Evaluation of salicylic acid treatment on expression of ...

Evaluation of salicylic acid treatment on expression of some genes

involving in morphine synthesis pathway in Opium Poppy (Papaver

Somniferum L)

Shokooh Hemati

MSc. Agricultural Biotechnology, Department of Plant Breeding & Biotechnology, Faculty of

Plant Production, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan,

Iran. Email: [email protected]

Ali Asghar Nasrollahnezhad Ghomi

*Corresponding author. Assistant Professor, Department of Plant Breeding & Biotechnology,

Faculty of Plant Production, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources,

Gorgan, Iran. Email: [email protected].

Ahad Yamchi

Associate Professor, Department of Plant Breeding & Biotechnology, Faculty of Plant

Production, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan, Iran.

Email: [email protected]

Seyedeh Sanaz Ramezanpour

Associate Professor, Department of Plant Breeding & Biotechnology, Faculty of Plant

Production, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan, Iran.

Email: [email protected]

Abstract Objective

The present study was performed to investigate the effect of salicylic acid at different times on

the expression of three genes involved in the morphine production end pathway (T6ODM, COR

and CODM) in Opium Poppy capsules. It should be noted that these genes play an important role

in the production of morphine as a medicinal alkaloid.

Materials and methods

Seeds of Papaver Somniferum were grown in pots under greenhouse conditions. When the plants

reached the flowering stage, two to three days after the petals fell; a superficial scratch was created

in the plant capsule and then treated with salicylic acid at a concentration of 50 μM. Capsule

sampling was performed at three times zero (a few minutes after spraying salicylic acid solution

on the capsule), three and 12 hours after salicylic acid treatment, compared to the control plant.

https://orcid.org/0000-0002-3818-4795

46

Agricultural Biotechnology Journal; Print ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

RNA was extracted from the capsule samples, followed by cDNA, and finally the results obtained

by qRT-PCR were analyzed using GenEX software.

Results

The results of this study showed that with increasing the time after treatment of the capsules with

salicylic acid, the expression level of all three genes decreased compared to the control plant. The

expression of T6ODM gene at zero time increased about 1.84 times the expression of gene

compared to the control plant, but the expression of this gene at 3 and 12 hours decreased by 46%

and 21%, respectively, compared to the gene expression in the control plant. The results also

showed that the expression of COR gene increased by about 1.26 times in zero hours compared

to the control plant and decreased by 15% in three hours and by almost 30% in 12 hours compared

to the control plant. . The expression level of CODM gene at zero hours was almost equal to that

of the control plant and at three and 12 hours their expression level was almost zero. Also, the

graphs related to T6ODM, CODM and COR genes showed that there is a significant difference

in terms of gene expression between different times in each gene.

Conclusions

It is generally inferred that salicylic acid treatment reduces the expression of the three end genes

involved in the morphine production pathway by increasing the time from zero hours to 12 hours.

Keywords: Salicylic acid, Morphine, T6ODM gene, COR gene, CODM gene.

Paper Type: Research Paper.

Citation Hemati SH, Nasrollahnezhad Ghomi AA, Yamchi A, Ramezanpour SS (2021)

Evaluation of salicylic acid treatment on expression of some genes involving in

morphine synthesis pathway in Opium Poppy (Papaver Somniferum L). Agricultural

Biotechnology Journal 13 (2), 45-60.

Agricultural Biotechnology Journal 13 (2), 45-60. DOI: 10.22103/jab.2021.15464.1204

Received: April 17, 2021. Accepted: May 31, 2021.

Publisher: Faculty of Agriculture and Technology Institute of Plant

Production, Shahid Bahonar University of Kerman-Iranian

Biotechnology Society.

© the authors

های مسیر سنتز مورفین در خشخاش بررسی تاثیر اسید سالیسیلیک بر بیان برخی ژن

(Papaver somniferum L)

یشکوه همت

گرگان، یعیو منابع طب یدانشگاه علوم کشاورز یاهی،گ یددانشکده تول یوتکنولوژی،گروه اصلاح نباتات و ب یوتکنولوژی،دانش آموخته ب

[email protected] :یانامهرا یران،گرگان، ا

یاصغر نصراله نژاد قم یعل

یار گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی، دانشکده تولیدگیاهی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی مسئول : استاد نویسنده*

[email protected] ، گرگان، ایران، رایانامه:09188412896گرگان. تلفن:

احد یامچی

شاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران،دا شگاه علوم ک شکده تولیدگیاهی، دان صلاح نباتات و بیوتکنولوژی، دان شیار گروه ا ن

[email protected] :رایانامه

سیده ساناز رمضانپور

دانشیار گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی، دانشکده تولیدگیاهی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران،

[email protected]رایانامه:

10/03/1400تاریخ پذیرش: 28/01/1400تاریخ دریافت:

چکیده

سید هدف: سی تاثیر ا ضر به منظور برر سیلیک در زمانپژوهش حا سیر انتهایی تولید سالی سه ژن درگیر در م های مختلف بر بیان

ها در تولید مورفین به عنوان یک ( در کپسول انجام گرفت. لازم به ذکر است که این ژنCODM و T6ODM ،CORمورفین )

آلکالوئید دارویی نقش بسزایی دارند.

شرایط گلخانه در گلدانPapaver Somniferum ی بذرهای گونه :هاروشمواد و شدند. زمانی که گیاهان به در شت ها ک

اسییید گیاه ایجادگردید و سییپ با کپسییولخراشیییدگی سییدری درها، مرحله گلدهی رسیییدند، دو تا سییه روز پ از ریزش گلبر

چند دقیقه پ از پاشیدن مرلول )در سه زمان صفر . نمونه گیری از کپسول ها میکرو مولار تیمار شدند 50سالیسیلیک در غلظت

https://orcid.org/0000-0002-3818-4795

(1400 تابستان، 2، شماره 13مجله بیوتکنولوژی کشاورزی )دوره

48


اسید سالیسیلیک ، نسبت به گیاه شاهد انجام شد. از نمونه ساعت بعد از تیمار کردن با 12(، سه و اسید سالیسیلیک بر روی کپسول

با استفاده PCR-qRTساخته شد و در نهایت نتایج به دست آمده از cDNAاستخراج گردید و به دنبال آن RNAهای کپسول

مورد تجزیه و ترلیل قرار گرفت. GenEXاز نرم افزار

سه :نتایج سدح بیان هر سیلیک، سالی سید سول ها با ا شان داد که با افزایش مدت زمان بعد از تیمارکردن کپ نتایج این پژوهش ن

شاهد کاهش یافت. میزان بیان ژن سبت به گیاه ساعت حدود در زمان ODM6Tژن ن سبت به 84/1صفر میزان بیان آن برابر ن

درصد نسبت به میزان بیان 21درصد و 46ساعت به ترتیب 12در گیاه شاهد افزایش پیدا کرد. اما میزان بیان این ژن در زمان سه و

در زمان صفر ساعت نسبت به گیاه شاهد حدود CORآن در گیاه شاهد کاهش نشان داد. همچنین نتایج نشان داد میزان بیان ژن

درصد نسبت مقدار بیان 30ساعت تقریبا به میزان 12درصد و در زمان 15برابر افزایش یافت و در زمان سه ساعت به میزان 62/1

شاهد کاهش یافت. میزان بیان ژن شاهد بود و در زمان CODMآن در گیاه سه و در زمان صفر ساعت تقریبا معادل با گیاه های

CORو ODM6T ،CODMهای . همچنین نمودارهای مربوط به ژنزدیک به صییفر بودسییاعت میزان بیان آن تقریبا ن 12

های مختلف در هر ژن اختلاف معنی داری وجود دارد. نشان دادند که از نظر بیان ژن بین زمان

لید مورفین را با شود که تیمار اسید سالیسیلیک بیان سه ژن انتهایی درگیر در مسیر توبه طور کلی چنین استنباط می گیری:نتیجه

دهد. ساعت کاهش می 12افزایش زمان از صفر به

.CODM ، ژنCOR، ژن T6ODM اسید سالیسیلیک ، مورفین، ژن :: هاکلیدواژه

پژوهشی.: نوع مقاله

بررسی تاثیر اسید سالیسیلیک بر بیان ( 1400همتی شکوه، نصراله نژاد قمی علی اصغر، یامچی احد، رمضانپور سیده ساناز ) استناد:

.60-45(، 2)13 ،مجله بیوتکنولوژی کشاورزی. (Papaver somniferum L)های مسیر سنتز مورفین در خشخاش برخی ژن

Publisher: Faculty of Agriculture and Technology Institute of Plant

Production, Shahid Bahonar University of Kerman-Iranian

Biotechnology Society.

© the authors

مقدمه

شوند. یمی گیاهی یافت هاگونهدرصد از 20دار با وزن مولکولی پایین هستند که در آلکالوئیدها گروه متنوعی از ترکیبات ازت

به عنوان دارو، مررک، مواد مخدر و سموم شده است هاآنفعالیت بیولوژیکی قوی برخی از آلکالوئیدها منجر به بهره برداری از

1400و همکاران، همتی

49


(Facchini 2001.)2500زر مرصولات طبیعی هستند که تقریبا بهای آلکالوئیدهای بنزیل ایزووکوئینولین یکی دیگر از گروه

Menispermaceae و Papaveraceae ،Ranunculaceae ،Berberiaceaeکه عمدتا در خانواده شوند ترکیب را شامل می

80تریاک، به عنوان لاتک خشک شده کپسول نارس خشخاش، شامل بیش از . (van der Heijden 2004) شوندیافت می

درصد( و به دنبال آن کدئین، تبائین، 21-4آلکالوئید ایزوکوئینولین است. آلکالوئیدهای اصلی به دست آمده از تریاک مورفین )

مهمی بخش کدئین و مورفین تجاری تولید جهت خشخاش کار و کشت (.Dewick 2002باشند )ئین میپاپاورین، نوسکاپین و نارس

قانونی غیر تولید درصد از تولید جهانی خشخاش صرف 90اگرچه نزدیک به . باشدمی دنیا نقاط از بسیاری در کشاورزی اندازچشم از

ساخت و (.Facchini and Park 2003)شود می استیلاسیون دی اُ-اُ ساده واکنش یک طریق از هروئین سنتز جهت مورفین

افتد. به طور کلی مورفین، نوسکاپین و پاپاورین آلکالوئیدهای فراوان های خاصی در گیاه اتفاق میتجمع آلکالوئیدها در اندام و سلول

(. Facchini and DeLuca 1995بد )یاهای هوایی هستند، در حالی که سانگئونارین به طور معمول در ریشه تجمع میدر اندام

یابند. اندازه گیری آلکالوئیدهای های هوایی افزایش میآلکالوئیدها در ریشه و سپ در مرحله گیاهچه و بعد از این مرحله در همه اندام

ها در ش گلبر های جمع آوری شده از گیاه خشخاش نشان دهنده این است که آلکالوئیدهای مورفینان پ از ریزموجود در کپسول

های هوایی به ویژه (. در خشخاش مورفین و کدئین بیشتر در اندامShukla and Singh 2000کنند )کپسول حضور پیدا می

(.Facchini et al. 2007کنند )کپسول تجمع پیدا می

تبائین ییلهوس به گیردیصورت م یاصل یرمرحله که در مس یناول وشاخه شده دو یندر مرل تبائ( 1ین )شکل مورف یرمس

بازآرایی شده و به کدئینون دچار یبه صورت خود به خود ینوننئوپکند. یم( کاتالیز شده و نئوپینون را تولید ODM6T) 1دمتیلا -اُ-6

(COR) 2یک آلدوکتوردوکتاز به نام کدئینون ردوکتاز ییلهبه وس ینونسپ کدئ. (2010Facchini and Hagel)شود یمتبدیل

)1999( Unterlinner Kutchan 3دمتیلاز-اُ-و کدئین سپ توسط کدئین به کدئین تبدیل شده (CODM به مورفین تبدیل )

دمتیلاسیون تبائین به اوریپاوین است را -اُ-3ل دمتیلاز اولین مرحله در مسیر فرعی که شام-اُ-جایگزین کدئین طوربهشود. یم

شود. خشخاش که در یمبه مورفین احیا COR توسطرا به مورفینون تبدیل کرده که اوریپاوین ODM6Tسپ کند.میکاتالیز

شود و یمسلولی الراق یوارهدشود. این ماده به یمهای مکانیکی قرار گرفته، مورفین سریعا به بی مورفین متابولیزه یبآسمعرض

ی پکتیناز شود. بر اساس این نتایج یک نقش یلهوسدرولیز به تواند باعث افزایش مقاومت به هییمنشان داده شده است که این امر

های به عمل میلادی مدالعات و بررسی 80دهه اواخردر (. 2001Morimoto et alتوان پیشنهاد داد )دفاعی را برای مورفین می

، رونویسی، ترجمه DNAترین فرایندهای ژنتیکی )مشتمل بر همانندسازی های مولکولی در زمره مهمآمده روشن نمود که مکانیسم

(.Mohammadabadi and Tohidinejad 2017ها( هستند )و حتی نروه تنظیم ژن

1. Thebaine -6-O- demethylase 2. Codeinone reductase 3. Codeine -O- demethylase


50


، Salsyn (CYP719B1)، SaLRهای مسیر متابولیکی آلکالوئیدهای مورفینان که مکان فعالیت آنزیم .1شکل

SaLAT، CODM ،T6ODM و COR دهدرا نشان می (adapted from Beaudoin and Facchini 2014;

Hagel and Facchini 2010).

Figure 1. The metabolic pathway of morphinan alkaloids that illustrates the action sites of

Salsyn (CYP719B1), SalR, SalAT, CODM, T6ODM and COR enzymes (adapted from

Beaudoin and Facchini 2014; Hagel and Facchini 2010).

شوند و در یک زمان خاص زمان بیان نمی یک سلول دارای تعداد زیادی ژن می باشد که هیچ گاه به طور هم ماده ژنتیکی

(. نیاز به 2015et al. Tohidi nezhadنمایند )فقط تعداد کمی از آنها بیان شده و پروتئین یا آنزیم مورد نیاز سلول را تولید می

به فرآورده ژن، آن ژن به صورت خاموش و شود و در صورت عدم نیازکند کنترل میبیان ژن توسط مریدی که در آن رشد می

Ahsaniکشف شد ) E.coli(. ساز و کار بیان ژن اولین بار در باکتری 2020Mohammadabadi) غیرفعال باقی خواهد ماند

et al. 2019aباشد. تنها یک مجموعه نسبتاً کوچک از تمام ژنوم در بعدی می های یوکاریوتی ترت کنترل موقت و چندژن (. بیان

(. بنابراین، Mohammadabadi et al. 2018ها به مرحله نمو بستگی دارد )ها بیان می شود و نیز بیان ژنهر یک از انواع بافت

(. همچنین مقدار مرصولات ژن که در همان Ahsani et al. 2019bست )ها برای هر بافت اختصاصی ابیان ژن در یوکاریوت


51


Mohammadabadiشود )سازند، ساخته شده سبب تنظیم بیان آن ژن میهایی که آن مرصول را میبافت و نیز در سایر بافت

ها در سدح سلولی یا کروموزومی های مرتبط با صفات اقتصادی و مدالعه آنها و پروتئین(. یکی از اقدامات اساسی مدالعه ژن2021

(. Jafari Darehdor et al. 2016است )

یهابنزوییک اسید تولید شده توسط گیاهان با نقش مهمی در پاسخ در واقع ،است فنولی که یک ترکیب 1اسید سالیسیلیک

بسیاری انجام شده که از این اخیرا مدالعات .(Hayat and Ahmad 2007باشد )یزنده و غیرزنده م یهادفاعی گیاهان به تنش

های ثانویه استفاده شده هورمون برای بررسی مسیرهای سیگنالیک سلولی و بیان ژن و بیوسنتز متابولیت ثانویه در بیوسنتز متابولیت

( مسیر CORو T6ODM ،CODMدر این مدالعه میزان بیان سه ژن کلیدی ) (.Chandra and Chandra 2011است )

ترین تجمع مورفین در آن وجود دارد ترت تاثیر اسید سالیسیلیک به عنوان تنش کپسول به عنوان اندامی که بیش تولید مورفین در

شود.گزارش می 2PCR -qRTغیر زیستی با استفاده از تکنیک

هامواد و روش

موجود( )رقم 1006760Pشناسایی با شماره Papaver. Somniferum گونهبرای انجام این ترقیق بذر گیاه خشخاش،

ساعت 24از کشت به مدت مورد نظر قبل ، بذرهایتهیه شد. به منظور شکستن خواب بذر ایران از مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی

اک باغچه و ماسه خی مساوی از خاک بر ، هاحجمها با ی مرطوب در یخچال نگهداری شد. کشت بذرها در گلدانپارچهدر داخل

سانتیگراد، انجام شد. درجه 25-20دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان در شرایط نور طبیعی و دمای گلخانهبادی در

جهت جلوگیری از ایجاد روی کپسول با پین استریل در هر میلی متر مربع از سدح، بر هاگلبر دو تا سه روز پ از ریزش

پری شد. برای تهیه میکرو مولار اسید سالیسیلیک اس 50. سپ کپسول گیاه با در سدح کپسول خراشیدگی ایجاد شد زخم عمیق

95لار اتانول میکرو مو 100( در s7401,Sigma-Aldrich )مرلول اسید سالیسیلیک، هفت میلی گرم پودر اسید سالیسیلیک

به مرلول درصد 20توین درصد حل و با آب مقدر به حجم یک لیتر رسانده شد. برای نفوذ بیشتر مرلول به گیاه، یک میلی مولار

ی ت و همچنین نمونه گیرمورد نظر اضافه شد. نمونه گیری از کپسول در سه زمان صفر ساعت، سه ساعت و دوازده ساعت انجام گرف

در هر زمان با شاهد مربوط به خود در همان زمان مقایسه گردید.

RNAبرای تعیین کیفیت )توکیو، ژاپن( استفاده شد. BioFluxشرکت p-BIOZOLاز بافر RNAمنظور استخراج به

از هر نمونه پنج RNAاند با توجه به کیفیت ب (.2)شکل درصد استفاده گردید 5/1الکتروفورز ژل آگارز از دستگاه اسپکتوفتومتر و

بر اساس دستورالعمل شرکت فرمنتاز انجام شد Oligo-dTبا آغازگر cDNAی تیمار و سنتز اولین رشته DNAseمیکرولیتر با

1. Salicylic Acid 2. Quantitative real-time polymerase chain reaction


52


بررسی کیفیت آغازگرهای طراحی شده از انجام شد. Prime 3و Quest Primer یبا نرم افزارها آغازگرها یطراح(. 3)شکل

انجام شد و اختصاصی بودن آعازگرها با نرم افزار بر خط Oligo Calculatorو Oligo Analyzeطریق نرم افزارهای بر خط

Primer Blast مورد ارزیابی قرار گرفت(2015Hashemi and Naghavi )استفاده در مورد یآغازگرها ی. نام و توال-qRT

PCR (.1شرح زیر است )جدول به

میکرولیتر از هر آغازگر با 2/0رقیق شده، cDNAمیکرولیتر حاوی یک میکرولیتر 20در حجم کلی PCRریل تایم

و کیت سایبر بایو پارس )دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، ایران( در دستگاه Iتکنولوژی رنگ سایبرگرین ز استفاده ا

5iQ ،نتایج حاصل از این (.2ها به شرح زیر است )جدول آمریکا( انجام شد. دمای مورد نیاز هر مرحله و تعداد چرخه )شرکت بیورد

به عنوان ژن کنترل داخلی جهت نرمال سازی نتایج 1اکتین -خانه دار بتاژن مرحله به صورت نسبی ارزیابی شد. در این آزمایش

به اینکه توجهبا( برای هر نمونه مراسبه شد. CT)دلتا دلتا ∆∆CTاستفاده از روش این نسبت با شدهاستفاده شد. ارزش نرمال

GenEXاعداد به مقادیر مدلق بااستفاده از نرم افزار CT∆∆-2دهد، با استفاده از فرمول یمرا در اختیار قرار ∆∆CTدستگاه عدد

رسم شد. Excelتبدیل شد و نمودار مربوط به بیان هر ژن در بافت کپسول توسط نرم افزار

نتایج و بحث

صفر ساعت ( نسبت به شاهد نشان داد که این ژن در زمان4)شکل T6ODMنتایج حاصل از مدالعه بیان نسبی ژن

هد افزایش پیدا کرد. میزان بیان این برابر نسبت به میزان بیان آن در گیاه شا 84/1دارای بیشترین میزان بیان بوده و به میزان تقریبا

ژن در زمان سه ساعت به کاهش یافت. بیان اینساعت، 12ژن ترت تیمار اسید سالیسیلیک با افزایش زمان تیمار به سه ساعت و

ساعت بود که به 12مان درصد نسبت به میزان بیان آن در گیاه شاهد کاهش نشان داد. و کمترین میزان بیان آن در ز 46میزان

T6ODMژن نظر بیان درصد نسبت به میزان بیان آن درگیاه شاهد کاهش نشان داد. همچنین نمودار نشان داد که از 21میزان

های مختلف، اختلاف معنی داری وجود دارد.بین تمام زمان

برابر نسبت 26/1 ( بیشترین میزان بیان این ژن مربوط به زمان صفر ساعت بود که به میزان5)شکل CORدر مورد ژن

زمان تیمار از صفر ساعت یشنیز ترت تیمار اسید سالیسیلیک با افزا CORبه میزان بیان آن در گیاه شاهد افزایش نشان داد. ژن

15ود که به میزان بساعت در بافت کپسول کاهش بیان نشان داد. کمترین میزان بیان این ژن در زمان سه ساعت 12به سه و

درصد نسبت به میزان بیان آن در گیاه شاهد کاهش پیدا کرد.

1.Beta Actin


53


دمتیلاز -، کدئین آ(T6ODM) دمتیلاز -آ-6تبائین هایاطلاعات و توالی آغازگرهای مربوط به ژن .1جدول

(CODM) کدئینون ردوکتاز ،(COR( )Hashemi and Naghavi 2015)

Table 1. Information and sequencing of primers regarding genes thebaine 6-O-demthylase

(T6DM), codeine O-demthylase (CODM), codeinone reductase (COR)

آغازگر نام

Primer name

توالی آغازگر

Primer sequence

C° دمای ذوب

Melting

point °C

واکنش طول محصول

Amplicone size

(bp)

آغازگر رفت

T6ODM For

5′ AAAACTCCCAGTGCCTCTCA 3′

58.4

bp 124

برگشت آغازگر

T6ODM Rev

5′ ACCCTTAATCTCGGCTGCTT 3′ 58.4

آغازگر رفت

CODM For

5′ TTGTGCTTAAATTTCGTGGATGAC 3´

60.1

bp 115


CODM Rev

5′ TGATTACATCACTTGACCCAAACAG 3′ 62.5

آغازگر رفت

COR For

5′ TTGATTGGGAACTAACGGCAGAAG 3′

63.5 bp 102


COR Rev

5′ TGAAAGGTCCAGTCGGTGATAACA 3′ 63.5

آغازگر رفت

β-ACTIN For

5′ TCTCAACCCAAAGGCTAATCG 3′ 59.4

143bp

آغازگر برگشت

β-ACTIN Rev

′5′ CCCCAGAATCCAAGACAATAC 3 59.4

درصد نسبت به میزان بیان آن درگیاه شاهد کاهش یافت. همچنین نمودار نشان 30ساعت 12میزان بیان این ژن در زمان

( در 6)شکل CODMدر بررسی میزان بیان ژن های مختلف، اختلاف معنی داری وجود دارد.بین زمان CORداد از نظر بیان ژن

بود که معادل با 1زمان صفر ساعت ترت تیمار اسید سالیسیلیک اختلاف معنی داری با شاهد مشاهده نشد و میزان آن تقریبا برابر

نیز میان تمامی CODMساعت نزدیک به صفر بود . در مورد ژن 12های سه ساعت و گیاه شاهد بود و بیان این ژن در زمان

های مختلف، اختلاف معنی داری وجود دارد. زمان


54


ای پلیمراز در زمان واقعیچرخه حرارتی واکنش کمی زنجیره .2جدول Table 2. Thermal cycle Quantitative real-time polymerase chain reaction

Step مرحله)ثانیه( زمان

Time (s)

گراد(یسانتدما )درجه

Temperature (̊C)

تعداد چرخه

Number of cycles

Denaturation 180 94 1 واسرشت

Denaturation 10 94 40 واسرشت

Annealing 30 62 40 اتصال

Extension 30 72 40 تکثیر

Read 20 78 40 خوانش

های کپسول گیاه خشخاشنمونه RNAتصویر الکتروفورز .2شکل

Figure 2. RNA electrophoretic image of poppy capsule samples

ی به منظور های زیادهای اخیر تلاشباشد. در سالدر این مدالعه برث در مورد سه ژن انتهایی مهم مسیر تولید مورفین می

-Sharma et al. 2013; Mora)های بیوتکنولوژی انجام گرفته است های ثانویه با استفاده از روششناخت و افزایش متابولیت

Pale et al. 2014). آلکالوئیدهای مورفینان به دلیل فعالیت دارویی مورد توجه هستند. علاوه بر این به دلیل سمیت آلکالوئیدهای

باشد که در مجاورت عناصر غربالی وجود های خاصی به نام لاتیسیفر میبنزیل ایزوکوئینولین تجمع این آلکالوئیدها مردود به سلول

(. از آنجا که تولید این آلکالوئیدها در Le Flem-Bonhomme et al. 2004; Liscombe and Facchini 2008دارند )

تواند به عنوان یک های غیر زیستی می(، بنابراین اعمال تنشChandra and Chandra 2011افتد )های خاصی اتفاق میسلول


55


به منظور افزایش این آلکالوئیدها مورد های تولید کننده آلکالوئیدهای بنزیل ایزوکوئینولینروش کاربردی برای افزایش بیان ژن

استفاده قرار گیرد.

ACTINبا استفاده از جفت آغازگر cDNAالگوی باندی حاصل از تکثیر .3شکل

Figure 3. The banding pattern generated by cDNA replication using the ACTIN primer

pairs

کپسول خشخاش تیمار شده با اسید سالیسیلیک در نمونه T6ODMروند تغییرات بیان نسبی ژن .4شکل

های مختلفنسبت به شاهد در زمان

Figure 4. Trends in the expression of T6ODM in opium poppy capsule under salicylic acid

treatment

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

0 h 3 h 12 h

ن ژ

یسب

ن نبیا

T6O

DM

R

ela

tiv

e ex

pre

ssio

n o

f T

6O

DM


56


در نمونه کپسول خشخاش تیمار شده با اسید سالیسیلیک CORروند تغییرات نسبی بیان ژن .5شکل


Figure 5. Trends in the expression of COR in opium poppy capsule under salicylic acid

treatment

در نمونه کپسول خشخاش تیمار شده با اسید سالیسیلیک CODMروند تغییرات نسبی بیان ژن .6شکل


Figure 6. Trends in the expression of CODM in opium poppy capsule under salicylic acid

treatment

انجام گرفت نشان داده شد که اسید سالیسیلیک در تجمع Hashemi and Naghavi (2015)ای که توسطدر مدالعه

ها نشان های زمانی مختلف موثر است. به علاوه آندر دوره Papaver orientaleآلکالوئیدهای مورفینان در کشت ریشه مویین

Sharifzadeh Naeiniهای زمانی کوتاه تر پایین است. همچنین های تولید کننده این آلکالوئیدها در دورهدادند که میزان بیان ژن

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

0 h 3 h 12 h

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

0 h 3 h 12 h

نبیا

ن

ژی

سبن

C

OR

R

elati

ve

exp

ress

ion

of

CO

R

ن ژ

یسب

ن نبیا

C

OD

M R

elati

ve

exp

ress

ion

of

CO

DM


57


et al. (2020 نشان دادند که تولید آلکالوئیدهای بنزیل ایزوکوئینولین با استفاده از اسید سالیسیلیک در کشت ریشه مویین )

Papaver armeniacum .افزایش پیدا کرد

اند که در بیوسنتز مورفین نقش اساسی دارند در گیاه خشخاش شناسایی شده CODMو T6ODM، CORهای ژن

(Beaudoin and Facchini 2014علاوه بر این در فرآیند اعمال تنش .) های غیر زیستی زمان تیمار و همچنین نوع بافت بر

این در پژوهش حاضر اثر اسید سالیسیک به عنوان تنش غیر زستی (. بنابرChong et al. 2005بیان بر بیان ژن تاثیر گذار است )

ساعت( در 12در کپسول خشخاش و در دورهای زمانی مختلف )صفر، سه و CODM و T6ODM، CORهای بر بیان ژن

را با T6ODMغلظت یکسان از این هورمون مورد بررسی قرار گرفت. نتایج پژوهش حاضر نشان دادکه اسید سالیسیلیک بیان ژن

نشان داد که Hashemi and Naghavi(2015ساعت کاهش داد. نتایج آزمایش انجام شده توسط ) 12افزایش زمان از صفر به

ساعت ترت تیمار اسید سالیسیلیک افزایش بیان چشمگیری نداشته است. که با نتایج ما 12در زمان شش و T6ODMبیان ژن

( نشان دادند که اسید سالیسیلیک اثر مثبتی بر بیان ژن 2020) .Sharifzadeh Naeini et alمدابقت داشت. همچنین

T6ODM در پژوهش حاضر نیز میزان بیان ژن .ساعت پ از تیمار داشت 12ر از های بیشتدر زمانCODM با فزایش زمان

این ژن در نشان دادند که میزان بیان Hashemi and Naghavi( 2015همچنین )ساعت کاهش نشان داد. 12تیمار از صفر به

و تجمع افزایش چشمگیری نداشت P. orientaleساعت در کشت ریشه مویین 12ساعت یعنی شش و 24های کمتر از زمان

یا میزان CODMکاهش یافت. که این ممکن است به دلیل فعالیت کم آنزیم کدئین نیز با افزایش دوره زمانی تیمار در این گیاه

تواند تبدیل تبائین و کدئین )به عنوان پیش ماده( به می CODMدر زمان بالاتر باشد. بیان بالای ژن CODMبیان کم ژن

;Allen et al. 2007تواند تجمع کدئین و مورفین را افزایش دهد )می CORمورفین را افزایش دهد. علاوه بر این بیان بالای ژن

Larkin et al. 2007 نتیجه پژوهش حاضر نشان داد که بیان ژن .)COR ساعت کاهش پیدا 12ر به با افزایش زمان از صف نیز

ساعت یعنی شش 24های کمتر از این ژن در زمان نشان دادند که میزان بیان Hashemi and Naghavi( 2015کرد. به علاوه )

پایین است. که با نتایج پژوهش حاضر مدابقت داشت. P. orientaleساعت در 12و

های های مورد مدالعه در زمانتاثیر بسیار کمی بر بیان ژنطبق نتایج گزارش شده در پژوهش حاضر اسید سالیسیلیک

کنند ساعت( پ از تیمار با اسید سالیسیلیک افزایش بیان پیدا می 48و 24تر )ها در دوره طولانیانتخاب شده داشت. بسیاری از ژن

(Hashemi and Naghavi 2015به طور کلی توانایی سنتز یک متابولیت خاص مانند مورفین .) به تکامل چندین آنزیم بیوسنتزی

(. Pichersky and Lewinsohn 2011ها در ژنوم بستگی دارد )های تکثیر شده توسط این آنزیماز طریق افزایش رونویسی ژن

سی قرار گرفت. : گیرینتیجه سیر تولید مورفین مورد برر سه ژن انتهایی م سیلیک بر بیان سالی سید ضر اثر ا در پژوهش حا

ترکیبات آلکالوئیدی که به عنوان ترکیبات دارویی در این گیاهان شیییناخته تولیدها در خشیییخاش بیشیییتر به لرا ن ژناهمیت ای

نتایج ترقیق حاضرنشان داد که میزان بیان این سه ژن کاهش پیدا کرد. بنابراین مدالعات دیگر با در نظر گرفتن .باشدد، میانشده

تواند صورت گیرد. در های درگیر در مسیر بیوسنتز مورفین میید سالیسیلیک بر روی بیان ژنهای بیشتر جهت شناخت بهتر اسزمان


58


این نتایج برای مهندسی مولکولی مسیر تولید ها را مورد بررسی قرار داد. ساعت نیز بیان این ژن 48و 24تر یعنی های طولانیزمان

های بیوتکنولوژی برای گیاه خشخاش مفید خواهد بود.تکنیکمورفین و تولید آلکالوئیدهای مورفینان با استفاده از

سگزاری شور در تهران :سپا ستی ک شکر و از مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زی شخاش ت سال بذر خ بخاطر همکاری در ار

شود.یمقدردانی

منابع

افت چربی زیرپوستی گاوهای ( بیان ژن لپتین در ب1398احسنی مرمدرضا ، مرمدآبادی مرمدرضا ، اسدی فوزی و همکاران )

.135-150(، 1)11. مجله بیوتکنولوژی کشاورزی Real Time PCRهلشتاین با استفاده از

( مقایسه سدوح مختلف بیان 1393توحیدی نژاد فاطمه، مرمدآبادی مرمدرضا، اسمعیلی زاده کشکوئیه علی، نجمی نوری عذرا )

. 35-50(، 4)6در بافت های مختلف بز کرکی راینی. مجله بیوتکنولوژی کشاورزی Rhebژن

CIB4( بررسی بیان ژن1395جعفری دره در امیر حسین، مرمدآبادی مرمدرضا، اسمعیلی زاده کشکوئیه علی، ریاحی مدوار علی )

-132(، 4)4در نشخوارکنندگان . مجله پژوهشReal Time qPCRهای مختلف گوسفند کرمانی با استفاده از در بافت

119.

. مجله بیوتکنولوژی کشاورزی Real Time PCRدر بز کرکی راینی با استفاده از ESR1بیان ژن ( 1399)مرمدآبادی مرمدرضا

12(1 ،)192-177 .

(، 4)12در بز. مجله بیوتکنولوژی کشاورزی ESR2مختص بافت ژن mRNAپروفایل بیانی ( 1399)مرمدآبادی مرمدرضا

181-167 .

References

Allen RS, Miller JAC, Chitty JA, et al. (2007) Metabolic engineering of morphinan alkaloids by

overexpression and RNAi suppression of salutaridinol 7-O-acetyltransferase in opium

poppy. Plant Biotechnol J 6, 22–30.

Ahsani MR, Mohammadabadi MR, Asadi Fozi M, et al. (2019a) Effect of Roasted Soybean and

Canola Seeds on Peroxisome Proliferator‐Activated Receptors Gamma (PPARG) Gene

Expression and Cattle Milk Characteristics. Iran J Appl Anim Sci 9, 635-642.

Ahsani MR, Mohammadabadi MR, Asadi Fozi M et al. (2019b) Leptin gene expression in

subcutaneous adipose tissue of Holstein dairy cattle using Real Time PCR. Agric

Biotechnol J 11, 135-150 (In Persian).

Beaudoin GAW, Facchini PJ (2014) Benzylisoquinoline alkaloid biosynthesis in opium poppy.

Planta 240, 19–32.

javascript:void(0)


59


Chandra S, Chandra R (2011) Engineering secondary metabolite production in hairy roots.

Phytochem Rev 10, 371–395.

Chong TM, Abdullah MA, Lai OM et al. (2005) Effective elicitation factors in Morinda elliptica

cell suspension culture. Process Biochem 40, 3397–3405.

Facchini PJ, Hagel JM, Liscombe DK, et al. (2007) Opium poppy: blueprint for an alkaloid

factory. Phytochem Rev 6, 97–124.

Dewick PM (2002) Medicinal natural products: a biosynthetic approach, 2nd. Wiley, Chichester.

Facchini PJ, Park SU (2003) Developmental and inducible accumulation of gene transcripts

involved in alkaloid biosynthesis in opium poppy. Phytochem 64, 177-186

Facchini PJ (2001) Alkaloid biosynthesis in plants: biochemistry, cell biology, molecular

regulation and metabolic engineering applications. Annu Rev Plant Physiol 52, 29-66.

Facchini PJ, DeLuca V (1995) Phloemspecific expression of tyrosine/dopa decarboxylase and

isoquinoline alkaloid biosynthesis in opium poppy. Plant Cell 7, 1811 - 21.

Hagel JM, Facchini PJ (2010) Dioxygenases catalyze the O-demethylation steps of morphine

biosynthesis in opium poppy. Nat Chem Biol 6, 273–275.

Hashemi SM, Naghavi MR )2015( Production and gene expression of morphinan alkaloids in

hairy root culture of Papaver orientale L. using abiotic elicitors. Plant Cell, Tiss Org

Culture 125(1), 31-41.

Hayat S, Ahmad A (2007) Salicylic asid: A Plant Hormone. Department of Botany Aligarh

Muslim University Aligarh 202002, India Pp, 4-11.

Jafari Darehdor AH, Mohammadabadi MR, Esmailizadeh AK, Riahi Madvar A (2016)

Investigating expression of CIB4 gene in different tissues of Kermani Sheep using Real

Time qPCR. J Rumin Res 4, 119-132 (In Persian).

Larkin PJ, Miller JAC, Allen RS et al (2007) Increasing morphinan alkaloid production by over-

expressing codeinone reductase in transgenic Papaver somniferum. Plant Biotechnol J 5,

26–37.

Le Flem-Bonhomme V, Laurain-Mattar D, Fliniaux MA (2004) Hairy root induction of Papaver

somniferum var. album, a difficult-totransform plant, by A. rhizogenes LBA 9402. Planta

218, 890–893.

Liscombe DK, Facchini PJ (2008) Evolutionary and cellular webs in benzylisoquinoline alkaloid

biosynthesis. Curr Opin Biotechnol 19, 173–180.

Mora-Pale M, Sanchez-Rodriguez SP, Linhardt RJ et al (2014) Biochemical strategies for

enhancing the in vivo production of natural products with pharmaceutical potential. Curr

Opin Biotechnol 25, 86–94.


60


Mohammadabadi MR (2021) Tissue-specific mRNA expression profile of ESR2 gene in goat.

Agric Biotechnol J 12 (4), 167-181 (In Persian).

Mohammadabadi MR (2020) Expression of ESR1 gene in Raini Cashmere goat using Real Time

PCR. Agric Biotechnol J 12 (1), 177-192 (In Persian).

Mohammadabadi MR, Kord M, Nazari M (2018) Studying expression of leptin gene in different

tissues of Kermani Sheep using Real Time PCR. Agric Biotechnol J 10, 111-122 (in

Persian).

Mohammadabadi MR, Tohidinejad F (2017) Charachteristics determination of Rheb gene and

protein in Raini Cashmere goat. Iran J Appl Anim Sci 7, 289-295.

Morimoto S, Suemori k, Moriwaki j et al. (2001) Morphine Metabolism in the Opium Poppy and

Its Possible Physiological Function. The J Biol Chem 276, 38179–38184.

Pichersky E, Lewinsohn E (2011) Convergent evolution in plant specialized metabolism. Annu

Rev Plant Biol 62, 549–566.

Sharma P, Padh H, Shrivastava N (2013) Hairy root cultures: a suitable biological system for

studying secondary metabolic pathways in plants. Eng Life Sci 13, 62–75.

Sharifzadeh Naeini M, Naghavi MR, Bihamta MR et al. (2020) Production of some

benzylisoquinoline alkaloids in Papaver armeniacum L. hairy root cultures elicited with

salicylic acid and methyl jasmonate. Plant Tissue Cult.

Shukla S, Singh SP ( 2000) Alkaloid profile in relation to different developmental stages of

Papaver somniferum L. Phyton (Horn, Austria) 41(1), 87-96.

Tohidi nezhad F, Mohammadabadi MR, Esmailizadeh AK, et al. (2015) Comparison of different

levels of Rheb gene expression in different tissues of Raini Cashmir goat. Agric Biotechnol

J 6, 35-50.

Unterlinner B, Lenz R, Kutchan TM (1999) Molecular cloning and functional expression of

codeinone reductase: the penultimate enzyme in morphine biosynthesis in the opium poppy

Papaver somniferum. Plant J, 18, 465–745.

Van der Heijden R, Jacobs DI, Snoeijer W et al. (2004) The Catharanthus alkaloids:

pharmacognosy and biotechnology. Curr Med Chem 11, 607–628.

Evaluation of salicylic acid treatment on expression of ...

Documents

Transcript of Evaluation of salicylic acid treatment on expression of ...