PRCTICA 5FLAVONOIDESPrctica #5DETERMINACIN DE FLAVONOIDESCortazar Murillo Elvis MarianOBJETIVOS Identificar flavonoides mediante reacciones colorimtricas en flores de algunas plantas. Identificacin de un tipo especfico de flavonoide en la flor de Bindes pilosa L. (mozote). Conocer la funcin de los reactivos a utilizar para la determinacin de flavonoides.

INTRODUCCINLos flavonoides fueron descubiertos por el premio nobel Szent-Gyrgi, quien en 1930 aisl de la cscara de limn una sustancia, la citrina, que regulaba la permeabilidad de los capilares sanguneos. Los flavonoides se denominaron en un principio vitamina P (por permeabilidad) y tambin vitamina C (porque se comprob que algunos flavonoides tenan propiedades similares a la vitamina C).El Dr. Szent-Gyrgi descubri que los flavonoides favorecen la funcin de la vitamina C, mejorando su absorcin y protegindola de la oxidacin. Los flavonoides comprenden varias clases de sustancias naturales, entre las cuales estn muchas de las que les confieren color amarillo, naranja, rojo, violeta y azul, a muchas flores, hojas y frutos, especialmente.Esta ruta resulta de dos vas biosintticas separadas, la va del cido chiqumico y la va cido malnico. Puede observarse que de manera general son molculas que tienen dos anillos bencnicos (o aromticos, para los qumicos orgnicos) unidos a travs de una cadena de tres tomos de carbono, puesto que cada anillo bencnico tiene 6 tomos de carbono, los autores los denominan simplemente como compuestos C6C3C6 (figura 1).

Figura 1. Esqueleto bsico de flavonoides. Flavonoles: X=OH; quercitina, R1=OH, R2=H; kamferol, R1=H, R2=H; myricetina, R1=OH, R2=OH. Flavonas: X=H; apigenina, R1=H, R2=H; luteolina, R1=OH, R2=H (Hertog et al, 1992).

Basados principalmente en el grado de oxidacin del puente de tres carbonos, los flavonoides son clasificados en diferentes grupos. El esqueleto de carbono bsico de un flavonoide puede tener numerosos sustituyentes (tabla 1).

Tabla 1. Caractersticas de las subclases de flavonoides.

Hasta ahora hemos visto aspectos relacionados con la estructura simple de los flavonoides, sin embargo dentro de las plantas los estudios han mostrado que estas sustancias se encuentran la mayora de las veces, ligados a molculas de carbohidratos. A este tipo de combinacin ncleo flavonoide bsico + una o varias unidades de carbohidratos, se les denomina GLICOSIDOS, y cuando no tienen ligadas molculas de carbohidratos se las denomina AGLICONAS FLAVONOIDES.

Distribucin y estado naturalLos flavonoides se encuentran ampliamente distribuidos en las plantas verdes (especialmente las angiospermas), y slo algunos pocos se han detectado en hongos y algas. Se han encontrado en las diferentes partes de las plantas, especialmente en las partes areas; y se les encuentra en forma libre (tambin llamados agliconas flavonoides), como glicsidos (la mayora de las veces), como sulfatos y algunas veces como dmeros y polmeros. Muy pocas veces se encuentran varias clases de flavonoides en un mismo tejido vegetal, sin embargo de las races de Lonchocarpus subglauscescens (leguminosas) se aislaron varias flavonas, flavonoles, isoflavonas, rotenoides, chalconas y flavanoles (Kanda et al, 1995).

Propiedades fsicasLas propiedades fsicas dependen de la clase de flavonoide considerado y su forma (libre, glicsido o sulfato). Por ejemplo las flavonas, flavonoles y auronas, debido al sistema conjugado son compuestos slidos con colores que comprenden desde el amarillo muy tenue hasta el rojo. Las antocianidinas son de colores rojo intenso, morado, violeta y azul. Las flavanonas y flavanonoles debido al carbono quiral C-2 presentan el fenmeno de la rotacin ptica. Los glicsidos son en general slidos amorfos, mientras que las agliconas y los altamente metoxilados son cristalinos. La solubilidad depende de la forma en que se encuentren y el nmero y clase de sustituyentes presentes. Los glicsidos, las antocianidinas y los sulfatos son solubles en agua y alcohol. Las agliconas flavonoides altamente hidroxiladas son solubles en alcohol (etanol, metanol y n-butanol), mientras que las poco hidroxiladas lo son en solventes como ter etlico, acetato de etilo y acetona. Las agliconas flavonoides altamente metoxiladas son solubles en solventes menos polares como el ter de petrleo y el cloroformo. Los flavonoides con hidroxilos fenlicos son solubles en soluciones alcalinas, pero algunos altamente hidroxilados se descomponen por accin de las bases fuertes, un hecho que permite reconocerlos y diferenciarlos de otros, y que hace aos se utiliz para su elucidacin estructural.

Propiedades de los flavonoidesLos flavonoides contienen en su estructura qumica un nmero variable de grupos hidroxilo fenlicos y excelentes propiedades de quelacin del hierro y otros metales de transicin, lo que les confiere una gran capacidad antioxidante (Peres, 1994). Por ello, desempean un papel esencial en la proteccin frente a los fenmenos de dao oxidativo, y tienen efectos teraputicos en un elevado nmero de patologas, incluyendo la cardiopata isqumica, la aterosclerosis o el cncer (Jang et al, 1997). Sus propiedades anti-radicales libres se dirigen fundamentalmente hacia los radicales hidroxilo y superxido, especies altamente reactivas implicadas en el inicio de la cadena de peroxidacin lipdica y se ha descrito su capacidad de modificar la sntesis de eicosanoides (con respuestas anti-prostanoide y anti-inflamatoria), de prevenir la agregacin plaquetaria (efectos antitrombticos) y de proteger a las lipoprotenas de baja densidad de la oxidacin (prevencin de la placa de ateroma) (Geleijnse et al, 2002). Adems de sus conocidos efectos antioxidantes, los flavonoides presentan otras propiedades que incluyen la estimulacin de las comunicaciones a travs de las uniones en hendidura, el impacto sobre la regulacin del crecimiento celular y la induccin de enzimas de destoxificacin tales como las monooxigenasas dependientes de citocromo P-450, entre otras (Stahl, Ale-Agha y Polidori, 2002).

FUNDAMENTOEnsayos de coloracinLos flavonoides se pueden reconocer experimentalmente mediante diferentes ensayos de coloracin. A continuacin se describen un ensayo general de reconocimiento como es el ensayo de Shinoda, y otros ensayos ms especficos para varias clases de flavonoides.

Ensayo de ShinodaLos flavonoides con el ncleo benzopirona (p. ej. flavonas, flavonoles, flavanonas, etc.) producen coloraciones rojizas cuando a sus disoluciones acuosas o alcohlicas se les adiciona magnesio seguido de HCl concentrado. Aunque no se conoce el mecanismo de esta prueba, es muy utilizada para reconocer esta clase de compuestos.

Ensayo con Zn/HClAl remplazar el Mg por el Zn en el procedimiento del ensayo de Shinoda, solamente los dihidroflavonoles (o flavononoles) producen coloraciones rojo-violetas. Las flavanonas y flavanoles no producen color o producen coloraciones rosadas dbiles.

Ensayo de PachecoEl slido flavonoide se calienta sobre una llama con unos pocos cristales de AcONa y 0.1 ml de anhdrido actico. Luego con 0.1 ml de HCl conc. Los dihidroflavonoles producen un color rojo caracterstico. Las flavonas, chalconas, auronas, flavonoles y flavanonas dan una respuesta negativa.

Ensayo del estroncio-amoniacoEste ensayo se utiliza para distinguir entre flavonas y flavonoles-3-O-sustitudos 5,6-dihidroxilados y 5-hidroxil-6-metoxilados.

Reconocimiento de antocianinasLas antocianinas se comportan como indicadores cido-base debido al proceso:A pH cido presentan coloraciones rojas, violetas y moradas; mientras que a pH alcalino presentan coloraciones verdes y azules. Con esta prueba se pueden diferenciar entre las antocianinas y las betacianinas (pigmentos nitrogenados de colores rojos y violeta de plantas del orden Centrosperma, como p. ej. Los pigmentos de la remolacha Beta vulgaris, Fam. quenopodiceas y tambin presentes en otras plantas como la Phytolacca americana, Fam. Fitolacceas).

DIAGRAMA DE FLUJO Y RESULTADOSPtalos de la flor a estudiar: mozote blanco (Bidens alba L.)Ptalos + vapores de amoniaco

Compuesto tipoRx coloracinResultado

FlavonasAmarillo+

FlavonolesAmarillo+

AntocianinasRojo intenso-

ChalconasAmarillo-rojo-

AuronaAmarillo-rojo-

En tubo de ensaye colocar: 3 gotas extracto + viruta Mg + 4 gotas HCl conc.

Compuesto tipoRx coloracinResultado

MetanolAguaClorof.ter

FlavonasNaranja+++---

FlavonoidesRojo----

FlavonolesRojo azulado----

FlavononasVerde-+++

FlavononolesVerde azulado----

Xantanos Violeta----

En tubo ensaye colocar: 3 gotas extracto + 3 gotas H2SO4

Compuesto tipoRx coloracinResultado

MetanolAguaClorof.ter

ChalconasRojo azulado----

AuronasRojo-guinda----

FlavonasAmarillo fuerte----

FlavononasNaranja o guinda+++-+++

FlavonolesAmarillo fuerte----

En tubo ensaye colocar: 2 gotas extracto + pizca Zn + 4 gotas HCl conc.

Compuesto tipoRx coloracinResultado

MetanolAguaClorof.ter

LeucoantocianidinasRojo----

CatequinasCaf amarillento----

+++: Positivo en su totalidad++: Positivo+: Positivo dudoso

OBSERVACIONESLa flor elegida fue mozote blanco (Bidens alba L.); se realiz la molienda no solo de los ptalos sino del tallo, hojas y estambre. Se ha reportado en lecturas que el mozote contiene un aproximado de 60 flavonoides (Bartolome, Villaseor y Yang, 2013), entre otros metabolitos secundarios; sin embargo no especifica en qu parte de la planta se encuentran determinados flavonoides. Se hace mencin de que la mayor cantidad de flavonoides esta en las flores y en las hojas. Imagen 2. Ptalo positivo a vapores de amoniaco: (+) a flavonas/flavonoles.

Imagen 1. Mozote blanco

Imagen 4. Prueba con H2SO4; de izq a der: metanol, ter, agua y cloroformo. (+++) a flavononas en metanol; (+) a flavonas en ter; (++) a flavononas en agua.

Imagen 3. Prueba de Shinoda; de izq a der: metanol, ter, agua y cloroformo. (+++) a flavonas y (+) a flavononas.

Imagen 5. Negativo a virutas de Zn y HCl

Como se puede observar en los resultados obtenidos, los flavonoides contenidos en la planta mozote blanco fueron flavonas y flavanonas:

En la reaccin de Shinoda, el magnesio metlico es oxidado por el HCl concentrado, dando como productos al H2, que es eliminado en forma de gas y el MgCl2, que es el que forma complejos con los flavonoides dando coloraciones caractersticas. El magnesio divalente intensifica la coloracin por estar doblemente coordinado (imagen 3). La mayora de los flavonoides cumplen con las mismas funciones; la bsqueda de la importancia de los diferentes flavonoides ha surgido en estos aos. La solubilidad en metanol puede deberse a la presencia agliconas flavonoides altamente hidroxiladas (solubles en alcohol), las poco hidroxiladas lo son en solventes como ter etlico; las agliconas flavonoides altamente metoxiladas son solubles en solventes menos polares como cloroformo.

CONCLUSIONESSe cumple con el objetivo de la identificar algunos flavonoides presentes en la planta mozote blanco; para una identificacin ms precisa de los flavonoides, se hubiese descartado los dems rganos de las plantas y trabajar nicamente con los ptalos. Algunos mecanismos de los reactivos a utilizar no estn del todo claros; sin embargo la versatilidad de los radicales que tiene la estructura del flavonoide le permite reaccionar de distinta manera ante las soluciones cidas y bsicas.

ACTIVIDADES COMPLEMENTARIAS1. Describe la ruta biosinttica de los flavonoides:Los flavonoides son metabolitos secundarios vegetales de origen biosinttico mixto: el anillo A proviene de la ruta de la malonilcoenzima A y el anillo B y la cadena C3 provienen de la ruta del cido shikmico. Un trictido se cicliza y se condensa con una molcula de cido p-cumrico. La enolizacin del ciclo proveniente de la ruta de la malonilCoA da origen al anillo aromtico A en las chalconas y flavanonas. Estas a su vez son los precursores de las dems clases de flavonoides. Es importante recalcar que este proceso de biosntesis sustenta el hecho de que en la mayora de flavonoides el anillo A sea meta-oxigenado, es decir como es caracterstico de los anillos aromticos originados por la va de la malonilCoA; y por otro lado, el anillo B proveniente de la ruta del cido shikmico, generalmente es orto-oxigenado.

(Martnez A, 2005)

2. Cul es la importancia de los flavonoides y sus aplicaciones en la industria farmacutica y de alimentos?Los flavonoides contienen en su estructura qumica un nmero variable de grupos hidroxilo fenlicos y excelentes propiedades de quelacin del hierro y otros metales de transicin, lo que les confiere una gran capacidad antioxidante. Por ello, desempean un papel esencial en la proteccin frente a los fenmenos de dao oxidativo, y tienen efectos teraputicos en un elevado nmero de patologas, incluyendo la cardiopata isqumica, la aterosclerosis o el cncer. Sus propiedades anti-radicales libres se dirigen fundamentalmente hacia los radicales hidroxilo y superxido, especies altamente reactivas implicadas en el inicio de la cadena de peroxidacin lipdica y se ha descrito su capacidad de modificar la sntesis de eicosanoides (con respuestas anti-prostanoide y anti-inflamatoria), de prevenir la agregacin plaquetaria (efectos antitrombticos) y de proteger a las lipoprotenas de baja densidad de la oxidacin (prevencin de la placa de ateroma). Funciones de los flavonoides: protegen contra el cncer, previenen los ataques cerebrales, frenan el proceso degenerativo de la arteriosclerosis, tienen efecto cardioprotector (inhiben la oxidacin de la lipoprotenas y la agregacin plaquetaria)regulan la presin arterial, potencian la accin de la vitamina C, son antiinflamatorios y tienen accin antialrgica, son diurticos.Los flavonoides son apropiados como agentes antisolares debido a que tienen una alta absorbancia UV y a que no son txicos. La mayor parte de la radiacin UV que alcanza la tierra est entre 320 y 400 nm (UV-A) y aunque la radiacin entre 290-320 nm (UV-B) es mucho menor, su nivel de energa es mucho mayor y causa quemaduras, daos en las clulas y cncer de piel. Las flavanonas bloquean la UV-B y las flavonas son filtros particularmente efectivos para la UV-A. Los steres de flavonoides tienen aplicaciones como descongestionantes, agentes de tratamiento de piel sensible, agentes de fortalecimiento de capilares sanguneos y agentes anti envejecimiento. Las esterasas presentes en los tejidos celulares (particularmente la epidermis), rompen los steres y regeneran los flavonoides iniciales, lo que permite que tengan su capacidad antioxidante inicial. Esto los hace especialmente tiles en humectantes y cosmticos.

3. Cul es la caracterstica de los flavonoides, que les hace reaccionar con cidos y bases?Basados en el grado de oxidacin del puente de tres carbonos, los flavonoides son clasificados en diferentes grupos. El esqueleto carbono bsico de un flavonol puede tener numerosos sustituyentes. Las propiedades cido-base muestran que los radicales flavonoides son neutros en un medio cido (por debajo de pH 3) y con una carga negativa a pH 7. Las repercusiones de la carga negativa son sumamente importantes en la evaluacin del potencial antioxidante de los flavonoides. Primero, el radical cargado negativamente no es probable que pase a travs de la membrana celular con carga negativa. Segundo, la reaccin de los radicales flavonoides con la vitamina E, que es termodinmicamente factible para algunos radicales flavonoides, tiene un obstculo adicional a causa de la repulsin electrosttica entre el anin del radical flavonoide y la membrana fosfolipdica cargada negativamente, donde la vitamina E se incrusta. Tercero, la oxidacin de un solo electrn de los flavonoides por cualquier oxidante tendr una barrera entrpica, porque por lo menos dos protones se intercambian en la reaccin. Los protones pueden intercambiarse entre los reactantes o con el solvente en el estado de transicin.

4. Si tuviera que purificar flavonoides, qu solventes utilizara y por qu?La solubilidad depende de la forma en que se encuentren y el nmero y clase de sustituyentes presentes. Los glicsidos, las antocianidinas y los sulfatos son solubles en agua y alcohol. Las agliconas flavonoides altamente hidroxiladas son solubles en alcohol (etanol, metanol y n-butanol), mientras que las poco hidroxiladas lo son en solventes como ter etlico, acetato de etilo y acetona. Las agliconas flavonoides altamente metoxiladas son solubles en solventes menos polares como el ter de petrleo y el cloroformo. Los flavonoides con hidroxilos fenlicos son solubles en soluciones alcalinas, pero algunos altamente hidroxilados se descomponen por accin de las bases fuertes, un hecho que permite reconocerlos y diferenciarlos de otros.

5. Realizar un cuadro de los resultados obtenidos y concluye interpretndolos.Revisar resultados y conclusin.

BIBLIOGRAFABartolome, P., Villaseor, I., Yang, WC. 2013. Bidens pilosa L. (Asteraceae): Botanical Properties, Traditional Uses, Phytochemistry, and Pharmacology. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. ID 340215, 51 pp.Geleijnse JM, Launer LJ, Van der Kuip DA, Hofman A y Witteman JC.: Inverse association of tea and flavonoid intakes with incident myocardial infarction: the Rotterdam study. Am J Clin Nutr, 2002, 75:880-886.Hertog, G.L., Hollmna, C.H., Venema, P. 1992. Optimization of a quantitative HPLC determination of potentially anticarcinogenic flavonoids in vetetables and fruits.J. Agric. Food Chem. 40:1591-1598.Jang M, Cai L, Udeani GO y cols.: Cancer chemopreventive activity of resveratrol, a natural product derived from grapes. Science, 1997, 275:218-221Kanda, N. y col.; J. CHEM. EDUC. 72 (12) 1131 (1995).Martnez, A. 2005. Flavonoides. Fac. Qumica Farmacutica. Universidad de Antioqua, Medelln.Peres W: Radicais Livres em nveis biolgicos. Ed. Universidade Catlica de Pelotas, Brasil, 1994, 49-81.Stahl W, Ale-Agha N y Polidori MC: Non-antioxidant properties of carotenoids. Biol Chem, 2002, 383:553-558LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA