バイオ医薬品の特性解析 - Waters Corporation©2010 Nihon Waters K.K....

1

バイオ医薬品の特性解析バイオ医薬品の特性解析ACQUITY UPLCACQUITY UPLC®®

SYNAPTSYNAPTTMTM G2 HDMSG2 HDMSTMTM

日本ウォーターズ株式会社日本ウォーターズ株式会社

ソリューションセンターソリューションセンター

©2010 Nihon Waters K.K.

日本薬学会第130年会併催薬科機器展示会新技術・新製品セミナー

2010/3/29 13:00-13:20

バイオ医薬品に適したバイオ医薬品に適したLC/MSLC/MS

より複雑な分子の機器分析に求められるのは

Monoclonal Antibody

より高い解像度

＋多様性＋

データ解析能力

©2010 Nihon Waters K.K. 2

MW 6,000

Insulin

MW 34,000

EPO

MW 147,000

Aspirin

MW 180

サイズ＝複雑さ

2

バイオ医薬品に適したバイオ医薬品に適したLC/MSLC/MSACQUITY UPLCACQUITY UPLC®®/SYNAPT/SYNAPTTMTM G2 HDMSG2 HDMSTMTM


ACQUITY UPLCACQUITY UPLC®®とカラムテクノロジーとカラムテクノロジー

PITTCON 2004


3

HPLC

Speed

耐圧： 15,000 psiシステム容量： 120 µL

ACQUITY UPLCACQUITY UPLC®®

より質の高いより質の高いLC/MSLC/MSデータデータ

HPLC

HPLC

UPLC®

Resolution

Sensitivity

=UPLC®


UPLC®

Sensitivity

Better MS DataBetter MS Data耐圧20,000 psiのカラム充てん剤

Anal. Chem. 2003, 75, 6781-6788

U.S. Patent No. 6,686,035 B2

バイオ医薬品バイオ医薬品UPLCUPLC®®カラムカラム

1. UPLC® Amino Acid Analysis Solution

標準物質による2. Peptide Separation Technology

3. Oligonucleotide Separation Technology

標準物質による厳しいQCチェック


4. Protein Separation Technology

5. Glycan Separation Technology

4

SYNAPTSYNAPTTMTM HDMSHDMSTMTM


PITTCON 2007

SYNAPTSYNAPTTMTM G2 G2 HDMSHDMSTMTM システムシステム

最先端のQ-TOFに３つの独自機能を付加・イオンモビリティ・デュアルディソシエーションMSE取込みモド

世界初のQ-TOFから10数年高レベルに改善された基本性能

・MSE取込みモード


ESI ⇔ MALDI簡易な切り替え

5

SYNAPTSYNAPTTMTM G2G2QQ--TOFTOF性能性能、、IMSIMS性能性能

高分解能 > 40,000 FWHM

ダイナミックレンジ > 105

高分解能、高質量精度MS/MS、定量性向上、高速データ取得率を提供する革新的なハイブリッド四重極-飛行時間型MS

高質量精度 1 ppm RMS

UPLC®対応データ取得率

20 spectra/sec

クラスリーディングの感度


高分解能、高質量精度、高効率IMSを組み合わせた四重極-IMS-飛行時間型MS

従来の4倍以上のモビリティ分解能

IMS精密質量測定

ソフトウェアによって衝突断面積情報取得

構造解析に最適なTAPフラグメンテーション

多様なアプリケーションをサポートする多様なアプリケーションをサポートする解析ソフトウェア解析ソフトウェア


Prepare Analyse Interpret Decide

6

SYNAPTSYNAPTTMTM HDMSHDMSTMTMによるによる抗体製剤分析ソリューション抗体製剤分析ソリューション


インタクト還元ペプチドアミノ酸

糖鎖・修飾構造

抗体製剤の特性解析抗体製剤の特性解析ワークフローワークフロー

- 分子量測定- 不純物分析- 糖鎖プロファイリング- 補欠分子族の確認

- LC,HC分析- 糖鎖プロファイリング

- ペプチドマッピング- ペプチドシークエンス- 培地由来の成分- 末端アミノ酸- 構成アミノ酸

- 修飾の確認/同定酸化・脱アミド etc

- S-S結合- 糖組成- 糖鎖構造- 糖鎖立体構造

Goal


7

- 分子量測定- 不純物分析




- ペプチドマッピング- ペプチドシークエンス

- 修飾の確認/同定- 酸化・脱アミド etc

ⅠⅠ．．分子量測定、不純物分析、糖鎖プロファイリング分子量測定、不純物分析、糖鎖プロファイリング

不純物分析- 糖鎖プロファイリング- 補欠分子族の確認

糖鎖プロファイリングペプチドシクエンス- 培地由来の成分- 末端アミノ酸- 構成アミノ酸

酸化脱アミド etc- S-S結合- 糖組成- 糖鎖構造- 糖鎖立体構造

Goal

Watersのソリューション

インタクトタンパク専用LC/MSカラムM PREPTM Mi D lti C l


— MassPREPTM Micro Desalting Column— Protein Separation Technology Column

ロット間解析、デコンボリューションソフト

— BiopharmaLynxTM

— MaxEnt1

インタクトインタクトIgGIgG分析ワークフロー分析ワークフロー

IgG製剤

軽鎖および重鎖

LC/MS（脱塩カラム）

DTT還元


BiopharmaLynxTM解析分子量測定ロット間比較不純物分析

糖鎖プロファイリング

8

MassPREPTM Desalting Column :ハイスループット検体 3

モノクローナル抗体の高速オンライン脱塩モノクローナル抗体の高速オンライン脱塩LC/MSLC/MS

+ 51Charge state

Pre-runBlank

TIC (0.0 – 3.0 min)

G0F/G1F

G1F/G1F

１検体＝ 3 min

MaxEnt1 :高精度デコンボリューションソフトイオン強度の定量的解析

-S-S

-

-S-S

-

-S-S-

-S-S

-

-S-S

-

-S-S

-

-S-S

-

-S-S

-

-S-S-

-S-S--S-S

--S-S-

S SS S

SS

SS

( )

( )

( )

( )

-S-S

-

-S-S

-

-S-S-

-S-S

-

-S-S

-

-S-S

-

-S-S

-

-S-S

-

-S-S-

-S-S--S-S

--S-S-

S SS SS SS S

SS

SS

SS

SS

( )

( )

( )

( )


0.5 µg IgG1

Post-runBlank

GOF/G0F

G0F/G2F

G1F/G2F

G0/GOF

G2F/G2F

Gal

Fuc

Man

Fuc

Gal

Fuc

Gal

Fuc

Man

Fuc

Man

Fuc

BiopharmaLynxBiopharmaLynxTMTMによるインタクトタンパク解析によるインタクトタンパク解析

BiopharmaLynxTM :ロット間比較不純物検出

糖鎖プロファイリングの確認


9







ⅡⅡ．．アミノ酸、ペプチド、修飾アミノ酸、ペプチド、修飾 etcetc




Goal


UPLC® AAA solutionP tid M i l ti


Peptide Mapping solution— RapiGestTM SF— Peptide separation technology column— MSE取り込みモード

— BiopharmaLynxTM 1.2

IgG製剤

ペプチドマッピングワークフローペプチドマッピングワークフロー

ペプチド

LC/MS（PSTカラム）

トリプシン消化


BiopharmaLynxTM解析ペプチドカバレージマップ

ロット間比較修飾ペプチド検索修飾サイトの特定

10

6 0e 2

7.0e-2

90 min

HPLC 2.1 x 250 mm, 3.5 µ

Peptide Separation TechnologyPeptide Separation Technology

8 0e 2

9.0e-2

1.0e-1

Time30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00 80.00 85.00 90.00

AU

1.0e-2

2.0e-2

3.0e-2

4.0e-2

5.0e-2

6.0e-2

55 minUPLC® 2.1 x 150 mm, 1.7 µImproved resolution

Reduced run time

PST Column :高速、高分離ペプチドマッピング


Time20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 42.00 44.00 46.00 48.00 50.00 52.00 54.00 56.00

AU

2.0e-2

3.0e-2

4.0e-2

5.0e-2

6.0e-2

7.0e-2

8.0e-2

TFA or Formic acid

pH 1-12, High Temp

Columns QC tested with a peptide map

%

G2 (M+H)+3

m/z 976.026

3

6

3

PST Column :

High Resolution Separation of High Resolution Separation of Glycopeptides by UPLCGlycopeptides by UPLC®®

%

47.40 47.60 47.80 48.00 48.20 48.40 48.60 48.80 49.00

%

1

47.40 47.60 47.80 48.00 48.20 48.40 48.60 48.80 49.002

G1 (M+H)+3

m/z 922.00

G0 (M+H)+3

m/z 867.99

6

3

6

3

6

3

6

3

6

3

6

3

66

PST Column :糖ペプチドの分離にも有効


Time47.40 47.60 47.80 48.00 48.20 48.40 48.60 48.80 49.00

%

1

m/z 867.9933

Mouse IgG glycoforms were detected using extracted mass chromatograms of the triply charged glycopeptides. The positional isomers of G1 have been separated by UPLC®.

11

BiopharmaLynxBiopharmaLynxTMTMによるペプチドマッピング解析によるペプチドマッピング解析


BiopharmaLynxTM :ロット間比較カバレージマップ差クロマトグラム修飾ペプチド解析

LC/MSLC/MSEE Data AcquisitionData Acquisition

1 sec

MSPrecursor


Precursor

MSE

Fragments

Retention Time

MSE取込みモード :情報のロスがない

LowEnergy ⇒ 質量情報HighEnergy ⇒ 配列情報

12

BiopharmaLynxBiopharmaLynxTMTM 1.2 : 1.2 : フラグメントイオンによるペプチドアサイン機能フラグメントイオンによるペプチドアサイン機能


BiopharmaLynxTM ver.1.2 :MSEデータ対応

フラグメントイオン（b/yイオン）によるより高確度な帰属

1.1. Fragmentation patterns can be compared between analysesFragmentation patterns can be compared between analyses2.2. Potential alternative peptide assignments tested and selectedPotential alternative peptide assignments tested and selected3.3. Modifications can be assigned to specific residuesModifications can be assigned to specific residues

BiopharmaLynxBiopharmaLynxTMTM 1.2 : 1.2 : アサインの確認アサインの確認


BiopharmaLynxTM ver.1.2 :帰属根拠の確認には

１クリックでスペクトル画面へ

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ⅢⅢ．．糖鎖糖鎖




Goal


LC/ESI/MSによるインタクトIgG測定IgGから糖鎖を切り出して測定


— MassPREPTM Glycoanalysis Kit— Glycan separation technology column— MALDI/MS

糖ペプチドのサイト特定と定量的測定

— BiopharmaLynxTM

糖鎖解析ワークフロー糖鎖解析ワークフロー

IgG製剤

糖ペプチド& ペプチド N-結合型糖鎖

2 ベル化

IgG(糖鎖なし)

PNGaseFトリプシン


2-ABラベル化

LC/FLR/MS

(GSTカラム)

LC/MS

（脱塩カラム）MALDI/MS

LC/MS

（PSTカラム）

14

GST column :ヒトIgGでメジャーな13糖鎖の分離でQCチェックしたカラム

GlycanGlycan Separation TechnologySeparation Technology

MassPREPTM Glycoanalysis kit :PNGaseFによる糖鎖切り出しHILIC SPEでのクリーンアップ

MALDIマトリックス


5 pmol inj. ProZyme 2-AB IgG in 75-65% ACN 46G

22500.000

25000.000

27500.000

30000.000

090520_YAA026_ABC_ProIgG_02 (1) ACQUITY FLR ChA Ex330,Em420 nmRange: 3066224.58

18.57

31.87

G0F G1F

G2F FLR

GSTGSTカラムによるカラムによる22--ABABラベル化糖鎖のラベル化糖鎖のLC/FLR/MSLC/FLR/MS

10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 42.00 44.00 46.00

EU x

10e

4

0.000

2500.000

5000.000

7500.000

10000.000

12500.000

15000.000

17500.000

20000.000

15.47

20.0721.22

25.60

26.6326.98

28.50

37.43

33.1734.28

41.03

090520_YAA026_ABC_ProIgG_02 1: TOF MS ES+ BPI

77.824.56

G0G1

Man6Man5

G2FS1

G0FGN G1FGN

5 pmol inj. ProZyme 2-AB IgG in 75-65% ACN 46G

100090520_YAA026_ABC_ProIgG_02 1047 (18.564) Cm (1038:1056) 1: TOF MS ES+

702792.3

G2G1FS1

Loss -15 Da of labeled glycans

GST column ：高い糖鎖分離能高感度蛍光検出

GST column ：ESI/MSによる構造情報


Time10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 42.00 44.00 46.00

%

7

18.55

9.86

20.0721.18

23.95

31.85

25.57

26.63

30.22

40.48

37.4733.01

43.3345.13

BPI

m/z800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800

%

0

758.2

792.8

1583.7

793.3

1380.6

793.81177.5

820.3 1015.5840.31218.5

1219.5

1381.6

1382.6

1383.6

1584.7

1585.7

1586.6

(M+H)+

(M+2H)2+

Loss of GN

Loss -15 Da of labeled glycansESI/MSによる構造情報

IMS機能によりMS3も可能

15

GOF

G1FA)

フリー糖鎖のMALDI/TOF

切出したフリー糖鎖の切出したフリー糖鎖のMALDI/MSMALDI/MS

m/z1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800

G2F

GlcNAcGlcNAcY1

B5Y2Y3

Y4

B2

Y5

B1Y4/Y5

B)

質量情報：高感度でシンプルなスペクトルマイナー糖鎖も検出可能


m/z100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800

Man

Fuc

Man

FucB4

3

B3

B2B1Y4

B2

Y5

B1

(M+Na)+B5Y5B4

B5/Y5

Y4

B5/Y5/Y5

B3/Y5

Y3

B2

B3/Y5/Y5

Y5/Y5Y4/Y4

B5/Y5/Y4Y2B1

B5Y3

G0FのMALDI/Q-TOF構造情報：

Q-TOFモードでフラグメンテーションの確認



抗体製剤の特性解析抗体製剤の特性解析ワークフローワークフロー

- 分子量測定- 不純物分析- 糖鎖プロファイリング- 補欠分子族の確認


- ペプチドマッピング- ペプチドシークエンス- 培地由来の成分- 末端アミノ酸- 構成アミノ酸

- 修飾の確認/同定酸化・脱アミド etc

- S-S結合- 糖組成- 糖鎖構造- 糖鎖立体構造

Goal


あらゆる特性解析に対応可能

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分析項目 UPLC®分離 MS 検出器

Software Solution system

ICHガイドライン Q6B 物理的化学的特性解析の分類

インタクトマスMassPREPTM micro desalting column PrST column

SYNAPTTM BiopharmaLynxTM

MaxEntTM 16.1.2 a) 分子量・分子サイズ

6.1.1 c) 末端アミノ酸配列

抗体分析のソリューション抗体分析のソリューションまとめまとめ

抗体

製剤評価

ペプチドマッピング PST columnSYNAPTTM HDMSTM

TUV

BiopharmaLynxTM

MaxEntTM 3 BioLynxTM

DriftScopeTM

6.1.1 c) 末端アミノ酸配列6.1.1 d) ペプチドマップ6.1.1 e) スルフヒドリル基及びジスルフィド結合6.1.1 f ) 糖組成・糖鎖構造6.1.2 e) 液体クロマトグラフィパターン6.2.2 a) 切断体6.2.2 b) 切断体以外の分子変化体

アミノ酸組成AccQ・TagTM Ultra BEH C18 column SYNAPTTM EmpowerTM

MassLynxTM 6.1.1 b) アミノ酸組成

糖鎖解析GST column

SYNAPTTM HDMSTM

FLR SimGlycan* DriftScopeTM

6.1.1 f) 糖組成・糖鎖構造- MALDI/SYNAPTTM

糖組成 Amide column SYNAPTTM

FLR BioLynxTM


アグリゲーション、重合体 SEC, IEX TUV EmpowerTM, MassLynxTM 6.2.2 c) 凝集物

HCP同定nanoACQUITY 2D RP-RP TRIZAICTM

SYNAPTTM PLGS6.2.1 a) 細胞基材に由来する不純物6.2.1 b) 細胞培養液に由来する不純物6.2.1 c) 細胞培養以降の工程に由来する不純物

HCP定量 nanoACQUITY TRIZAICTM TQ VerifyE

TargetLynxTM

コンフォメーション、サブユニット- SYNAPTTM HDMSTM DriftScopeTM

6.1.2 f) 分光学的性質nanoACQUITY HDX* SYNAPTTM -

薬物動態

同定 PST column SYNAPTTM PLGS

定量 PST column TQ VerifyE

TargetLynxTM

SYNAPTSYNAPTTMTM HDMSHDMSTMTMによる核酸医薬分析による核酸医薬分析


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～60merまでのピーク分離にてQCチェックしたカラム

①①核酸医薬の核酸医薬のLC/MSLC/MS分析分析UPLCUPLC®®によるオリゴヌクレオチドの分離によるオリゴヌクレオチドの分離

ACQUITY® BEH OST C18, 50 x 2.1 mm, 1.7 µm column30-60 mer oligothymidine ladder, 0.2 mL/min


40T

0 minutes 8

50T60T

UV 260 nm

移動相：A: 15 mM TEA, 400 mM HFIP aq.B: 50% Solvent A, 50% MeOH

①核酸医薬の①核酸医薬のLC/MSLC/MS分析分析不純物分離不純物分離

合成核酸よりも短いshort-mer不純物の高いピーク分離能

核酸LC/MSのスタンダードメソッド


TIC MS

18

①①核酸医薬核酸医薬ののLC MSLC MS分析分析ProMass for MassLynxProMass for MassLynxTMTM ワークフローワークフロー

Deconvolution

-3-4 自動デコンボリューション

Deconvolution-5

charged envelope parent MW

1) MassLynxTM と ProMass間での簡易なデータのやり取り

2) バックグラウンド除去とピーク検出の全自動化


3) 設定されたシーケンスに基づくマススペクトルのピークアサイン

4) １塩基脱離の適切なアサイン

5) 結果のレポートフォーマット化

自動ピーク検出

①核酸医薬の①核酸医薬のLC MSLC MS分析分析ProMassProMass for MassLynxfor MassLynxTMTM 結果表示結果表示

検出されたピーク情報をテーブルに表示

保持時間、質量数、イオン強度、シーケンス


バッチ間の差を色分けして表示

19

分析項目 UPLC®分離 MS 検出器

Software Solution system

分子量修飾確認

OST columnHFIP/TEA（1本鎖） SYNAPTTM MaxEntTM1

ProMass

核酸分析のソリューション核酸分析のソリューションまとめまとめ

核酸

製剤評価

分子量、修飾確認OST columnAmmonium bicarbonate（２本鎖） SYNAPTTM MaxEntTM1

ProMass

配列確認

OST column SYNAPTTM MaxEntTM3 Spreadsheet*

- MALDI/SYNAPTTM

不純物解析 OST column SYNAPTTM

TUV ProMass

PEG化核酸 (MassPREPTM desalting column) SYNAPTTM HDMSTM MaxEntTM1 BiopharmLynxTM


PEG化核酸 (MassPREP desalting column) (charge stripping) BiopharmLynxDriftScopeTM

コンフォメーション、衝突断面積 - SYNAPTTM HDMSTM DriftScopeTM

薬物動態

同定 OST column SYNAPTTM ProMass

定量OST column BEH C18 1.0mm column nanoACQUITY UPLC® (TRIZAICTM)

SYNAPTTM QuanLynxTM

総括総括バイオ医薬分析のためのトータルソリューションバイオ医薬分析のためのトータルソリューション

ACQUITY UPLC®

カラムテクノロジー


SYNAPTTM G2 HDMSTM

アプリケーションマネージャXevoTM QTof MS

20

一般ポスター発表一般ポスター発表QQ--TofTofを用いたバイオ医薬品の特性解析を用いたバイオ医薬品の特性解析

1. UPLC®/MSを用いた遺伝子組換えIgGの糖鎖の定量

2 Nano UPLC®/MSを用いたIgGのペプチドマッピング2. Nano UPLC®/MSを用いたIgGのペプチドマッピング

3. イオンモビリティを用いたリガンド結合タンパクの構造変化の解析

4. UPLC®/イオンモビリティTofを用いた糖ペプチドの定性および定量的解析

5. UPLC®/MSおよびUPLC®/MSEを用いた核酸製剤の迅速な特性および配列


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ブース番号45

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