Mémoire présenté en vue de l’obtention du diplôme de

MAGISTER

En Gestion des Ressources Aquatiques

LABORATOIRE D’AQUACULTURE ET DE BIOREMEDIATION

(AQUABIOR)

Thème :

Présenté par:

Lablack Monya

Devant la commission du jury :

Président : Pr SLIMANI Miloud Professeur à l’université d’Oran (Es-Sénia).

Examinateur : Dr KERFOUF Sid Ahmed Maître de conférences à l’université de Sidi Bel-Abbès.

Examinateur : D

r ABI AYAD S-M-El-Amine Maître de conférences à l’université d’Oran (Es-Sénia).

Promoteur : Dr BABA HAMED Mohamed Bey Maître de conférences à l’université d’Oran (Es-Sénia).

Année universitaire : 2011 - 2012

Faculté des Sciences

Département de Biotechnologie

Extraction et purification du collagène à partir de la peau et des

écailles du tilapia du Nil adulte (Oreochromis niloticus)

(Linnaeus, 1758)

Remerciements J’exprime d’abord mes profonds remerciements à mon DIEU qui m’a donné le

courage et la volonté d’achever ce travail.

Mes remerciements s’adressent particulièrement :

Au Pr SLIMANI Miloud, Je tiens à lui exprimer mes sincères remerciements pour

avoir accepter de présider ce jury de mémoire.

Au Dr ABI-AYAD S-M-E-M, pour m’avoir accueilli au sein de son laboratoire,

accepté d’examiner ce travail et pour le soutien scientifique et moral qu’il n’a cessé de me

prodiguer. J’ai été particulièrement touchée par sa rigueur scientifique et l’attention qu’il m’a

accordé malgré ses multiples obligations.

Au Dr KARFOUF Ahmed qui a accepté d’évaluer et de juger ce manuscrit en qualité

de rapporteur. Je tiens à lui exprimer ma profonde gratitude.

J'adresse mes plus sincères remerciements à Monsieur BABA HAMED Mohamed Bey

pour l'appui technique et les encouragements qu'il m'a apporté tout au long de mes travaux,

pour ses précieux conseils et l'aide qu'il m'a prodigué dans la préparation de ce travail. Je le

remercie chaleureusement pour m'avoir toujours offert des conditions de travail favorables.

Au Dr ALI MEHIDI Smail je le remercie de m'avoir proposé son aide durant ces

années ainsi que pour son soutien, sa disponibilité et ses multiples interventions tout au long

de ce mémoire.

J'exprime ma reconnaissance aux Dr LAMARA Sid Ahmed, Dr BEN SAHLA TALET

Ahmed et Dr DRICI Habiba pour avoir toujours prêtés attention à mes sollicitations et pour

leurs multiples connaissances, et tout simplement leur sympathie.

Je tiens également à remercier les membres du laboratoire d’Aquaculture et de

Bioremediation (AQUABIOR) à qui j’adresse mes sincères remerciements pour leurs

échanges scientifiques stimulants et leur soutien moral.

Dédicace

Je dédie ce travail tendrement à une personne que je n’oublierai jamais ma très chère défunte tante Hebiba que Dieu tout puissant ai pitié de son âme.

A mes parents, ou ’ils trouvent ici toute ma gratitude pour leur

soutien tout au long de mes études A ma très chère grand-mère que Dieu la protège. A mes sœurs, mon frère, mes beaux frères, mes nièces et mes neveux

que Dieu les bénisses. A toute ma famille et mes amies.

Index des abréviations

Aa

AFM

ASC

Cell Nk

ESB

FACITs

FMD

IFN-y

MEC

MMPs

PDGF

PGs

SEM

TEM

TGF

Th1

TIMP

TNF- α

TSE

: Acide aminé

: Atomic Force Microscopy

: Acide Soluble Collagen

: Cell Natural Killer

: Encéphalopathie Spongiforme Bovine

: Fibril-Associated Collagen with Interrupted Triple helixes

: Food Mouth Disease

: Interféron -y

: Matrice extracellulaire

: Matrix-MetalloProteinases

: Platelet-Derived Growth Factor

: Protéoglycanes

: Scanning Electron Microscope

: Transmission Electron Microscopy

: Transforming Growth Factor

1. : T Helper 1

: Tissue Inhibition of MMP

2. : Tumor Necrosis Factor α

: Transmissible Spongiforme Encéphalopathie

Index des Figures

Figure 1 :

Figure 2 :

Figure 3 :

Figure 4 :

Figure 5 :

Figure 6 :

Figure 7 :

Figure 8 :

Figure 9 :

Figure 10 :

Figure 11 :

Figure 12 :

Figure 13 :

Figure 14 :

Figure 15 :

Figure 16 :

Figure 17 :

Figure 18 :

Figure 19 :

Figure 20 :

Ultrastructure des matrices extracellulaires et composition en

macromolécules de différents tissus…………….……………………..........

Schématisation d'une molécule de collagène. Les trois chaînes α

constitutives sont supposées différentes et elles sont figurées avec des

couleurs différentes ……………………...………………………………....

Structure des trois acides amines majoritaires : Gly , Pro et Hyp de la triple

hélice du collagène …………………….. ………………………….............

Section transverse (A ;B) et longitudinale (C ;D) de la triple hélice de

collagène (trois chaînes α) (A ;C) et d’une triple hélice composée de trois

hélices α (B ;D) tracées à la même échelle ………………………….….....

Projection simplifiée de la disposition des atomes …………………………

Structure quaternaire de la triple hélice du collagène………………………..

Représentation schématique, des gènes codants pour les chaînes α1 et α2

du collagène de type I ……………………………………..………………..

Processus d’assemblage des fibrilles de collagène…………………

Organisation des fibrilles dans différents organes....................................

Formation des membranes basales à partir du collagène IV ……………...

Les sous-produits de poisson………………………………………………..

Taux de production de sous-produit par activité (A) et par espèce (B) ……

Tilapia du Nil (Oreochromis niloticus) ……………………..………….…..

Morphologie externe d’Oreochromis niloticus ……………………...……..

Schéma représentant Oreochromis niloticus adulte avec barres noires

verticales typiques sur la nageoire caudale ……………..…………….……

Schéma représentant la tête d’Oreochromis niloticus avec premier arc

branchial découvert (18 et 4 branchiospines respectivement sur partie

inférieure et supérieure) …………………………………………………….

Caractéristiques morphologiques spécifiques d’Oreochromis niloticus …...

Répartition géographique d’O. niloticus et principales zones d’élevage et

d’importation de l’espèce …………………………………………………..

Principales productions piscicoles mondiales …………….………………..

Mode de prélèvements d’échantillons d’écailles (A) et de peau (B) du

tilapia du Nil (Oreochromis noliticus) …………………….……….............

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Figure 21 :

Figure 22 :

Figure 23 :

Figure 24 :

Figure 25 :

Figure 26 :

Figure 27 :

Figure 28 :

Figure 29 :

Figure 30 :

Figure 31 :

Observation microscopique de la peau d’oreochromis niloticus à partir

d’une coloration bichromique …………………….......................................

Observation microscopique de la peau d’oreochromis niloticus à partir

d’une coloration de Van Gieson …………………..………………………..

Rendement d’ASC à partir de la peau et des écailles du tilapia du Nil

(Oreochromis niloticus)……………………………………………………

Spectre d’absorption en UV d’ASC à partir de la peau d’Oreochromis

niloticus………………………………………………………………………………

Spectre d’absorption en UV d’ASC à partir des écailles d’Oreochromis

niloticus………………………………………………………………………………

Courbe de la gamme étalon selon la méthode de Bradford ……...…………

Solubilité d’ASC de la peau d’Oreochromis niloticus dans l’acide

acétique à 0,5 M à différents niveaux de pH……………………………….

Solubilité d’ASC des écailles d’Oreochromis niloticus dans l’acide

acétique à 0,5 M à différents niveaux de pH………………………………..

Solubilité d’ASC de la peau d’Oreochromis niloticus dans l’acide

acétique à 0,5 M à différentes concentrations de NaCl…………………..

Solubilité d’ASC des écailles d’Oreochromis niloticus dans l’acide

acétique à 0,5 M à différentes concentrations de NaCl…………………….

Analyse d’ASC du tilapia du Nil (Oreochromis niloticus) par SDS-PAGE..

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Index des Tableaux

Tableau 1 :

Tableau 2 :

Tableau 3 :

Tableau 4 :

Tableau 5 :

Tableau 6:

Tableau 7 :

Tableau 8 :

Des différents groupes de collagène ………………………………….

Composition en acides aminés des chaines de types α1, α2 et α3

constituantes du collagène de la peau de morue ………………………

Composition du Bouin liquide …………………..…………………….

Présentation des différentes étapes de déshydratation et inclusion …….

Présentation des différentes étapes de coloration à l’hématoxyline et

l’éosine ….…………….………………………………………………..

Préparation la solution de Van Gieson………………………………….

Composition des gels d’électrophorèse…………………………………

Composition du tampon de solubilisation ……………………………...

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Résumé

Le collagène acido-soluble, acid-solubilised collagen (ASC), est extrait à partir d’un

homogénat de peau et d’écailles de tilapia du Nil (Oreochromis niloticus).

L’histologie de la peau du tilapia du Nil a montré que les fibres de collagène sont

présentes au niveau de la couche dermique. La peau semble plus riche en collagène qui

représente 19,53 % du poids sec alors qu’il n’est que de 4 % au niveau des écailles.

Le spectre d'absorption à l’ultraviolet de cette molécule extraite des deux fractions,

présente un maximum d’absorption à 210 nm, ce qui pourrait suggérer de la similarité des

deux molécules extraite et de la pureté des extraits.

L’influence du pH sur la solubilité donne un maximum de solubilité à pH 2 pour le

collagène de la peau et pH 3 pour le collagène des écailles, alors qu’une précipitation est

observée à pH 8 pour le collagène de la peau et pH 9 pour le collagène des écailles. Une

diminution de solubilité est observée en présence de NaCl à 2 % et 1 % respectivement pour

le collagène de la peau et des écailles.

L’étude en PAGE-SDS des deux extraits d’ASC, suggère la présence de collagène

de type I vue la présence de deux chaines (α 1 et α 2) et d’une sous-unités β.

Mots clés : Collagène, Oreochromis niloticus, tilapia du Nil, extraction du collagène,

collagène acido-soluble (ASC), solubilité.

Abstract

The acid-solubilised collagen (ASC) was extracted from a homogenate of skin and

scales of Nile tilapia (Oreochromis niloticus).

The histology of the skin of Nile tilapia showed that the collagen fibers are present in

the dermal layer. The skin looks rich in collagen, which represents 19.53 % of dry weight that

is only 4 % at the scales.

The ultraviolet absorption spectrum of this molecule extracted from both fractions has

a maximum absorption at 210 nm, which could suggest the similarity of two molecules

extracted and the purity of the extracts.

The influence of pH on the solubility gives a maximum solubility at pH 2 for the

collagen in the skin and pH 3 for collagen scales, whereas precipitation was observed at pH 8

for collagen in the skin and pH 9 for collagen scales. A decrease in solubility was observed in

the presence of 2 % NaCl and 1 % respectively for collagen in the skin and scales

respectively.

The study by SDS-PAGE of both extracts of ASC, suggesting the presence of collagen

type I for the presence of two chains (α 1 and α 2) and a β subunit.

Keywords: Collagen, Oreochromis niloticus, Nil tilapia, collagen extraction, acid-solubilised

collagen (ASC), solubility.

ملخص

Acid-solubilised collagenوجهيضيت يستخهض انكىالجيه انقببم نهزوببن في انىسط انحمضي و انمسمً ببال

(ASC) مه خهيط نجهذ وحشاشف انسمك انبهطي انىيهيOreochromis niloticus.

يبذو انجهذ .انطبقت انجهذيت ة عهً مستىيمىجىدانكىالجيه أنيبف أننهجهذ انبهطي انىيهي أظهش انتشكيب انىسيجي

.٪ عهً مستىي انحشاشف 6جبف نهجهذ بيىمب ال يمثم إال ٪ مه انىصن ان 35,75غىيب ببنكىالجيه إر اوه يمثم

يظهش رسوة ( انجهذ و انحشاشف)إن طيف االمتصبص نألشعت فىق انبىفسجيت نهزا انجضئ انمستخهض مه انعيىتيه

.ممب يفتشض وجىد تشببه بيه انجضيئيه انمستخهصيه و وقبء انمستخهصبث, وبوىمتش 432عىذ القصوى

( pH)ضت عهً انزوببن يعطي أقصً قببهيت نزوببن كىالجيه انجهذ عىذ أط هيذسوجيىي إن تبتيش دسجت انحمى

8بيىمب شىهذ تشسب نكىالجيه انجهذ عىذ أط هيذسوجيىي قيمته , نكىالجيه انحشاشف 5و أط هيذسوجيىي قيمته 4قيمته

جيه انجهذ وانحشاشف نىحظ في االوخفبض في قببهيت روببن كىالإن . نكىالجيه انحشاشف 5وعىذ أط هيذسوجيىي قيمته

.٪ عهً انتىاني 3و 4بتشكيض ( NaCl) كهىسيذ انصىديىووجىد

بىني أكشيالميذ نكهتب انمستخهصيه بىاسطت تقىيت ( ASC) انكىالجيه انقببم نهزوببن في انىسط انحمضيإن دساست

( 3α ,4α)ا نتكىوه مه سهسهتيه وظش( type I)انكىالجيه مه قذ أظهشث وجىد انىىع األول SDS-PAGEهالو إستششاد

.βو وحذة فشعيت

انكىالجيه انقببم نهزوببن في انىسط , انكىالجيهاستخالص , سمك انبهطي انىيهي, انكىالجيه :الكلمات المفتاحية

. انزوببن, (ASC)انحمضي

TABLE DES MATIERES

INTRODUCTION…………………………………………………………………….…. 1

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE……………………………………………………….... 3

1. La molécule de collagène.…………………………………………............... 3

1.1. Généralités sur la matrice extracellulaire (MEC)………..…………... 3

1.2. Définition du collagène.………………...............................................

1.3. Rôle du collagène.……………………………………………………...

1.4. Classification et types de collagènes.……………………………..….

1.5. Structure du collagène ………….……………………………………

1.5.1. Structure primaire…...…………………………………………

1.5.2. Structure secondaire...…………………………………………

1.5.3. Structure tertiaire………………………………………………

1.5.4. Structure quaternaire...…………………………………………

1.6. Synthèse du collagène..………………………………………………

1.7. Assemblage du collagène.……………………………………………

1.8. Organisation macromoléculaire des collagènes...……………………

1.9. Dégradation du collagène………….…………………………………

1.10. Régulation de la production du collagène.………………………….

1.11. Solubilité du collagène...……………………………………………

1.12. Anomalies du collagène : Origine de plusieurs maladies.…………..

1.13. Transformation du collagène en gélatine……………………………

1.14. Utilisations du collagène.…………………………………………...

1.15. Origines du collagène industriel.…………………………………..

1.16. Collagène et poissons….……………………………………………

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2. La présentation de l’espèce………………….………………...…………...... 28

2.1. Position systématique et taxonomique……………………………….

2.2. Caractéristiques morphologiques...…..……………………………….

2.3. Répartition géographique.…………………………………………….

2.4. Exigences écologiques de l’espèce...………………………………….

2.5. Intérêt économique et importance halieutique………..………………

2.6. Nutrition et croissance ………..………………………………………

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MATERIEL ET METHODES………….……………………………………………..... 35

1. Matériel biologique………………………………………………………….... 35

2. Préparation des coupes…………………………………………………….......

2.1. Technique de préparation…………………………...………………...

2.1.1. Fixation…………………………………………………………

2.1.2. Déshydratation………………………………………………….

2.1.3. Eclaircissement………………………………………................

2.1.4. Inclusion dans la paraffine……………………………………...

2.1.5. Enrobage et mise en blocs………………………………….…..

2.1.6. Réalisation des coupes au microtome………………………..…

2.2. Coloration des coupes………………………………………………...

2.2.1. Coloration bichromique….……………………………………..

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2.2.2. Coloration de Van Gieson………………………………………

2.3 Obtention des photos……….…………………...……………….…….

3. Extraction du collagène……………..……………………................................

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4. Etude physico-chimique du collagène ……………………………………....... 39

4.1. Mesure du spectre d’absorption ……………………............................

4.2. Détermination de la solubilité du collagène…………………………..

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4.2.1 Effet du pH sur la solubilité du collagène………………………

4.2.2 Effet de la concentration de NaCl sur la solubilité du collagène.

4.3 Dosage des protéines …………………………………………………

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5. Analyse du collagène par électrophorèse (PAGE-SDS)…………………........

5.1. Préparation des gels…………………………………………………...

5.2. Solubilisation des échantillons et migration…………………………..

5.3. Coloration des gels……………………………………………………

5.4. Décoloration des gels………………………………………………….

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RESULTATS ET DISCUSSION ……..……..………………………………..………... 42

1. Etude histologique…………………...………………………………………...

2. Extraction du collagène………………………………………………………..

3. Etude physico-chimique du collagène…….………………………………......

3.1. Spectre d’absorption en UV du collagène………………………………..

3.2.Détermination de la solubilité du collagène……..………..……………….

3.2.1. Effet du pH sur la solubilité du collagène…………………………...

3.2.2. Effet de la concentration de NaCl sur la solubilité du collagène …...

4. Analyse du collagène par électrophorèse (PAGE-SDS)……………………….

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CONCLUSION ………………………………………………………………………….. 51

REFERENCES BIBLIOGRAPIQUES………………………………………………… 52

INTRODUCTION

1

Introduction

Le collagène est la protéine la plus abondante chez les vertébrés. Il représente environ

30 % des protéines totales. Le collagène est un composant majeur du tissu conjonctif, la peau,

les muscles, les dents, les os, le tendon, le cartilage et les vaisseaux sanguins. Comme

protéine fibreuse, il joue un rôle principal en assurant la cohésion, l’élasticité et la

régénération de tous ces tissus.

En raison de ses bonnes propriétés biologiques et fonctionnelles, le collagène est d’un

intérêt primordial dans les utilisations biomédicales, pharmaceutiques, cosmétiques et

agroalimentaires.

Les principales sources de collagène sont limitées à ceux des animaux terrestres, tels

que la peau et les os des bovins, et des porcins. Ces dernières années, la crise de la fièvre

aphteuse (FMD), la manifestation d’encéphalopathie spongiforme bovine (ESB) et la grippe

aviaire ont causé des restrictions au commerce de collagène (Helcke, 2000). Il est intéressant

de chercher des sources plus sûres de collagène provenant des animaux marins (les poissons,

les méduses, spongiaires et calmar) et ceux vivant dans des régions haute et froides sans

pollution environnementale (Kołodziejska et al., 1999 ; Nagai et al., 2000 ; Swatschek et al.,

2002 ; Sadowska et al., 2003 ).

Par conséquent, de nombreux scientifiques se sont attelés à produire du collagène à

partir d’animaux marins (Nagai & Suzuki, 2000b ; Nagai et al., 2002 ; Ogawa et al., 2003 ;

Jongjareonrak et al., 2005). Les déchets de poissons tels les peaux, les os et les écailles sont

riches en collagène. Récemment, les propriétés biochimiques du collagène extrait des poisons

tambour noir (Pogonias cromis), rondeau mouton (Archosargus probatocephalus) (Ogawa et

al., 2004) et vivaneau à lignes jaunes ou jaunet (Lutjanus vitta) (Jongjareonrak et al., 2005),

ont été caractérisés

Cependant, peu d'informations concernent les caractéristiques du collagène de la peau

et des écailles du tilapia du Nil (Oreochromis niloticus). Le tilapia du Nil est un poisson d'eau

douce, largement cultivé et consommé au monde. Il est le troisième groupe le plus important

de poissons cultivés après les cyprinidés et les salmonidés.

En raison de l’abondance du tilapia du Nil (Oreochromis niloticus) dans l’industrie de

pêche, une quantité importante de peau, d’écailles, d’os et des têtes sont rejetés pour

n’exploiter que les filets. La conversion d’une telle perte en produits à forte valeur ajoutée tel

2

le collagène serait d’un grand apport économique et une alternative au remplacement du

collagène des mammifères terrestres (Shao-kui et al., 2009).

L’objectif de ce travail est d’estimer la quantité de collagène présente dans la peau et

les écailles du tilapia du Nil et ce en adaptant une méthode optimale d’extraction et de

déterminer ses propriétés physico-chimiques.

ETUDE

BIBLIOGRAPHIQUE

3

1. La molécule de collagène:

1.1. Généralités sur la matrice extracellulaire (MEC) :

La matrice extracellulaire (MEC) regroupe tous les éléments qui entourent les cellules

chez les organismes pluricellulaires (Bataller & Brenner, 2005). Elle est principalement

composée de molécules de collagène et d’élastine qui lui confèrent respectivement ses propriétés

de rigidité et d’élasticité, mais aussi d’autres molécules comme la fibrilline, la fibronectine, la

laminine ou encore les protéoglycanes (PGs) qui servent de renfort aux deux premières

protéines, mais aussi à créer des liens entre les cellules (Strupler, 2008). Cette MEC est donc

un ensemble de molécules en réseau dont la synthèse assure à la fois la cohérence d'un tissu et

la transmission de nombreux messages intercellulaires (Plauchu et al., 1997).

Les cellules du tissu conjonctif baignent dans un milieu très riche en eau contenant de

petites molécules dissoutes (sels minéraux, sucres, polypeptides) et de volumineuses

macromolécules protéiques. Certaines s’organisent en fibres facilement visibles en

microscopie photonique, alors que d’autres sont trop fines pour être observées.

Les macromolécules se divisent en deux grands groupes :

- Les fibrillaires avec les collagènes, l’élastine et les fibrillines.

- Les non-fibrillaires avec les protéoglycanes anioniques (non sulfatés) comme le hyaluroane,

les sulfatés comme le chondroïtine-sulfate, le kératane-sulfate et l’héparane-sulfate.

Outre l’aspect structural de ciment cellulaire, les MEC jouent un rôle actif dans

l’interaction des cellules entre elles. Elles servent à stocker les protéines et les facteurs de

croissance qui seraient libérés en cas de besoin (Taipale & Keski-Oja, 1997) ou encore à guider

des cellules mobiles (Condeelis & Segall, 2003). C’est grâce à cette trame de connexions que

se réalise la vie cellulaire (adhérence, morphogenèse, apoptose…) et que se forgent les

caractéristiques tissulaires (solidité, souplesse, transparence). Il est nécessaire de constater à

quel point des tissus aux propriétés aussi différentes que l’os, la peau, la cornée ou encore les

tendons sont structurés à partir des mêmes matériaux de base et notamment à partir des

collagènes (Fichard et al., 2003) (figure 1).

4

Figure 1 : Ultrastructure des matrices extracellulaires et composition en macromolécules de

différents tissus (Fichard et al., 2003).

Cependant c’est l’organisation de réseau de collagène qui détermine la fonction et la

spécificité du tissu. Ainsi la cornée, où les fibres s’agencent en un contre-plaqué extrêmement

régulier, permet la transparence de ce tissu. La peau, où les fibres de collagènes, de section

hétérogène, ne présentent aucune direction privilégiée, caractéristiques garantes de la

cohésion de ce tissu particulièrement élastique et déformable. Dans le tendon, les faisceaux de

fibres sont parallèles les uns aux autres, formant de solides câbles capables de résister aux

forces de tensions considérables que subit ce tissu (Andrikopoulos et al., 1995 ; Danielson et

al., 1997 ; Kyriakides et al ., 1998 ; Mao & Bristow, 2001).

Dans notre étude bibliographique, nous nous intéressons au collagène qui est le

composant majeur de la matrice extracellulaire. Nous nous focalisons sur ses caractéristiques

structurales, mécanistiques et leurs rôles biologiques et biochimiques ainsi que leurs

applications dans différents domaines.

1.2. Définition du collagène :

Le terme « collagène » est à l’origine, un néologisme de la langue française de colle et

gène qui engendre la cohésion, utilisé au cours du XIXe siècle par les histologistes pour la

description de la substance fondamentale des tissus conjonctifs (van Der Rest & Garrone,

1991).

5

Le collagène est une glycoprotéine fibreuse insoluble qui constitue un groupe à part

entière parmi les macromolécules structurales de la matrice extracellulaire et du tissu

conjonctif. C'est la protéine la plus abondante du règne animal et plus remarquée chez les

vertébrés (Darnell et al., 1990). Le collagène représente 80 % du poids des tissus conjonctifs

et 30 % des protéines de l’organisme. On le trouve pratiquement dans tous les tissus (la peau,

les tendons, les cartilages, les os, les dents, les membranes, la cornée et les vaisseaux de tous

les vertébrés), permettant ainsi leur cohésion, leur élasticité et leur régénération. Il sert

principalement à titre de soutien, de remplissage, d’attache, d’isolant, de protection ou encore

de transport dans le cas du système sanguin. Le collagène forme des fibres qui résistent à

l'étirement et a la particularité d'être aussi résistant que l'acier (une fibre de 1 mm de diamètre

peut supporter 10 kg) (http://cosmeticshomemadecolchique.wordpress. com /2011/01/11/le-

collagene/).

Les fibres de collagène sont très bien identifiables au microscope d´après leurs rayures

transversales, leur coloration histologique, leur capacité de gonflement et de contraction

soudaine qu´elles subissent à une température de 60 °C. A cette température, une partie du

collagène se dissous dans l´eau pour devenir gélatine ou matière visqueuse (Blažej et al., 1984

; Stančíková et al., 1999 ; Birk & Bruckner, 2005).

1.3. Rôle du collagène :

Le collagène présente une double fonction biologique. D’une part, avec l’élastine et

les glycoprotéines, il est responsable de la cohésion des tissus et des organes. D’autre part, le

collagène confère des propriétés d’hydratation, de résistance, d’élasticité, de souplesse et de

l’intégrité des organes. Par exemple dans le scorbut, où une carence en vitamine C

empêche la formation de la triple hélice de collagène, la gaine de collagène qui entoure les

vaisseaux sanguins est fragilisée et entraine de nombreuses hémorragies. Le collagène est

aussi essentiel dans la cicatrisation puisque la baisse de tension sur les fibres de collagène lors

d’une coupure est un signal d’activation des fibroblastes (cellules spécialisées dans la synthèse

des protéines de la matrice extracellulaire) qui vont ensuite synthétiser des fibres jusqu’à

rétablir cette tension tissulaire et refermer la plaie (Grinnell, 1994 ; Tomasek et al., 2002).

1.4. Classification et types de collagènes :

Il existe différentes familles de molécules de collagènes, qui possèdent différentes

structures moléculaires, différentes organisations macromoléculaires et différentes fonctions

(tableau 1). On compte jusqu’à présent 23 types de collagènes, numérotés de I à XXIII,

6

assemblés à partir de 41 chaînes α génétiquement distinctes (Ricard-Blum & Ruggiero, 2005).

Leur point commun est la présence d’un domaine en triple hélice qui leur donne un caractère

inextensible et leur permet de résister à la traction (Van Der Rest, 1991).

Tableau 1 : Les différents groupes de collagène.

Type et structure Distribution dans les tissus Caractéristiques

Fonction

Collagènes fibrillaires

I [α1(I)]2α2(I)

I [α1(I)]3

II [α1 (II)]3

III [α1(I I I)]3

V α1(V), α2(V), α3(V)

XI α1(XI), α2(XI), α3(XI)

Os, derme, tendons, ligaments, cornée ...

Derme, dentine

Cartilage, humeur vitrée, nucleus pulposus

Derme, paroi des vaisseaux, intestin

Poumons, cornée, os

Cartilage, corps vitré, nucleus pulpopsus

Le type le plus abondant

Forme mineure

Majoritaire dans le cartilage

Souvent associé au type I

Peut s’associer au type I

Associé au type II

Résistance

à

l’étirement

Collagènes des membranes

basales

IV [α1(IV)]2α1−6(IV)

Membrane basale

Forme des réseaux 2D

support

Collagènes microfibrillaires

VI α1(VI), α2(VI), α3(VI)

Derme, cartilage, placenta, poumon, paroi

des vaisseaux

s’organise en fibrilles formant

un collier de perles

Liaisons

entre les

molécules

Fibrilles d’ancrage

VII [α1 (VII)]3

Peau, jonction dermo-épidermique,

muqueuse orale, cervix, membrane foétale

Réseaux hexagonaux

VIII

X

Vaisseaux (endothélium), cornée

Cartilage, plaque de croissance

support

FACIT

IX

XII

XIV

XIX, XX, XXI

Cartilage

Tendons, ligaments

Peau, tendons

Liaisons

entre

molécules

Collagènes tansmembranaires

XIII,

XVII

Cœur, vaisseaux

Liaisons à

la cellule

Multiplexines

XV, XVI

XVIII

Rétine, iris

Liaisons à

la cellule

(Ricard-Blum & Ruggiero, 2005)

7

1.5. Structure du collagène :

Les collagènes forment une très grande superfamille dont la définition est maintenant

biochimique : chaque molécule de collagène est constituée de l’assemblage de trois chaînes

polypeptidiques hélicoïdales (figure 2), appelées chaînes α, qui sont enroulées entre elles

pour former une triple hélice (Van Der Rest & Garrone, 1991).

1.5.1. Structure primaire :

Chaque chaîne α présente une séquence primaire caractérisée par une succession de

triplets [Gly − Xaa − Yaa] n, où une glycine (Gly) est insérée tous les 3 acides aminés,

tandis que la proline (pro) est fréquente en position Xaa et sa forme hydroxylée,

l'hydroxyproline (Hyp) en position Yaa (figure 2) (Myllyharju & Kivirikko, 2004 ; Ricard-

Blum & Ruggiero, 2005). La présence d’hydroxyproline étant essentielle pour stabiliser la

triple hélice et étant tout à fait caractéristique des molécules de collagène (Darnell et al.,

1990 ; Rossert et al., 2003).

La structure primaire de la chaîne α du collagène type I est composée de séquence

suite en acide aminé du 13ème

au 66ème

:

...Gly-Pro-Met-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Arg-Gly-Leu-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ala-Hyp-Gly-

Pro-Gln-Gly-Phe-Gln-Gly-Pro-Hyp-Gly-Glu-Hyp-Gly-Glu-Hyp-Gly-Ala-Ser-Gly-Pro-Met-

Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Lys-Asn-Gly-Asp-Asp...

Figure 2 :

Schéma d'une molécule de collagène. Les trois chaînes α constitutives sont supposées

différentes et elles sont figurées avec des couleurs différentes (Pekkala et al., 2004).

La composition en acides aminés du collagène est particulière. Ainsi, près d’un tiers

de ses résidus sont des glycines (Gly) (330 mol pour 1000 mol d´acides aminés). La glycine

est un petit acide aminé. Sa chaîne latérale ne consiste en effet que d'un atome d'hydrogène

qui est disposé dans la molécule de manière totalement régulière, c’est à dire qu´elle constitue

8

chaque troisième acide aminé dans la séquence des chaînes individuelles (Cassens, 1966).

Cette disposition permet un lien serré des chaînes polypeptidiques dans une triple hélice et

elle favorise le rapprochement et l’emboitement des chaînes entre-elles.

Le collagène est constitué de 15 à 30 % de proline (Pro) et de 4-hydroxyproline (Hyp)

(Taskiran et al., 1999). La chaîne latérale de la proline se replie et vient rejoindre son

groupement aminé: la chaîne latérale dépasse l'axe principal de la chaîne polypeptidique

comme une anse de tasse.

L’hydroxyproline constitue près de 10 % des acides aminés de la molécule du

collagène. La concentration en hydroxyproline est environ 5 fois plus élevée dans le collagène

que dans toute autre protéine (la réticuline, qui contient également une quantité considérable

d´hydroxproline, est en somme un collagène de type III) (Woessner, 1961).

Figure 3 : Structure des trois acides amines majoritaires : Gly, Pro et Hyp de la triple hélice

du collagène.

L’hydroxyproline est toujours à gauche d’une glycine. Elle est produite après la

traduction de l'ARNm (des modifications post-traductionelles) du collagène en chaîne

polypeptidique: elle résulte d'une hydroxylation d'un résidu proline par l'enzyme prolyl

hydroxylase, avec comme co-facteurs O2, Fe2+, l'α-cétoglutarate et l'acide ascorbique

(vitamine C) (Darnell et al., 1990) (figure 3). Ces composants sont très important car le cœur

actif de l'enzyme contient du Fe2+ et s'il n'est pas activé par tous les composants

précédemment cités, il devient Fe3+ et entraîne une inactivation de l'enzyme. On sait

également que le groupement hydroxyle de l’hydroxyproline participe à la formation de

liaisons hydrogènes entre les chaînes et avec les molécules d’eau piégées dans la triple hélice

(Ward & Courts, 1977).

9

On trouve 2 formes d'hydroxyproline : la forme 3-hydroxyproline et la forme 4-

hydroxyproline qui est la plus fréquente.

Il faut aussi noter que si les trois chaînes polypeptidiques qui constituent la molécule

de collagène sont toutes de type α, elles ne sont pas toutes identiques au niveau de leur

séquence primaire (tableau 2).

Tableau 2 : Composition en acides aminés des chaines de types α1, α2 et α3 constituantes du

collagène de la peau de morue (résidus / 1000 résidus totaux).

Acides aminés α1 α2 α3

4-hydroxyproline

Acide aspartique

Thréonine

Sérine

Acide glutamique

Proline

Glycine

Alanine

Valine

Méthionine

Isoleucine

Leucine

Tyrosine

Phénylalanine

Hydroxylysine

Lysine

Histidine

Arginine

Tryptophane

Amide nitreux

55

50

23,4

70

76

98

339

119

15,5

16,7

10,8

18,8

1,8

13,2

5,5

31,3

5,2

51

0

43

52

54

26,9

73

62

97

348

107

19,5

18,3

9,2

24,4

4,7

9,1

9,5

20,6

11,5

54

0

46

58

51

24,5

73

78

96

347

101

20,1

16,8

8,9

17,5

2,6

11

5,3

30,3

7

51

1

54 (Cassens, 1996)

Les domaines hélicoïdaux de la molécule de collagène sont résistants à l'action des

protéases et ne peuvent être clivés dans des sites précis, que par des collagénases spécifiques.

Ces domaines sont par ailleurs très résistants à la dénaturation thermique (jusqu'à plus de 40

°C) et possèdent une relative rigidité. La molécule de collagène se comporte comme un

bâtonnet dont la flexibilité est fonction du nombre d'interruptions dans la triple hélice

(Garrone, 1998).

Un autre modèle, basé sur le rassemblement des résidus polaires et hydrophobes

montre une distribution périodique tous les 234 résidus approximativement. Par ailleurs, des

études antérieures (Yannas, 1972), ont assimilé le collagène à un « copolymère à blocs »

caractérisé par des séquences « polaires » et « apolaires » alternées :

10

Avec A et B des acides aminés basiques, acides ou hydroxylés tels que l'arginine, la lysine,

l'acide aspartique, l'acide glutamique et la sérine. Et C représentant le plus souvent

l'hydroxyproline, et dans une moindre mesure l'alanine, la glycine, l'acide glutamique, l'acide

aspartique, l'arginine, la phénylalanine, la thréonine et la sérine.

L’alternance des séquences « polaires » et « apolaires », confirmée par des études de

spectroscopie Raman (Frushour & Koenig, 1975) a permis de rendre compte de certaines

caractéristiques dans les propriétés des types de collagènes, comme :

- Une différence dans les niveaux d’hydratation et de gonflement.

- Une différence de résistance à l'extension.

- Une différence dans le niveau d'ordre et la nature des conformations.

1.5.2. Structure secondaire :

L’hélice du collagène est une hélice de 1,5 Å de rayon et de pas gauche (elle tourne en

montant dans le sens des aiguilles d’une montre). C’est une hélice de type polyproline II

stabilisée par une teneur en amino-acide élevée. Elle s’élève de 2,86 Å par résidu et comporte

3,33 résidus par tour. On peut la comparer à l’hélice α qui est une hélice droite de 2,24 Å de

rayon et qui s’élève de 1,53 Å par résidu et compte 3,6 résidus par tour (Beck & Brodsky,

1998). L’arrangement de la triple hélice de collagène provient de la répulsion stérique entre

les cycles pyrrolidines des résidus de proline. Une autre différence avec l’hélice α est que l’on ne

retrouve pas des ponts hydrogènes stabilisants entre les résidus d’une même hélice de

collagène pour la stabiliser.

Trois chaînes α vont s’assembler pour former une hélice droite de 2,8 Å de rayon

et de 85,5 Å de pas d’hélice (Beck & Brodsky, 1998) (figure 4). La chaîne latérale de la

glycine est constituée d’un unique atome d’hydrogène qui pointe toujours vers l’intérieur

alors que les résidus des autres acides aminés pointent vers l’extérieur, ce qui fait de la triple

hélice un assemblage très compact. La stabilité de la triple hélice est assurée par les liaisons

hydrogènes entre les résidus glycines d’une chaîne et les groupements carboxyles d’une autre,

et est encore renforcée par l’hydroxylation des prolines grâce à un effet stéréoélectronique.

La différence entre les types de collagène se fait au niveau des domaines non collagéniques.

-(Gly-A-B)n-(Gly-Pro-C)n

polaire apolaire

11

Figure 4 : Section transverse (A ; B) et longitudinale (C ; D) de la triple hélice de collagène

(trois chaînes α) (A ; C) et d’une triple hélice composée de trois hélices α (B ; D) tracées à la

même échelle (Beck & Brodsky, 1998).

1.5.3. Structure tertiaire :

La structure tertiaire (molécule de tropocollagène) est formée par l’enroulement de

trois chaînes α en une superhélice droite avec un pas de 8,6 nm (Ramachandran, 1967 ;

Ramachandran & Ramakrishnan, 1976 ; Nimni & Harness, 1988).

Dans la molécule tropocollagène, toutes les trois chaînes son maintenues côte à côte

par des liaisons hydrogènes entre les chaînes voisines. Ces liaisons peuvent se produire

seulement lorsque toutes les trois chaînes se rapprochent les unes des autres; dans le cas de

collagène, ceci est rendu possible par la présence de glycine toutes les troisièmes positions,

c’est à dire un acide aminé sans chaîne voisine. La projection simplifiée de la structure

tropocollagène le long de l´axe principale de la triple hélice est illustrée en figure 5.

Chacune des trois chaînes (A, B, C), se lie à la chaîne voisine avec un atome alpha-

carbonique allant de l´extérieur vers le centre du triple-faisceau, tandis que les hydrogènes du

carbones-alpha de la glycine sont positionnés à proximité du centre.

12

Figure 5 : Projection simplifiée de la disposition des atomes

(http://www.hypro.cz/hyRubrIn.aspx?intRubrKis=1251&intLang=4).

Dans ce centre, il n´y a pas d´espace suffisant pour un autre carbone. Si un résidu autre

que glycinique était présent dans cette position (seule la glycine ne contient pas de ß-carbone

dans sa molécule), toutes les trois chaînes devraient alors être plus éloignées, il ne pourrait

donc pas se former des liaisons hydrogènes stabilisantes entre les chaînes α (Birk & Bruckner,

2005). La structure primaire décrite dans la partie précédente répond certes à l´exigence de la

présence de glycine à l´exception des régions terminales qui sont relativement courtes. En

moyenne, 1,7 liaisons d’hydrogènes se forment dans le tropocollagène pour chaque troisième

résidu aminoacides.

La disposition détaillée des liaisons hydrogènes stabilisantes n´est bien sûr pas pareille

pour toutes les séquences. La liaison peptidique de la proline ne peut former de liaison

hydrogène dans laquelle le donneur est un azote parce qu´il est intégré dans un cercle

pentamère et ne possède aucun hydrogène lié. L´hydroxyproline peut toutefois former des

liaisons hydrogènes par l´intermédiaire de son groupement hydroxyle. La disposition des

liaisons hydrogènes à divers endroits de l´élément tropocollagène peut être différente car la

structure n´a pas de séquences répétées à l´exception de la présence de glycine toutes les

troisièmes positions (Blažej et al., 1984 ; Stančíková et al., 1999 ; Birk & Bruckner, 2005).

13

1.5.4. Structure quaternaire :

Les collagènes fibrillaires sont structurés en domaine de triple hélice. Ces fibrilles vont

s'associer entre elles pour donner une fibrille d'ordre supérieur (500 nm). Ces grosses fibrilles

peuvent à leur tour former une fibre de collagène de 1 à 10 µm. Le collagène comme toutes

les protéines de l'organisme est renouvelé en permanence. Sa durée de vie dans le derme est

estimée à deux mois.

Le collagène I est constitué d’un domaine en triple hélice de 1050 acides aminés

tournant l'une autour de l'autre en une super-hélice orientée dans le sens des aiguilles d’une

montre. L'hélice de collagène individuelle tourne dans le sens inverse (figure 6) (Darnell et

al., 1990) ; auquel s’ajoute 150 acides aminés du côté N-terminal et 250 du côté C-terminal.

Ces deux domaines servent à la reconnaissance des chaînes α entre elles pour former la triple

hélice. Une nomenclature a été mise en place pour nommer les différents domaines des

chaînes de collagènes, les domaines collagéniques étant notés COL et les non-collagéniques

NC (Canty & Kadler, 2002 ; Hulmes, 2002).

Figure 6 : Structure quaternaire de la triple hélice du collagène (Darnell et al., 1990).

D’autre part, les autres types de collagènes possèdent des interruptions de leurs

domaines en triple hélice plus ou moins nombreuses. Celles-ci vont servir à réaliser des fonctions

supplémentaires et permettent l’assemblage de ces collagènes selon des schémas complexes.

14

1.6. Synthèse du collagène :

Les gènes codants pour le collagène possèdent un nombre variable d’exons (entre 3 et

17) séparés par des introns. Pour un gène donné, des sites différents d’initiation de la

transcription ou bien des épissages alternatifs des introns peuvent donner naissance à différents

types de collagènes. Un gène est donc associé à plusieurs chaînes α.

Pour le domaine hélical du collagène, tous les exons proviennent de la duplication d'un

exon primaire de 54 pb qui code pour 18 aa c'est à dire environ 6 tours d'hélice. Certains

exons sont multiples de 54 pb (108 pb = 2*54 ou 162 pb = 3*54 par exemple...) et d'autres ont

perdus une séquence (gly X-X = 45 pb).

La molécule de collagène de type I est constituée de deux chaînes α1 et d’une chaîne

α2. Il y a donc deux gènes codants pour le collagène de type I : COL1A1 qui code pour la

chaîne α1, et COL1A2 qui code pour la chaîne α2. Ces deux gènes sont situés sur deux

chromosomes différents, mais ils ont une structure très semblable, qui est également très

proche de la structure des autres gènes codants pour des collagènes fibrillaires (figure 7)

(Vuorio & De Crombrugghe, 1990).

Figure 7 : Représentation schématique, des gènes codants pour les chaînes α1 et α2 du

collagène de type I (Vuorio & De Crombrugghe, 1990).

Une fois synthétisée, chaque chaîne polypeptidique va subir des hydroxylations et des

glycosylations (Rossert & De Crombrugghe, 2001). Au niveau des ribosomes, les chaînes α

sont sécrétées dans la lumière du réticulum endoplasmique (translocation) où elles vont subir

d’importantes modifications post-traductionnelles (ces modifications se produisent sur les

15

résidus de proline et de lysine). Le peptide signal attaché au propeptide N-terminal, dont la

nature n’est pas connue à ce jour, est clivé. Certains résidus prolines et lysines du polypeptide

vont être hydrolysées par la prolyl-4-hydroxylase (P-4-H) en 4-hydroxyproline et la

lysylhydroxylase en hydroxylysine (Kivirikko & Myllyharju, 1998).

Le propeptide C-terminal est modifié par N-glycosylation et certaines hydroxylysines

sont O-glycolysées. Les différentes modifications post-traductionnelles et la formation des

ponts disulfures entre les propeptides C-terminaux vont aligner trois chaînes α qui vont

s’enrouler comme une fermeture éclair en direction du N-terminus (Hulmes, 2002). Les

triples hélices de collagènes, appelées à ce stade procollagène, sont alors empaquetées dans des

vésicules dans l’appareil de Golgi et excrétées à l’extérieur de la cellule. Lorsque les trois

chaînes qui composent la molécule sont identiques, la molécule est dite homotrimérique

tandis qu’une molécule formée de chaînes différentes est hétérotrimérique.

1.7. Assemblage du collagène :

L’assemblage du collagène suit le processus décrit par Canty & Kadler (2005)

(figure 8). Après exocytose, les propeptides C et N terminaux sont coupés par des enzymes (des

procollagène peptidases). Ces derniers vont libérer une triple hélice mature ; la molécule est

alors dénommée tropocollagène. La diminution de la solubilité liée à la perte des peptides

terminaux enclenche le phénomène de fibrillogenèse.

Figure 8 : Processus d’assemblage des fibrilles de collagène (Canty & Kadler, 2005).

16

Les chaînes α sont synthétisées dans le réticulum endoplasmique, assemblées en

triples hélices grâce à l’interaction entre les parties C terminales. Il suit de nombreuses

modifications post-traductionnelles. A l’extérieur de la cellule, les propeptides sont coupés

et les molécules de collagène peuvent alors s’assembler en fibrilles. La stabilisation des

fibrilles est réalisée à l’aide de liens covalents entre les molécules de collagène d’une

même fibrille (Canty & Kadler, 2005).

Les molécules de tropocollagènes (300 nm de long et 1,5 nm de diamètre) vont s’aligner

parallèlement et dans le même sens, avec un décalage de 67 nm. C’est ce décalage qui leur

donne leur aspect strié si particulier en microscopie électronique ou en microscopie à force

atomique (AFM). Pour stabiliser l’ensemble, des lysines de la partie N-terminale d’une

molécule sont pontées de façon covalente à d’autres lysines de la partie C-terminale d’une

molécule voisine par l’action de la Lysyl oxydase. Cela permet aux molécules de

tropocollagène de s’assembler en une fibrille de diamètre variable, entre quelques dizaines de

nanomètres et des centaines de nanomètres, suivant les organes et leur composition dans les

différents types de collagène. Les fibrilles elles-mêmes peuvent se regrouper en fibre de

collagène dont le diamètre est compris entre 1 μm et 10 μm (Canty & Kadler, 2005).

La molécule de tropocollagène est stabilisée par des ponts hydrogènes entre les

hélices. Elle est très dépendante de la présence d'hydroxyproline. En l’absence

d'hydroxyproline, la triple hélice est très instable à température ambiante et ne se forme

pratiquement pas à la température du corps. Du fait de l'hydroxylation de la proline, qui a lieu

dans le réticulum endoplasmique pendant la maturation du collagène, en présence d'acide

ascorbique (un cofacteur de l'enzyme prolyl hydroxylase), une carence en cette vitamine

conduit à une très mauvaise synthèse de collagène, ce qui conduit à la fragilité des vaisseaux

sanguins, des tendons, et de la peau, symptômes caractéristiques du scorbut (Darnell et al.,

1990).

1.8. Organisation macromoléculaire des collagènes :

On distingue deux superfamilles :

- Les collagènes fibrillaires :

Il existe de nombreux types d’organisation de collagènes fibrillaires, dont on peut

donner quelques exemples :

Dans la cornée, la taille des fibrilles est maintenue à environ 35 nm et celles-ci sont

organisées en lamelles dans lesquelles toutes les fibrilles ont une même direction (Komai &

17

Ushiki, 1991). La direction des fibrilles tourne d’environ 90◦ entre chaque lamelle et reste

toujours parallèle à la surface de la cornée, à la manière d’un contreplaqué (figure 9 (a)). Cette

organisation très particulière est une des raisons de la transparence de la cornée.

Dans le derme, les fibres ont des diamètres variables, ne sont pas parallèles entre elles

et ne sont pas rectiligne. L’ensemble des fibres va former une sorte de pelote de fils qui va

donner à la peau ses propriétés de résistance à la tension mais aussi son pouvoir à s’étirer

(Ushiki, 2002) (figure 9 (b)).

Dans l’aorte, les fibres de collagène de l’adventice ne sont pas cylindriques, mais

ressemblent à des rubans qui entourent le média. Le collagène de l’adventice est là pour

soutenir les cellules musculaires lisses et leur offrir une structure rigide sur laquelle s’appuyer

(Ushiki, 2002) (figure 9 (c)).

Dans les tendons, les fibres sont parallèles entre elles et, à un âge donné, ont des

diamètres assez proches. Toutefois, leur diamètre varie avec l’âge du tendon. Chez la souris,

à 4 jours les fibres font 64 ± 12 nm, à 10 jours 102 ± 37 nm, à 1 mois 195 ± 62 nm et à

3 mois 223 ± 82 nm (Ezura et al., 2000) (figure 9 (d)).

Figure 9 : Organisation des fibrilles dans différents organes :

(a) Image TEM du stroma cornéen humain : toutes les fibrilles ont la même direction dans

une même lamelle et un diamètre constant d’environ 35 nm (K = keratocyte, barre d’échelle

= 1 μm) (Komai & Ushiki, 1991).

(b) Image SEM des fibres de collagène dans le derme humain : les fibres ont des diamètres

variables (barre d’échelle 5 μm).

(c) Image SEM des fibres de collagène de l’adventice d’une aorte de rat : les fibres sont en

ruban (b-c) (Ushiki, 2002).

18

(d) Image TEM de la structure des fibrilles durant le développement (4 jours, 10 jours, 1 mois,

3 mois) d’un tendon de souris : les fibrilles sont cylindriques et leur diamètre augmente avec

le temps (barre d’échelle 300 nm) (d) (Ushiki, 2002).

- Les collagènes non fibrillaires :

Dans d’autres types de collagènes, les domaines non collagéniques, c’est à dire qui ne

s’assemblent pas en triple hélice, empêchent la formation de fibrilles:

Le collagène IV s’assemble grâce à ses domaines non collagéniques pour former un

réseau complexe qui sera stabilisé ensuite par des liaisons entre les parties collagéniques

(figure 10).

Figure 10 : Formation des membranes basales à partir du collagène IV

Trois chaînes α du collagène IV s’assemblent pour former une triple hélice. La

structure supramoléculaire est formée par dimérisation des domaines C terminaux et par

tetramérisation des domaines N terminaux. Lors de son développement, la membrane basale

glomérulaire est d’abord composée d’un réseau α 1 α 2 (IV) qui est ensuite remplacé par un

réseau possédant plus de ponts covalents α 3 α 4 α 5 (IV) et qui est aussi caractérisé par des

boucles et des enroulements superhélicoïdaux (Boutaud et al., 2000).

19

Les collagènes IV et VII vont former des complexes, les plaques d’ancrage, pour relier la

membrane basale entre l’épiderme et le derme avec les collagènes fibrillaires du derme (Keene,

1987).

Les collagènes transmembranaires ont un domaine N-terminal intracellulaire, un court

domaine transmembranaire, puis un domaine extracellulaire lui-même composé de plusieurs

domaines en triple hélice. Ces collagènes servent à relier les cellules entre elles et à la

membrane basale. Si leur partie extracellulaire est séparée de la partie intracellulaire par

l’action d’enzymes, elle sert alors de protéine de signalisation (Franzke et al., 2005).

1.9. Dégradation du collagène :

La dégradation des collagènes, ou d’autres molécules de la matrice extracellulaire, est

réalisée essentiellement par une famille d’enzymes, les Matrix-MetalloProteinases MMPs, qui

peuvent être classées en au moins 5 groupes distincts : collagénases, gélatinases,

stromélysines, métallo-élastases et MMPs membranaire (MT-MMPs : Membrane type Matrix

metalloproteinases) (Trackman, 2005). Elles jouent un rôle physiologique pendant la

croissance fœtale, chez l'adulte dans le renouvellement tissulaire et en pathologie, dans les

processus métastasiques de l'os. Elles peuvent être inhibées par les TIMP (Tissue Inhibition of

MMP) notamment dans le traitement contre le cancer, pour éviter les métastases.

Dans cette famille nous nous intéressons essentiellement aux collagénases (MMP-1,

MMP-8, MMP-13, MMP-20) qui initient spécifiquement la dégradation des collagènes

fibrillaires de type I, II et III. Elles clivent la triple hélice pour donner deux fragments

correspondant aux 3/4 N-terminaux et 1/4 C-terminaux. Cette coupure provoque le

déroulement de la triple hélice et libère un collagène dénaturé, alors accessible aux

protéinases non spécifiques.

La spécificité de ces collagénases est variable : la collagénase-1 (MMP-1 ou

collagénase interstitielle) dégrade le collagène de type III plus efficacement que les types I et

II tandis que la MMP-8 (ou collagénase-4) est plus active sur le type I. La collagénase-3

(MMP-13) possède une spécificité de substrat plus large : outre les collagènes fibrillaires et la

gélatine, elle dégrade aussi les collagènes de type IV, IX, X et XIV. Cette collagénase possède

également un site de clivage supplémentaire dans le collagène de type I au niveau du domaine

non collagénique N-terminal (Quinn et al., 1990) et dont le mode d’action est encore inconnu.

Les MMP-2 et MMP-9, quant à elles, ne digèrent que les collagènes déjà dénaturés (gélatine).

20

1.10. Régulation de la production du collagène :

Pendant le développement embryonnaire, le collagène de type I est synthétisé à un niveau

relativement élevé, cette synthèse se ralentit ensuite au cours de la vie pour atteindre chez

l’adulte un niveau assez faible (Rossert et al., 2003).

La régulation de la synthèse du collagène se fait avant tout au niveau transcriptionnel,

mais aussi au niveau de son assemblage et de sa dégradation. Bien qu’il reste beaucoup à

découvrir sur les mécanismes de régulation transcriptionnelle, certaines molécules sont

connues pour modifier le niveau d’expression des collagènes (Ghosh, 2002).

Le TGF-3 (Transforming Growth Factor) augmente la transcription des gènes

correspondants aux protéines de la matrice extracellulaire (Rossert & De Crombrugghe, 1996;

Massagué & Wotton, 2000), mais rend aussi plus stable les ARNm du collagène. Il stimule la

prolifération de fibroblastes et inhibe les métalloprotéases. Cette protéine est sécrétée par de

nombreuses cellules, y compris les macrophages, les lymphocytes, les fibroblastes, les

cellules endothéliales, et certaines cellules rénales comme les cellules mésangiales, les cellules

tubulaires proximales et les cellules du canal collecteur. Le PDGF (Platelet-derived growth

factor), l’angiotensine II, les produits de peroxydation liquides ou l’hypoxie augmentent la

synthèse du TGF-3 et ont donc un effet profibrosant. Les effets du TGF-3 sur la production de

matrice extracellulaire par les cellules fibroblastiques ont pu être confirmés in vivo dans

plusieurs modèles (Roberts et al., 1986).

L’interféron -y (IFN--y) est quant à lui une cytokine produite à la fois par les lymphocytes

T auxiliaires de type Th1 et par les cellules NK. L’IFN--y diminue à la fois la prolifération des

fibroblastes et la synthèse de collagène de type I par ces cellules (Rossert & De Crombrugghe,

1996).

Le TNF- α (Tumor necrosis factor α) et l’interleukine-1 sont deux autres cytokines

régulant la production de collagène et toutes les deux sont produites par les macrophages.

Bien que leurs mécanismes d’action soit différents, leurs résultats sont proches : ils stimulent

la prolifération des fibroblastes, mais inhibent la production de collagène de type I et augmentent

la production de collagénases interstitielles et donc la dégradation du collagène (Rossert & De

Crombrugghe, 1996).

On peut encore citer la prostaglandine E2, les interleukines 4 et 10, l’oncostatine

M, les corticoïdes, l’acide rétinoïque, la vitamine C, l’epidermal growth factor, l’insulin

growth factor 1, le fibrobalst growth factor ... Ceci montre la complexité du mécanisme de

régulation du collagène et les nombreuses cascades de signalisation qui contrôlent sa synthèse.

21

Il existe une forte relation entre la production de collagène, le développement cellulaire,

l’inflammation et la cicatrisation.

1.11. Solubilité du collagène :

L’hydrolyse totale de la protéine est une libération des constituants par la rupture de

toutes les liaisons peptidiques.

A l’état natif, des protéines fibreuses comme le collagène sont pratiquement

insolubles dans l’eau. Lorsque le collagène natif est dénaturé par l’action de la chaleur ou de

certaines substances chimiques, comme l’urée par exemple, les trois chaînes peptidiques de la

molécule de collagène se déroulent et se dissocient. Plus la molécule aura un fort degré de

liaison des fibres de tropocollagène entre-elles, plus cette dissociation sera peu efficace. On

parle alors d’un degré de solubilité du collagène qui est plus ou moins important. Ce degré de

solubilité est donc directement fonction du degré de réticulation de la molécule elle-même. Le

degré de réticulation est caractéristique du tissu mais varie aussi avec l’âge (Cassens, 1966).

Si on considère l’effet négatif sur la tendreté de la viande joué par la présence de tissu

conjonctif intramusculaire, on sait que cet effet sera plus marqué chez les animaux âgés que

chez les jeunes et donc que la tendreté de la viande diminue avec l’âge des animaux. Si on

considère maintenant l’effet positif de la cuisson sur la tendreté de la viande, on doit

considérer que celui-ci est due à la dénaturation thermique des liens intramoléculaires du

collagène qui de fait devient moins résistant au forces de cisaillement exercée par la

mastication. En conséquence, on doit aussi considérer que pour un même résultat de tendreté

donné, la viande d’un animal plus âgé devra être plus cuite (plus de dénaturations thermiques)

que celle d’un animal jeune, et ce afin de mieux solubiliser le collagène.

1.12. Anomalies du collagène : Origine de plusieurs maladies :

Un groupe d’au moins 10 maladies différentes dues à des anomalies du collagène est

aujourd’hui connu. Les syndromes d’Ehlers-Danlos, sont tous caractérisées par une hyper

extensibilité des ligaments des articulations et de la peau liée à la perte de rigidité de la

molécule de collagène (Voet & Voet, 2005). Avec cette maladie, la peau est fragile, se fend

rapidement (même pour des traumatismes minimes), surtout au niveau articulaire, et le

moindre choc provoque facilement des ecchymoses.

Des mutations affectant le collagène de type I, conduisent généralement à une

ostéogénèse imparfaite (osteogenesis imperfecta). Les manifestations cliniques de ces

maladies sont très variées mais peuvent aller d’une forme létale à la naissance à des formes

22

sévères entrainant un handicap profond chez la personne atteinte. Le simple changement d’un

acide aminé peut aussi modifier profondément la structure de la molécule de collagène ou le

mécanisme de formation des fibrilles. Le remplacement de la glycine centrale par une alanine

dans chacune des chaînes polypeptidiques de la molécule de collagène provoque une

distorsion de la triple hélice de collagène qui entraine des anomalies de structure de la

molécule et montre que l’intégrité structurale du collagène est indispensable à son bon

fonctionnement (Voet & Voet, 2005).

1.13. Transformation du collagène en gélatine :

Lors de l’extraction de la gélatine à partir du collagène, les liaisons hydrogène sont

brisées par élévation de température, la structure en hélice disparaît. Les chaînes adoptent la

conformation pelote, le collagène se transforme en gélatine.

La conversion du collagène en gélatine a été longuement étudiée (Veis, 1964 ;

Harding, 1965 ; Ward & Courts, 1977). Elle se réalise en deux étapes : la solubilisation du

collagène (soit en milieu acide, soit en milieu basique) et sa conversion en gélatine. Cette

dernière est le résultat de la dénaturation de la structure tertiaire de la triple hélice de

tropocollagène. Les chaînes se dissocient et adoptent alors une configuration pelote statistique

(Jones, 1987). Ceci est engendré par le fait que l´état collagène n´est stabilisé généralement

que par des liaisons covalentes faibles (hydrogène, polaire, contacts hydrophobes et autres)

qui sont sensibles à la chaleur et, lors de leur réchauffement, elles diminuent leur énergie de

liaison.

Un collagène modifié comme tel ne résiste pas aux protéases courantes.

Techniquement, le terme de gélatine est utilisé que pour les produits solubles ayant une

viscosité supérieure et une coloration plus claire que la colle. La transformation en gélatine se

produit généralement à environ 60 °C. Toutefois, elle dépend du pH, de la force ionique, de la

composition de la solution et du degré de réticulation.

La modification de la structure du collagène permettant la formation de liaisons

transversales thermiquement régulières (par exemple les liaisons covalentes) engendre un

décalage important de la température de transformation vers des valeurs supérieures. C’est en

fait la base du tannage du collagène pour la fabrication du cuir. Par la dénaturation du

collagène en présence de matières diminuant l´énergie des liaisons stabilisantes. La

transformation collagène - gélatine se produit à une température normale. Un collagène

normal d´un tissu physiologiquement adulte ne se dissout que très peu lors de la température

23

de réchauffement. Ceci est dû à la réticulation covalente se produisant lors du processus de

vieillissement (Blažej et al., 1984 ; Stančíková et al., 1999 ; Birk & Bruckner, 2005).

1.14. Utilisations du collagène :

Dans les temps anciens, il était utilisé comme une « colle biologique », et au cours du

temps, son industrialisation, a amené à l’utiliser dans de nombreuses applications.

A la Haute Antiquité, en Egypte, les artisans étaient en mesure de produire de la colle

à partir d’os et de peaux d’animaux, pour rassembler les pièces de bois entre elles. En Europe,

l’industrialisation de la fabrication de colle à partir du collagène a démarré dès la fin du

17ème siècle aux Pays-Bas et dès le début du 18ème en Angleterre (Shrieber & Gareis, 2007).

Depuis 1930 en Europe, avec l’élevage intensif du porc, une source de peau fraîche est venue

s’ajouter aux matières premières traditionnelles. La production du collagène a pris des

destinations pour de multiples usages.

Les secteurs les plus importants utilisant le collagène sont : les industries

biomédicales, pharmaceutiques et cosmétiques (Lee et al., 2001). Il est également utilisé dans

d’autres secteurs tels que l’industries alimentaires et photographiques (Kim & Mendis, 2006 ;

Senaratne et al., 2006).

Les applications biomédicales et pharmaceutiques du collagène sont observées dans le

traitement de l'hypertension, de l’incontinence urinaire, de la douleur associée à l’arthrose

(Rustad, 2003), dans la technologie de tissu pour des implants chez l'homme, l’inhibition des

maladies angiogéniques, telles que des complications de diabète, l'obésité, et l'arthrite (Rehn

et al., 2001). Le collagène peut servir aussi à la production des fils chirurgicaux, des feutres et

des mousses hémostatiques, des membranes collagènes, des capsules, des filtres et autres.

Selon les orthopédistes, la poudre de collagène laissée sur place dans les procédés

d’ostéosynthèse, permet une plus rapide consolidation osseuse. Le collagène possède

également des propriétés intéressantes dans le traitement de cancers, en réduisant la formation

de cartilage et d’os afin de soulager les douleurs des patients atteints d’arthrite osseuse. Le

collagène est utilisé en tant que molécule porteuse de principe actif, de protéine ou de gènes

(Kim & Mendis, 2006). Le collagène est dépourvu de caractère antigénique. Il est par

conséquent biocompatible dans les tissus vivants.

Le collagène est largement et différemment utilisé dans les produits cosmétiques ou

intégrés dans les formes galéniques, tel que dans la production des greffes sous cutanées,

comme élément de compresses, d’onguents et de crèmes pour le traitement des brulures, des

24

vergetures, des cicatrices et comme antirides pour le retardement des symptômes de

vieillissement de la peau.

Dans le secteur alimentaire, le collagène trouve des applications comme la préparation

de gélatine et l’épuration des jus et des boissons alcoolisées (Caroline, 2005).

Il existe une autre industrie ancienne du collagène, celle du tannage. En effet, le cuir

n'est rien d'autre que du collagène du derme spécialement traité avec des agents tannants. Une

variante de cette industrie est celle de la conservation des animaux et des cadavres humains: la

momification.

Le collagène peut être transformé en boyaux de films photographiques et de saucisses

et peut également être employé comme additif. Le collagène est utilisé pour la fabrication des

cordes des instruments de musique (http://www.universalis.fr/encyclopedie/collagene/).

1.15. Origines du collagène industriel:

Le collagène a été produit à partir des peaux et des os d'origine bovine ou porcine et

des déchets de volailles (Hinterwaldner, 1977 ; Ward & Courts, 1977). Cependant des

considérations d’ordre culturelles ou religieuses sont très regardantes quand à la source du

collagène.

L’épidémie de ESB l’Encéphalopathie Spongiforme Bovine maladie de la vache folle

en 1980, la crise de la fièvre aphteuse (FMD) ont poussé à chercher de nouvelles sources

alternatives de collagène provenant de l'environnement aquatique (Senaratne et al., 2006)

telles que les poissons, les méduses, les spongiaires, les calmars et d'autres fruits de mer

(Zhang et al., 2007), et ceux vivant dans les hautes latitudes et des régions froides sans

pollution environnementale (Kołodziejska et al., 1999 ; Nagai et al., 2000 ; Swatschek et al.,

2002 ; Sadowska et al., 2003).

1.16. Collagène et poissons :

Le collagène des poissons est le produit de remplacement potentiel du collagène des

mammifères (Pranoto et al., 2007). Outres les considérations épidermiques, il pourrait être

utilisé par les nations islamiques et indoues, qui ne peuvent utiliser respectivement le

collagène porcin ou bovin (Badii & Howell, 2006).

De nombreux travaux ont été réalisés sur la stabilité thermique du collagène des

poissons (Kimura et al., 1988 ; Zhu & Kimura, 1991; Nagai & Suzuki, 2000a ). Le collagène

des poissons a une stabilité thermique inférieure à celle du collagène des mammifères. La

température de dénaturation du collagène est en fonction du milieu dans lequel vivent les

25

individus (Nagai & Suzuki, 2000a). La plupart des collagènes connus des poissons se

dénaturent aux températures inférieures à 30 °C, indiquant qu’il est généralement moins

stable que ses répliques mammifères (Grossman & Bergman, 1992 ; Foegeding et al., 1996).

Haug et al., (2004) ont entrepris l'étude comparative sur les propriétés rhéologiques du

collagène des poissons et des mammifères et ont constaté que la différence principale réside

dans le contenu en acides aminés en proline et en hydroxyproline, qui stabilisent la

conformation . La faible teneure en proline et hydroxyproline serait à l’origine au faible

pouvoir gélifiant du collagène des poissons.

Les poissons des eaux froides ont un collagène pauvre en hydroxyproline et une faible

stabilité thermique comparativement aux poissons des eaux chaudes. L’hydroxyproline est

impliquée dans la liaison d'hydrogène d'inter-chaîne, qui stabilise la structure triple

hélicoïdale du collagène (Darby & Creighton, 1993). On rapporte également que des espèces

de poisson des eaux froides contiennent des niveaux plus élevés en acides aminés tels que la

sérine et la thréonine (Balian & Bowes, 1977). Généralement, le contenu de collagène des

poissons varie avec l’espèce, l’âge et la saison (Montero et al., 1991 ; Foegeding et al.,

1996 : Ciarlo et al., 1997 ; Nagai et al., 2002).

Au cours du traitement industriel des poissons, une grande quantité de déchets (50-70

%) est produite (figure11) (Kittiphattanabawon et al., 2005). Ces déchets ont été

principalement employés comme nourriture ou engrais (Nagai & Suzuki, 2000b).

Figure 11 : Les sous-produits de poisson (www.bretagne-qualite-

mer.com/.../Valorisation%20des%20coproduits.pdf).

26

En outre, l'élimination des déchets peut causer une sérieuse pollution de

l’environnement. Certains pays, comme la Norvège ou l’Island, sont passés à une politique de

«0 rejet», c'est-à-dire une obligation pour les bateaux de pêche de débarquer la totalité des

captures. Cette tendance augmentera la quantité des sous-produits à valoriser. Les rejets

français sont estimés à 60 000 t/an (Pérez-Galvez & Bergé, 2008).

Figure 12 : Taux de production de sous-produit par activité (A) et par espèce (B) (Pérez-

Galvez & Bergé, 2008).

L’utilisation de ces déchets, pour produire des ingrédients utiles tels que le collagène,

le sulfate de chondroïtine et la gélatine présente des intérêts environnementaux significatifs

(Kimura et al., 1988 ; Zhu & Kimura, 1991; Nagai & Suzuki, 2000a). Le collagène d’origine

marine peut être natif (obtenu par extraction douce) ou hydrolysé.

De nombreuses études ont été réalisées sur l’extraction de collagènes à partir des

sous-produits marins, essentiellement des peaux, des écailles et d’os de beaucoup d'espèces de

poissons d’eau de mer telles que le calmar (Illex argentinus) (Kołodziejska et al., 1999), la

cardine (Lepidorhombus boscii) (Montero & Gomez-Guillen , 2000), le poisson globe

(Takifugu rubripes) (Nagai et al., 2002), le tambour noir (Pogonia cromis) (Ogawa et al.,

2003), le colin d’Alaska (Theragra chalcogramma) (Zhou & Regenstein, 2004), le thon de

truite saumonnée (Cho et al., 2005), le vivaneau à lignes jaunes ou jaunet (Lutjanus vitta)

(Jongjareonrak et al., 2005), le thon germon (Thunnus alalunga), l'argent-ligne grognement

(Noitup et al., 2005) et le scad de shortfin (Decapterus macrosoma) (Cheow et al., 2007).

L’extraction du collagène à partir de la peau des poissons d'eau douce a été rapporté,

sur le tilapia du Mozambique (ou tilapia noir) (Oreochromis mossambicus), le tilapia rouge

(Oreochromis nilotica) (Nagai & Suzuki, 2002), la courbine barbiche (Johnius dussumeiri), le

rondeau mouton (Archosargus probatocephalus) (Ogawa et al., 2003), la perche du Nil (Lates

niloticus) (Muyonga et al., 2004), la cordelette de bigeye (Priacanthus macracanthus)

B A

27

(Jongjareonrak et al., 2006), le poisson-chat (Ictalurus punctaus) (Liu et al., 2007) et la carpe

herbivore (Ctenopharyngodon idella) (Zhang et al., 2007).

L'utilisation des écailles de poissons comme source de collagène a été réalisée sur la

sardine (Sardina pilchardus) (Nomura et al., 1996), la dorade japonaise (Pagrus major), le

tilapia rouge (Oreochromis nilotica) (Ikoma et al., 2003), le tambour noir (Pogonias cromis),

le rondeau mouton (Archosargus probatocephalus) (Ogawa et al., 2004) et le sébaste

atlantique (Sebastes mentella) (Wang et al., 2008),

Peu d'information concernant les caractéristiques du collagène de la peau du tilapia du

Nil (Oreochromis niloticus) ont été rapportée.

Dans cette étude, nous nous intéressons à l’extraction, la purification et la

caractérisation de collagène extrait de la peau et des écailles du tilapia du Nil (Oreochromis

niloticus), élevé au niveau du laboratoire «AQUABIOR» du Département de Biotechnologie

de l’université d’Oran.

28

2. La présentation de l’espèce :

2.1. Position systématique et taxonomique :

Le genre Tilapia, (SMITH, 1840) est un poisson d'eau douce essentiellement africain.

Il a d'abord été divisé sur la base de différences morphologiques en 3 sous-genres: Tilapia,

Sarotherodon (Ruppel, 1852) et Neotilapia (Regan, 1911). Mais, depuis le début de ce siècle,

le nombre d'espèces de Tilapia a fortement augmenté avec la découverte d'espèces nouvelles,

ce qui a conduit les systématiciens à revoir régulièrement la taxonomie de ce genre

rassemblant actuellement plus de 90 espèces.

Oreochromis niloticus (Linnaeus, 1758) est une espèce parmi les tilapias incubateurs

buccaux, elle fait partie, de la famille des Cichlidés et l’ordre des Perciformes.

Taxonomie de l’espèce :

Règne : Animal.

Embranchement : Chordatés.

Sous-embranchement : Vertébrés

Super classe : Gnathostomes.

Sous classe : Actinoptérygiens.

Super ordre : Téléostéens.

Ordre : Perciformes

Famille : Cichlidés.

Genre : Oreochromis.

Espèce : Oreochromis niloticus (Linnaeus, 1758).

Figure 13 : Tilapia du Nil (Oreochromis niloticus) (AQUABIOR, 2010).

29

Une nouvelle classification ayant pour critère le comportement de reproduction ainsi

que la nutrition, divise la famille des Cichlidés en deux genres :

les Tilapias : regroupant les incubateurs sur substrat avec garde biparentale (en couple) et à

caractère macrophytophage.

les Sarotherodons : regroupant les incubateurs buccaux, divisés en deux sous genres :

- les incubateurs buccaux biparentaux et uniparentaux paternels à caractère planctonophage,

les Sarotherodon.

- les incubateurs buccaux uniparentaux maternels à caractère planctonophage représentés par

les Oreochromis (Kestemont et al., 1989).

2.2. Caractéristiques morphologiques :

Oreochromis niloticus est une espèce qui se distingue par certaines caractéristiques

morphologiques typiques de la famille des Cichlidés à savoir :

- Une tête portant une seule narine de chaque côté.

- Un os operculaire non épineux.

- Un corps comprimé latéralement, couvert essentiellement d'écailles cycloïdes et

parfois d'écailles cténoïdes.

- Une longue nageoire dorsale à partie antérieure épineuse.

- Une nageoire anale avec au moins les 3 premiers rayons épineux.

Des caractéristiques morphométriques ont fait l’objet d’études (Trewavas, 1983), et

permettent généralement la distinction des tilapias adultes (figure 15-16) :

Figure 14: Morphologie externe d’Oreochromis niloticus (AQUABIOR, 2010).

1-l’œil ; 2- narine ; 3- bouche ; 4- nageoire pectorale ; 5- nageoire ventrale ; 6- nageoire anale ;

7- nageoire caudale ; 8- nageoire dorsale.

1 2 3

4

5 6

7

8

30

- une coloration grisâtre avec poitrine et flancs rosâtres et une alternance de bandes

verticales claires et noires nettement visibles notamment sur la nageoire caudale et la partie

postérieure de la nageoire dorsale.

- un nombre élevé de branchiospines fines et longues (18 à 28 sur la partie inférieure

du premier arc branchial, et 4 à 7 sur la partie supérieure).

- une nageoire dorsale formée d’une seule pièce comprenant une partie épineuse

présentant 17 à 18 épines et une partie molle présentant 12 à 14 rayons souples. La nageoire

caudale porte des rayures verticales blanches et noires et la nageoire anale possède au moins

les 3 premiers rayons épineux.

- un liséré noir en bordure de la nageoire dorsale et caudale chez les mâles (Kestemont

et al., 1989).

Figure 15 : Schéma représentant Oreochromis niloticus adulte avec barres noires

verticales typiques sur la nageoire caudale (Pullin, 1988).

Figure 16 : Schéma représentant la tête d’Oreochromis niloticus avec premier arc

branchial découvert (18 et 4 branchiospines respectivement sur partie inférieure et supérieure)

(Pullin, 1988).

Le dimorphisme sexuel chez Oreochromis niloticus apparait à partir d’un poids de 30

g. Ce dimorphisme se caractérise par les différences suivantes :

31

la hauteur du corps est plus grande chez le mâle que chez la femelle.

la femelle à une couleur légèrement plus foncée et bleuâtre.

les bas de joues de femelles sont gonflés à cause de l'incubation buccale.

la papille urogénitale (un organe qui sert à l'excrétion de l'urine et à l'expulsion

des produits sexuels) est légèrement différente chez les deux sexes. Chez le mâle elle est

protubérante en forme de cône et porte un pore urogénital à l'extrémité, alors que chez la

femelle, elle est petite, arrondie avec une fente transversale au milieu (pore génital) et un pore

urinaire à l'extrémité (figure 17).

Figure 17 : Caractéristiques morphologiques spécifiques d’Oreochromis niloticus

(Heut, 1970). 1- Nageoire caudale ; 2- Papille urogénitale.

Oreochromis niloticus se distingue d’Oreochromis aureus, une espèce très proche, par

la présence chez le mâle de cette dernière d’un liséré rouge le long de la bordure des nageoires

dorsales et caudales (Kestemont et al, 1989).

2.3. Répartition géographique :

Oreochromis.niloticus présente une distribution initiale strictement africaine couvrant

les bassins du Nil, du Tchad, du Niger, des Volta, du Sénégal et du Jourdain ainsi que les lacs

du Graben est-africain jusqu'au lac Tanganika (Philippart & Ruwet, 1982). Cette espèce est

largement répondue en Afrique hors de sa zone d'origine pour compléter le peuplement des

lacs naturels ou de barrages déficients ou pauvres en espèces planctonophages ainsi que pour

développer la pisciculture (figure 18).

Welcomme, (1988), signale son introduction au Burundi et au Rwanda en 1951, à

Madagascar en 1956, en République Centrafricaine et en Côte d'Ivoire en 1957, au Cameroun

32

en 1958, en Tunisie en 1966, en Afrique du Sud en 1976 et à des dates inconnues au Zaïre et

en Tanzanie et en Algérie en Mai 2001 (MPRH & CNDPA., 2002).

Figure 18 : Répartition géographique d’O. niloticus et principales zones d’élevage et

d’importation de l’espèce (http://aquaculture-aquablog.blogspot.com/2009/08/malgre-les-

tempetes-le-tilapia-garde.html).

Le tilapia constitue le troisième groupe des poissons les plus cultivés dans le monde,

après les cyprinidés et les Salmonidés (figure 19).

Figure 19: Principales productions piscicoles mondiales (FAO, 2005).

33

Le tilapia est produit dans plus de 100 pays. Sa production mondiale a augmenté plus

de trois fois depuis 1984. Cette espèce commence également à être cultivée en Algérie, où son

introduction est assez récente datant de 2001 (MPRH & CNDPA., 2002). On rencontre des

fermes aquacoles à Saïda (Aïn Skhouna), Laghouat et Relizane (Oued djamaa).

2.4. Exigences écologiques de l’espèce :

De nombreuses études de terrain et de laboratoire (Pullin & Lowe-McConnell, 1982;

Fishelson & Yaron, 1983 ; Plisnier et al., 1988) montrent que la distribution géographique

d'une espèce (animale ou végétale) est fortement liée à ses exigences écologiques colonisant

ainsi, des milieux extrêmement variés tels que les rivières, les lacs, les eaux très faiblement ou

très fortement minéralisées.

Oreochromis niloticus est une espèce euryèce et eurytope adaptée à de larges

variations des facteurs écologiques connus pour avoir une influence sur la survie et la

reproduction de cette espèce. Ce sont notamment, le niveau d'eau, les précipitations, la

température, la conductivité, le pH et la transparence (Bénech & Dansoko, 1994).

En milieu naturel l’Oreochromis niloticus supporte des températures qui varient entre

13,5 et 33°C. L’interval de tolérance thermique observé au laboratoire se situe entre 7 et 41°C

pendant plusieurs heures (Balarin & Hatton, 1979). La température optimale de reproduction

se situe entre 26 et 28°C et le minimum requis étant 22°C (Kestemont et al., 1989).

L'euryhalinité d’Oreochromis niloticus est également bien connue. On le rencontre

dans des eaux à salinité comprise entre 0,015 et 30 ‰. Toutefois au-delà de 20 ‰ l'espèce

subit un stress important qui la rend sensible à une série de maladies, réduisant sa

compétitivité par rapport à d'autres espèces (Tilapia melanotheron). De plus, la reproduction

est inhibée en eau saumâtre à partir de 15 à 18 ‰. De même, la tolérance aux variations de pH

est importante du fait que l'espèce se rencontre dans des eaux présentant des valeurs de pH

comprises entre 5 et 11 (Chervinski, 1982).

Du point de vue concentration en oxygène dissous, cette espèce tolère à la fois de nets

déficits et des sursaturations importantes. Ainsi jusqu'à 3 ppm d'oxygène dissous

Oreochromis niloticus ne présente pas de difficultés métaboliques particulières mais en-

dessous de cette valeur, un stress respiratoire se manifeste bien que la mortalité ne survienne

qu'après 6 heures d'exposition à des teneurs inférieures à 3 ppm. Grâce à son hémoglobine

particulière à haute affinité pour l'oxygène dissous (0,12 ppm), cette espèce peut supporter sur

de courtes périodes des concentrations aussi faibles que 0,1 ppm d'oxygène dissous

(Kestemont et al., 1989).

34

2.5. Intérêt économique et importance halieutique :

Bien que l’Afrique soit le continent d’origine des tilapias, la production sur ce

continent reste extrêmement limitée. Quelques fermes industrielles commencent à apparaître

dans certains pays d’Afrique tels que l’Algérie, le Nigeria, le Zimbabwe, l’Ouganda, mais

tout reste à faire en terme de développement de l’aquaculture en général et de la pisciculture

du tilapia en particulier.

En 2004, le tilapia a gagné la huitième place parmi les produits comestibles de la mer

les plus populaires aux États-Unis d’Amérique. La production globale de toutes les espèces de

tilapia varie de 1,5 million tonnes en 2003 à 2,5 millions tonnes en 2010, avec une valeur

marchande de plus de 5 milliard de dollars U.S. La majeure partie de cette grande production

est représentée par Oreochromis niloticus (F.A.O., 2008).

Des études portent actuellement sur de nouvelles tendances culturales :

- Le développement de nouvelles souches à croissance plus rapide par des techniques de

reproduction sélective.

- Les procédures de reproduction visant à reproduire génétiquement des mâles

(population monosexe mâle) sans utilisation directe d’hormone.

- Les systèmes de polyculture en étang.

- Les systèmes rentables intensifs à recyclage (El-Sayed, 2006).

2.6. Nutrition et croissance :

Oreochromis niloticus est principalement phytoplanctonophage (Moriarty &

Moriarty, 1973) et consomme de multiples espèces de Chlorophycées, Cyanophycées,

Euglenophycées, ce qui ne l’empêche pas d’absorber des zooplanctons et aussi des sédiments

riches en bactéries et diatomées.

Oreochromis niloticus est une espèce connue pour sa croissance rapide (Lowe-Mc

Connell, 1982) et présente un indice de croissance plus performant que les autres espèces de

tilapia (Pauly & al., 1988). Sa durée de vie est relativement courte (4 à 7 ans). Sa vitesse de

croissance est extrêmement variable selon les milieux. La croissance la plus lente et la durée

de vie la plus courte sont observées dans le lac Alaotra au Madagascar (20 cm à 4 ans) et la

croissance la plus rapide et la longévité la plus longue (38 cm à 7 ans) sont observées dans le

lac Albert au Kenya (Kestemont & al., 1989).

MATERIEL

ET

METHODES

35

Matériel et méthodes

1. Matériel biologique :

Les poissons utilisés lors de cette expérience sont tilapia du Nil (Oreochromis

noliticus) adultes d’un poids moyen de 110 à 170 g provenant d’une ferme aquacole d’Ain

Skhouna (90 km au Sud de la wilaya de Saïda). Les poissons sont rapportés vivants au

laboratoire de l’Aquaculture et de Bioremédiation (AQUABIOR) et élevés dans des

aquariums adaptés.

Une fois abattus, les poissons sont écaillés et dépiautés manuellement. La quantité

d’écailles prélevée de chaque poisson est d’environ 1,10 à 3 g. La peau et les écailles de

poissons sont nettoyées, lavées à l'eau courante. La peau est coupée en petits morceaux de 1 x

1 cm. Les échantillons sont conservés à – 20 °C jusqu’à utilisation.

2. Préparation des coupes :

La peau est coupée en pièces 0,5 x 0,5 cm et fixé dans le BOUIN alcoolique (tableau

3), pendant deux semaines, après passage par des étapes de déshydratation dans l’acétone et

éclaircissement dans le xylène et une inclusion dans la paraffine (tableau 4). L’échantillon est

enrobé et mis en blocs.

Tableau 3 : Composition du Bouin liquide : solution mère (1l)

Solution Quantité

Alcool 95°

Acide picrique cristallisé

1l

10 g

Bouin alcoolique (100ml)

Solution Quantité Conservation

Solution mère

Formol

Eau distillée

Acide acétique glacial

45 ml

26 ml

22 ml

7 ml

2 Semaines

AQUABIOR, 2010 AQUABIOR, 2010

Figure 20 : Mode de prélèvements d’échantillons d’écailles (A) et de peau (B) du tilapia

du Nil (Oreochromis noliticus).

A B

36

Tableau 4 : Présentation des différentes étapes de déshydratation et inclusion

Etape Solution Durée

I- la fixation

Bouin alcoolique

15 jours

II- Déshydratation :

4 bains d’acétone :

2 bains de xylène :

Acétone 1

Acétone 2

Acétone 3

Acétone 4

Xylène 1

Xylène 2

30 min

30 min

30 min

30 min

1 h

1 h

III- inclusion et enrobage :

2 bains de paraffine

Paraffine 1

Paraffine 2

1h

1h

(Leeson et al., 1988)

2.1. Technique de préparation :

2.1.1. Fixation :

La fixation permet d’immobiliser les structures et les constituants cellulaires dans un

état aussi voisin que possible du vivant et ainsi les conserver pour permettre des préparations

permanentes.

2.1.2. Déshydratation :

La déshydratation par l’acétone. L’échantillon est d'abord déshydraté dans l’étuve à

40 °C (immersion dans deux bains successifs d'acétone).

2.1.3. Eclaircissement :

Le remplacement de l’acétone par un solvant de la paraffine pour éclaircissement est

destiné à chasser l'acétone par deux bains successifs de xylène qui durent 1h pour chaque bain

à 40 °C.

2.1.4. Inclusion dans la paraffine :

L’inclusion proprement dite dans la paraffine fondue qui prend la place du solvant ; Le

prélèvement imbibé de solvant est ensuite imprégné à chaud dans deux bains successifs de

paraffine fondue à 70 °C pendant 1heure pour chacun.

2.1.5. Enrobage et mise en blocs :

La préparation du bloc de paraffine (enrobage) se fait dans les barres de Leuckart

préalablement chauffées dans lesquelles on verse de la paraffine fondue pour obtenir après

refroidissement un bloc cubique solide.

37

2.1.6. Réalisation des coupes au microtome :

Le bloc de paraffine est débité perpendiculairement à la surface de la peau en sections

de 7 à 8 μm d’épaisseur à l’aide d’un microtome manuel AMERICAIN OPTICAL après avoir

monté le bloc de paraffine dans le porte bloc. Les rubans de coupe sont collés sur une lame en

verre à l’aide d’une colle biologique à base d’albumine 1 %. Le collage et le séchage se font

sur une plaque chauffante à une température de 37 à 40°C.

2.2. Coloration des coupes :

2.2.1. Coloration bichromique :

les lames sont colorées par hématoxyline et éosine (Guillermo,1998) , c’est une

coloration standard utilisée en histologie. Le collagène est coloré en rouge; le muscle en

jaune. Les étapes de la coloration sont décrites dans le tableau 5.

Tableau 5: Présentation des différentes étapes de coloration à l’hématoxyline et l’éosine.

Etapes Bains Durée

Déparaffinage

Rinçage

Hydratation

Coloration

Rinçage

Coloration

Rinçage

Déshydratation

3 bains d’alcool

Eclaircissement

Montage

2 bains de xylène

1 bain d'alcool absolu

1 bain d'alcool à 95°

Eau courante

à l'hématoxyline

à l'eau de robinet

à l'éosine

Eau courante

1 bain alcool 70°

1 bain d’alcool absolu

1bain d’alcool 95°

2 bains de xylène

milieu de montage (Eukitt)

Pose d'un couvre objet

(lamelle)

10 mn chacun

3 mn

3 mn

6 mn

1 mn

6 mn

10 secondes

6 mn

1 mn 30 secondes

2 mn

2 mn

5mn/bain

(Guillermo, 1998)

2.2.2. Coloration de Van Gieson :

La coloration de Van Gieson est une coloration spécifique du tissu conjonctif. Le fond

cytoplasmique, le muscle, la fibrine et les globules rouges sont colorés en jaune. Les noyaux

ne sont pas colorés. Le collagène est rose vif. C’est les mêmes étapes de coloration que

précédemment décrit avec la solution de Van Gieson comme colorant (tableau 6).

38

Tableau 6 : Préparation la solution de Van Gieson.

Solution Volume Durée

Acide picrique à saturation

Fuschine acide (1% dans de l’eau)

100 ml

5-15 ml

5 mn

2.3 Obtention des photos :

Les photos des coupes sont prises grâce à un microscope optique (model OLYMPUS

CX21) couplé à une caméra numérique (model Digital Camera Eyepiece DCE-1) raccordée à

un ordinateur à un grossissement de 5x et 10 x.

3. Extraction du collagène :

Le collagène est extrait selon la méthode de Nagai et Suzuki (2000) avec une légère

modification.

Les échantillons de peau et d’écailles sont traités séparément. Avant extraction du

collagène on procède d’abords à une déprotéinisation puis une délipidation.

La déprotéinisation s’effectue pendant 48 h sous agitation à 4 °C dans du NaOH 0,1 M

à raison de 1 g d’échantillon pour 30 ml de NaOH (la solution est changée toutes les 8 h). Les

composés alcalino-insoluble sont filtrés sur de la gaze, et lavés à l’eau distillée jusqu’à

neutralisation.

Après la déproteinisation, on procède à une délipidation au butanol 10 % (v/v),

pendant 24 h sous agitation à 4 °C. Le solvant est changé tous les 8 h. Le rapport échantillon-

solvant est de 1:30 (w/v). La solution est filtrée sur de la gaze. Le rétentat est lavé à l’eau

distillée jusqu’à neutralité.

Les composants insolubles de la peau et des écailles sont extraits dans l’acide acétique

0.5 M au rapport 1:50 et 1:10 (w/v) respectivement pendant trois jours sous agitation. Les

solutions visqueuses sont centrifugées à 14.000 g pendant 40 mn à 4 °C. Le surnageant de

chaque mélange est prélevé et conservé à 4 °C. Les précipités de la peau et des écailles sont

traités de nouveaux à l’acide acétique 0.5 M au rapport 1:30 et 1:5 (w/v) respectivement

pendant deux jours sous agitation. L’extrait de chaque solution est centrifugé à 14.000 g

pendant 40 mn à 4 °C.

Les surnageants issus des deux extractions successives, des échantillons sont salés au

NaCl 0,9 M. le collagène est précipité à 2,3 M NaCl dans du Tri-HCl 0,05 M pH 7,5. Après

centrifugation à 14000 g pendant 40 mn à 4 °C, les culots de la peau et des écailles sont

récupérés et dissouts respectivement dans 10 et 5 volumes d’acide acétique 0,5 M.

39

Les solutions sont dialysées contre 10 volumes d'acide acétique 0.1 M dans une

membrane de dialyse de porosité 1,5 à 3 nm, pendant 24 h à 4 °C. La solution de dialyse est

changée toutes les 4 h. Une seconde dialyse est effectuée contre de l’eau distillée jusqu’à

neutralisation. Le produit de la dialyse est lyophilisé pendant 24 h (model Liofilizador de

Laboratorio CRYODOS TELSTARO). Le dialysat est désigné sous le nom de l'ASC (Acide

Soluble Collagen).

4. Etude physico-chimique du collagène :

4.1. Mesure du spectre d’absorption :

L’ASC de la peau et des écailles est mesurée en utilisant un spectrophotomètre

(modèle Jenway 6315 spectrophotomètre UV/ visible). L'ASC (0,4 mg) est dissous dans 100

ml de tampon acétate de sodium 0,02 M (pH 4,8) contenant de l'urée 2 M. La solution est

placée dans une cuve en quartz de 1 cm de largeur. Le spectre UV est étudié dans un

intervalle de longueurs d'ondes compris entre 198-350 nm (Shao-kui et al., 2009).

4.2. Détermination de la solubilité du collagène :

La solubilité de l'ASC de la peau et des écailles d’Oreochromis niloticus est

déterminée dans l’acide acétique à 0,5 M à différents niveaux de pH et différentes

concentrations de NaCl selon la méthode de Jongjareonrak et al., (2005).

L’échantillon du collagène est dissout dans l'acide acétique à 0,5 M sous agitation

douce à 4 °C pendant 12 h pour obtenir une concentration finale de 3 et 6 mg/ml

respectivement pour le pH et la concentration de NaCl.

4.2.1. Effet du pH sur la solubilité du collagène :

Des solutions de collagène à une concentration de 3 mg/ml sont ajustées à différents

pH au NaOH 6 M ou HCl 6 M. On procède à une variation de pH allant de 1 à 10. Après

agitation de 30 min à 4 °C, la solution est centrifugée à 10.000 g pendant 30 min à 4 °C. La

teneur en protéines dans le surnageant est estimée par la méthode de Bradford en utilisant

l'albumine sérique bovine (BSA) comme protéine étalon.

4.2.2. Effet de la concentration de NaCl sur la solubilité du collagène :

Une solution de collagène (2,5 ml) à une concentration de 6 mg/ml dans 0,5 M d'acide

acétique est mélangée à 2,5 ml de NaCl à froid dans l’acide acétique à diverses

concentrations pour obtenir des concentrations finales de NaCl de 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%

40

et 6% (w/v). Les mélanges sont agités doucement pendant 30 min à 4 °C puis centrifugés à

10.000 g pendant 30 min à 4 °C. La teneur en protéines dans les surnageants est estimée par

la méthode de Bradford en utilisant la BSA comme protéine étalon.

4.3. Dosage des protéines :

Les protéines sont dosées selon la méthode de Bradford (1976) avec le BSA come

étalon. 10 µl d’échantillon sont mis en présence de 500 µl de réactif de Bradford et ajusté à 1

ml avec de l’eau distillée.

Le réactif de Bradford est constitué de Bleu de Coomassie (G-250) 100 mg, d’éthanol

(95 %) 50 ml, d’acide phosphorique (85 %) 100 ml et d’eau distillée q.s.p 1 litre.

5. Analyse du collagène par électrophorèse (PAGE-SDS) :

Le collagène (ASC) est analysé en PAGE-SDS. Le gel est préparé selon la méthode de

Laemmli (1970). Nous avons utilisé un gel de concentration de 5 % et de séparation de 7 %.

L’électrophorèse est réalisée sur plaque en verre de 20 x 16,5 cm; les espaceurs

utilisés ont une épaisseur de 1 mm (Bioblock).

Les échantillons de collagène (1 mg) sont dissous dans une solution de 1ml de tampon

phosphate de sodium pH 7,2, 0,02 M contenant du SDS 1 % (w/v) et urée 3,5 M. Le mélange

est agité doucement à 4 °C pendant 12 h. Le surnageant est recueilli après centrifugation à

3000 g pendant 3 min à 4 °C.

5.1. Préparation des gels :

Tableau 7 : Composition des gels d’électrophorèse

Solutions mères Gel de

concentration 5%

Gel de

séparation 7%

Solution d’acrylamide/bis-acrylamide 40 % 1,25 ml 7 ml

Tampon de séparation tris-HCl 1 M (pH 8,8) / 15 ml

Tampon de concentration tris-HCl 1 M (pH 6,8) 1,25 ml /

Solution SDS 10 % 0,1 ml 0,4 ml

Persulfate d’Ammonuim 10 % (μl)* 100 ul 400 ul

Temed (μl) 10 ul 40 ul

Eau distillée 7,35 ml 17,38 ml

* : Solution préparée extemporanément.

41

5.2. Solubilisation des échantillons et migration :

- Préparation des échantillons :

Les échantillons de volume v sont additionnés à ½ v de tampon de solubilisation.

Tableau 8 : Composition du tampon de solubilisation.

Tris-Hcl 1 M (pH 6,8) 0,15 g

Glycérol 2,5 g

SDS 0,4 g

Bleu de Bromophénol 1% 0,01 g

β-Mercaptoéthanol 0,5 g

Eau distillée 100 ml

40 µl de chaque échantillon est mélangé à 20 µl de tampon d’échantillon puis chauffés à 100

°C pendant 2 mn. Les dépôts sont réalisés à l’aide d’une seringue Hamilton.

- La migration :

Composition du tampon d’électrophorèse : la solution de migration est composée de

tris 0,25 M, glycine 1,92 M, SDS 1g et eau distillée q.s.p 1000ml; avant de compléter à l’eau

distillée le pH est ajusté à 8,3 au HCl. La migration est réalisée à 240 mA et 114 V.

5.3. Coloration des gels :

Après migration les gels sont démoulés et mis dans une solution de coloration pendant 1 h, de

composition ;

Bleu de coomassie R-250 (Merck) : 2,5 g

Méthanol : 450 ml

Acide acétique : glacial100 ml

Eau distillée : qsp 4 litres

5.4. Décoloration des gels :

Les gels sont ensuite décolorés dans un mélange acide acétique, méthanol et d’eau

distillée avec un rapport (3/1/6) (v/v/v). La solution est changée plusieurs fois jusqu’à

décoloration du gel.

RESULTATS

ET

DISCUSSION

42

Résultats et discussion

1. Etude histologique :

L’étude histologique est nécessaire pour visualiser et différencier les éléments

cellulaires et moléculaires. Il existe un très grand nombre de colorations histologiques qui

utilisent un à trois colorants différents en fonction du tissu observé, des cellules et

molécules que l’on veut révéler. Le principe des colorations histochimiques repose sur les

interactions chimiques (hydrophobicité, acidophilie, basophilie…) entre colorants et

molécules du tissu. Pour notre étude nous avons utilisé deux colorations (coloration

bichromique et coloration de Van Gieson).

La coloration au bichromate a permis de mettre en évidence le collagène coloré en

rose vif au niveau de la couche dermique et musculaire (figure 21). De même après la

coloration de Van Gieson, le collagène présente la même localisation (figure 22).

Figure 21: Observation microscopique de la peau d’oreochromis niloticus à partir d’une

coloration bichromique (1. grossissement x10 et 2. grossissement x5).

Figure 22 : Observation microscopique de la peau d’oreochromis niloticus à partir d’une

coloration de Van Gieson (grossissement x5).

A. épiderme; B. fibres de collagène; C. les fibres musculaires.

AQUABIOR, 2010

A

B

B

C

AQUABIOR, 2010

A

C

B

AQUABIOR, 2010

A

C

B

43

La peau des poissons est constituée d’un épiderme et d’un derme séparés par une

membrane basale, l’hypoderme restant quasi inexistant.

En effet, Les fibres de collagène sont observées dans la couche dermique de la peau du

tilapia du Nil. Elles sont également observées dans la couche musculaire. Ce résultat est en

accord avec celui de Bauchet (2006) qui a montré l’existence du collagène dans le derme du

poisson medaka (Oryzias latipes) et celui de Yan et al. (2009) chez le calmar (Ommastrephes

bartrami)

2. Extraction du collagène :

Le collagène acido-soluble (ASC) est extrait à partir de la peau et des écailles du

tilapia du Nil (Oreochromis niloticus). L’ASC issus des deux échantillons n’est pas

complètement solubilisé dans l'acide acétique, mais dissous dans ce dernier. Le rendement

d’ASC de la peau est 5 fois plus élevé que celui des écailles. Le rendement des écailles est de

4 % alors que celui de la peau est de 19,53 % (figure 23).

Figure 23: Rendement d’ASC à partir de la peau et des écailles du tilapia du Nil

(Oreochromis niloticus)

Ces résultats concordent avec les travaux d’Ogawa et al. (2003) qui ont obtenu un

rendement d’ASC de la peau de la même espèce à 20,70% ce qui était plus élevé chez

0

20

40

60

80

100

Peau Ecailles

poids résiduel

(%)Poids initial

Poids après déprotéinisation

Poids après délipidation

ASC )poids lyopholisé(

44

Noitup et al. (2005) et Nagai et Suzuki (2000) qui ont obtenus un rendement de collagène

respectivement 38,84 % et 39,4 %.

Ceci suggère que le rendement d'ASC de la peau d’Oreochromis niloticus est

beaucoup plus élevé que celui de la peau de vivaneau à bande brune (Lutjanus vitta) (9%)

(Nagai et al., 2002), de torafugu ou poisson-globe tigré (Takifugu rubripes) (10,70%), de

tambour noir (Pogonias chromis) (2,30 %), de rondeau mouton (Archosargus

probatocephalus) (2,60%) (Ogawa et al, 2003), de carpe herbivore (Ctenopharyngodon

idella) 8,00% (Zhang et al., 2007). Par contre, les peaux de loup de mer (Lateolabrax

japonicus) (51,4%), de maquereau (Scomber scombrus) (49,8%), de requin dormeur cornu

(Heterodontus francisci) (50,1%) (Nagai & Suzuki, 2000) et de perche du Nil adulte (Lates

niloticus) (58,70%) (Muyonga et al., 2004), présentent des rendements plus intéressants.

3. Etude physico-chimique du collagène :

3.1. Spectre d’absorption en UV du collagène :

La plupart des protéines ont une absorbance maximale aux environs de 280 nm. Ceci

est lié à la présence des acides aminés aromatiques tels que la tyrosine et le tryptophane.

L’étude du spectre d’absorption à l’UV de l’ASC de la peau (figure 24) et des écailles

(figure 25) du tilapia du Nil, montre un maximum d’absorption de 210 nm très inférieur au

maximum d’absorption des protéines. Cette particularité serait liée à la présence importante

de CO, COOH et CONH2 au niveau des chaînes polypeptides de collagène (Edwards et al.,

1997). Il serait aussi suggéré que la diminution du maximum d’absorption est liée à la faible

teneur en tyrosine du collagène (Duan et al., 2009).

Figure 24: Spectre d’absorption en UV d’ASC à partir de la peau d’Oreochromis niloticus.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

190 210 230 250 270 290 310 330 350

Absorbance

Longueur d'onde (nm)

Peau

45

Figure 25: Spectre d’absorption en UV d’ASC à partir des écailles d’Oreochromis niloticus.

Les résultats obtenus en figure 24 et 25 confirment donc que les solutions analysées

sont bien du collagène et sont aussi confortées par les travaux de Liu et al. (2007) sur la peau

de barbue de rivière (Ictalurus punctatus), Yan et al. (2008) sur la peau de colin d’Alaska

(Theragra chalcogramma) et Zhang et al. (2009) sur la peau de poisson-chat (Mystus

macropterus) qui observent des maximums d’absorption compris entre 210-240 nm.

3.2. Détermination de la solubilité du collagène :

3.2.1. Effet du pH sur la solubilité du collagène :

L’étude de l’influence du pH sur la solubilité du collagène a été réalisée sur les deux

extraits lyophilisés des ASC de la peau et des écailles du tilapia du Nil.

Les extraits lyophilisés ont été solubilisés dans des solutions d’acide acétique 0,5 M de

pH 1 à 10. Après solubilisation, la teneur en protéine du surnageant est quantifiée par la

méthode de Bradford (1967), en réalisant une courbe étalon au BSA (figure 26).

L’ASC de la peau présente une solubilité maximale aux environs des pH 2 et 3 (figue

27). En effet, la teneur maximale en protéines (ASC) est au niveau des surnageants obtenus à

ces pH. Plus de 90 % de l’ASC de départ ont été solubilisé. Ceci confirme donc la propriété

acido-soluble du collagène. A partir du pH 6 la solubilité diminue fortement jusqu’à presque

s’annulée entre les pH 8 et 9.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

190 210 230 250 270 290 310 330 350

Absorbance

Longueur d'onde (nm)

Ecailles

46

Figure 26 : Courbe de la gamme étalon selon la méthode de Bradford (1967).

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Ab

sorb

ace

à 5

95

nm

Concentration (BSA( (µg/ml(

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Teneur en

protéine (g/l(

pH

Peau

Figure 27: Solubilité d’ASC de la peau d’Oreochromis niloticus dans l’acide acétique

à 0,5 M à différents niveaux de pH

47

Les résultats indiquent que le pHi de l’ASC de la peau du tilapia serait compris entre 8

et 9. Des travaux similaires sur différents collagènes suggèrent en effet que le pHi de cette

molécule est compris entre 6 et 9 (Foegeding et al., 1996).

Les mêmes résultats sont obtenus sur les extraits ASC des écailles (figure 28), ou le

maximum de solubilité est observé à pH 3 et le minimum entre 8 et 10, à de différence que la

chute de la solubilité est observée à partir de pH 7 au lieu de pH 6 pour l’ASC de la peau.

3.2.2. Effet de la concentration de NaCl sur la solubilité du collagène :

Dans le même contexte, nous avons étudié la solubilité des différentes fractions

d’ASC en faisant varier la force ionique du milieu.

Les fractions lyophilisées d’ASC de la peau et des écailles, sont solubilisées dans un

gradient de concentration croissant de NaCl (0 à 6 %). La teneur en protéines solubles dans le

surnageant est estimée de la même façon par la méthode de Bradford (1967) avec le BSA

comme protéine étalon (figure 26).

L’ASC de la peau présente une bonne solubilité entre 0 et 2 % de NaCl. Une chute

importante de la solubilité est observée à partir de 3 % de NaCl (figure 29). L’ASC des

écailles reste soluble jusqu’à 1 % en NaCl et présente par contre une chute importante de

solubilité à 2 % de NaCl ou presque 50 % des protéines précipitent (figure 30).

0

1

2

3

4

5

6

7

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Teneur en

proteine (g/l))

pH

Ecailles

Figure 28: Solubilité d’ASC des écailles d’Oreochromis niloticus dans l’acide acétique

à 0,5 M à différents niveaux de pH

48

Le NaCl baisse la solubilité du collagène en améliorant les interactions hydrophobe-

hydrophobe provoquant une agrégation des liaisons et rupture des liaisons ioniques avec

l’eau, d’où la précipitation des protéines (Damodaran, 1996 ; Vojdani, 1996).

0

1

2

3

4

5

6

0 1 2 3 4 5 6

Teneur en

protéine (g/l(

Concentration de NaCL (%(w/v))

Peau

0

2

4

6

8

10

12

14

0 1 2 3 4 5 6

Tieneur en

proteine (g/l)

Cencentration de NaCl (% (w/v))

Ecailles

Figure 29: Solubilité d’ASC de la peau d’Oreochromis niloticus dans l’acide acétique à 0,5

M à différentes concentrations de NaCl

Figure 30: Solubilité d’ASC des écailles d’Oreochromis niloticus dans l’acide acétique à

0,5 M à différentes concentrations de NaCl

49

Des résultats similaires sont observés pour l’ASC de la peau de Vivaneau à bande

brune (Lutjanus vitta) (Jongjareonrak et al., 2005), de beauclaire pintade (Priacanthus

tayenus) (Kittiphattanabawon et al.,2005) et de poisson-chat (Pangasianodon hypophthalmus)

(Singh et al., 2011).

4. Analyse du collagène par électrophorèse (PAGE-SDS) :

En vue de connaitre le type de collagène extrait, les molécules d’ASC de la peau, des

écailles et des os du tilapia ont été étudiées en PAGE-SDS.

Le pattern protéique obtenu (figure 31) montre des profils identiques pour les 3

extraits ; soit 3 bandes majeures de 200, 118, 105 Kda. Les bandes correspondraient

respectivement aux chaines β, α1 et α2. Cette configuration est caractéristique du collagène

type I.

Figure 31 : Analyse d’ASC du tilapia du Nil (Oreochromis niloticus) par SDS-PAGE

1 : collagène de la peau - 2 : collagène des écailles - 3 : collagène de l’os

β

α 1

α 2

1 2 3

200 Kda

100 Kda

85 Kda

70 Kda

60 Kda

50 Kda

150 Kda

120 Kda

AQUABIOR, 2010

50

Le collagène type I est en effet structuré en triple hélice : deux hélices α1 et une hélice

α2. Il appartient à la famille des collagènes fibrillaires et est présent dans les tissus

conjonctifs, abondant dans le derme, les os, les tendons, les ligaments et la cornée. Deux

gènes COL1A1 et COL1A2 codent respectivement pour α 1 et α 2 (Vuorio & De

Crombrugghe, 1990).

La bande protéique β présente généralement dans les extraits collagèniques correspond

à une protéine ligand non collagènique de 200 Kda. La sous unité β1 est exprimé par les

cellules endothéliales et reconnait comme ligand, le collagène, la laminine et la fibronectine

(Kramer et al., 1990 ; Defilippi et al., 1991).

Des profils protéiques d’ASC similaires à nos travaux sont observés chez le poisson-

globe tigré (Takifugu rubripes) (Nagai et al., 2002), le tambour noir (Pogonias chromis) et

rondeau mouton (Archosargus probatocephalus)(Ogawa et al., 2004), la perche du Nil (Lates

niloticus) (Muyonga et al., 2004), le beauclaire pintade (Priacanthus tayenus)

(Kittiphattanabawon et al., 2005), le poisson de globe ou fugu (Lagocephalus gloveri)

(Senaratne et al., 2006), le Colin d'Alaska (Theragra chalcogramma) (Yan et al., 2008), le

requin bambou (Chiloscyllium punctatum) (Kittiphattanabawon et al., 2010) et le poisson-chat

(Pangasianodon hypophthalmus) (Singh et al., 2011),

CONCLUSION

51

Conclusion

L’exploitation des filets de tilapia génère une quantité importante de sous-produit

(plus de 50% du poids). Troisième production mondiale en quantité de poisson, le tilapia est

un bon candidat pour la production du collagène à partir des sous-produits.

Cette étude a permis de déterminer les conditions optimales pour l'extraction du

collagène à partir des sous-produits tels que la peau et les écailles du tilapia du Nil

(Oreochromis niloticus).

Les coupes histologiques montrent en effet une présence importante de collagène

présent au niveau dermique. La peau serait plus riche en collagène que les écailles, il

représente respectivement 19,53 % et 4 % du poids initial des déchets.

La méthode décrite pour l’extraction d’ASC semble efficace, vu l’obtention de

molécules relativement pur. On obtient en effet des spectres d’absorption à l’UV homogènes

et caractéristiques du collagène. Le maximum d’absorption est de 210 nm, observé aussi bien

pour l’ASC de la peau que de l’écaille.

Le caractère acide soluble du collagène extrait est bien mis en évidence. A pH 3, les

molécules extraites présentent une parfaite solubilité. Cette solubilité diminue brusquement à

partir de pH 5 pour la peau ou plus de 60 % du collagène précipité. A ce même pH, le

collagène des écailles présente environ 20 % de précipitation. L’influence de la force ionique

du milieu semble aussi montrer des différences entre l’ASC de la peau et l’ASC des écailles.

Alors que la solubilité de l’ASC des écailles est affectée à partir de 1M de NaCl, l’ASC de la

peau se trouve encore soluble jusqu’à 2M en NaCL. Au delà il y’a précipitation.

Les profils électrophorètiques des ASC obtenus confirment la présence de collagène

type I de par la présence des chaines α1 et α2.

En vue d’une meilleure caractérisation de cette molécule pour usage industriel, une

étude de l’influence de la température sur la dénaturation du collagène serait déterminante,

bien que le collagène des poissons soit connu pour sa sensibilité à des températures

inferieures à 30 °C, restent relativement plus faibles que celles des mammifères terrestres.

Aussi l’étude de la viscosité dans différent milieu permettrait de mieux cibler son

usage éventuellement dans l’industrie cosmétique et alimentaire. La connaissance du poisson

influe sur la structure du collagène. Les différents paramètres étudiés en fonction de l’âge du

tilapia permettraient aussi un meilleur rendement en collagène d’un point de vue quantitatif et

qualitatif.

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