EXTRACCIÓN DE DNA MITOCONDRIAL modificada.pdf
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EXTRACCIÓN DE DNA
MITOCONDRIAL
EQUIPO 1:
Cuenca Pérez Emir Moisés
Estrada Aguilar Flor Ivonn
Flores Pimentel Felipe Antonio
Marcelino Ayala Manuel
Sánchez Arrieta Yesssenia
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Las mitocondrias son orgánulos que se encuentran en las células eucariotas
Contienen las enzimas para la mayoría de las reacciones oxidativas que generan energía para las funciones
celulares.
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• Poseen varias características importantes que las hace un poco diferentes del resto de los orgánulos de las células eucariotas.
Por ejemplo, son orgánulos de doble membrana, poseen una envoltura exterior y una envoltura interior. la característica más sorprendente y diferencial es que poseen su propio ADN (ADNmt).
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ADN
• Se trata de una molécula circular de ADN, helicoidal, con doble hebra, y supercondensada.
• En los seres humanos tiene un tamaño aproximado de 16569 pares de bases mientras que en levaduras contiene cerca de 80000 pares de bases y en plantas varía entre 100 y 2000 kb.
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ADN Mitocondrial
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El ADN MITOCONDRIAL se hereda en todas las personas ,es procedente de la madre.
Nos permite ver las relaciones hermano-hermano de madre.
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• TIPOS DE MUESTRA
(Sangre, pelos, saliva, semen, etc...).
• ESTADO DE LA MUESTRA
(Buen estado ó degradada).
• CANTIDAD DE MUESTRA
(Indicios mínimos, o cantidad suficiente).
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Pretratamineto
• Limpieza superficial de los RO o dientes, para la
eliminación de los posibles contaminantes
(material exógeno y/o bacterias).
• Se realizan lavados con agua destilada o
eliminación de la capa superficial mediante
abrasión mecánica o lijado.
• Irradiación de las piezas a analizar con luz
ultravioleta.
• Pulverización.
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• Descalcificación del polvo de hueso
mediante lavados con EDTA, que es un
quelante iónico que actúa secuestrando
las sales iónicas contenidas en la
muestra, incluyendo el calcio de los
huesos.
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EXTRACCIÓN
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PROTOCOLO: “Extracción de
ADN por fenol:cloroformo” • Las muestras son digeridas con proteinasa K
y un detergente como Triton X-100 o SDS, que rompe las membranas celulares.
• El digerido es mezclado con una solución de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:25:1), paso que es repetido hasta eliminar la coloración.
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•Para eliminar las trazas de fenol, se puede anadir una solución de cloroformo:alcohol isoamílico .
•La fase acuosa, que contiene el ADN se trasvasa a un tubo limpio.
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• A partir de este punto, se incluye una fase de precipitación con acetato amónico y etanol absoluto frío, introduciendo la concentración en pequeños volúmenes ,usando sistemas de filtración por centrifugación.
• Dicha concentración se realiza mediante dispositivos de ultrafiltración 80,81, que permiten la retención selectiva del ADN extraído.
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Protocolo
«Desmineralización-silica» • Presenta 2 claves fundamentales: la
digestión completa, aumentando la proporción de tampón de digestión y polvo de hueso; y la eliminación de inhibidores, mediante la purificación con resina.
• Digestión inicial de toda la matriz ósea, lo que supone una desmineralización total.
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• El tampón de desmineralización consiste en EDTA (0,5 M), laurilsacnosinato sódico (1%) y proteinasa K.
• Una vez digerido, el sobrenadante es filtrado en dispositivos de ultrafiltración92, y el volumen recuperado
• Pasa a ser procesado siguiendo las especificaciones de la casa comercial del kit QIAquick®.
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Silica-sal • Se añade polvo de hueso/diente de una
solución de extracción, consistente en EDTA y proteinasa K.
• Dejar incubar toda la noche
• Al sobrenadante obtenido se le añade una solución de unión de base de tiocianato de guanidinio (GuSCN) concentrado y cloruro o acetato sódico (NaCl/Ac), y la suspensión de silica
• Incubar en obscuridad
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• Una vez descartado o almacenado el sobrenadante al precipitado de silica someter a lavados con solución de lavado de base etanólica (EtOH 50%, NaCl yEDTA)
• Finalmente se añade la cantidad requerida de tampón TE para eluir el ADN retenido en la silica.
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• NOTA:
Para muestras que no contienen inhibidores de la PCR, se pueden usar otras sales diferentes, como el cloruro sódico. Estas sales no caotrópicas son mucho más baratas y actúan igual de bien o incluso mejor en términos de recuperación de ADN. Pero, tienden a copurificar inhibidores de la PCR y, por tanto, no deben ser usadas con muestras que probablemente contengan inhibidores.
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Bibliografía
• Barrio-Caballero PA. Revisión de métodos
de extracción de ADN a partir de restos
óseos en el laboratorio forense. Rev Esp
Med Legal. 2012.
http://dx.doi.org/10.1016/j.reml.2012.11.00
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