación- proceso metabólico en el que el oxígeno es el aceptor finalde una cadena de transporte de electrones.

Proceso que permite el crecimiento de un microorganismo a partir de sustratos naturales que son biotransformados a través de una serie debioconversiones que forman parte de una ruta metabólica.

Producto que se obtiene en la fermentación

Biomasa levadura del pan (Ind. Panadera)Productos metabólicos metabolismo anaerobioProductos de metabolismo primario aminoácidos, vitaminas etc.Productos de oxidación incompleta ácido acético. Ácido glucónico etc.Productos de metabolismo secundario (*) antibióticos, inmunosupresores, etc.PolisacáridosProteínasEtc.

(*)Los productos de metabolismo secundario no son necesarios para el crecimiento oreproducción del microorganismo. Su producción es especifica de la cepa

Enzymes, produced by living systems, are natural proteins with catalytic properties. As catalysts, enzymes are both efficient and highly specific for a particular chemical reaction involving the synthesis, the degradation or the alteration of a compound. Cofactors are involved in reactions where molecules are oxidized, reduced, rearranged or connected.

Biotechnology is broadly defined as a technique that involves the use of living organisms or their products to make or modify a product for commercial purposes.

Biotransformation is a reactión catalyzed by enzymes (whole cell) where a non natural substrate of the enzymes is involved.

Green chemistry is the design of chemical products and processes that reduce or eliminate the use and generation of hazardous substances.

Main Enzyme Classes____________________________________________________Enzyme class Catalyzed reaction____________________________________________________Oxidoreductases Oxidation-reduction reactions

Transferases Transfer of functional group

Hydrolases Hydrolytic reactions

Lyases Group elimination (creation of double bonds)

Isomerases Isomerization reaction

Ligases Bond formation coupled with a triphosphate cleavage

____________________________________________________

Biocatalytic process

The process refers to a reaction or a set of simultaneous reactions in which a pre-formed precursor molecule is converted

(rather than in fermentation process with de novo productions from acarbon and energy source such as glucose via primary metabolism)

The process must involve the use of enzymes and/or whole cells or combinationthereof, either free or immobilized

The process should lead to the production of a fine chemical or commodity product That is usually recovered after the reaction

Enzymes involved in the most important industrial bioprocesses

Hydrolases.- 40 processOxido-reductases .- 24 processLyases .- 16 processTransferases .- 3 processIsomerases .- 3 process

Liese et al. INDUSTRIAL BIOTRANSFORMATIONS Wiley-VCH 3rd ed 2008

EXCUSAS PARA NO EMPLEAR ENZIMAS

1.- Las enzimas son muy caras.•A primera vista, parece irrefutable.•Los precios oscilan entre $100,000/kg para una enzima de diagnóstico(láctico deshidrogenasa) hasta $100/kg para las preparaciones crudasde amilasas.•Para las enzimas más útiles en Biotransformaciones, los precios oscilanentre $500 hasta $20,000/kg, dependiendo de la pureza.

•No obstante, no debe considerarse tanto el precio en sí cuanto su contribución alprecio final del producto.•Ejemplos:

• Transaminasa ($20-30/kg) para la producción de p-fluoro-L-fenilamina($500/kg).• El costo final de la penicilinacilasa en la producción de Penicilina G es deaproximadamente $1/kg.• El costo final de la aspartasa en la producción de ácido L-aspártico es menorde aproximadamente $0.1/kg.

•Finalmente, si comparamoscon los precios de loscatalizadores químicos,veremos que no existe muchadiferencia!•SI SE INMOVILIZAN,PUEDEN REUTILIZARSE,CON LO QUE EL COSTOGLOBAL VA A VERSEDISMINUIDO


2 .- Las enzimas son muy sensibles y fáciles de desactivar.•En efecto, muchas enzimas se desnaturalizan en condiciones de altatemperatura o valores extremos de pH. Inclusive las disolucionesenzimáticas con el tiempo pierden actividad a temperatura ambiente.

•¿Y eso implica inestabilidad?.

•Lo verdaderamente importante por considerar es la ESTABILIDADOPERACIONAL en las condiciones de trabajo.•Existen muchos ejemplos industriales donde las enzimas exhibenexcelentes condiciones de estabilidad, especialmente si estáninmovilizadas.


•También se pueden usar enzimas de organismos termófilos, queson resistentes a las altas T (T>60ºC).

•Se pueden introducir modificaciones en la enzima para aumentarsu estabilidad o variar su selectividad (DIRECTED EVOLUTION).


3.-Las enzimas son activas solamente sobre sus sustratosnaturales

•Algunas (las más especializadas) pero otras muchas no.•Las hidrolasas, proteasas, esterasas y especialmente lipasas, soncapaces de aceptar sustratos muy distintos de los suyosnaturales.

•Proceso one-pot deLONZA en un bio-reactor de 15m3

•Amidasa de Comomonasacidovorans expresadaen E. Coli.•El enantiómero hidrolizado de la amida se recicla a amida racémica.•La Cilastatina es uninhibidor de la β-galactosidasa.


•Proceso de SEARLE, USA•La enzima se emplea inmovilizada.•El producto se usa para el tratamiento de enfermedadescardiovasculares.


4.-Las enzimas solamente trabajan en concentraciones muybajas de sustrato, por lo que la productividad del procesobiocatalizado es baja.

•Proceso de GlaxoSmithKline•La enzima es una proteasaalcalina (alcalasa).•El medio de reacción esTHF/agua.•Resultados: 50 % deconversión, ee > 99%•La concentraciónde sustrato es 100g /l.

ABACAVIR, anti-HIVZiagen TM


•Proceso de Chirotech•Planta piloto en Shasun Chemicals, India•La concentración de sustrato es 150 g/l


5.-Las enzimas solamente catalizan reacciones pocoatractivas.

•Rotundamente falso•El volumen de reacciones catalizadas por la enzimas es muy importante.


6.-Las enzimas solamente funcionan en medios acuosos, donde lossustratos mas interesantes para un químico orgánico son insolubles.

•Rotundamente falso•Se verán innumerables ejemplos de la utilización de enzimas en medios no convencionales(orgánicos, fluidos supercríticos, líquidos iónicos, …)


Realmente el agua se usa solo si uno de los sustratos es soluble solo en agua

Ventajas de utilizar medios orgánicos

1.- mayor rendimiento total al no haber reacciones secundarias v.g: hidrólisis o al no haber formación de emulsiones que dificultad la recuperación del producto

2.-Aumento de la solubilidad de las moléculas orgánicas, lo que aumenta la velocidad de reacción

3.- se evita la contaminación microbiana

4.- se disminuye la desactivación enzymática por efecto de la temperatura.

VENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES

1.- Las enzimas son catalizadores muy eficientes:•aceleración de velocidad del orden de 8 a 12 factores de magnitud•se usan a concentraciones del 0.001 al 0.0001%, frente a los catalizadoresquímicos (0.1-1%).•Si consideramos las condiciones de su uso (T, presión) su eficacia es aunmayor

•Se puede usar la enzima inmovilizada, o bien las célula enteras tambiéninmovilizadas. Es uno de los procesos biocatalizados de mayor productividad.

1 kg

10.000 a100.000 kg

3$/kg


2.- Las enzimas no producen contaminación medioambiental

•Las enzimas son proteínas y, por tanto, biodegradables.

•Si se usan soportes inertes (sílice, barro de diatomeas), el derivado

inmovilizado sigue siendo inocuo para el medio ambiente.

•Además, las condiciones suaves de trabajo implican poco consumo energético,

y por tanto poco costo y baja/nula emisión de gases contaminantes.

•Las enzimas son eco-eficientes, pues en sus procesos se consume menos agua,

productos de partida y energía


3.- Las enzimas trabajan en condiciones suaves de pH,temperatura y presión•Generalmente las enzimas funcionan a T ambiente, presión atmosférica y pHneutro o cercano a la neutralidad.•Por ello se minimiza la generación de subproductos por reacciones colaterales,lo que conlleva un aumento de la conversión y facilita los procesos derecuperación de productos (down stream)•Uno de los ejemplos mas claros: producción de acrilamida por Nitto Chemical,Japón.

•La escala de producción es aproximadamente 20.000 toneladas métricas al año.•El proceso químico opera a temperaturas de 80-140ºC y siempre se produce ácido acrílico como subproducto. Además usa un catalizador de Cu que genera subproductos tóxicos (HCN entre ellos)•El proceso enzimático opera a 10ºC para generar un 100% de acrilamida


4.- Las enzimas no están limitadas a su papel natural


5.- Las enzimas pueden catalizar un amplio espectro de reacciones

•HIDROLISIS-SINTESIS DE ESTERES, AMIDAS, LACTONAS, ANHIDRIDOS,EPOXIDOS y NITRILOS

•OXIDACIONES-REDUCCIONES DE ALCANOS, ALQUENOS, COMPUESTOSAROMÁTICOS, ALCOHOLES, ALDEHIDOS y CETONAS, SULFUROS YSULFOXIDOS.

•ADICION-ELIMINACION DE AGUA, AMONIACO, ACIDO CIANHIDRICO.

•HALOGENACIONES y DEHALOGENACIONES, ALQUILACIONES yDEALQUILACIONES, ISOMERIZACIONES, CONDENSACIONES ALDOLICAS,ACILOINICA, ADICIONES DE MICHAEL.

•TRANSPOSICIONES TIPO CLAISEN.

•CICLOADICIONES DIELS-ALDER


CONSECUENCIA: Se llego a pensar que la biocatálisis y las biotransformaciones llegarían a

sustituir por completo a la Síntesis Orgánica y a la catálisis convencional

A B C D EBiocat.

Hoy día ya se ha visto que ambaslíneas son complementarias peroexcluyentes

1.- Las enzimas son producidas en la naturaleza como un sólo enantiómero

no existen "imágenes especulares" de las enzimas formadas por D-aminoácidos. Se debe hacer un "screening" si se quiere buscar laenantioselectividad opuesta o modificar la enzima por técnicas de ingenieríagenética

2.- Las enzimas requieren parámetros operacionales muyestrechos

3.- Las enzimas presentan su mayor actividad en medios acuososproductos orgánicos poco solubles en agua

4.- Las enzimas pueden sufrir procesos de inhibiciónpor sustrato: mantener baja la concentración inicialpor producto final: hay que retirar el producto a medida que se forma

DESVENTAJAS DE LAS BIOTRANSFORMACIONES

ESTADO ACTUAL DE LAS BIOTRANSFORMACIONES

0

50

100

150

200

250

300

350

Núm

ero

de p

ublic

acio

nes

82 84 86 88 90 92 94 96 98 00 02 04 6 8

Año

BIOCATAL! ORGANIC SYNTHESIS and ENZYM!

La mayoría de los Químicos Orgánicos la han aceptado como unaherramienta más dentro del arsenal sintético.

www.sciencedirect.com

CONCEPTOS BÁSICOS

Enzimas usadas en procesos de investigación

CONCEPTOS BÁSICOS

CONCEPTOS BÁSICOS

Cumulative number of bioprocess initiated

020406080

100120140160

1960 1970 1980 1990 2000 2006

year

num

ber

process

Current opinion in Biotechnology 2007

CONCEPTOS BÁSICOS

CONCEPTOS BÁSICOS

¿QUÉ BUSCA UN QUÍMICO ORGÁNICO CUANDO USA UNA ENZIMA?

•APROVECHARSE DE LA PRECISIÓNQUÍMICA DE LAS MISMAS.

•ESTA PRECISIÓN SE PUEDE ABORDARDESDE DOS PUNTOS DE VISTA:

•MECANÍSTICO•CINÉTICO

ASPECTOS MECANÍSTICOS

PRINCIPIO LLAVE-CERRADURA

MODELO ENCAJE INDUCIDO KOSHLAND, D.E. Y NEET, K.E.Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 1974, 37, 359

ASPECTOS MECANÍSTICOS

OAc

OAc OAc

OOAcOH

OAc OAc

O OAcOAc

OH OAc

OAcO

+PFL

Selectivity of the enzyme derivative

Lipase derivative Yield(%) t(h) 5-OH (%) 3-OH (%)

Octyl agarose 100 31 21 79Glutaryl agarose 100 432 -- 100EPOXY eupergit 16 480 51 49EPOXY sepabeads 39 360 4 96

Tetrahedron 2003,59, 5705-5711

OAc

OAc OAc

OOAcOH

OAc OAc

O OAcOAc

OH OAc

OAcO

+CRL

Selectivity of the enzyme derivative

Lipase derivative Yield(%) t(h) 5-OH (%) 3-OH (%)

Octyl agarose 100 3 96 4Glutaryl agarose 100 76 95 5EPOXY eupergit 100 70 97 3EPOXY sepabeads 92 190 90 10

ASPECTOS CINETICOS

CATÁLISIS ENZIMÁTICA:POR DISMINUCIÓN DE LA ENERGIA DE ACTIVACIÓN

¿POR QUÉ SE DISMINUYE LA ENERGÍA DEACTIVACIÓN?

Existen 5 factores que se pueden considerar:

1.- FACTOR PROXIMIDAD y ORIENTACIÓNEl método clásico que emplea una enzima para incrementar la velocidadde una reacción bimolecular es usar la energía de unión para traer a losdos reactivos a una proximidad adecuada dentro del centro activo, detal forma que podemos considerarlas TRAMPAS DE ENTROPÍA.

ASPECTOS CINETICOS

Complejo EA

B

Δ G‡= Δ H‡–TΔ S‡

Por tanto, la energía inicial del complejo E-A-B será superior y la E activaciónmenor

ASPECTOS CINETICOS

ΔG‡

MeN

Me Me+

O

O

NO2

HO

NO2

O-

O MeN

MeMe

H+ +H2O

ON

MeMe

O

NO2O-NMeMe

O

H

+

HO

NO2+

H2O

Reacción de segundo orden, k = 4.3 mol-1 l min-1

Reacción de primer orden, k = 21500 mol-1 l min-1

ASPECTOS CINETICOS

EJEMPLOS QUÍMICOS

ASPECTOS CINETICOS

Disminución de entropía por aproximación.

Disminución de entropía por

aproximación y orientación

2.- FACTOR CATÁLISIS ÁCIDO-BASE

Existen 2 tipos:

Específica, si intervienen contribucionesde H+ y OH- en la reacción. O sea, estosiones aceleran la reacción, por lo que lavelocidad de reacción depende sólo del pH,y no de la concentración del tampón.

General, cuando el tampón en su conjuntoayuda a estabilizar el estado de transiciónvía donación o eliminación de un protón,por lo que la velocidad de reaccióndepende de la concentración del tampón,así como del apropiado estado deprotonación. ES LA QUE PRODUCEN LASENZIMAS

ASPECTOS CINETICOS

ASPECTOS CINETICOS

CATALISIS BASICA

La hidrólisis se produce con mayor rapidez en presencia de hidróxido, perotambién depende de la concentración de imidazol del buffer, porque puedeaceptar un protón del agua y generar el hidróxido. Posteriormente, puedevolver a dar el protón al acetato de para-nitrofenilo y originar un mejor gruposaliente.

ASPECTOS CINETICOS

3.- FACTOR CATÁLISIS COVALENTE

Las reacciones pueden catalizarse por la formación y desaparición rápidade intermedios covalentes. En estos casos, los estados de transición seestabilizan por la enzima.

Las enzimas favorecen la unión del estado de transición en lugar de la delsustrato.

ASPECTOS CINETICOS

3.- FACTOR CATÁLISIS COVALENTE

Sin catálisis Catálisis enzimático

S0

Mala unión del sustrato

S

Fuerte unión del ET

O

O O H2OO-

O

O-O

+

. ASPECTOS CINETICOS

O

O O

NO

O-

O

N O

O-

O

N N

O

+ O-O

H2O

OH

O-

NO-

O+

NH

Hidrólisis de anhídrido acéticoen agua.

Hidrólisis de anhídrido acéticoen agua catalizada por piridina

Intermedio covalente 1

Intermedio covalente 2

ASPECTOS CINETICOS

Mecanismo de acción de las hidrolasas dependientes de serina PASO 1

ASPECTOS CINETICOS


4.- FACTOR DISTORSIÓN

Al entrar al centro activo, el sustrato debe distorsionarse.Eso hace que tenga una geometría y una distribución electrónica más cercana a la delestado de transición.

EJEMPLO: Mecanismo de acción de la lisozima

ASPECTOS CINETICOS

Es una pequeña enzima globular formada por129 aminoácidos.Hidroliza cadenas de polisacáridos,particularmente los que forman elpeptidoglicano de la pared celular de lasbacterias, cortando el enlace glicosidico entreC-1 de una molécula de acido N-acetilmurámico NAM y C-4 de una molécula de N-acetil glucosamina NAG.

ASPECTOS CINETICOS

La estructura 3D se ha determinado enpresencia de un análogo del sustrato nohidrolizable, que se une fuertemente ala enzima para originar el complejo ES,pero no puede originar E y P.

El centro activo: hendidura en lasuperficie, donde pueden encajar en 6subsitios distintos 6 moléculas demonosacárido por enlaces de hidrogeno.En uno de esos subsitios, llamadosubsitio D, para que se encaje lamolécula de NAM se tiene que produciruna distorsión del sustrato desde silla abote lo que aumenta la energía delestado inicial, por lo que se disminuye laenergía de activación. .

ASPECTOS CINETICOS

A partir de la estructura de rayos X se sabe que el carbono C1 de la unidad D se sitúa entre 2 residuos carboxilato (Glu-35 y Asp-52). Asp-52 existe en forma ionizada, mientras que Glu-35 esta protonado. Glu actúa como un acido general que protona el grupo saliente en el estado de transición, mientras que Asp estabiliza la carga positiva dei intermedio. Entonces Glu actúa como una base y desprotona el agua en el estado de

ASPECTOS CINETICOS

5.- FACTOR MICROENTORNO

Las reacciones químicas se ven afectadas por los disolventes.La existencia de microentornos hace que las micro-constantesdieléctricas sean diferentes, por lo que los micro-pKa de los aminoácidoscambia. Esta es la situación en la catálisis enzimática.

Grupo cadena lateral

Carga neta a pH 7

pKa

del AA librepKa

in protein

Asp carboxilo -1 3.9 4-5Glu carboxilo -1 4.1 4-5His imidazol Aprox 0 6.0 6-7

Cys tiol Aprox 0 8.4 8-9.5Tyr fenol 0 10.5 9.5-10Lys amino +1 10.5 ~10Arg guanidinio +1 12.5 ~12

Ser hidroxilo 0 ~16

ASPECTOS CINETICOSEfecto del pH en la acción de la papaina

pH < 4.2 pH>8.2

Cinética Enzimática

CONCEPTOS BÁSICOS

DEFINICIONES.

1.CONVERSION.Número de moléculas convertidas por número demoléculas iniciales.

Xs : conversión del sustrato S

ns0 : cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reacción.

ns : cantidad (moles) de sustrato S al final de la reacción

CONVERSION.

Este parametro debe maximizarse para• evitar el reciclado del sustrato no convertido.• minimizar el volumen del reactor.• evitar reacciones no deseadas con el sustrato no

convertido.

No obstante• grandes conversiones requieren largos tiempos de

reacción.• grandes conversiones requieren grandes cantidades de

catalizador.

CONCEPTOS BÁSICOS

2.RENDIMIENTONúmero de moléculas de producto sintetizadaspor número de moléculas iniciales.

ηp : conversión del producto Pnp0 : cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reacción.np : cantidad (moles) de producto P al final de la reacción.νs : factor estequiométrico para el sustrato Sνp : factor estequiométrico para el producto P

CONCEPTOS BÁSICOS

RENDIMIENTO.

Junto con la conversión y la selectividad define cuantasmoléculas de producto son sintetizadas por molécula desustrato.Esta definición se refiere al rendimiento analítico, y es elque debe utilizarse para el entendimiento de los pasosindividuales de reacción y el planteamiento de modeloscinéticos.Es más aplicado hablar de rendimiento aislado, quecuantifica el rendimiento después de los procesos deldownstream.Si consideramos el proceso completo, el rendimiento globales el producto matemático de todos los pasos individuales.

CONCEPTOS BÁSICOS

3.SELECTIVIDADNúmero de moléculas de producto sintetizadaspor número de moléculas convertidas.

σp : selectividad para el producto pns0 : cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reacciónns : cantidad (moles) de sustrato S final de la reacciónnp0 : cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reacción.np : cantidad (moles) de producto P al final de la reacción.νs : factor estequiométrico para el sustrato Sνp : factor estequiométrico para el producto P

CONCEPTOS BÁSICOS

• LAS ENZIMAS son proteínas que se comportancomo catalizadores muy potentes y eficaces de lasreacciones químicas de los sistemas biológicos.

• La CATÁLISIS ENZIMÁTICA es esencial para lossistemas vivos.

• La mayoría de las Reacciones Químicasocurrirían muy lento en condicionesbiológicamente significativas.

• Hace posible que en condiciones fisiológicastengan lugar reacciones que sin catalizadorrequerirían condiciones extremas de presión,temperatura o pH.

• Las biomoléculas son muy estables a pH neutro,temperatura suave y ambiente acuoso

CONCEPTOS BÁSICOS

Características

• Como catalizadores, los enzimas actúan en pequeñacantidad y se recuperan indefinidamente, in vivo.

• No llevan a cabo reacciones que seanenergéticamente desfavorables, sino que solamenteaceleran las que espontáneamente podríanproducirse. ΔGo <0

• Los enzimas son catalizadores específicos: cadaenzima cataliza un solo tipo de reacción, y casisiempre actúa sobre un único sustrato o sobre ungrupo muy reducido de ellos. Esto es cierto in vivo,peor no in vitro, lo cual es el origen de lasBiotransformaciones

CONCEPTOS BÁSICOS

Estructura-actividad catalítica

• La actividad catalítica depende del mantenimiento de la conformación proteica nativa

• Si se desnaturaliza laproteína o se disocia ensubunidades pierde suactividad.

• Estructuras 1°, 2°, 3° y 4°son esenciales

Lisozima y susubstrato

El sustrato es reconocido por la enzima(centro de reconocimiento) y Biotransformado en

el centro activo

Cofactor (Coenzima):

Átomo, ion o molécula que participa en el procesocatalítico sin ser enzima ni substrato.

Los cofactores participan de dos maneras distintas:

1. A través de una fijación muy fuerte a la proteína y no sonmodificados en el ciclo catalítico.- cofactor

2. Como un segundo substrato; se ven modificados en el ciclo catalítico y por lo general requieren otra enzima para volver al estado original.- coenzima

Se pueden extraer sin perder actividad

biológica

Extractos se usa paraEstudios de :

Reacciones metabólicasy su regulación

Estructuras y mecanismos de acción

Catalizadores en síntesis industrial

Diagnósticos enfermedades

Distribución intracelular de las

enzimas

Localización porHistoenzimologíaEnsayos Elisa

Biotransformaciones

La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas porenzimas. Estos estudios proporcionan información directa acerca delmecanismo de la reacción catalítica y de la especifidad del enzima.

La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse conrelativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislarel enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH,temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentracionessaturantes de sustrato.

En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidadmáxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la apariciónde los productos o la desaparición de los reactivos.

CINÉTICA ENZIMÁTICA

Al seguir la velocidad de aparición de producto (o de desaparición del sustrato) enfunción del tiempo se obtiene la llamada curva de progreso de la reacción, osimplemente, la cinética de la reacción. A medida que la reacción transcurre, lavelocidad de acumulación del producto va disminuyendo porque se va consumiendo elsustrato de la reacción. Para evitar esta complicación se procede a medir la velocidadinicial de la reacción (v0).La velocidad inicial de la reacción es igual a la pendiente de la curva de avance atiempo cero. De esta forma, la medida de v0 se realiza antes de que se consuma el 10%del total del sustrato, de forma que pueda considerarse la [S] como esencialmenteconstante a lo largo del experimento. Además, en estas condiciones no es necesarioconsiderar la reacción inversa, ya que la cantidad de producto formada es tanpequeña que la reacción inversa apenas ocurre. De esta forma se simplificanenormemente las ecuaciones de velocidad.

Cinética de aparición de producto

Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de la concentracióninicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción, manteniendo lacantidad de enzima constante.

Si representamos v0 frente a [S]0 obtenemos una gráfica como la de la Figura.

Cuando [S]0 es pequeña, la velocidad inicial es directamente proporcional ala concentración de sustrato, y por tanto, la reacción es de primer orden.A elevadas [S]0, el enzima se encuentra saturada por el sustrato, y lavelocidad ya no depende de [S]0. En este punto, la reacción es de ordencero y la velocidad es máxima (Vmax).

Activador: Agente que aumenta la actividad enzimática

Inhibidor: Agente que disminuye la actividad enzimática

Inhibidor reversible: establece un equilibrio reversible con la Enzima. Un aumento en la ocncentración de sustrato elimina la inhibición

E + I EI

Inhibidor irreversible: modifica químicamente a la enzima. Un aumento de la concentración de sustrato no reactiva la enzima

E + I E’

4.1 PARÁMETROS BÁSICOS

SELECTIVIDAD.

Describe las moléculas de producto sintetizadas en relacióncon todas las moléculas convertidas.Debe ser lo más cercana posible a 1 para evitar gastosinnecesarios de sustrato, por lo que es uno de los factoreseconómicos más importantes.Es un parámetro decisivo para estimar el tiempo dereacción, pues su evaluación continua nos indicará si dedemosdetener la reacción en un momento determinado.La combinación de estos tres parámetros básicos nos llevaa la siguiente ecuación:.

Velocidades de las reacciones químicas efecto de los catalizadores

• Velocidades de reacción y orden de reacción– Reacciones de 1º Orden

• Para la reacción irreversible:

A B

[A]/[A] 0 = e -(k-1t) k1 [s-1]

donde [A]0 = concentración inicial de A cuando t = 0.

Integrando la ecuación anterior

Representación gráfica

• Los procesos bioquímicos son reversibles

[A]k1

k--1

[B]

Donde k1 y k-1 son constantes de velocidad de 1er orden, directa e inversa.

En el equilibrio

• Reacciones de 2° Orden

2Ak2 B

Donde k2 es cte de v de 2° orden [(mol/L)-1 s-1]

Los esquemas de reacciones complejas se simplifican con un paso limitante de la velocidad

Velocidades de las reacciones químicas efecto de los catalizadores

Estados de transición y Barreras de reacción

• ¿Qué determina la velocidad de una reacción?– Barrera energética – Estado de transición

Estados de transición y Barreras de reacción

K = e - ΔG≠ /RT

¿Qué hace un catalizador?

Disminuye la energia libre de activación ΔG ≠ sin afectar a la energía libre del proceso ΔG o

Reacción Energía de activación (Kcal*mol-1)

H2 O + O2

18

b) el hierro catalítico (Fe) realiza la reacciónH2O2 H2 O + O2

13

H2O2 H2 O + O2

12

H2O2 H2O + O2

5

Cómo funcionan las enzimas• Los enzimas disminuyen la energía de

activación de las reacciones

el peróxido de hidrógeno se descompone en:H2 O2

c) el platino catalítico (Pt) realiza la reacción :

d) la catalasa una enzima hepática la realiza

¿Qué hace un catalizador?

• ¿Cómo reduce el catalizador la barrera energética?– Reducción de entropía– Desolvatación– Se compensa tensión o

distorsión del sustrato– Consigue alineamiento

entre grupos funcionales catalíticos de la E y el S

¿Cómo actúan las enzimas como catalizadores?

Sitio Activo

1.- El enzima y su sustrato

2.- Unión al centro activo

3.- Formación de productos


Hipótesis de la Cerradura y la llave (E. Fischer, 1894)

Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospecífica,de la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura.

Modelo aceptado durante mucho tiempo; hoy se considerainsuficiente al no explicar algunos fenómenos de la inhibi-ción enzimática, por ejemplo


• Hipótesis del Ajuste Inducido (Daniel Koshland, 1958)– E Induce al S a configuración aproximada al Estado de

Transición

1. UNE S2. REDUCE Ea

3. IMPULSA Catálisis4. LIBERA P5. SE REGENERA

Tanto la enzima como el substrato sufren una alteraciónen su estructura por el hecho físico de la unión.

Está mucho más de acuerdo con todos los datos experimen-tales conocidos hasta el momento.

La teoría del Ajuste Inducido se amplía en la actualidaddefiniendo la acción enzimática como

Estabilización del Estado de Transición

Según lo cual, el Centro Activo enzimático es en realidadcomplementario no al substrato o al producto, sino alestado de transición entre ambos.

Cinética de Michaelis-Menten

Para explicar la relación observada entre la velocidad inicial (v0) y laconcentración inicial de sustrato ([S]0) Michaelis y Menten propusieronque las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dosetapas: En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato yen la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacióndel producto, liberando el enzima libre:

k1

K -1

k2

Cinética de la Catálisis Enzimática

• Cinética de Michaelis-Menten

– 1º etapa se forma el complejo enzima-sustrato.

– 2º etapa, el complejo enzima-sustrato da lugar ala formación del producto, liberando la enzimalibre:

Paso lento

V1 = k1 [E] [S]

V2 = k2 [ES]

V3 = k3 [ES]k1 k3

E + S ES E+ P

k2

Cinética de la Catálisis EnzimáticaEn este esquema, k1, k-1 y k2 son las constantes cinéticas

individuales de cada proceso y también reciben elnombre de constantes microscópicas develocidad. Según esto, podemos afirmar que:

• v1 = k1 [E] [S] • V2 = k2 [ES] • v3 = k3 [ES]

Podría Expresarse V como función de [E]t y [S]

Asumiendo que E y S están en equilibrio cuando k2<< k-1

Ks cte de disociación

Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida alsustrato (ES), de forma que la concentración total de enzima, [ET],(que es constante a lo largo de la reacción) es:[ET] = [E] + [ES]Como [E] = [ET] - [ES], resulta que: v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]

Este modelo cinético adopta la hipótesis del estadoestacionario, según la cual la concentración delcomplejo enzima-sustrato es pequeña y constante a lolargo de la reacción. Por tanto, la velocidad de formacióndel complejo enzima-sustrato (v1) es igual a la de sudisociación (v2+ v3):v1 = v2 + v3Además, como [ES] es constante, la velocidad deformación de los productos es constante:v = v2 = k2 [ES] = constante.

Pero E, S y ES no están en equilibrio pues ES se conviente en P Continuamente

Modelo de Briggs – Haldane: Estado Estacionario

Como v1=v2+v-1, podemos decir que:k1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES]Despejando [ES], queda que:

siendo

donde la expresión (k2+k3)/k1 se ha sustituido por KM, oconstante de Michaelis-Menten.Esta relación nos explica las razones que hacen de la KM unparámetro cinético importante.Por lo tanto, en el estado estacionario, la velocidad de formación del producto es:

v = v3 = k3 [ES] =

http://www.ehu.es/biomoleculas/ENZ/ENZ3.htm�




















Para cualquier reacción enzimática, [ET], k3 y KM son constantes.Vamos a considerar dos casos extremos:•A concentraciones de sustrato pequeñas ([S] << KM) v = (k3 [ET]/KM) [S].Como los términos entre paréntesis son constantes, pueden englobarse enuna nueva constante, kobs, de forma que la expresión queda reducida a: v =kobs [S], con lo cual la reacción es un proceso cinético de primer orden.

•A concentraciones de sustrato elevadas ([S] >> KM), v = k3 [ET]. Lavelocidad de reacción es independiente de la concentración del sustrato, ypor tanto, la reacción es un proceso cinético de orden cero. Además,tanto k3 como [ET] son constantes, y nos permite definir un nuevoparámetro, la velocidad máxima de la reacción (Vmax): Vmax = k3 [ET], quees la velocidad que se alcanzaría cuando todo el enzima disponible seencuentra unido al sustrato.Si introducimos el parámetro Vmax en la ecuación general de la velocidad,(la fórmula recuadrada anteriormente), obtenemos la expresión másconocida de la ecuación de Michaelis-Menten:


Pero E, S y ES no están en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente

Modelo de Briggs – Haldane: Estado Estacionario

Entonces


• KM es característica de cada reacción

• Tiene unidades de concentración

• Cuando KM >> [S] se alcanza Vmax

Ecuación de Michaelis - Menten

Cinética de la Catálisis Enzimática• Para reacciones de pasos múltiples:

K2 es un caso particular la Kcat

Se hace un análisis similar pero teniendo presente el paso lentode la reacción como determinante de la misma


Significado de KM, Kcat, Kcat/KM

• KM

– Cuando k2 << k-1 Entonces KM ≅ k-1/k1 = K

• Afinidad de la enzima por el sustrato

– KM = [S] cuando V = ½ Vmax

• Es una medida de la [S] necesaria para alcanzar

una catálisis eficaz


Significado de KM, kcat, kcat/KM

• kcat [segundos-1]

– Medida directa de la producción catalítica en

condiciones óptimas (enzima saturada)

– Tiempo necesario para cambiar S en P

– Número de recambio (N° moléculas de S

transformadas por segundo)


Significado de KM, kcat, kcat/KM

• kcat/ KM

– Cuando [S] << KM Entonces [E]t << [E]

– Medida directa de eficiencia y especifidad

de la enzima

– Permite comparar eficiencia de una

enzima con diferentes sustratos

– Valor máximo entre 108 y 109 (mol/L)-1 s-1

Cinética de la Catálisis EnzimáticaAlgunos valores representativos


• Representación doble inversa o de Lineweaver-Burk


• Representación de Eadie- Hofstee

Factores que afectan la velocidad de reacción

En condiciones deconcentración de [E],pH y temperaturaconstante se observaque la accisacorrespondiente aVmax/2 es Km

• Efecto de la variación de la concentración del sustrato


En condiciones deconcentración de Screcientes hasta lasaturación, pH ytemperatura constante seobserva que la velocidadinicial crece con [s]

• Efecto de la variación de la concentración de la enzima

Factores que afectan la velocidad de reacción• Efecto de la temperatura sobre la actividad

enzimática– En general, los aumentos de temperatura aceleran las

reacciones químicas: por cada 10ºC de incremento, lavelocidad de reacción se duplica, Q10.


• Efecto del pH sobre la actividad enzimática– Los enzimas poseen grupos químicos ionizables

(carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH;imidazol, etc.) en las cadenas laterales de susaminoácidos

Cinética Enzimática• Reacciones en que intervienen dos o

más sustratos. Puede haber dos casosextremos:

– Unión aleatoria de los sustratos

La fosforilación de la glucosa con ATP, catalizada con hexokinasa, con tendencia a

unirse a la glucosa en primer lugar.

•Unión ligeramente priorizada de uno de los sustratos


• Reacciones en que intervienen dos o mássustratos– Unión ordenada de los sustratos

Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzimanicotinamida adenindinucleotido (NAD+).


• Reacciones en que intervienen dos o mássustratos– Mecanismo “ping-pong”

La ruptura de una cadena polipetídica con una serin-proteasa, tal como la tripsina o la α-chymotripsina.


Análisis cinético en el estado estacionario de las reacciones bi-sustrato

Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo

Cinética Enzimática• Mecanismos de Inhibición

Cinética Enzimática• Mecanismo de Inhibición Reversible

– Inhibición competitiva

Métodos gráficos de determinación del proceso de inhibición

Cinética Enzimática• Mecanismos de Inhibición Reversibles

– Inhibición no competitiva

Métodos gráficos de determinación del proceso de inhibición

Cinética Enzimática• Mecanismos de Inhibición Reversibles

– Inhibición no-competitiva


• Mecanismos deInhibición Irreversibles

– Análogos del estado detransición

– Marcadores de afinidad– Inhibidores suicidas

Activador alostérico: favorece la unión del sustrato

Inhibidor alostérico: impide la unión del sustrato

Elementos de la reacción

El enzima no fosforilado es inactivo

El enzima fosforilado es activo

Activación enzimática por fosforilación de la enzima

Resolución de mezclas racémicas

Hay tres metodologías para preparar compuestos ópticamente puros

1) Partir de compuestos quirales enantioméricamente puros (se obtiene de la Naturaleza)

2) Resolución cinética de mezclas racémicas

3) Síntesis asimétrica a partir de sustratos proquirales y un catalizador quiral

El primer método tiene el problema de la dificultad de hallar el producto adecuadoen la Naturaleza

La biocatálisis se emplea a nivel industrial en los otros dos métodos dadas las Características de las enzimas como catalizadores.

Resolución cinética

Se basa en la distinta velocidad de reacción de cada uno de los dos Enantiómeros de un racémico frente a un catalizador quiral

En el caso ideal, el máximo rendimiento que se puede obtener es de un 50%.No obstante siempre el valor es menor pues la velocidad de reacción dependede la concentración de sustrato y a medida que avanza la resolución el proceso se ralentiza para el enantiómero mas gastado.

R

Racemico(R+S)

S

%R-%Se.e =------------

%R + %S

*para lograr buenos e.e. se detiene la reacción antes de llegar al 50% de rendimiento

HO OHH H

Lipasas Proteasas

R

O

O R

O

O R

O

O CCl3 R

O

O

AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCIONDE MEZCLAS RACÉMICAS

Resolución de alcoholes secundarios empleando hidrolasas

R1 R2

OHO

O

R4R1 R2

O R4

O

+ R3

R1 R2

O R4

O

o

4.1 PARÁMETROS BÁSICOS

4.EXCESO ENANTIOMÉRICOEn una mezcla de dos enantiómeros, es elporcentaje de uno de los enantiómeros menos eldel otro.

eeR : exceso enantiomérico del enantiómero R.

nR : cantidad (moles) del enantiómero R

nS : cantidad (moles) del enantiómero R

PARÁMETROS BÁSICOS en biocatálisis

EXCESO ENANTIOMÉRICO.

Describe la pureza óptica de una molécula ópticamenteactiva.Debido a que los dos enantiómeros pueden tenerpropiedades muy diferentes, deben buscarse procesos quetranscurran de manera lo más enantioselectiva posible.Muchos procesos, sobre todo en la industria de producciónde fármacos y agroquímicos (pesticidas, fungicidas, …), queoriginalmente se producían en forma racémica, comienzan aser producidos de forma enantioméricamente pura.(RACEMICSWITCH).Ventajas obvias: se produce menos del enantiómero nodeseado, aumenta la capacidad de la fábrica, hay menoscontaminación, …..

Enantiomeric ratio = E

E = ___Va___= _(kcat/Km)a___Vb (kcat /Km)b

Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_ln [(1-c)(1+ees) ]

Product E= __ln [1-c(1+eep)]ln [1-c(1-eep)]

ΔΔ G≠ = -RT ln E


R1 R2

OHO

O

R4R1 R2

O R4

O

+ R3

R1 R2

O R4

O

o

Condiciones para realizar una resolución cinética dinámica (DKR)

1.- La resolución cinética debe ser eficiente (E >20) 2.- La racemización debe ser rápida . Al menos 10 veces mas rápida que la reacción de la enzima con el enantiómero menos activo

k rac > 10 kent-s3.- La reacción de racemización no debe dar lugar a la formación de subproductos4.-El metal de transición usado no debe racemizar el producto de reacción5.- Lla resolución cinética y la racemización deben ser compatibles y eficaces en las mismas condiciones de reacción. One pot synthesis.


Resolución cinética dinámica de alcoholes secundarios y de aminas primarias

Matute An.Quim. 2006, 102, 46-52


Resolución cinética dinámica

Hoyos y col J.Org.Chem 2006, 71,7632-7

100% e.e.98% yield


TIPOS DE PRECISIÓN ENZIMÁTICA

•LA PRECISIÓN SE TRADUCE EN:

•SELECTIVIDAD HACIA SUSTRATO•QUIMIOSELECTIVIDAD (grupo)•REGIOSELECTIVIDAD (zona)•ESTEROSELECTIVIDAD (esteroquímica)

5.NÚMERO DE RECAMBIO(TURNOVER NUMBER).Número de moléculas sintetizadas por númerode moléculas de catalizador usadas.

tn : número de recambionP : cantidad (moles) de producto P al final de la reacciónncat: cantidad (moles) de catalizadorνp : factor estequiométrico para el producto P


NÚMERO DE RECAMBIO Turnover number.

Es una medida de la eficiencia del catalizador.

tn debe ser lo mayor posible con vistas a la reducción delprecio final del producto, sobre todo en los casos en los queel catalizador sea muy caro.

Suele combinarse con otros parámetros (velocidad dedesactivación, tiempo de vida medio) para dar una idea máscorrecta de la eficacia del catalizador.

En el caso de reacciones en las que existan cofactores ocoenzimas necesarias para la actividad catalítica se puedendefinir valores de tn para estas moléculas.


6.FRECUENCIA DE RECAMBIONúmero de moléculas convertidas por unidad detiempo.

tof : frecuencia de recambio (s-1)δns : diferencial de cantidad (moles, μmoles ) de sustratoconvertidoncat: cantidad (moles, μmoles ) de catalizadorδt : diferencial de tiempo para la conversión (s)


FRECUENCIA DE RECAMBIO.

Es una medida de la actividad enzimática.

Es mucho mayor para biocatalizadores que paracatalizadores químicos.

Ejemplo: catalizador químico para la epoxidación (Mn-Saleno):

tof 3 h-1. Catalizador enzimático: cloroperoxidasa (CPO): tof

4500 h-1

Pero también deben considerarse los pesos moleculares:635 frente a 42000 g •mol-1.


7. ACTIVIDAD ENZIMÁTICAVelocidad de reacción por unidad de peso decatalizador (proteína).

V : máxima actividad de la enzima en unas condicionesdeterminadas (katal • kg-1, U • mg-1)δns : diferencial de cantidad (moles, μmoles) de sustratoconvertidomcat: peso (kg, mg ) de catalizadorδt : diferencial de tiempo para la conversión (s, min)


ACTIVIDAD ENZIMÁTICA.

La unidad en el Sistema Internacional: KATAL (kat = mol •s-1= 6 • 107 U). Como suelen ser valores muy pequeños, sehabla generalmente de microkat, nanokat o picokat.Es más práctico el uso de UNIDADES (1U = 1 μmol•min-1).Los valores de actividad deben expresarse siempre para unsustrato determinado y en unas determinadas condiciones dereacción (temperatura, tipo y conc. de buffer, pH, …)Para determinar la concentración de una disolución deproteína ser suelen emplear métodos indirectos, bienfotométricos (Bradford, Biuret, Lowry) o analíticos(electroforesis)La actividad también puede expresarse por unidad devolumen (U•mL-1) cuando la concentración enzimática nopuede determinarse.


8. VELOCIDAD DE DESACTIVACIÓNEs la pérdida de actividad catalítica por unidadde tiempo.

kdeact : velocidad de desactivación.V0 : actividad de la enzima al comienzo de la medición (U • mg-1)V1 : actividad de la enzima al final de la medición (U • mg-1)t0 : tiempo inicial de medición (min, h, d)t1 : tiempo final de medición (min, h, d)

Expresa la estabilidad del catalizador.


9. VIDA MEDIATiempo al que la actividad enzimática se reducaa la mitad. t1 /2 : vida media (min, h, d)

kdeact : velocidad dedesactivación.Vx : actividad de la enzima untiempo x (U • mg-1)tx : tiempo medición (min, h, d)

Expresa estabilidad.

Suele seguir un decaimiento exponencial



Proceso irreversible

•SELECTIVIDAD DE SUSTRATO•Incluso conociendo la estructura 3D de una enzima, a veces es difícil entenderpor qué una enzima reconoce un tipo de sustratos, mientras que otros similares noson transformados.•Por ejemplo, la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedadde 2-oxoácidos usando ácido L-glutámico o L-Aspártico como donador del grupoamino.


SELECTIVIDAD DE GRUPO FUNCIONAL

•Es la capacidad de las enzimas para actuar sobre un grupofuncional determinado en una molécula en la cual existe otro grupofuncional más reactivo en condiciones químicas.


•REGIOSELECTIVIDAD•Es la capacidad de las enzimas para actuar sobre un grupo funcionaldeterminado en una molécula en la cual existe otro grupo funcional similar oidéntico en reactividad.

O

R2 O O

OCH3R1

(R,S)

lipasa deGeotrichum candidum

medio acuosoOH O

OCH3R1

esteres de ácidos grasos consustituyentes aciloxi en beta

+O

R2 O O

OCH3R1

(S)

(R)

inalterado

R1 R2 selectividad (E)heptilo propilo 11

undecilo propilo 20pentadecilo propilo 20

5,5-dibutilpentilo propilo 62undecilo clorometilo 3undecilo heptilo 5


N

S

CH3

CH3

HH

O

NO

HO

N

HH

O

NO

HOS

CH3

CO2H

A cilasa

A cilasa

N

S

CH3

CH3

HH

O

H2N

N

HH

O

H2N S

CH3

CO2H

HON

NN

NNH2

O

Tyr

H

O

Gly

H

O

Gly

H

O

Phe

H

O

R

R= Leu Leu-encefalina

R= Met Met-encefalina

α-quimotripsina

papaina


OCH3

ClH3CO O

O OCH3

O

H3C

Microsporumcanis

OH

ClH3CO O

O OCH3

O

H3C

OCH3

ClH3CO O

O

O

H3C

HO

Batrylis alii Cercospora melonis

OCH3

ClHO O

O OCH3

O

H3C

Ref.- BOOTHROYD, B. y cols. (1961) Biochem. J. , vol. 80, p. 34

GRISEOFULVINA(antibiótico)

α-quimotripsina

NCH3

O

O

H3C

OH

NCH3

O

O

HO

HO

hidrólisis química delacetato en 6-alfa-

O

O

H3C

O

O

CH3

N

hidrólisis enzimática delester dihidrocinámico en

3-beta

Chapmann, P. J. y cols.-(1965)

.Biochem. Biophys. Res. Commun. vol. 20, p. 104 Lin, Y.Y. y Jones, J. B. (1973)

J. Org. Chem. vol.38, p. 3575


N

O HO H

O HH

HO

subtilisina

butirato de tricloroetilopiridina

N

O H

O HH

H O

O

O

82 %

lipasa de Chromobacterium viscosum

butirato de tricloroetilo

N

O HH

HO

O

OO

O

72 %

CASTANOSPERMINAinhibidor de glucosidasaagente antineoplásicotratamiento del SIDA

MARGOLIN, A.L. y cols. 1990 J.Am.Chem.Soc ., 112, 2849


•ESTEREOSELECTIVIDAD

•Es la capacidad de las enzimas para reconocer quiralidad oproquiralidad en un sustrato.•Es sin duda la propiedad enzimática más empleada enBiotransformaciones.•Como la quiralidad es una cuestión de espacio, un sustrato debeubicarse de una manera determinada en tres dimensiones para permitirun alto grado de enantioselectividad.•Existe una teoría basada en este hecho, como es la llamada REGLA DELOS TRES PUNTOS, que permite explicar los tres tipos deesteroselectividad enzimática.


CB

A

cara Re

cara Si

CB

A

A

B C

CA

B

A

B C

ataque Siataque Re

REGLA DE LA SECUENCIAA>B>C

DISCRIMINACIÓN ENANTIOTÓPICA

DISCRIMINACIÓN ENANTIOFACIAL

A

CB

A

acción enzimática

pro-R

pro-S

CB

A

A

BC

AC

BA C

BA C

BA

A

CA

B

A

AB

Cpro-R

pro-S pro-S pro-S

pro-R

pro-R

A. OGSTON, Nature, 1948, 162, 963

REGLA DE LA UNIÓN POR TRES PUNTOS


DISCRIMINACIÓN ENANTIOMÉRICA

D

CB

A

D

AB

C

(S)(R)

D

CB

A

D

AB

C

D

A BC

D

AB C

CB

A

acción enzimática

CB

A CB

A CB

A

E

+ A [EA]

[EB]

E + P

E + Q+B

∆∆G# = ∆∆H# - T∆∆S# = -RTln (VA/VB)

ASPECTOS CINETICOS de la resolución de racémicos

∆∆G#(kcal/mol) VA/ VB ee (%) 0.118 1.2 10 0.651 3 50 1.74 19 90 2.17 39 95 3.14 199 99 4.50 1999 99.9


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