Exercise - ESIbadiaa/CHM3102_chromato3a.pdf10th International Symposium of Proteins, Peptides and...
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Exercise
1CHM 3102
Dans le but de préparer une colonne d’immunoaffinité vousdevez purifier des anticorps IgG à partir d’épanchementascitique de souris, quelle mode de séparation et quel type de colonne utiliserez vous et comment pourriez vous vérifier la pureté de l’échantillon?
Chromatographie par interaction hydrophobique
2CHM 3102
Principe de séparation∆G = ∆H - T∆S
Ligand PH
Protéine
Régionhydrophobe
Ligand
PH
+ +
Support solide
Moléculed’eau
L’échantillon protéique est dissout dans un tampon de sel de haute concentration.
Les molécules d’eau près de la surface du ligand et de la surface hydrophobe de la protéine sontplus ordonnées qu’en solution (effet “protection”).
Le déplacement des molécules d’eau entourant le ligand et la région H de la protéine donne lieu a une augmentation d’entropie rendant ainsi cette interaction thermodynamiquement favorisée.
Interactions de type van der Waals augmentent entre le ligand et la région H avec l’augmentation
de la structure ordonnée de molécule d’eau en présence de sel (“salting out”).
• Fractionation of proteins by hydrophobic interaction chromatography, with reference to serum proteins. Proceedings Intl. Workshop on Technology for Protein Separation & Improvement of Blood Plasma Fractionation. Reston, Virginia, 1977, 410–421, Hjertén, S.
• Salt effects on hydrophobic interactions in precipitation and chromatography of proteins: an interpretation of the lyotropic series. Arch. Biochem. Biophys. 183 (1977) 200–215, Melander, W.,Horvath, C.
• Role of physical forces in hydrophobic interaction chromatography. Separation & Purification Methods 9 (1980) 267–370, Srinivasan, R., Ruckenstein, E.
Chromatographie par interaction hydrophobique
3CHM 3102
Facteurs affectant la chromatographie par interaction hydrophobique
Type de ligand et degré de substitutionType de support solideConcentration et type de selpHTempératureAdditifs
Chromatographie par interaction hydrophobique
4CHM 3102
Type de ligand type et degré de substitution
Cap
acité
de
liais
on
(mg p
roté
ine/
ml gel
)
C4 C6 C8µmol ligand/ml gel10 20 30
• La capacité de liaison de l’adsorbant augmenteavec la chaine alkyl et le degré de substitution.
• Un plateau de capacité de liaison est atteintlorsque le degré de substitution est elevémarquant un ancrage multipoint de la protéine et une difficulté d’élution.
• Le degré de substitution est plus faible qu’enchromato. phase inverse (d’environ 30 vs. >100 µmol ligand/ml gel).
Les gels Sepharose sont produits par Amersham Bioscienceset comprennent de l’agarose (3,6-anhydro-L-galactose)“cross-linked” formant des macropores permettant l’accès de biomolecules de 4 MDa (agarose 6%), 27 MDa (agarose 4%). Les gels superose sont des billes de 13 um diam. d’agarose(12%) “cross-linked” pour colonne FPLC.
Chromatographie par interaction hydrophobique
5CHM 3102
Type de support
Les supports solides sont typiquement hydrophilique et contiennent des gels à base d’hydrate de carbone e.g. agarose ou co-polymères synthétique greffés.
La selectivité sur un support de co-polymère ne sera pas la même que sur un support de type agarose utilisant le mêmetype de ligand.
Pour obtenir le même type de résultats il serait nécessaire de modifier les conditions d’adsorption et d’élution.
Chromatographie par interaction hydrophobique
6CHM 3102
Concentration et type de sel
Capacité de charge sur unecolonne Phenyl Sepharose en fonction de la concentration de sel initiale (AmershamPharmacia Biotech).
Formationde ppt.
• Protéines sont injectées dans un tampon de sel de haute concentration (sous le point de ppt).
• La colonne est préconditionnée avec le mêmetampon et concentration de sel.
• Les protéines sont eluées avec un gradient de selprogressivement plus dilué (tampon dilué ou avec de l’eau).
Série de Hofmeister et effet sur la ppt
Aug. de la ppt (“salting out”)
Anions: PO43-, SO4
2-, CH3COO-, Cl-, Br-, NO3-, ClO4
-, I-, SCN-
Cations: NH4+, Rb+, K+, Na+, Cs+, Li+, Mg2+, Ca2+, Ba2+
Aug. de l’effet chaotropique (“salting in”)
Voir: Arch. Biochem. Biophys. 183 (1977) 200–215, Melander, W.,Horvath, C.Separation & Purification Methods 9 (1980) 267–370, Srinivasan, R., Ruckenstein, E.
Chromatographie par interaction hydrophobique
7CHM 3102
pH Volume d’elution/volume protèines non-retenues
En général les interactions hydrophobiques sont diminuéesavec l’augmentation de pH possiblement avec l’apparitiond’un plus grand nombre de site négativement charge rendant la protéine plus hydrophilique.
La diminution du pH occasionneune augmentation apparentedes interactions hydrophobiquespossiblement dû a un changement de conformation rendant la protéine plus hydrophobe.
1: Soyabean trypsin inhib. 5: Enolase2: Hum. Serum Alb. 6: Ovalbumine3: Lysozyme 7: RNase4: Transferrin 8: Cytochrome C
Hjertén, S., Yao, K., Eriksson, K.-O., Johansson, B. “Gradient and isocratic High Performance Hydrophobic Interaction Chromatography of proteins on agarosecolumns”. J. Chromatog. 359 (1986) 99–109,
Chromatographie par interaction hydrophobique
8CHM 3102
Température
Généralement les interactions hydrophobiques augmententavec l’accroissement de température dû à l’effet entropique et aux forces d’attractions van der Waals.
Cependant dans certains cas les protéines peuvent êtredénaturées et changer de conformation avec l’augmentation de température donnant lieu à un changement de solubilité en solution
Chromatographie par interaction hydrophobique
9CHM 3102
Additifs
• De faibles concentrations d’alcools, détergents et d’agents chaotropique(“salting-in”) miscibles dans l’eau affaiblieront les interactions hydrophobiques et occasionneront l’élution des protéines.
• Les groupes non-polaires alkyls des alcools et détergents compétitionnentavec les protéines liées et peuvent déplacer celles-ci du ligand.
• Les effects chaotropiques des sels affectent la structure de la sphèred’hydratation des protéines liées et diminue la tension de surface de l’eau.
• L’utilisation d’additifs ne doit pas compromettre l’activité des protéines ouleur dénaturation.
• Ceux-ci peuvent etre utilisés pour reconditionner les colonnes et dissocierles protéines adsorbées.
Chromatographie par interaction hydrophobique
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Exemple de séparation% A
100
80
60
40
20
Colonne: Phenyl Superose PC 1.6/5Echantillon: Fraction active d’un homogénat de cerveau de
boeuf purifié par CEA.Tampon A: 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT, I mM EDTA,
1.7 M (NH4)2SO4.Tampon B: 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT, I mM EDTA.Débit: 50 µl/min.Détection: A280nm ou activité GAP-3 (hydrolyse 32P-GTP)
Nice, E., Fabri, L., Burgess, A., Simpson, R., Hellman, V., Andersson, K., A multidimensional HPLC strategy for the purification of proteins and peptides for micro-sequence analysis: - The role of micropreparative ion exchange columns. 10th International Symposium of Proteins, Peptides and Polynucleotides, Wiesbaden, Germany, October 1990
Chromatographie par interaction hydrophobique
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Exemple de séparation% B
100
80
60
40
20
0
Colonne: Alkyl Superose HR 5/5Echantillon: 100 µl ascite de souris contenant anticorps
monoclonal IgG1(a) ou IgG2a (b).Tampon A: 0.1M phosphate, pH 7, 2 M (NH4)2SO4.Tampon B: 0.1M phosphate.Détection: A280nm
Amersham Biosciences
Chromatographie sur phase inverse
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Principe de séparation
Phase stationnaire greffée avec ligand C4, C8 ou C18
Peptide injecté dans la phase mobile et entrainevers la colonne
Peptide adsorbé sur la phase stationnaire
Peptide désorbé de la phase stationnaire avec le gradient d’acetonitrile
• Le peptide est d’abord adsorbé sur la phase stationnaire en présence d’une phase mobile aqueuse.
• La désoption du peptide est effectuée en augmentant le % solvant organique(e.g. acetonitrile) en utilisant un gradiant d’élution.
• La colonne est par la suite ré-équilibrée avec le solvant aqueux.
• Phénomène d’adsorption ou la séparation survient par un mécanisme de partition entrela phase mobile et la phase stationnaire.
• La distribution du peptide entre les deux phases depend des affinités hydrophobiqueset de la composition de la phase mobile
Chromatographie sur phase inverse
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Facteurs affectant la chromatographie surphase inverse
Phase stationnaireType de ligandComposition de la phase mobile Diametre des poresTaille des particulesDimension de la colonneTempératureAdditifs
Chromatographie sur phase inverse
14CHM 3102
ColonneAcier inoxydable (pression)Diamètre des particules : 3 à 10 µmTaille des pores : 70 à 300 ÅAire : 50 à 250 m2/g
Chromatographie sur phase inverse
15CHM 3102
Phase stationnaire
[W.R.Melander, C.Horvath, Reversed-Phase Chromatography, in HPLC Advances and Perspectives, V2, Academic Press, 1980]
[K.K.Unger, Porous silica, Elsevier, 1979]
Chromatographie sur phase inverse
16CHM 3102
Phase stationnaire
Comprend des groupessilanol libres pouvantdonner lieu a d’autrestypes d’interactions
Chromatographie sur phase inverse
17CHM 3102
Phase stationnaire
Solubilité de la silice en fonction du pH
Limitations de la silicepH
<2 (hydrolyse Si-O-Si-R)>8 (dissolution)
Tamponphosphate (inorganique) vsTris (organique)Molarité
Température
Supports polymériques (PS-DVB) également utilisé
Chromatographie sur phase inverse
18CHM 3102
Phase stationnaire
Modification des groupes silanols
Chromatographie sur phase inverse
19CHM 3102
Type de ligand et diamètres des pores
300 Å50-100 Å
Transfert de masserestreint
Transfert de masseplus efficace
Diamètres des pores
Phase greffée
Silanol libre résiduel
Ether; source de silanol
n: 17, C187, C83, C4
Greffon
Groupe terminal (Capping group)
Chromatographie sur phase inverse
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Composition de la phase mobile (solvants)Acetonitrile (ACN)• Volatile • Faible viscosité• Peu d’absorption UV adsorption à basse longueur d’onde• Couramment utilisé pour la séparation des peptides
Isopropanol• Utilisé pour les protéines de masse élevée ou tres hydrophobe• Viscosité élevée• Peut etre dilué avec ACN 1:1• 1-3% IPA dans ACN peut améliorer le rendement dans certain cas (Synthetic
Peptide Purification by Application of Linear Solvent Strength Gradient Theory, J.C. Ford and J.A. Smith, J. Chrom. 483, 131–143 (1989))
Ethanol• Utilisé pour purification a grande échelle• Bon solvant pour la chromato. phase inverse• Utilisé pour l’élution de protéines hydrophobes
Methanol et autres solvantsOffre tres peu davantage comparativement aux solvants plus couramment utilisés
Chromatographie sur phase inverse
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Propriétés physiques des solvants
Chromatographie sur phase inverse
22CHM 3102
Viscosité des mélanges de solvants
La viscosité des mélanges eau-alcoolaugmente de façonsignificative jusqu’àune proportion 1:1.double
50%
Chromatographie sur phase inverse
23CHM 3102
Composition de la phase mobileGradient d’élution
Elution trop rapide
Elution trop lente
Elution trop rapide
Elution trop lente
Comment améliorer la résolution?
Chromatographie sur phase inverse
24CHM 3102
Gradient d’élution et solvant organique
N. C. Robinson, M.D. Dale, L.H. Talbert, “Subunit Analysis of Bovine Cytochrome c Oxidase by Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography”, Arch. of Biochem. and Biophys. 281(2), 239–244 (1990)
Colonne: Vydac 218TP104Echantillon: Sous-unités cytochrome C oxidaseGradient: 25-50% acetonitrile (0.1%TFA)Détection: A214nm
Une meilleure résolution peutêtre obtenue avec un gradient plus lent
Il est recommandé d’avoir unecomposition initiale de 3-5% ACN pour réduire le temps de re-équilibration et la difficultéa rehydrater la phase stationnaire. On peut utiliserune pente d’élution de 0.5-1.0%/min
Chromatographie sur phase inverse
25CHM 3102
Composition de la phase mobileL’ionisation de differents acidesaminés peut influencer l’adsorption et l’ordre d’élution
1 Bradykinin2 Oxytocin3 Angiotensine II4 Neurotensine5 Angiotensine III
Effect du pH
Chromatographie sur phase inverse
26CHM 3102
Composition de la phase mobileFormation de paire d’ions
Acide trifluoroacetique (TFA)
• Courramment utilisé pour les séparations de peptides
• Volatil• Peu d’absorption UV a basse
longueur d’onde• Concentration typique: 0.1% dans
eau et ACN• Peu etre utilise pour solubiliser
protéines hydrophobiques
0.1% TFA
0.3% TFA
Digest trypsiqued’apotransferrin surcolonne Vydac218TP54
0.1% TFA
20 mM phosphate pH:2
5 mM HCl pH:2
Separation de peptides surcolonne Vydac218TP54
1. oxytocin2. bradykinin3. angiotensin II 4. neurotensin5. angiotensin I
Autres
Acide heptafluorobutyrique (HFBA)Triethylamine phosphate (TEAP)Acide formique – LC/MS
Variation de sélectivité
Chromatographie sur phase inverse
27CHM 3102
Taille des particules
Avantage: N ↑
Inconvénient : P ↑
3500
pdLN ≈
L : longueur de la colonne (cm)dp : diamètre des particules (µm)
Chromatographie sur phase inverse
28CHM 3102
Taille des particules
Perte de charge (∆P) : pression qu’il faut appliquer pour faire passer la phase mobile dans la colonne chromatographique
15022cpddFLP η
≈∆L : longueur de la colonne (cm)dp : diamètre des particules (µm)dc : diamètre de la colonne (cm)F : débit (mL/min)η: viscosité (cP)∆P : perte de charge (atm)
Horvath, C., in Chromatography, partie A, Heftmann (Ed.), Chap. 3, 1983
Chromatographie sur phase inverse
29CHM 3102
Taille des particules
Separation de peptide standards surune colonne Vydac 214TP avec particules de differentes dimensions Gradient: 24–95 % ACN (0.1% TFA) en 30 min debit: 1.5 mL/min.
5 µm
10 µm
15-20 µm
The Handbook of Analysis and Purification of Peptides and Proteins by Reversed-Phase HPLC Grace Vydac, 3rd Edition, 2002
Largeur de pic selon la variation de la taille des particules et de la quantité chargéeConditions: VYDAC® 214TP, 5 µm, 10 µm, 15–20 µm, 20–30 µm Gradient: 24–95 % ACN (0.1% TFA) en 30 min debit: 1.5 mL/min; echantillon: ribonuclease.
Les difference de performance analytique entre les tailles de particulesdeviennent moins grande avec la quantite chargee.
Chromatographie sur phase inverse
30CHM 3102
Dimension de la colonne et considérationspratiquesDébit actuel peut varier d’un facteur 2 plus haut ou plus bas dependant de la méthode
Capacité de charge optimalecorrespond a la quantité de peptide pouvant être chargé sur la colonne sans compromettre la résolution
Quantité maximale de charge correspond à la quantité maximaled’échantillon pouvant être purifiésur la colonne avec un rendementet une pureté raisonable
The Handbook of Analysis and Purification of Peptides and Proteins by Reversed-Phase HPLC Grace Vydac, 3rd Edition, 2002
Pression pour une colonne de 25 cm (1:1 eau:ACN) est typiquement de 1000-1800 PSI
Chromatographie sur phase inverse
31CHM 3102
Température
La température de la colonne peutaffecter la viscosité du solvant, la pression (perte de charge), le temps de rétention et la sélectivité. Unetempérature < 60°C estrecommandée afin de limiter la dégradation de la phase stationnaireet l’élévation accrue de la pression(<5000 PSI).
Separation de digest trypsique de l’hormone de croissance humaineConditions: C18, 4.6 x 150 mm. Debit: 1 mL/min. Gradient de 0–60% ACN (0.1% TFA) en 60 min. Hancock et al.
Temperature as a variable in reversed-phase high-performance liquid chromatographic separations of peptide and protein samples. I. Optimizing the separation of a growth hormone tryptic digest, W.S. Hancock, R.C. Chloupek, J.J. Kirkland and L.R. Snyder, J. Chrom. 686, 31–43 (1994)
Chromatographie sur phase inverse
32CHM 3102
Exemple de séparation
Identification de variant génétique lors de l’apparitionde globule rouge anémiquede type faucille
Conditions: VYDAC® 218TP51 (C18, 5 µm 1.0 x 250 mm) Gradient: 0–40% ACN en 50 min (0.1% TFA) debit 50 µL/min.
Automated Analytical System fo the Examination of Protein Primary Structure,Y.L.F. Hsieh, et.al., Anal. Chem. 68, 455–462 (1996)
Le phénotype est caracterisé par une substitution de l’acideglutamique par une valine en position 6 de l’hémoglobine. Cechangement se distingue par l’apparition d’un peptide plus hydrophobe
Chromatographie sur phase inverse
33CHM 3102
Exemple de séparationLa déamidation des peptides est un phénomene courant et possiblementnaturel. La déamidation non-enzymatique de l’asparagine (et a un moindre degré la glutamine) peut se produire naturellement par l’isomérisation et la racémisation de l’aspartate et l’asparagine en condition de pH neutre ou basique. Certaineséquence comprenant les acides aminésGN et SN sont plus susceptibles à la déamidation et peuvent accélérer ceprocessus.
Wright, H. T. CRC Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1991, 26, 1-52.Bischoff, R.; Kolbe, H. V. J. J. Chromatogr., A 1994, 662, 261-278.
Séparation de peptides trypsiques de la somatotropin de boeuf(BST) montrant la déamidation de Asn99. Conditions: VYDAC®218TP54 (C18, 5 µm, 4.6 x 250 mm) gradient: 0–15% ACN en 20 min, 15–21% ACN (0.1%TFA) en 12 min, 21–48% ACN en 27 min, 48-75% ACN en 4 min debit: 2.0 mL/min.
Purification and Characterization of Recombinant BovineSomatotropin Containing an Isoaspartyl Residue, M.R. Schlittler,P.C. Toren, N.R. Siegel and B.N. Violand, Ninth ISPPP, 1989, Abstract 621
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Détecteurs
Détecteurs (3 classes) :
Universel : Basé sur une propriété fondamentale des moléculesEx. : réfractométrie
Sélectif : Basé sur une propriété particulière d’une famille de composés, par exemple la présence d’un élément ou d’un group. fonctionnelEx. : UV, fluorescence, électrochimie
Spécifique : Basé sur une propriété unique à un composéEx. : spectrométrie de masse (MS)
35CHM 3102
Détecteurs
RéfractométrieMesure continue de la différence d’indice de réfraction entre la phase mobile et l’effluent de la colonne
Réfractomètre à
déviation
36CHM 3102
Détecteurs
AvantagesUniverselFacteur de réponse semblable pour des produits de même classe
Réfractométrie
InconvénientsManque de sensibilité(général)
dépend de ∆nD entre soluté et éluant
Affecté par T, qui doit être contrôlée à 0.001, et par le débit de la phase mobileGradient d’élution possible seulement si les deux solvants ont des indices de réfraction semblables
37CHM 3102
Détecteurs
Détecteur UVLongueur d’onde variable
Cellule de détection
Phasemobilelcε=A
38CHM 3102
Détecteurs
Détecteur UV : Barrette de photodiodes (DAD; PDA)
39CHM 3102
Détecteurs
Détecteur UV :
InconvénientsSubstances : chromophoreFacteur de réponse : différent pour chaque composéDAD : emploi plus difficileLimité par le « cut-off »de la phase mobile
Avantages Sélectif : choix de la longueur d’ondeDAD : mesurer àplusieurs λ (puretéd’un pic)Peu sensible à T et débitFacile à utiliser et àentretenirPeut être utilisé en mode gradientNon destructif
40CHM 3102
Électrophorèse
Électrophorèse :Séparation basée sur la migration différentielle des solutés sous l’influence d’un champ électrique Technique complémentaire à la chromatographie liquide Modes de séparation
Classique (papier ou acétate de cellulose, gel)Capillaire (solution libre ou zone, milieu micellaire, gel, focalisation isoélectrique, isotachophorèse, électrochromatographie)
41CHM 3102
Electrophorèse
Electrophorèse sur gel Une dimension (SDS-PAGE)Bi-dimensionnelle (gel 2D)
Electrophorèse capillaireSolution ou ZoneIsotachophorèseFocalisation isoélectriqueGelEn milieu micellaire
42CHM 3102
Electrophorèse
Concept de base – mobilité ionique
ElectrophorèseElectrolyse
+ -2 H2O + 2e → H2 + 2 OH-
2 H2O + → O2 + 4 H+
+ 4e
Electrolytes
V
Distance
R ~ 0
+ -
+-
SupportFaible conductivité
V
Distance
R >> 0
43CHM 3102
Electrophorèse
Concept de base – mobilité ionique
Champs électrique (V/cm)
q E = f v
µ = v/E = q/f
Charge
Coefficient de friction
Vélocité(cm s-1)
Mobilité ionique(cm2V-1s-1)
44CHM 3102
Electrophorèse sur gelSupport solide et réseau poreux
Catalyseur: Tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)
CH2=CH-
CO
NH2
CH2=CH
CO
NH
CH2
CO
CH2=CH
+
Acrylamide
Methylene-bis-acrylamide
(CH3)2N(CH2)2N(CH3)2
Initiateur: Persulfated’ammonium/potassium
S2O82- → SO4
•-
CH2=CH-
CO
NH2
CH2=CH
CO
NH
CH2
CO
CH2=CH
- CH2- CH-
CO
NH2
NH2
CO
CH2-CH-
NH2
CO
- CH2-CH-
La concentration de TEMED determine la longueur des chaines de polymere et sastabilite mecaniqueLa dimension des pores est controllee par la concentration d’acrylamide et de bis-acrylamide. La composition des gels est definie par %T et %C:
%T = (poids en g de monomère + cross-linker)/100 mL varie entre 5 et 20%%C = 100 (poids du cross-linker)/(poids du monomère + cross-linker)
45CHM 3102
Electrophorèse sur gel
Mobilité electrophorètique
CH3-(CH2)10-CH2-O-SO3-, Na+
1% SDS100°C
β-ME2 min
• Réduction des ponts disulfure• Dénaturation et linéarisation de la
protéine• Le SDS se lie a la protéine ~ 1
molécule/3 lien peptidique• Charge/poids de protéine est ~ cst• Force électrique est proportionnelle à la
charge et donc Fe/Mr ~ cst• Si Fe/Mr est ~ cst comment se fait
la séparation?
Lo
g M
r
Mobilité rel.0 0.2 0.4 0.6 0.8
4.0
4.2
4.4
4.6
4.8
5.0
46CHM 3102
Electrophorèse sur gel
Instrumentation• Les gels sont disponible en format
deja polymerisé• On choisit %T pour la gamme de
poids moléculaire désiré• L’échantillon (avec marqueur de
migration bleu de bromophenol) est appliqué dans un puit au haut du gel
• Des standards de poids moléculairepre-colorés sont disposés de chaque coté de façon a faciliterl’alignement
• On utilise un “stacking gel” de faible %T pour compresser les protéines en début de gel et obtenir une meilleure résolution
• Le gel est coloré par la suite au coomassie ou à l’argent
47CHM 3102
Electrophorèse sur gel
Préparation des échantillons
Tampon de resolubilisation
Produits Concentration2X 4x
Tris-HCl, pH 6.8* 0.125 M 0.25 MSDS 4 % 8 %β-ME** 5 % 10 %DTT** 0.15 M 0.3 MGlycerol 20 % 30 %Bromophenol bleu 0.01 % 0.02 %
* Utiliser Tris base et ajuster pH avec HCl pour éviter force ionique trop grande** Utiliser le β-ME ou le DTT
Précautions: Utiliser gants pour eviter contamination (keratin ~ 55kDa). Manipulation sous la hotte SDS et β-ME sont toxiques. Eviter la surcharge doser les proteines par BCA avec leur séparation sur gel 10 cm ~ 0.5–4.0 µg pour échantillons purifiés et 40–60 µg pour echantillons bruts avec Coomassie (sens. ~100ng) ou ~ 50 x moins avec coloration à l’argent (sens. 2-5 ng). Utiliser DNase pour réduire les aggrégats d’ADN
48CHM 3102
Electrophorèse sur gel
% acrylamide et la gamme de poids moléculaire
Source: Bio-Rad: The little book of standards
Électrophorèse bi-dimensionnelle
49CHM 3102
HistoriqueIntroduit en 1975 par P.H. O’Farrell et J. Klose. 1ere
dimension utilise gel-ampholyte dans tubes étroits.Résolution accrue issue de l’orthogonalité et des performances respectives de IEF et SDS-PAGE.Introduction de bandes avec gradient de pH immobilisé en 1982 par A. Görg et al. permettant unemeilleure reproductibilité.Développement commercial par Amersham, Bioraden ~ 1990.
O'Farrell, P.H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250, 4007–4021 (1975).Klose, J. Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel approachto testing for induced point mutation in mammals. Humangenetik 26, 231–243 (1975). Bjellqvist, B., Ek, K., Righetti, P.G., Gianazza, E., Görg, A., Westermeier, R., Postel, W. Isoelectric focusing in immobilized pH gradients: principle, methodology and some applications. J. Biochem. Biophys. Methods 6, 317–339 (1982).
Électrophorèse bi-dimensionnelle
50CHM 3102
Principe de séparation
1ere dimension (séparation par pI)
Ampholytes: gel en tubes comprennant un melange d’ampholytes avec unegamme de pI.
Bandes d’immobilines comprenant un melange de composes ayant des fonctionsacides et base et lie a un monomere d’acrylamide le tout immobilise sur une bandede plastique:
CH2= CH–C–NH–RO
R = Groupes tampons acides ou bases faibles
2e dimension (séparation par Mr)
Gel acrylamide (SDS-PAGE) de plus grande dimension et accommodant la longueur des tubes ou bandes immobilines %T: 10 ou 12 % ou gradient de 8-12%.
Électrophorèse bi-dimensionnelle
51CHM 3102
Principe de séparation
Électrophorèse bi-dimensionnelle
52CHM 3102
Équipement
Etan IPGphorFocalisation isoélectrique
Etan DaltSDS-PAGE (12 gels)
Carottier automatiséPermet l’excision des
protéines sur gel
Électrophorèse bi-dimensionnelle
53CHM 3102
Préparation de l’échantillon
Lyse cellulaire (choc osmotique, gel/dégel, detergents, enzymatique), fractionnement mécanique (sonication, french press, billes de verre, etc..)Utilisation d’inhibiteur de protéolyseCentrigugationPrécipitation (sulfate d’ammonium, TCA, acétone)Enlever contaminants potentiels (nucleotides, métabolites, phospholipides, sels, detergents, AND, ARN, polysaccharides, lipides)Dosage (BCA, Lowry, Bradford, etc…)
Électrophorèse bi-dimensionnelle
54CHM 3102
Solubilisation de l’échantillon (avant IEF)
8 M urée, 4% CHAPS, 60 mM DTT, 2% Pharmalyte™ 3–10, 0.002% bromophenol bleu.
Pour protéines de haute masse moléculaire ouhydrophobes:
7 M urée, 2 M thiourée, 4% CHAPS, 60 mM DTT, 2% Pharmalyte pH 3–10, 0.002% bromophenol bleu.
NB Urée et thiourée perturbe les ponts hydrogenes et les forces de LondonUrée peut former des modifications (carbamylation) si T°>37°C
cyanate (HN=C=O) carbamylation (Lys, Arg)(R-NH2 R-NH-CO-NH2)serie de carbamylation
Électrophorèse bi-dimensionnelle
55CHM 3102
Sélection de bande d’immobiline
Bandes (3 mm x 18 cm x 0.5 mm)
4 7
3.5 4.5 5.5 6.7
4.0 5.0 6.0
3 10
6 11
Gamme large
Gamme moyenne
Gamme étroite
Électrophorèse bi-dimensionnelle
56CHM 3102
Sélection de bande d’immobiline
(41.5 kDa ; pI 4.91)
pH 4.5-5.5
pH 3-10
pH 4.0-7.0
(41.2 kDa ; pI 4.94)
Gamme étroite
Gamme moyenne
Gamme large
Permet une augmentation de la résolution
Électrophorèse bi-dimensionnelle
57CHM 3102
Rehydratation de l’échantillon• Échantillon charge (urea, CHAPS, DTT,
ampholytes, etc…) dans une cassette• En présence d’huile non conductrice• Température ambiante• Période: ~12 h
pI
++ --- - - -+ + + + + ++ -
pH 4 pH 7
CathodeAnode
Focalisation isoélectrique• Température: 20°C• 80 mA/bande• 500-8,000 V sur 12 h• 32,000 Vh
Électrophorèse bi-dimensionnelle
58CHM 3102
2e dimension (SDS-PAGE)
Conditions
• 500 V• 1600 mW/gel• Contrôle de la T a°20C• ~6 h
-
+Gel 10% acrylamide(22 cm x 23 cm x 1 mm)
2% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8.8, 6 M uree, 30% (v/v) glycerol, 0.002% bromophenol bleu15 min 10 ml + 100 mg DTT15 min 10 ml + 250 mg IAA
Equilibration
4 7MW
Électrophorèse bi-dimensionnelle
59CHM 3102
Coloration• Coomassie
• Sensibilité (~50 ng)• Non spécifique• Non quantitatif
• Argent• Sensibilité (0.5-1.2 ng)• Longue préparation• Non spécifique• Protéines peuvent avoir une coloration négative
• Colorants fluorescent (SYPRO ruby)• Sensibilité (1-2 ng)• Spécifique, quantitatif• Excision problématique
Électrophorèse bi-dimensionnelle
60CHM 3102
Analyse d’image
5.5 6.05.04.54.0
116
66
97
55
81
30
45
21
14
pI
Mr(kDa)
(4.5-5.5)
(4.0-5.0) (5.0-6.0)
Assemblage des gels, comparaison de l’expression différentiellepour l’échantillonnage réitéré et excision des protéines d’intérêt