Evaluation of a nanofluid device for the separation of confined macromolecules on an entropic basis...

UNIVERSITA DEGLI STUDI DI NAPOLI

FEDERICO II

FACOLTA DI INGEGNERIA

CORSO DI LAUREA IN SCIENZA ED INGEGNERIA DEI

MATERIALI

TESI DI LAUREA TRIENNALE

VALUTAZIONE DI UN DISPOSITIVO

NANOFLUIDICO PER LA SEPARAZIONE SU

BASE ENTROPICA DI MACROMOLECOLE

CONFINATE

Relatore:

Ch.mo Prof. Paolo Netti

Correlatore:

Dott.ssa Ing. Ilaria De Santo

Candidato:

Emanuele Zappia

Matr. 539/212

ANNO ACCADEMICO 2011-2012

La scienza e un cimitero di idee morte, anche se ne puo uscire la vita.

- Miguel de Unamuno

Indice

Introduzione 3

1 Stato dell’arte 6

1.1 La nanofluidica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

1.1.1 Le premesse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

1.1.2 Problematiche legate alla nanoscala . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.1.3 Principali modelli di diffusione in sistemi nanofluidici . . . . . 13

1.1.4 Applicazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

1.2 Termodinamica di polimeri in sistemi nanofluidici . . . . . . . . . . . 20

1.2.1 Polimeri in soluzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

1.2.2 Polimeri in regime di confinamento . . . . . . . . . . . . . . . 25

1.3 Separazione di biomolecole mediante sistemi nanostrutturati . . . . . 30

1.3.1 Meccanismi di separazione molecolare . . . . . . . . . . . . . . 31

1.3.2 Esempi di sistemi nanostrutturati per la separazione molecolare 34

2 Materiali e metodi 41

2.1 Apparato sperimentale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

2.1.1 Strumentazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

2.1.2 Dispositivo nanofluidico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

2.2 Il PEG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

2.3 Funzionamento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

2.3.1 Prinicipi e metodi d’acquisizione dati . . . . . . . . . . . . . . 47

2.3.2 Calibrazione del volume confocale . . . . . . . . . . . . . . . . 52

2.4 Elaborazione dei dati sperimentali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

3 Risultati e discussione 55

3.1 Misure di diffusione del PEG in soluzione . . . . . . . . . . . . . . . . 55

3.2 Comportamento del PEG in nanocanali a varie temperature . . . . . 57

3.3 Meccanismo di separazione proposto . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

1

Conclusioni e sviluppi futuri 66

Riferimenti bibliografici 68

Ringraziamenti 76

2

Introduzione

Negli ultimi anni le nanotecnologie hanno avuto un incredibile sviluppo in molte

aree scientifiche. La capacita di manipolare la materia su scala nanometrica e la

produzione di materiali dalle proprieta innovative hanno contribuito a dare ampia

visibilita a questa disciplina, le cui applicazioni spaziano dall’elettronica alla nano-

medicina, dal campo ambientale alle biotecnologie.

In tale contesto la nanofluidica, area disciplinare di recente sviluppo che si occupa

del comportamento, della manipolazione e del controllo dei fluidi confinati in strut-

ture nanometriche e una disciplina dalle forti potenzialita. Si e infatti osservato che

il comportamento dei fluidi in strutture nanometriche si discosta dal comportamen-

to dei fluidi in sistemi macroscopici; in particolare si sono osservate deviazioni dal

modello classico nel comportamento di fluidi confinati in sistemi nanometrici sia in

ambito statico che dinamico. Le regioni di fluido confinate esibiscono infatti nuove

proprieta e sono stati evidenziati mutamenti nelle caratteristiche termodinamiche dei

sistemi nanofluidici nonche alterazioni della reattivita chimica all’interfaccia fuido-

solido delle specie inserite in tali sistemi.

Alla base di tutti i dispositivi nanofluidici, ed in particolare per sistemi di separa-

zione molecolare, i processi diffusivi delle molecole confinate su scala nanometrica

sono estremamente rilevanti. Si e osservato che la diffusione di molecole all’interno

di strutture nanometriche si discosta dal modello classico diffusivo. La diffusione

all’interno di tali sistemi assume caratteristiche particolari a seconda del sistema e

delle molecole considerati; essa e influenzata da molti fattori quali il rapporto tra la

dimensione della molecola e le dimensioni caratteristiche del sistema, le forze elettro-

statiche, le interazioni di van der Waals, le forze capillari e le interazioni superficiali,

tutti parametri che giocano ruoli chiave sulla nanoscala.

Le applicazioni in nanofluidica sono molteplici, come ad esempio il rilascio control-

lato di farmaci, il sequenziamento del DNA ed in particolare lo sviluppo di sistemi

nanostrutturati per la separazione molecolare; quest’ultimo settore applicativo ri-

veste un ruolo fondamentale in molte aree scientifiche ed e tutt’oggi un campo in

continua evoluzione; lo studio di possibili sistemi di separazione molecolare, del de-

3

sign di congegni innovativi e dell’ingegnerizzazione dei meccanismi diffusivi sono

tematiche oggetto di forte interesse ed in continuo sviluppo. Infatti, nella moderna

biologia e nell’ingegneria biomedica, la capacita di separare ed identificare biomole-

cole da campioni biologici complessi, in maniera accurata ed efficiente, e rilevante

per lo sviluppo di applicazioni che spaziano dalla chimica industriale alla biologia

diagnostica.

In tale ambito i dispositivi di filtrazione nanostrutturati assumono un ruolo sempre

piu rilevante offrendo forti vantaggi rispetto alle tecnologie di filtrazione moleco-

lare convenzionali quali il controllo ingegnerizzato del meccanismo, l’automazione

del processo e le dimensioni notevolmente contenute dei dispositivi. Nonostante le

enormi potenzialita, i sistemi nanofluidici di separazione sono stati applicati sin’ora

soltanto a molecole cariche che, per ottenere un’efficace separazione, necessitano di

campi elettrici o flussi imposti, necessari anche per le tecniche di separazione con-

venzionali.

In tale contesto e interessante valutare la possibilita di sfruttare il confinamento di

biomolecole in un dispositivo che ne condizioni le proprieta fisico-chimiche di confi-

gurazione, dimensione e mobilita al fine di realizzare un dispositivo di separazione

che non utilizzi campi esterni imposti ne di pressione idrodinamica, ne campi elet-

trici.

In questo lavoro di tesi e stato quindi valutato un meccanismo innovativo di sepa-

razione molecolare nanofluidico su base entropica.

L’idea di base di tale dispositivo risiede nelle possibilita di far variare la quantita

di molecole confinate in un nanocanale di dimensioni confrontabili a quelle della mo-

lecola modello, in risposta a variazioni di temperatura imposte al sistema. Infatti

un incremento di temperatura causa l’aumeto del contributo entropico nel bilancio

energetico di una molecola confinata, facendo sopraggiungere la possibilita di una

condizione energeticamente sfavorevole e di conseguenza la fuoriuscita dall’ambiente

confinato.

Sono state quindi impiegate delle molecole modello di PEG (polietilenglicole), un

polimero flessibile, elettricamente neutro e solubile in acqua, al fine di valutarne

il comportamento diffusivo in nanocanali al variare della temperatura. Le misure

sono state effettuate a diverse temperature d’esercizio (23, 37 e 45C) ed utilizzando

preparati di PEG a diversi pesi molecolari (20 kDa e 40 kDa), sia in soluzione, per

valutare la variazione del raggio idrodinamico del polimero a seconda della temepra-

tura, che in dispositivi nanofluidici con nanocanali di 10 nm di spessore.

Per tali esperimenti ci siamo avvalsi della tecnica di spettroscopia di correlazione di

fluorescenza FCS, abbinata alla microscopia confocale, che ci ha permesso di esegui-

4

re misurazioni accurate su un numero ridotto di molecole.

Analizzando le cinetiche di svuotamento nei vari esperimenti si e osservato che al-

l’aumentare della temperatura la cinetica di svuotamento dai nanocanali del PEG

40 kDa e del PEG 20 kDa hanno caratteristiche diverse.

L’effetto della temperatura sulle condizioni di confinamento spontaneo di molecole

di PEG in nanocanali e stato interpretato attraverso il modello per polimeri confi-

nati in soluzione proposto da De Gennes.

Da queste considerazioni abbiamo quindi analizzato la natura del fenomeno termo-

dinamico, registrando, attraverso il confronto delle due cinetiche, una piu veloce

fuoriuscita dai nanocanali di molecole a piu alto peso molecolare all’aumentare della

temperatura.

In sintesi e stata verificata sperimentalmente la validita del principio alla base di

un possibile dispositivo nanostrutturato di separazione molecolare su base entropica,

regolato dalla temperatura.

5

Capitolo 1

Stato dell’arte

Indice

1.1 La nanofluidica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

1.1.1 Le premesse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

1.1.2 Problematiche legate alla nanoscala . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.1.3 Principali modelli di diffusione in sistemi nanofluidici . . . . . . . 13

1.1.4 Applicazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

1.2 Termodinamica di polimeri in sistemi nanofluidici . . . . . . . . 20

1.2.1 Polimeri in soluzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

1.2.2 Polimeri in regime di confinamento . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

1.3 Separazione di biomolecole mediante sistemi nanostrutturati . 30

1.3.1 Meccanismi di separazione molecolare . . . . . . . . . . . . . . . 31

1.3.2 Esempi di sistemi nanostrutturati per la separazione molecolare . 34

1.1 La nanofluidica

1.1.1 Le premesse

La nanofluidica e lo studio del comportamento, della manipolazione e del controllo

dei fluidi confinati in strutture nanometriche (1-100 nm).

Si tratta di un’area disciplinare abbastanza recente: infatti solo nel 1995 e stato at-

tribuito ad essa un nome specifico, in analogia con il termine microfluidica, scienza

di cui e figlia e catalogata come disciplina solo 5 anni prima [42]; la relativamente

recente nascita della nanofluidica e strettamente legata allo straordinario sviluppo

delle nanotecnologie che si e avuto negli ultimi anni.

6

Capitolo 1 La nanofluidica

Le nanotecnologie rappresentano lo studio della manipolazione della materia su

scala nanometrica e la progettazione e realizzazione di sistemi dalle piu svariate ap-

plicazioni.

Sebbene esse abbiano avuto una significativa crescita solo nell’ultimo ventennio, lo

sviluppo dei suoi principi fondamentali e avvenuto durante l’ultima meta del secolo

scorso; a partire dalla famosa dichiarazione di Feyman del 1959 There’s a plenty

of room at the bottom, nella quale venivano illustrati i concetti fondamentali alla

base della nanotecnologia; passando poi per l’invenzione di strumenti fondamentali

che hanno portato molti traguardi tecnologici (quali l’invenzione del microscopio

elettronico a scansione per effetto tunnel) o anche scoperte basilari come quella del

fullerene nel 1985, portando infine, nel 1986, alla pubblicazione del libro Engines of

creation: The coming era of nanotechnology di Kim Eric Dexler, in cui venivano

sviscerati gli obbiettivi ed i concetti fondamentali di questa disciplina.

Lo sviluppo delle nanotecnologie ha reso possibile manipolare la materia su pic-

colissima scala, consentendo la realizzazione di materiali innovativi dalle proprieta

magnetiche, elettriche, meccaniche e ottiche rivoluzionarie [29][40], portando tra

l’altro alla realizzazione di complessi dispositivi nanostrutturati (come ad esempio

nanotubi, strutture nanoporose o nanoparticelle [42][31][4]) che rispondono all’esi-

genza di miniaturizzazione presente in molti campi applicativi.

L’evoluzione della nanofluidica e quindi intimamente legata allo sviluppo del-

le nanotecnologie; e stato infatti possibile realizzare sistemi nanofluidici solo con

l’avvento di tecnologie in grado di fabbricare tali dispositivi, quali ad esempio la

litografia a raggi x. Inoltre, anche grazie all’avvento di strumenti d’analisi qua-

li il microscopio elettronico a scansione per effetto tunnel o il microscopio a forza

atomica, e stato possibile effettuare misurazioni accurate su tali sistemi e quindi

caratterizzarli, studiarli ed ingegnerizzarli.

La nanofluidica, sebbene di recente sviluppo, ha influenzato molte altre discipline

come la scienza dei polimeri, la fisica dei fluidi, la genetica, la tribologia; lo schema

in figura 1.1 indica le maggiori discipline che interagiscono con essa.

L’eterogeneita delle varie aree scientifiche coinvolte mostra chiaramente l’inter-

disciplinarieta della nanofluidica ed i suoi molteplici settori applicativi.

Emanuele Zappia 7


Figura 1.1: Discipline collegate alla nanofluidica ed alcuni importanti settori correlati.

1.1.2 Problematiche legate alla nanoscala

Per comprendere il diverso comportamento fisico di un fluido confinato in una strut-

tura nanometrica e opportuno definire il ruolo delle forze in gioco su nanoscala e

quanto e come esse incidano sul sistema.

Infatti, quando le dimensioni caratteristiche dei sistemi sono dell’ordine dei nm, le

forze elettrostatiche, le interazioni di van der Waals, le forze capillari e le interazio-

ni superficiali incidono molto di piu nella caratterizzazione del sistema rispetto ai

classici sistemi macroscopici. Al contrario, assumono una minore importanza sulla

nanoscala le forze gravitazionali e inerziali [23].

Si sono osservate infatti deviazioni dal modello classico nel comportamento di

fluidi confinati in sistemi nanometrici sia in ambito statico che dinamico [22][34]. Le

regioni di fluido confinate esibiscono infatti nuove proprieta, (ad esempio la viscosita

aumenta enormemente in prossimita della parete di un poro nanometrico). In gene-

Emanuele Zappia 8


Figura 1.2: Alcune forze significative in sistemi nanofluidici.

rale possono avvenire mutamenti nelle proprieta termodinamiche e anche alterazioni

della reattivita chimica della specie all’interfaccia fluido-solido [30].

Alla base di tutti i dispositivi nanofluidici, ed in particolare per sistemi di sepa-

razione molecolare, i processi diffusivi delle molecole confinate su scala nanometrica

sono estremamente rilevanti. E’ necessario quindi valutare le problematiche legate

alla mobilita delle molecole sulla nanoscala.

Un primo importante aspetto da considerare e la dimensione della molecola ri-

spetto alla dimensione caratteristica del sistema nanometrico come, ad esempio, il

diametro di un nanocanle. Infatti e possibile trattare il trasporto di molecole attra-

verso nanocanali con la teoria della sfera rigida solo se, detto s raggio di girazione1

di una molecola e d il diametro del nanocanale, risulta che sd< 1 [6].

1Il raggio di girazione e definito nel paragrafo 1.2.

Emanuele Zappia 9


In queste condizioni la conformazione della molecola e tale da non essere influenzata

dalle pareti e puo essere trattata, in prima approssimazione, come una sfera rigida.

Si puo quindi descrivere la concentrazione nel nanocanale attraverso il parametro di

partizione K

Keq =CinCbulk

Dove Cin e la concentrazione nel canale e Cbulk la concentrazione all’esterno del

canale.

L’ostacolo idrodinamico viene invece descritto daKD che tiene conto delle interazioni

chimiche e idrodinamiche della molecola. Questi due coefficienti vengono combinati

per definire il coefficiente di diffusione effettivo Dconfined [5][32][36]

Dconfined = DbulkKeqKD

Se invece il rapporto sd

tende a 1, Keq e KD tendono a zero, e quindi la teoria

idrodinamica della sfera rigida non e piu adatta a descrivere il trasporto delle mole-

cole nei nanocanali.

Per descrivere al meglio il comportamento di molecole all’interno di queste strut-

ture dobbiamo considerare quelle forze che su scala nanometrica incidono maggior-

mente nel trasporto delle molecole nei nanocanali, come le forze di interfaccia, le

forze elettrostatiche e le interazioni con la superficie; bisogna inoltre tener presente

quei fenomeni termodinamici che influenzano la conformazione delle molecole, in

quanto, come gia detto, esse non possono piu essere considerate come sfere rigide.

In questo contesto le interazioni energetiche a piccolo raggio come le interazioni di

van der Waals o le attrazioni idrofobiche, influenzano significativamente la mobilita

molecolare nei nanocanali, assumendo un ruolo determinante nella caratterizzazione

di sistemi nanofluidici.

Le considerazioni da fare sull’influenza che hanno questo tipo di forze in sistemi

nanometrici devono tenere conto di diversi fattori, come la carica della molecola, la

presenza e la natura della carica sulle superfici del canale [30].

Anche le forze d’interfaccia (ossia le forze che le macromolecole possono esercita-

re tra di loro, sugli ioni vicini e sulla superficie le quali agiscono all’interfaccia delle

molecole o in prossimita di essa) giocano un ruolo significativo nelle dinamiche di

sistemi nanofluidici.

Le forze d’interfaccia piu rilevanti sono di natura elettrica, in quanto esse sono con-

Emanuele Zappia 10


seguenza della presenza della nuvola elettronica di vari atomi esposti alla superficie.

Bisogna inoltre considerare le lunghezze caratteristiche sulle quali agiscono queste

forze (che nei liquidi sono dell’ordine di 1-100 nm) come la lunghezza dei legami

idrogeno, la scala di lunghezza associata alle forze di van der Walls e la lunghezza

di Debye; quest’ultima delimita fino a che distanza dalla superficie il fluido interno

risente delle interazioni della carica superficiale delle pareti, cioe fino a che distanza

la carica della superficie influenza il potenziale elettrico del fluido. Questo potenziale

sara quindi funzione della distanza del fluido dalla superficie.

Risulta quindi evidente come la presenza di un potenziale elettrico di questo genere

possa agire attraendo o respingendo molecole cariche dalla superficie e quindi in-

fluenzando il trasporto delle stesse nel nanocanale.

Altri fenomeni caratterizzanti i sistemi nanofluidici sono le interazioni repulsive

con la superficie dei nanocanali, chiamate repulsioni di Born o repulsioni steriche.

Queste forze repulsive derivano dall’interazione delle molecole con la nuvola elet-

tronica della superficie ed aumentano enormemente con l’accrescersi della distanza

intermolecolare. La repulsione di Born puo evitare ad una molecola di entrare in aree

nanoconfinate o puo portare macromolecole ad assumere conformazioni entropiche

meno favorite.

Figura 1.3: Membrane nanoporose (pori di 100 e 200 nm) e particolare di molecola diDNA attraverso un nanoporo.

Altri aspetti fondamentali per studiare la mobilita di molecole all’interno di na-

nocanali riguardano le conformazioni che esse possono assumere durante il trasporto

in sistemi nanostrutturati e considerazioni termodinamiche da associare a questo ti-

po di fenomeni.

Ad esempio possiamo considerare la dinamica di una molecola di DNA attraverso

una membrana porosa.

Emanuele Zappia 11


Figura 1.4: Barriera energetica nel meccanismo di trasporto del DNA attraverso unnanoporo.

In questo caso, poiche le dimensioni caratteristiche della struttura hanno lo stesso

ordine di lunghezza della lunghezza di persistenza2 della catena di DNA, la macromo-

lecola, per passare attraverso la membrana, dovra stirarsi linearmente modificando

la sua conformazione; questo fenomeno si traduce in una perdita di entropia che

potrebbe addirittura impedire al DNA di continuare a muoversi in tale struttura.

Tale perdita entropica e attribuibile ai cambi conformazionali che si verficano quando

una molecola flessibile e confinata in strutture nanometriche; le interazioni energe-

tiche molecola-parete potrebbero bilanciare tale perdita entropica [17].

Tutt’ora i meccanismi di trasporto di molecole flessibili in strutture confinate

non sono del tutto chiari in quanto gli aspetti da prendere in considerazione per

caratterizzare al meglio sistemi nanofluidici sono molteplici e di grande complessita.

2La lunghezza di persistenza e definita nel paragrafo 1.2

Emanuele Zappia 12


1.1.3 Principali modelli di diffusione in sistemi nanofluidici

Prima di trattare i meccanismi di diffusione in sistemi nanofluidici accenniamo la

trattazione classica alla diffusione, in quanto i modelli diffusivi per tali sistemi sono

una deviazione dal modello classico.

I due approcci classici fondamentali sono quello macroscopico e quello microsco-

pico; il primo si basa sulle soluzioni matematiche stabilite da Adolf Fick ed e quello

maggiormente utilizzato in applicazioni ingegneristiche, mentre il secondo fa capo

alla teoria di Brown, sviluppata poi da Maxwell ed Einstein.

Ricaviamo ora una delle equazioni fondamentali per l’approccio microscopico

proposto da Fick.

Consideriamo

J = −D∇C (1.1)

Dove D e il coefficiente di diffusione e ∇C il gradiente di concentrazione.

Considerando l’equazione di continuita

∂c

∂t= −∇J

E sostituendo quest’equazione nella (1.1) otteniamo la prima legge di Fick per

la diffusione

∂c

∂t= ∇(D∇C) (1.2)

Note le concentrazioni iniziali e le condizioni al contorno quest’equazione ci con-

sente di calcolare la distribuzione di concentrazione in ogni istante [14].

L’approccio microscopico mette in relazione i moti Browniani delle molecole (os-

sia i moti disordinati delle particelle aventi diametro dell’ordine del micrometro

presenti in fluidi o sospensioni fluide) con la diffusione. Einstein ha il merito di aver

identificato nel cammino quadratico medio delle particelle aventi moto Browniano

il valore caratteristico per descrivere la loro diffusione; nel modello random walk di

Emanuele Zappia 13


Einstein la mobilita di una molecola consiste in periodi di movimenti indisturbati

interrotti da bruschi cambiamenti di direzione quando essa collide con altre parti-

celle [3].

Ad una data temperatura la velocita media della particella rimane costante mentre,

a causa delle collisioni con altre particelle, la sua velocita istantanea varia.

Figura 1.5: Modello randomwalk di una particella in un moto Browniano.

Einstein mise poi in relazione il coefficiente di diffusione al cammino quadratico

ottenendo le seguenti formule a seconda del caso monodimensionale, bidimensionale

e tridimensionale

1D 〈r2(t)〉 = 2Dt

2D 〈r2(t)〉 = 4Dt

3D 〈r2(t)〉 = 6Dt

Emanuele Zappia 14


Dove 〈r2(t)〉 e il cammino quadratico medio.

Si vede quindi che in regime di diffusione Fickiano la radice del cammino quadratico

medio e proporzionale alla radice del tempo.

Figura 1.6: Il cammino quadratico medio in funzione del tempo nel modello Fickiano.

Deviazioni dal modello Fickiano

In alcuni casi reali, come ad esempio in sistemi nanofluidici, la diffusione delle sin-

gole particelle puo essere influenzata da ostacoli, zone di adsorbimento, regioni a

maggiore concentrazione o locali anisotropie.

Questi diversi fattori influenzano il meccanismo di diffusione delle particelle causan-

do deviazioni dal modello Fickiano classico e non mantenendo la proporzionalita tra

cammino quadratico medio e la radice del tempo.

Viene definita diffusione anomala un processo per il quale, a causa di ostruzioni

o vincoli, la dipendenza dal tempo del cammino quadratico medio e influenzata da

un fattore α chiamato coefficiente di anomalia

〈r2(t)〉 = 6Dtα, 0 < α < 1 (1.3)

Quindi il cammino quadraico medio non ha piu dipendenza lineare col tempo

ma si ha una dipendenza di tipo legge di potenza, con esponente α; i sistemi in cui

molecole presentano questo tipo di diffusione sono membrane porose e molti altri in

cui e significativa la presenza di ostacoli.

Quando la molecola e stericamente confinata in un sistema di dimensione finita si

ha una diffusione di tipo confinato il cui modello e descritto dalla seguente formula

Emanuele Zappia 15


Figura 1.7: Il cammino quadratico medio in funzione del tempo nel modello della diffusioneanomala.

〈r2(t)〉 ' 〈r2C(t)〉

1− A1e

−6A2Dt

〈r2C

(t)〉

, A1, A2 6= 0 (1.4)

Dove 〈r2C(t)〉 e un asintoto che rappresenta l’area effettiva del confinamento e

dove i parametri A1, A2 sono relativi alla geometria del sistema e difficilmente rica-

vabili analiticamente.

Nel caso di diffusione di particelle rigide, in un sistema avente dimensioni che

approssimano la dimensione delle particelle, si realizza un moto diffusivo single file.

Figura 1.8: Rappresentazione del modello single-file.

In questo caso il cammino quadratico medio sara

〈r2(t)〉 = 6Ft12 (1.5)

Risultando essere proporzionale alla radice del tempo, dove F e il coefficiente di

mobilita.

Questo modello descrive unicamente il movimento di particelle rigide quando non

e consentito il passaggio simultaneo delle stesse all’interno delle strutture confinate

Emanuele Zappia 16


e non tiene conto della flessibilita delle molecole e delle interazioni tra superficie e

particelle [33][9].

Figura 1.9: Il cammino quadratico medio in funzione del tempo per il modello classico edeviazioni.

1.1.4 Applicazioni

Molte sono le applicazioni della nanofluidica ma il settore in cui si sono maggior-

mente sviluppate e quello biomedicale; in questa sezione verranno presentati alcuni

esempi significativi.

Nel settore del drug delivery sono in corso di studio diversi sistemi nanofluidici

per la risoluzione di problemi legati al controllo delle cinetiche di rilascio di principi

attivi in ambito farmacologico. Il rilascio attraverso mezzi convenzionali presenta

cinetiche in cui si registra un brust iniziale o un andamento esponenziale; questo

tipo di cinetiche spesso fanno si che si raggiungano, in fase di somministrazione,

concentrazioni nocive di principio attivo; si ha comunque, in ambito farmacologico,

uno scarso controllo sulla velocita di rilascio del principio attivo. Per ovviare a que-

sto problema si stanno progettando dispositivi, attraverso lo studio di meccanismi

diffusivi anomali in mezzi di rilascio nanostrutturati, con cinetiche di interesse per

terapie specifiche. Si e osservato come, modificando il design di dispositivi nano-

strutturati, sia possibile modulare la riduzione del coefficiente di diffusione variando

cosı il tipo di cinetica di rilascio.

Una delle cinetiche piu studiate e la cinetica di ordine zero, un particolare tipo di

Emanuele Zappia 17


cinetica con andamento non esponenziale. Si e dimostrato che la velocita di rilascio

del principio attivo, per questo tipo di cinetica, e costante nel tempo per un periodo

significativamente lungo; e pertanto possibile ingegnerizzare e controllare tale diffu-

sione a seconda della regolazione delle dimensioni del nanocanale in cui diffondono

le molecole.

Uno studio interessante e stato effettuato sulla cinetica di diffusione di una proteina

modello, l’albumina bovina (BSA Bovine Serum Albuminum), attraverso strutture

nanoporose. Sono state utilizzate molecole di albumina bovina dal diametro idrodi-

namico di 8 nm e membrane nanoporose con differenti dimensioni dei pori (13, 26

nm e pori con dimensione maggiore di 26 nm).

Figura 1.10: Cinetiche di diffusione in vitro dell’albumina bovina a confronto. A sinistra irisultati sperimentali ottenuti utilizzando membrane porose con pori di 26 nm di diametroe a destra utilizzando membrane porose con pori di 13 nm di diametro [28].

Si e osservato come la cinetica di diffusione, utilizzando le strutture con pori di

13 nm, sia di ordine zero per l’intero esperimento; per le membrane con pori di 26

nm i dato ottenuti hanno mostrato un profilo di rilascio esponenziale, mentre per

membrane con pori diametro maggiori di 26 nm si e osservata una cinetica di rilascio

con diffusione Fickiana. Per dimensioni dei pori inferiori a 13 nm non si e osservato

alcun rilascio [28].

Un’altra applicazione interessante in ambito biomedicale e l’utilizzo di strutture

nanofluidiche per studiare la sequenza del DNA, utile non solo per il sequenziamento

del genoma stesso ma anche per l’identificazione di agenti patogeni, applicazioni in

medicina legale e per il rilevamento di impronte biologiche.

Sono stati studiati vari metodi per un’efficace tecnica di sequenziamento del DNA

attraverso sistemi nanostrutturati. Possono essre cosı superati i limiti imposti dal-

le tecniche in uso, sia migliorandone l’efficienza che prevedendone in futuro anche

Emanuele Zappia 18


l’automazione.

Ad esempio e stata sviluppata una tecnica d’analisi per rivelare singoli frammen-

ti istonici di DNA nella cromatina nucleare attraverso un metodo di microscopia

confocale a fluorescenza multicolore; il protocollo consiste nell’inserire la cromatina

in una soluzione confinata all’interno di un canale nanofluidico e sottoporla ad un

campo elettrico. La cromatina, migrando attraverso canali sufficientemente stretti,

si allunga permettendo un’accurata identificazione dei segnali di sequenza. I segnali

vengono rilevati con l’uso di un microscopio confocale atto a rilevare la fluorescenza

delle singole molecole. Solo grazie al confinamento imposto dai canali nanofluidici si

sono potute effettuare accurate analisi di fluorescenza di singole molecole di DNA,

pur trattando soluzioni a concentrazioni relativamente elevate. Lo studio ha di-

mostrato come questa tecnica permetta una mappatura molecolare particolarmente

efficace [10].

Figura 1.11: Analisi lineare del DNA che migra in dei microcanali attraverso una tecnicadi microscopia laser [38].

Un altro settore rilevante d’applicazione della nanofluidica consiste nello svilup-

po di tecniche innovative di separazione molecolare, di cui si parlera in maniera

approfondita nel paragrafo 1.3.

Emanuele Zappia 19

Capitolo 1 Termodinamica di polimeri in sistemi nanofluidici

1.2 Termodinamica di polimeri in sistemi nanofluidici

In questo paragrafo viene mostrato il comportamento termodinamico dei polimeri in

soluzione, in regime confinato e non, al fine di evidenziare le condizioni energetiche

caratterizanti il confinamento di una catena polimerica.

Per poter procedere ad un’analisi esaustiva verranno prima introdotte le principali

caratteristiche dei polimeri in soluzione in ambiente non confinato e successivamente

verra analizzato il modello per polimeri confinati proposto da de Gennes [11].

1.2.1 Polimeri in soluzione

I polimeri sono macromolecole che si presentano sottoforma di lunghe catene o re-

ticoli costituite da un gran numero di gruppi molecolari, legati attraverso legami

covalenti, detti unita ripetitive.

Per ogni coppia polimero-solvente esiste una temperatura Θ, detta temperatura

ideale, alla quale i segmenti della macromolecola non tendono ne ad attrarsi ne a

respingersi; a questa temperatura il solvente si dice anch’esso ideale. Consideran-

do per semplicita il caso dei polimeri apolari, e stato osservato che a temperature

superiori a Θ i segmenti della catena tendono a respingersi, la catena risulta media-

mente piu espansa rispetto allo stato ideale e manifesta un volume proprio, chiamato

volume escluso, in quanto un dato segmento della macromolecola non puo entrare

in uno spazio occupato da ogni altro segmento, in questo caso il sovente e definito

solvente buono. Al contrario, per temperature inferiori a quella ideale, le intera-

zioni tra i segmenti della catena sono piu favorite delle interazioni tra il solvente

ed i segmenti stessi; pertanto questi ultimi si attirano reciprocamente, e la catena

risulta piu contratta rispetto allo stato ideale, il solvente in questo caso e definito

solvente cattivo [7]. In tutta la trattazione consideriamo il solvente ideale non con-

siderando il caso reale e quindi il modello self-avoiding. Le proprieta fisico-chimiche

dei polimeri possono essere descritte attraverso vari modelli, qui verra illustrata

una delle piu semplici rappresentazioni: il modello random-walk. Prima di entrare

nel merito della trattazione e importante dare alcune definizioni di elementi fonda-

mentali che caratterizzano geometricamente la catena e alcune informazioni basilari

riguardo i polimeri in soluzione.

Consideriamo il polimero in un solvente ideale, in generale gli angoli di valenza3

e la lunghezza di legame della macromolecola rimangono praticamente invariati. Al

contrario gli angoli di rotazione interna attorno ai legami semplici di catena possono

3gli angoli di valenza sono gli angoli diedri che si formano tra i due piani contenenti due legami di unitaripetitive consecutivi

Emanuele Zappia 20


variare e sono la causa e variabile principale della possibilita di assumere diverse

conformazioni della catena4.

Figura 1.12: Rappresentazione dell’angolo di valenza α e l’angolo di rotazione interna ϕnei polimeri [25].

Gli angoli di rotazione interna su legami adiacenti non sono indipendenti e tendo-

no a mantenere stabile la direzione della catena; tuttavia questa dipendenza si perde

man mano che aumenta il numero di legami tra il legame di riferimento iniziale e

quello finale.

Al di sopra di un determinato numero di legami si ha totale indipendenza d’orienta-

zione dell’angolo di rotazione e il polimero puo essere visualizzato come un insieme

4L’angolo di rotazione interna ϕi attorno ad un dato legame li e definito come l’angolo diedro tra i duepiani cosı definiti: il piano che contine il legame li e il legame che lo precede li−1 e il piano che contine illegame li ed il legame che segue li+1

Emanuele Zappia 21


di segmenti aventi orientazione indipendente tra di loro, tali segmenti sono chiamati

segmenti statistici e la lunghezza ad essi associata e chiamata lunghezza di persi-

stenza. La presenza dei segmenti statistici e la causa della flessibilita del polimero,

che variera al variare della lunghezza di persistenza.

Un polimero in soluzione ha quindi la possibilita di assumere un gran numero di

configurazioni, l’insieme di queste possibili configurazioni e chiamato gomitolo sta-

tistico [7].

Figura 1.13: Una rappresentazione del gomitolo statistico.

Il concetto di gomitolo statistico serve a descrivere l’insieme delle forme che

puo assumere una macromolecola ed e alla base della trattazione dei polimeri in

soluzione.

Un’importante quantita misurabile con esperimenti di diffusione della luce e il

raggio di girazione quadratico medio 〈s2〉; tale quantita rappresenta la distanza

media quadratica degli atomi della catena dal loro baricentro

〈s2〉 =N+1∑i=1

〈Ri2〉

N + 1(1.6)

Dove N e il numero di legami compresi nella catena principale, N + 1 sono gli

atomi della catena stessa e Ri e il vettore tra il baricentro della catena e l’atomo

i-esimo.

Un’altra quantita con cui possiamo descrivere le dimensioni della macromolecola

e il vettore testa-coda r

r = L1 + L2 + L3 + · · ·+ Li (1.7)

Emanuele Zappia 22


Figura 1.14: Una rappresentazione del raggio di girazione.

Figura 1.15: Una rappresentazione del vettore testa-coda.

tale vettore rappresenta la distanza dal punto iniziale della catena a quello finale;

nell’equazione (1.15) r e espresso come somma dei vettori Li che collegano l’inizio e

la fine di ogni segmento statistico.

Introduciamo ora il modello random-walk, in cui si considera il polimero all’in-

terno di una struttura geometrica reticolare in cui la catena e disposta in maniera

casuale come mostrato in figura 1.16.

Il percorso e una successione di N passi, dove il passo successivo puo orientarsi

Emanuele Zappia 23


Figura 1.16: Random-walk di una catena polimerica in un reticolo bidimensionale

in tutte le direzioni vicine, quindi tutte le possibilita sono equiprobabili.

L’entropia S(r) associata a tutte le conformazioni di catena aventi come punto di

partenza (r = 0) e r come punto finale e

S(r) = kln[<N(r)] (1.8)

Dove <N e il numero di percorsi distinti possibili della catena dall’origine al

punto r.

In relazione a <N possiamo esprimere il numero totale di passi zN

∑r

<N(r) = zN

Dove z e il numero di vicini possibili per ogni passo, e dove il vettore testa-coda

r si puo esprimere come sommatoria su n delle lunghezze di persistenza an

r = a1 + a2 + · · ·+ aN =∑n

an

I vari vettori aN avranno z orientazioni possibili e orientazioni indipendenti fra

di loro, quindi possiamo esprimere il valore quadratico medio del vettore testa-coda

〈r2〉 nel modello random-walk come

Emanuele Zappia 24


〈r2〉 =∑nm

〈an · am〉 =∑n

an2 = Na2 = R0

2

Qualitativamente possiamo dire che, per il modello random-walk, la quantita R0

risulta ∼ N12a.

Considerando che nel modello random-walk la probabilita di trovare una catena in

una data configurazione assume una distribuzione di tipo gaussiano e che l’entropia e

esprimibile in funzione delle possibili configurazioni del polimero secondo l’equazione

(1.8) abbiamo che

S(r) ∼ 3r2

2R02 (1.9)

Da qui possiamo descrivere il sistema in termini di energia libera

G(r) = E− TS

Dove possiamo assumere, per questo modello, la quantita E costante nel caso di

conformazioni indipendenti e quindi ottenere

G(r) = G(0) +3Tr2

2R02 (1.10)

Formula fondamentale per il sistema che inoltre definisce la costante elastica di

una catena ideale [11].

1.2.2 Polimeri in regime di confinamento

Consideriamo una catena ideale confinata in un tubo di diametro D come mostrato

in figura 1.17.

Si parlera di regime confinato quando D R0 e D a, l’ultima condizione

assicura adeguata mobilita al polimero all’interno del canale.

Per il momento non consideriamo l’interazione tra le pareti del canale e la macro-

molecola, quindi escludiamo fenomeni di adsorbimento (ricordiamo inoltre che per

tutta la trattazione consideriamo il solvente ideale (T = Θ) e quindi ignoriamo in-

terazioni intercatena).

Poiche il confinamento non influenza il comportamento del polimero lungo la

direzione parallela all’asse del tubo, avremo che la lunghezza che il polimero occupa

Emanuele Zappia 25


Figura 1.17: Catena polimerica confinata in un canale.

nel nanocanale R‖ risulta R‖ = R0.

Procediamo ora a valutare l’energia di confinamento associata al sistema.

Assumiamo che l’unico contributo energetico significativo sia dato dall’entropia,

quindi non consideriamo forze di van der Waals a lungo raggio all’interno del tubo

e stimiamo la riduzione di entropia ∆S dovuta al confinamento.

Avremo che ∆S sara una funzione lineare di N , inoltre ∆S dipendera solo dal rap-

porto R0

D.

Avremo quindi che

∆S ∼ −R0

D

y

∼ Ny2

Dove y e fattore di scala.

E poiche ∆S deve essere una funzione lineare di N avremo che y = 2 e quindi

∆S ∼ −kb(R0

D

)2

(1.11)

Ricordando che abbiamo assunto che l’unico contributo energetico significativo

sia dato dall’entropia e che kb e la costante di Boltzmann pari circa a 1.38 · 10−23,

consideriamo il tutto in termini di energia libera

Emanuele Zappia 26


∆G = −T∆S

∆G = kbT(R0

D

)2

(1.12)

Quest’equazione (1.12) rappresenta l’energia di confinamento, in termini di ener-

gia libera, associata al sistema.

La trattazione risulta comunque valida anche per il confinamento in una slitta o in

una sfera, ad eccezione solo del coefficiente R0

D[11].

Modello del debole adsorbimento

Consideriamo ora il caso in cui ci siano fenomeni di debole adsorbimento, cioe seg-

menti di polimero aderiscono leggermente alle pareti del canale formando grandi

anse che si estendono fino ad una lunghezza media pari a D.

Figura 1.18: Debole adsorbimento di una catena polimerica confinata in un canale.

In questo caso l’equazione (1.12) diventa

∆G ∼= kbT(R0

D

)2

− kbTδfbN (1.13)

Emanuele Zappia 27


Dove Tδ e l’attrazione tra il monomero adsorbito e la superficie, fb e la frazione

di monomeri adosrbiti.

Il secondo termine al secondo membro e dovuto alle interazioni con le pareti.

Essendo la densita di monomeri riferita allo spessore del canale D avremo che

fb ∼=a

D

Inserendo quest’espressione nell’equazione (1.13) e minimizzando la funzione

rispetto a D avremo che

D ∼=ak

δ(δ 1, D R0)

Da cui si ricava l’entalpia H

H ∼= −kbTNδ2 (1.14)

Le condizioni richieste per l’adsorbimento di catene separate non si realizzano

mai nella realta, ma questo modello potrebbe risultare molto utile per ulteriori con-

siderazioni sul fenomeno dell’adsorbimento per piu catene [11].

Il bilancio energetico di una catena confinata e positivo solo se c’e interazione

alla parete; esso viene valutato sia attraverso il contributo della perdita entropica,

dovuta al cambio di conformazione della macromolecola e che varia a seconda di dif-

ferenti gradi di confinamento (in quanto l’entropia risulta proporzionale a(R0

D

)2

),

che attraverso il guadagno entalpico dovuto alle interazioni con la parete. Quindi se

la perdita entropica sara preponderante rispetto al guadagno entalpico si avra una

condizione di instabilita, in quanto risultera ∆G > 0 e il confinamento della catena

non sara piu energeticamente favorito.

E’ stato studiato, attraverso l’ausilio di elaboratori software quali MATLAB,

VDM e NAMD, il comportamento termodinamico del polietilenglicole messo in in-

terazione con un nanocanale avente dimensione caratteristica confrontabile con il

raggio di girazione della molecola utilizzata; in questo lavoro [27] si sono valuta-

te le variazioni entropiche ed entalpiche del sistema molecola-nanotubo ed e stato

realizzato un modello al calcolatore che permette di prevedere qualitativamente un

possibile confinamento spontaneo del PEG tramite l’analisi dell’andamento dei due

contributi, entropico ed entalpico, in funzione del coefficiente R0

Da varie temperature.

Il fenomeno significativo che si riscontra in questa analisi e che, a seconda del

peso molecolare e della temperatura, si avra un diverso valore di R0

Ddi instabilita

Emanuele Zappia 28


Figura 1.19: Andamento dei contributi entalpico ed entropico in funzione di R0D , a varie

temperature e pesi molecolari [27].

termodinamica (cioe ∆G = 0 per ∆S = ∆H), al di la del quale il confinamento

della catena non sara piu energeticamente favorito (∆G > 0).

E’ interessante valutare questo tipo di fenomeno su cui basare un possibile mecca-

nismo di separazipone molecolare innovativo.

Emanuele Zappia 29

Capitolo 1 Separazione di biomolecole mediante sistemi nanostrutturati

1.3 Separazione di biomolecole mediante sistemi nanostrut-

turati

La separazione molecolare riveste un ruolo fondamentale in molte aree scientifiche

ed e tutt’oggi un campo in continua evoluzione; lo studio di possibili sistemi di se-

parazione molecolare, del design di congegni innovativi e dell’ingegnerizzazione dei

meccanismi diffusivi sono tematiche oggetto di forte interesse ed in continuo svilup-

po.

Nella moderna biologia e nell’ingegneria biomedica la capacita di separare ed identi-

ficare biomolecole da campioni biologici complessi, in maniera accurata ed efficiente,

e rilevante per lo sviluppo di applicazioni che spaziano dalla chimica industriale alla

biologia diagnostica, ad esempio la proteomica e la diagnosi del cancro, o per lo

studio delle caratteristiche molecolari nelle malattie dell’uomo [16].

Con l’avvento di tecnologie in grado di realizzare sistemi nanometrici, in congiun-

zione ad una sempre maggiore comprensione dei meccanismi di diffusione a livello

nanometrico, i dispositivi di filtrazione nanostrutturati rivestono un ruolo sempre

piu rilevante nell’ambito della separazione molecolare; questi sistemi offrono infat-

ti dei forti vantaggi rispetto alle tecnologie di filtrazione molecolare convenzionali,

quali il controllo ingegnerizzato del meccanismo, l’automazione del processo e le di-

mensioni notevolmente contenute, dell’ordine appunto dei nm.

Nonostante gli enormi sviluppi avuti in questo campo molte problematiche sono an-

cora aperte e sono necessarie ulteriori sperimentazioni per un vero e proprio sviluppo

a livello industriale.

Tutti i meccanismi di filtrazione analizzati sono stati congeniati per molecole ca-

riche e, per ottenere un’efficace separazione, necessitano della presenza di un campo

elettrico o di un flusso imposto.

Solo recentemente e stato proposto un sistema di manipolazione molecolare innova-

tivo chiamato entropoforesi, che si basa su un meccanismo di diffusione regolato da

forze entropiche.

In questo contesto un eventuale sistema di separazione molecolare su base entropi-

ca, che risulti efficace anche per molecole neutre, abbatterebbe molti dei limiti dei

meccanismi di separazione in uso.

In questo paragrafo verranno illustrati i principali meccanismi di separazione

molecolare ed alcuni esempi di sistemi di flitrazione artificiali nanostrutturati.

Emanuele Zappia 30


1.3.1 Meccanismi di separazione molecolare

Le proprieta di biomolecole attraverso un struttura filtrante sono determinate prin-

cipalmente da complesse interazioni tra le dinamiche molecolari proprie degli am-

bienti confinati e la fisica dei sistemi nanofluidici, inoltre bisogna considerare anche

la chimico-fisica del sistema.

La teoria del trasporto confinato

Srumenti di estremo interesse nella separazione molecolare sono i sistemi nanostrut-

turati di filtrazione che sfruttano la teoria del trasporto confinato.

Un semplice sistema a cui possiamo fare riferimento e quello in cui una biomolecola

passa, ad esempio, attraverso un nanoporo cilindrico. Come illustrato nel paragrafo

1.1.2, la teoria idrodinamica del il trasporto confinato di molecole e stata molto ben

sviluppata e da la possibilita di calcolare varie caratteristiche del sistema (come ad

esempio il coefficiente di partizione, permeabilita ecc); quando invece tale teoria non

risulta piu valida, insorgono molte problematiche legate al trasporto di molecole in

ambienti nanostrutturati. E’ necessario quindi avere un quadro d’insieme generale

sul sistema e considerare tutti i fenomeni fisici rilevanti come l’interazione sterica,

l’interazione elettrostatica, la conformazione idrodinamica della molecola, cinetiche

di adsorbimento ecc.

Studiando le problematiche legate a questi sistemi, sfruttando le conoscenze acqui-

site e variando determinati parametri sono stati proposti molti meccanismi in grado

di influenzare le proprieta di trasporto della molecola in maniera controllata, otte-

nendo cosı sistemi ingegnerizzati atti a separare biomolecole in base a determinati

criteri.

Ad esempio, utilizzando sistemi nanoporosi che manifestano una diversa inte-

razione elettrostatica con la molecola d’interesse, possiamo influenzare la confor-

mazione della molecola, la sua lunghezza di persistenza ed altri parametri, i quali

condizionano le proprieta di trasporto della stessa [18].

Meccanismi di separazione delle matrici gel

Per risolvere i problemi legati alla separazione per elettroforesi in soluzione di mole-

cole cariche sono stati sviluppati dei metodi di separazione che sfruttano le matrici

gel. Gli stessi sono stati sfruttati nei sistemi nanostrutturati di filtrazione (infatti

tali dispositivi sfruttano questi meccanismi mimando le strutture delle matrici gel o

Emanuele Zappia 31


Figura 1.20: Schema e fenomeni fisici rilevanti nel trasporto confinato.

attraverso la progettazione di design particolari).

Sono stati proposti tre meccanismi di separazione distinti per spiegare come una

macromolecola flessibile e lineare possa migrare in maniera differente attraverso il

gel a seconda della dimensione della stessa confrontata con la dimensione media dei

pori, cioe a seconda del rapporto Rgb

(dove Rg e il raggio di girazione della molecola

e b il diametro medio dei pori del gel).

Separazione di Ogston(Rgb < 1

)Nella separazione di Ogston la macromolecola

e piu piccola dei pori del gel o degli ostacoli all’interno della matrice.

La separazione molecolare avviene a causa delle interazioni steriche tra la macromo-

lecola e il network poroso del gel.

A causa del rapporto Rgb< 1, in condizioni imperturbate la molecola si puo muovere

in maniera relativamente libera attraverso la matrice gelatinosa.

Questo meccanismo e stato proposto come processo di separazione molecolare tra-

mite applicazione di un campo elettrico.

Intrappolamento entropico(Rgb ∼ 1

)Si parla di intrappolamento entropico

quando Rgb∼ 1, la conformazione della macromolecola flessibile e costretta a defor-

marsi o a passare attraverso gli ostacoli del mezzo gelatinoso.

Ad ogni punto il numero di possibili conformazioni determina lo stato entropico

locale della molecola. Le differenze entropiche derivano dall’eterogeneita spaziale

della matrice gelatinosa, in quanto con la deformazione della molecola si avra una

riduzione dell’entropia conformazionale della stessa. La molecola quindi si separera

tendendo a localizzarsi preferenzialmente in spazi meno ristretti, dove la sua con-

formazione libera sara energeticamente favorita; risultando in un aumento locale

Emanuele Zappia 32


Figura 1.21: Meccanismi di separazione in matrici gel(in alto) e in sistemi nanostrtturati(in basso).

dell’entropia della molecola stessa.

Reptation(Rgb > 1

)Con il termine reptation si intende un movimento attivato

termicamente di una lunga macromolecola, lineare e flessibile. La maniera in cui si

muove la molecola attraverso la matrice gelatinosa, occupando contemporaneamente

piu pori, ricorda il movimento di un serpente, ed e simile al meccanismo di reptation

in un tubo, proposto originariamente da de Gennes per entanglaments di polimeri

artificiali.

In questo meccanismo solo i segmenti finali di una catena polimerica lineare e fles-

sibile possono liberarsi, in quanto la molecola subisce una flessione curvilinea lungo

l’asse della cavita porosa. Il profilo casuale del poro e la frizione dovuta allo scorri-

mento della molecola rallentano lo spostamento del centro di massa della stessa.

Rispetto al meccanismo di trasporto da intrappolamento entropico il numero di

Emanuele Zappia 33


configurazioni possibili per far reptare la molecola non dipende dalla posizione [16].

1.3.2 Esempi di sistemi nanostrutturati per la separazione molecolare

Design Forza di trasporto Meccanismo di separazione Campione molecolare

Percorso asimmetrico ad ostacoli Campo elettrico Moto browniano rettilineo DNA (15-30 kbp)Array di trappole entropiche Campo elettrico Intrappolamento entropico DNA (5-160 kbp)Array di microcolonne Campo elettrico pulsante Elettroforesi per stretching DNA (61-209 kbp)Array di nanocolonne Campo elettrico Elettroforesi per collisione DNA (1-38 kbp)Array di microcolonne Pressione Biforcazione di flusso laminare DNA (60-200 kbp);

proteine (10-200 kDa)Array di nanofiltri Campo elettrico Separazione di Ogston, DNA (50 bp-2 kbp);

Inrappolamento entropico proteine (10-300 kDa)Array autoassemblante Campo elettrico Collisione elettroforetica DNA (15-145 kbp)di particelle paramegnetiche

Tabella 1.1: Sommario di sistemi nanostrutturati artificiali per la separazione molecolare[16].

Array di micro e nanocolonne

Il primo filtro molecolare microstrutturato riportato in letteratura era composto da

un array incapsulato di colonne della dimensione di pochi µm, fabbricato tramite

etching di una base di silicone usando tecniche di microffabricazione tipiche dei se-

miconduttori convenzionali.

Utilizzando tale sistema si e osservato un fenomeno di elettroforesi in situ di lunghe

molecole di DNA allungate; per la prima volta si e realizzata una separazione di

macromolecole flessibili in un sistema le cui caratteristiche erano ben conosciute e

controllabili dal punto di vista ingegneristico.

A partire da questo lavoro pionieristico [41] altri gruppi hanno impiegato varie tec-

niche di microfabbricazione per realizzare micro e nanostrutture per il confinamento

e la separazione molecolare [16].

I sistemi di array di micro e nanocolonne sfruttano diversi meccanismi di sepa-

razione simili a quelli delle matrici gel, in quanto il design di questi sistemi tende a

mimare la struttura di tali materiali.

In tabella 1.1 si riportano vari meccanismi di separazione a seconda del design, della

forza di trasporto e del meccanismo di separazione del sistema.

Le tecniche di fabbricazione sono varie tra cui l’etching chimico e la fotolitogra-

fia; le tecniche di microlitografia offrono vari vantaggi tra cui il preciso controllo

sulla geometria del sistema e la flessibilita del design a seconda delle applicazioni

desiderate.

Si e dimostrata l’efficienza di tali sistemi che hanno efficacemente separato lunghi

Emanuele Zappia 34


frammenti di DNA sia nella separazione in batch [2] che in flusso continuo [8].

Figura 1.22: (a) SEM ( Scanning Electron Micrograph) di ostacoli nanometrici per lasparazione del DNA [1]; (b) Nanocolonne per la separazione del DNA (scala 500 nm).

Strutture anisotrope per la bioseparazione in flusso continuo

E’ stata studiata la possibilita di separare biomolecole con differenti proprieta (co-

me grandezza, carica o idrofobicita) attraverso l’anisotropia strutturale in un mezzo

filtrante a due dimensioni; il meccanismo prevede che le biomolecole seguano un per-

corso di migrazione differente a seconda delle loro diverse proprieta, cosı da essere

separate in maniera efficace.

Il risultato ottenuto e che differenti molecole avranno un differente angolo di

deflessione di flusso e si otterra un’effettiva separazione (figura 1.23 sulla destra);

fenomeno non rilevato in mezzi isotropi (figura 1.23 sulla sinistra).

In figura 1.24 si riporta un esempio del design di un sistema di separazione dalla

struttura anisotropa chiamato Anisotropic Nanofilter Array (ANA).

La struttura consiste in un array periodico bidimensionale di nanofiltri. Il mec-

canismo di separazione dell’ANA si basa su differenti caratteristiche di separazione

lungo le due direzioni ortogonali della struttura, che sono situate in maniera orto-

gonale e parallela alle file di nanofiltri.

Applicando un campo elettrico Ey lungo l’asse positivo y molecole con carica nega-

tiva uniforme (come il DNA), una volta iniettate nell’array, assumeranno un movi-

mento di deriva nei canali profondi con una velocita negativa Vy indipendente dalla

dimensione.

Un campo elettrico ortogonale Ex, sovrapposto lungo la direzione negativa dell’asse

Emanuele Zappia 35


Figura 1.23: (A destra) struttura anisotropa per la separazione molecolare in flussocontinuo, (a sinistra) un mezzo isotropo in cui non avviene separazione.

Figura 1.24: Schema esemplificativo dell’ANA (Anisotropic Nanofilter Array).

x attraverso i nanofiltri, guidera selettivamente le molecole trasportate nel canale

profondo facendole saltare, attraverso i nanofiltri, verso il canale successivo nella

direzione positiva dell’asse x.

Il passaggio delle molecolare attraverso i nanofiltri, sotto l’influenza del campo elet-

trico Ex, puo essere descritto come un fenomeno influenzato dal superamento, ter-

micamente attivato, di barriere energetiche (in termini di energia libera) lungo la

soglia dei nanofiltri.

Emanuele Zappia 36


Secondo il meccanismo di separazione di Ogston, queste barriere energetiche favori-

scono il passaggio di molecole di piccole dimensioni, facendo sı che le molecole piu

corte abbiano una velocita di passaggio Px piu grande.

Infatti molecole piu corte avranno un distanza di deriva caratteristica media L piu

corta nei canali profondi tra due nanofiltri consecutivi, originando un piu grande

angolo di deflessione θ [15].

Questo fenomeno accade quando le molecole hanno un diametro minore della di-

mensione di confinamento dei nanofiltri.

Invece, per molecole con un diametro maggiore della dimensione di confinamento

dei nanofiltri, il passaggio richiede che le molecole si deformino formando delle ernie

a discapito della loro energia interna conformazionale (meccanismo di intrappola-

mento entropico).

Molecole piu lunghe riescono a deformarsi piu facilmente e quindi hanno una piu

grande velocita di passaggio Px, risultando in un piu grande angolo di deflessione θ

[19].

L’ANA rappresenta un significativo progresso nel design dei sistemi di separazio-

ne molecolare nanostrutturati in quanto, operando in flusso continuo, permette di

raccogliere in continuo sottoinsiemi di biomolecole d’interesse, migliorando inoltre

la specificita e la sensibilita del sistema di separazione.

Array monodimensionale di trappole entropiche

In una serie di pubblicazioni [20][21], utilizzando un meccanismo di intrappolamento

entropico, e stata dimostrata l’efficacia di array di nanofiltri per la separazione di

molecole di DNA.

Figura 1.25: Schema del sistema di trappole entorpiche per la separazione del DNA [26].

Emanuele Zappia 37


Il sistema mostrato in figura 1.25 e una struttura monodimensionale di trappole

entropiche formata dall’alternarsi di nanoslitte e microslitte, ottenute da una base

di silicone tramite fotolitografia e tecniche di wet etching e poi ricoperte da un ri-

vestimento in Pyrex.

La presenza di un catodo e di un anodo ai due estremi del sistema fa sı che si generi

un campo elettrico; le molecole di DNA inserite sono quindi guidate tramite elet-

troforesi attraverso il dispositivo.

Le molecole sono temporaneamente intrappolate al confine tra la regione micro-

metrica e quella nanometrica per un tempo caratteristico τ prima di deformarsi,

formando delle ernie a scapito della loro energia interna conformazionale, ed iniziare

ad entrare nella nanoslitta.

Il tempo di intrappolamento τ puo essere espresso da un equazione di tipo Arrhenius

τ = τ0e

(α

EkbT

)La barriera di attivazione e data dal termine esponenziale che risulta essere indi-

pendente dalla dimensione della molecola e dove E rappresenta la forza del campo

elettrico nella regione della slitta.

Il termine τ0 rappresenta la probabilita di liberarsi dalla nanoslitta per unita di

tempo e dipende dal numero di monomeri presenti al confine tra le due regioni; τ0

risulta essere, in buona approssimazione e per basse intensita di campo elettrico,

proprorzionale a ∼ 1dR0

, dove d e la profondita della nanoslitta e R0 il raggio di

girazione della molecola.

Le molecole piu lunghe riescono quindi a sfuggire prima dalle nanoslitte rispetto

a quelle piu corte, a causa del meccanismo di formazione delle ernie; ipotesi confer-

mata dalle osservazioni e simulazioni al calcolatore [39].

Poiche la probabilita di sfuggire dalle nanoslitte dipende dalla lunghezza della mo-

lecola, al termine della separazione le differenti regioni del dispositivo conterranno

macromolecole di diversa lunghezza [26].

Entropoforesi

Tutti i dispositivi illustrati ed anche quelli elencanti nella tabella 1.1, al di la del

differente meccanismo sfruttato, necessitano della presenza di un campo elettrico o

di un flusso imposto per avere un’effettiva ed efficace separazione molecolare.

Solo recentemente e stato sviluppato un meccanismo di manipolazione molecolare

Emanuele Zappia 38


su base esclusivamente entropica chiamato entropoforesi [37].

Il sistema sviluppato nel lavoro e mostrato in figura 1.26 e una struttura carat-

terizzata da un complesso gradiente entropico ingegnerizzato: in particolare e stata

realizzata una struttura di nanocanali a profondita variabile il cui profilo richiama

quello di una scala.

Le profondita dei gradini variano generando zone di transizione tra un forte con-

finamento ed un confinamento piu moderato, cosı che lungo tutto il dispositivo il

confinamento risulta essere man mano decrescente.

Figura 1.26: (a) Come condizione iniziale il DNA e stato forzato elettrocineticamente adentrare nella struttura confinata, a t1 la forza applicata esterna e stata rimossa e il DNAe migrato lungo il dispositivo per entropoforesi, a t2 il DNA e raccolto sul fondo dellascala in una trappola entropica. (b) Le molecole di DNA sono trasportate lungo l’altezzadi ogni gradino dai moti Browniani e forze entropiche. (c) Immagine di un microscopioottico a campo chiaro del dispositivo nanofluidico vuoto, ogni gradino e apparentementeun colore diverso, a causa dell’interferenza con la luce bianca. I canali di collegamentosono visibili sulla sinistra e sulla destra. (d) Grafico, in corrispondenza all’immagine (c),dell’energia libera di confinamento e la profondita dei gradini in funzione della posizione.

All’interno di tale struttura sono state inserite molecole di DNA.

Il sistema, seguendo la seconda legge della termodinamica, fa si che le molecole mi-

grino attraverso il dispositivo da sole e raggiungano determinate concentrazioni in

specifiche regioni del sistema guidate esclusivamente da forze di natura entropica

e dal loro naturale moto Browniano; infatti a causa della natura casuale dei moti

browniani, molecole a piu basso peso molecolare impiegano piu tempo nel diffondere

lungo il canale, poiche queste ultime hanno maggiore possibilita di movimento in

Emanuele Zappia 39


direzioni non efficaci per lo svuotamento rispetto alle molecole a piu alto peso mo-

lecolare.

La diffusione delle molecole di DNA lungo la struttura e regolata dalle forze entropi-

che che sopraggiungono ai bordi tra i vari scalini, il DNA migra cosı lungo la scala.

L’analisi di questo meccanismo diffusivo e stata eseguita attraverso una tecnica di

microscopia di fluorescenza.

Sono state utilizzate molecole modello di DNA a diversa lunghezza e morfologia ed

e stata cosı studiata l’influenza di tali parametri in questo sistema di manipolazione

molecolare.

Emanuele Zappia 40

Capitolo 2

Materiali e metodi

Per poter rilevare e seguire le molecole a livello nanometrico abbiamo utilizzato la

spettroscopia di correlazione di fluorescenza in congiunzione alla microscopia confo-

cale.

Il sistema, in breve, consiste nell’irradiare il campione con un raggio laser focalizzato

nel volume confocale e misurare la successiva emissione in fluorescenza delle moleco-

le irradiate; vengono quindi registrate le fluttuazioni d’intensita di fluorescenza nel

tempo di misura e rispettivamente calcolata la funzione di autocorrelazione associa-

ta a tali fluttuazioni.

In questo capitolo verranno descritti in dettaglio la strumentazione, i materiali

ed i metodi d’analisi utilizzati.

In figura 2.1 e riportato uno schema generale del sistrma di misura.

Indice

2.1 Apparato sperimentale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

2.1.1 Strumentazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

2.1.2 Dispositivo nanofluidico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

2.2 Il PEG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

2.3 Funzionamento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

2.3.1 Prinicipi e metodi d’acquisizione dati . . . . . . . . . . . . . . . . 47

2.3.2 Calibrazione del volume confocale . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

2.4 Elaborazione dei dati sperimentali . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

41

Capitolo 2 Apparato sperimentale

Figura 2.1: Panoramica del sistema di misura.

2.1 Apparato sperimentale

2.1.1 Strumentazione

La strumentazione utilizzata consiste in un microscopio confocale ConfoCorll (Carl

Zeiss, Jena, Germania) dotato di divisore di fascio dicroico con messa a fuoco

manuale nel piano xy.

Tale strumento e composto da un microscopio a trasmissione invertito Zeiss Axio-

vert 200M utilizzabile a luce trasmessa e riflessa al quale e collegato un sistema di

illuminazione atto a rilevare ed illuminare il campione attraverso una scansione pun-

to per punto.

Il sistema illuminante e composto da una lampada a mercurio per l’analisi a

fluorescenza, con i filtri dicroici standard per l’imaging della fluorescenza della fluo-

resceina (FITC) e della rodamina (TRITC). Tale sistema e inoltre provvisto di tre

linee di laser: un laser argon con lunghezze d’onda di 453, 477, 488 e 514 nm e due

laser elio-neon con lunghezze d’onda rispettivamente pari a 543 e 633 nm.

Emanuele Zappia 42


Figura 2.2: Microscopio confocale Confocor II utilizzato per gli esperimenti.

Nelle misurazioni abbiamo eccitato delle molecole di polietilenglicole, funzionaliz-

zate con rodamina B, da una fascio laser a 543 nm e abbiamo raccolto l’emissione

attraverso un filtro BP (band pass) 560 - 615 nm.

Il campione in cui sono avvenute le misure e un sistema nanofluidico la cui analisi

sara oggetto del prossimo paragrafo.

2.1.2 Dispositivo nanofluidico

Il sistema nanofluidico e composto da un chip, provvisto di nanocanali collegati a

serbatoi micrometrici, inserito in un supporto adeguato e collegato a siringhe in

borosilicato cariche della soluzione campione mediante microcapillari e connettori

PEEK.

I microcapillari sono stati forniti dall’ Upchurch Scientific, U.S.A. mentre le si-

ringhe ed i connettori PEEK dall’ ILS (Innovative Labor System, Germania).

Nello specifico il chip, anch’esso in borosilicato, e stato realizzato via etching

chimico e fusion bonding.

I nanocanali hanno una profondita di 10 nm, lunghezza di 500 µm ed ampiezza che

Emanuele Zappia 43


Figura 2.3: Dispositivo utilizzato, composto dal chip nanofluidico, inserito nell’appositosupporto, connesso tramite microcapillari e connettori alle siringhe cariche di soluzione.

puo essere di 5, 10 o 30 µm. L’angolo di contatto e di circa 18 ± 8 ed, essendo

minore di 90, ci indica che la superficie e idrofilia; la ruvidezza superficiale del ca-

nale dichiarata dal produttore e, in genere, minore di 1 nm.

I nanocanali sono collegati a serbatoi micrometrici attraverso dei supporti adegua-

tamente progettati.

Figura 2.4: Schema del chip nanofluidico apoderato.

Il sistema, prima di effettuare le misurazioni, deve essere adeguatamente prepa-

rato: viene preparata una soluzione di acqua distillata (pH = 6.8, 18 MΩcm

) rifiltrata,

Emanuele Zappia 44

Capitolo 2 Il PEG

per assicurare la purezza della soluzione, attraverso dei filtri da 100 µm (What-

man) e PEG funzionalizzato con rodamina B neutra (Nanocs, New York) a vari pesi

molecolari (20 e 40 kDa) a seconda della misurazione.

Figura 2.5: Il chip inserito nel supporto e posizionato sull’obiettivo.

Viene quindi applicata una piccola pressione sulle siringhe, facendo cosı fluire la

soluzione nei serbatoi e, dopo non aver rilevato piu flussi residui, vengono connessi

al chip.

I nanocanali vengono quindi lasciati a riposo per una decina di ore per far raggiunge-

re l’equilibrio al sistema, cosı da consentire la diffusione della soluzione fluorescente

dai serbatoi ai nanocanali. Infine, una volta riempiti i nanocanali, il sistema e pron-

to per effettuare le misurazioni; il chip viene posto con relativo supporto nella zona

d’analisi del microscopio confocale e si procede alla misura.

Successivamente, per poter eseguire esperimenti a diverse temperature (23, 37 e

45C), viene posta una piastra riscaldante al di sopra di un contenitore metallico

che circonda il campione nella zona d’analisi del microscopio.

La temperatura viene monitorata attraverso una termocoppia collegata precedente-

mente al campione.

2.2 Il PEG

La macromolecola modello utilizzata per gli esperimenti e il polietilenglicole (PEG),

un polimero derivato dall’ossido di etilene.

In letteratura il polimero prodotto dall’ossido d’etilene viene chiamato polietilengli-

cole (PEG) quando il peso molecolare medio del materiale e al di sotto di 20.000 gmol

,

mentre polietilenossido (PEO) al di sopra di tale peso molecolare ed infine, generi-

camente, poliossietilene (POE) indipendentemente dal peso molecolare. In generale

Emanuele Zappia 45

Capitolo 2 Il PEG

le proprieta chimiche della molecola non variano sensibilmente col peso molecolare

mentre variano le proprieta fisiche.

La formula del PEG e:

HO − CH2 − (CH2 −O − CH2−)n − CH2 −OH

La sua formula bruta:

C2nH4n+2On+1

Il PEG viene prodotto per polimerizzazione anionica o cationica; di solito viene

utilizzato il processo per via anionica per ottenere una bassa polidispersita nel pro-

dotto finale. La polimerizzazione avviene partendo dall’ossido di etilene piu acqua e

oligomeri gia formati di glicole etilenico, il tutto catalizzato da agenti acidi o basici.

Il PEG a basso peso molecolare, nel suo stato finale, si presenta come un liquido

incolore, mentre il prodotto ad alto peso molecolare e un solido biancastro. Questo

polimero e solubile nel benzene, diclorometano, metanolo e in acqua. Gli usi di que-

sto materiale spaziano dalla farmaceutica come base per creme o agente dispersivo

nei dentifrici, non essendo tossico per l’uomo, sino al restauro, ad esempio come

consolidante di legni archeologici bagnati.

Questa macromolecola, oltre ad essere solubile in acqua, e flessibile e disponibile a

differenti pesi molecolari (20 e 40 kDa) ed e quindi risultata adatta per studiare la

cinetica di confinamento in nanocanali a differenti temperature.

Nei nostri esperimenti abbiamo utilizzato PEG funzionalizzato con rodamina B,

molecola che rende fluorescente il materiale.

Si riportano in tabella 2.1 alcune caratteristiche del PEG [24].

Raggi di girazione e rapporto con l’altezza del PEG

MW [kDa] rg [nm]rgh

20 4,7 0,4740 6,9 0,69

Tabella 2.1: Raggi di girazione e relativo rapporto con l’altezza del PEG, secondoKawaguchi [24].

Emanuele Zappia 46

Capitolo 2 Funzionamento

2.3 Funzionamento

2.3.1 Prinicipi e metodi d’acquisizione dati

La tecnica utilizzata nei nostri esperimenti al fine di valutare la concentrazione e i

tempi di diffusione del PEG all’interno dei nanocanali, in funzione dei differenti pesi

molecolari del polimero e delle differenti temperature, e la spettroscopia di correla-

zione di fluorescenza FCS abbinata alla microscopia confocale.

Il principio che sta alla base della tecnica FCS e quello di perturbare esternamen-

te il sistema attraverso raggi laser che eccitano le molecole nel campione, le quali,

dopo aver assorbito la radiazione elettromagnetica, se fluorescenti, si rilasseranno

emettendo a loro volta una radiazione elettromagnetica, sotto forma di fotone.

Tale emissione verra rilevata dallo strumento, contando il numero di fotoni rilevati

nell’unita di tempo, e visualizzata come fluttuazione d’intensita di fluorescenza; tale

intensita variera a seconda del numero di molecole che e passato nel volume illumi-

nato nel tempo di misurazione.

A differenza di altre tecniche la particolarita del metodo FCS e quella di trarre van-

taggio dalle fluttuazioni spontanee delle molecole eccitate; noi rileviamo i parametri

fisici d’interesse proprio attraverso la misurazione delle fluttuazioni di fluorescenza

che vengono normalmente classificate come rumore di fondo del segnale misurato.

In particolare lo strumento rileva le intensita di fluorescenza delle molecole che at-

traversano il volume di misura a causa del moto browniano delle stesse.

Inoltre questo metodo di misurazione e particolarmente adatto al nostro caso, in

quanto puo essere utilizzato per studi su scala nanometrica; infatti con la tecnica

FCS anche una singola molecola da un contributo significativo al segnale. Questo

metodo d’analisi si presta ad effettuare misure su campioni contenenti un numero

limitato di molecole, cosı da limitare anche disturbi dovuti a rumori di fondo [35].

In definitiva abbiamo la possibilita di rilevare anche poche molecole ed eseguire

misurazioni in volumi molto piccoli.

La tecnica di microscopia confocale ci permette di ridurre lo spazio di misura sul

campione attraverso un sistema di specchi e lenti atti a focalizzare la luce prove-

niente dai laser in un volume molto piccolo, chiamato volume confocale.

Il volume confocale e descritto come un ellissoide dai confini geometrici non ben de-

finiti; si puo ben approssimare tale ellissoide ad un volume gaussiano, che nel nostro

caso ha le dimensioni di: wz = 1, 5 µm in altezza e wxy = 0, 17 µm di diametro

come mostrato in figura 2.7. E’ possibile regolare il volume confocale regolando il

diametro del fascio laser.

Emanuele Zappia 47


Figura 2.6: Schema del nanocanle con particolare dell’effettivo volume di misura.

L’effettivo spazio in cui verranno rivelate le molecole non e pero l’intero volume,

bensı il piano focale (chiamato anche sezione ottica), che e la sezione corrispondente

al punto di massima concentrazione del raggio; quindi solo le molecole passanti per

tale piano saranno eccitate contribuendo alla formazione dell’immagine finale.

Attraverso un sistema di specchi oscillanti viene spostato il punto illuminato nel cam-

pione, cosı da effettuare una scansione completa dell’intera sezione ottica; inoltre,

spostando il campione lungo l’asse verticale, sara possibile effettuare nuove scansioni

su diverse sezioni ottiche.

Figura 2.7: Volume confocale.

Quindi l’unico piano eccitato e esclusivamente la sezione ottica fissata cosı da

avere una diminuzione della luce fuori fuoco e della dimensione laterale dell’imma-

Emanuele Zappia 48


gine, portando ad una riduzione complessiva dei disturbi legati ai rumori di fondo

[12].

In definitiva la combinazione delle due tecniche di misura permette di ridurre il nu-

mero delle molecole nel volume di controllo senza compromettere il rapporto segnale-

rumore.

Il sistema nel suo insieme prevede che il raggio laser passi attraverso uno specchio

dicroico, venga poi diretto all’interno del microscopio confocale, ed infine, incidendo

sul campione, illumini il volume confocale.

La fluorescenza emessa dalle molecole passanti per il volume illuminato, nel tempo di

misura, incidera sullo stesso obiettivo, passera attraverso il divisore di fascio dicroico

e verra mappata all’interno del pinhole nel piano dell’immagine dell’obbiettivo (80

µm a 543 nm); infine tale radiazione elettromagnetica passera attraverso un filtro

passa banda (560 - 615 nm) per giungere su di un fotodiodo valanga (APD) [35]. La

fluorescenza rilevata dai fotodiodi viene quindi trasmessa in maniera tale da avere

in uscita un segnale elaborabile al calcolatore; tale segnale e infine autocorrelato al

calcolatore.

I dati cosı ottenuti vengono salvati in formato raw e successivamente elaborati

attraverso un software personalizzato (Fluctation Analyzer) [12].

Il software mostra in contemporanea sia la curva di autocorrelazione calcolata che il

segnale in fluorescenza per permettere una migliore regolazione e controllo del setup,

nonche eventuali correzioni del fuoco durante le misurazioni.

Otterremo una certa fluttuazione d’intensita di fluorescenza a seconda del numero

di fotoni rilevati dal sistema, il software calcolera la funzione di autocorrelazione a

partire da tale fluttuazione.

Tutte le funzioni di autocorrelazione vengono calcolate direttamente a partire dalla

traiettoria del segnale. L’intera informazione viene riunita in pacchetti di 2 µs, si

effettua quindi un bin di 2 µs [12].

Gli esperimenti, per avere sufficienti informazioni statistiche, vengono svolti per

almeno 10 minuti.

Le misure vengono effettuate in ambiente termostatato a 23, 37 e 45C.

Abbiamo eseguito misure di diffusione del PEG in soluzione a varie temperature

(23, 37 e 45C) a vari pesi molecolari (20, 30 e 40 kDa). Inoltre abbiamo eseguito

degli esperimenti nel dispositivo nanfluidico usando, anche in questo caso, preparati

di PEG a vari pesi molecolari (20 e 40 kDa) a varie temperature (23, 37 e 45C e a

Emanuele Zappia 49


45C dopo 14 ore). Abbiamo registrato le funzioni di autocorrelazione sia all’interno

del nanocanale, posizionandoci sempre a 50 µm di distanza dalla parete del reservoir,

che nel reservoir al fine di valutare il numero di particelle medio 〈N〉 sia all’interno

del nanocanale che fuori.

La funzione di autocorrelazione

La funzione di autocorrelazione correla le fluttuazioni di fluorescenza nel tempo

confrontando il segnale registrato con una versione dello stesso ritardata nel tempo

come mostrato in figura 2.8.

La funzione di autocorrelazione da quindi una misura della modifica del segnale

dopo un dato intervallo di misura.

Per tempi brevi il segnale e simile a se stesso, piu il tempo passa e piu la somiglianza

del segnale diminuisce [12].

Figura 2.8: Rappresentazione schematica dell’evoluzione nel tempo della funzione diautocorrelazione associata ad un segnale.

Matematicamente la funzione di autocorrelazione normalizzata e definita dall’e-

quazione (2.1):

G(τ) =〈δI(t) δI(t+ τ)〉

〈I(t)〉2(2.1)

Dove le δI(t) sono le deviazioni di intensita di fluorescenza rispetto all’intensita

di fluorescenza media in un certo istante.

Emanuele Zappia 50


E’ possibile esprimere la funzione di autocorrelazione delle fluttuazioni delle in-

tensita come convoluzione della funzione di autocorrelazione delle fluttuazioni di

concentrazione e, tramite opportune sostituzioni e considerazioni, si ottiene la fun-

zione di autocorrelazione di un processo diffusivo browniano in 3D, come mostrato

nell’equazione (2.2)

G(τ) =1

N

1

(1 + 4Dτwxy2 )

√1 + 4Dτ

wz2

(2.2)

Ricordando che wxy e wz sono rispettivamente le dimensioni di diametro e altezza

del volume confocale approssimanto ad una forma gaussiana posso introdurre il

parametro di struttura s

s =wzwxy

(2.3)

Contando che il tempo di diffusione τdiff e pari a

τdiff =wxy

2

4D

Ed infine sostituendo nella (2.2) le varie quantita si ottiene la funzione di auto-

correlazione in funzione di N , s e τdiff (parametri di lettura degli esperimenti FCS)

come mostrato nell’equazione (2.4)

G(τ) =1

N

1

(1 + ττdiff

)√

1 + ττdiff s2

(2.4)

E’ possibile esprimere la funzione di autocorrelazione anche nel caso di diffusione

anomala, contando che in questo tipo di diffusione c’e una differente dipendenza

temporale, non piu lineare, ma dipendente dal coefficiente di anomalia α.

La funzione in questo caso diventa

G(τ) =1

〈N〉1

(1 + ( ττdiff

)α)

√1 +

( ττdiff

)α

s2

(2.5)

Risulta inoltre che

G(0) =1

〈N〉(2.6)

Informazione molto utile per le valutazioni delle concentrazioni all’interno del

nanocanale.

Emanuele Zappia 51


E’ opportuno presentare anche il modello di Wirth con il quale e possibile espri-

mere la funzione di autocorrelazione considerando anche fenomeni di adsorbimento

e desorbimento delle molecole alle pareti del canale. In tale modello viene introdotto

il tempo medio di desorbimento τdes, che rappresenta il tempo medio in cui le mole-

cole sono adsorbite alla parete, e la funbound, funzione che rappresenta la probabilita

di una molecola di trovarsi in uno stato non legato, quali nuove variabili all’interno

dell’espressione della funzione di autocorrelazione

G(τ) =1

〈N〉

((funbound)

1

1 + ( ττdiff

)+ (1− funbound)e

ττdes

)(2.7)

2.3.2 Calibrazione del volume confocale

La fase di calibrazione del volume confocale viene effettuata eseguendo numerose

prove di diffusione con una macromolecola a coefficiente di diffusione noto.

Utilizzando l’equazione (2.8) possiamo ricavare il parametro wxy (diametro del vo-

lume confocale) utile alla calibrazione

D =wxy

2

4τdiff(2.8)

D e il coefficiente di diffusione noto, τdiff e il tempo di diffusione che ricaviamo

da misure di fitting eseguendo un numero sufficiente di prove.

La molecola che abbiamo utilizzato e la rodamina 6G, la quale a 25C ha un coeffi-

ciente diffusione di D = 4 · 10−6 cm2

s[13].

Un’altra quantita che ricaviamo dalle prove di calibrazione e il parametro di

struttura s (che nel nostro caso e ∼= 5), definito dall’equazione (2.3).

Inoltre prendendo come riferimento l’approssimazione del volume confocale V

alla forma di un volume gaussiano possiamo calcolare anche la concentrazione Cin

all’interno dei nanocanali come:

Cin =〈N〉VN

Con 〈N〉 numero di molecole medio e N numero di Avogadro pari a 6, 022 ·1023.

Il coefficiente di diffusione D e una proprieta idrodinamica delle molecole e puo

essere calcolato attraverso l’equazione di Stokes-Einstein (2.9)

Emanuele Zappia 52

Capitolo 2 Elaborazione dei dati sperimentali

D =kbT

6πrhη(2.9)

Dove kb e la costante di Boltzmann pari circa a 1.38·10−23 m2kgKs2

, T la temperatura

assoluta, η la viscosita del solvente e rh il raggio idrodinamico della molecola.

2.4 Elaborazione dei dati sperimentali

Figura 2.9: Procedura di fitting.

Le funzioni di autocorrelazione ottenute vengono trattate attraverso una pro-

cedura di fitting, ossia un trattamento attraverso il quale otteniamo una funzione

matematica che meglio approssima i dati raccolti, tale funzione prende il nome di

funzione best fit.

Per le misurazioni eseguite al di fuori dei nanocanali abbiamo utilizzato il modello di

diffusione classico e la relativa funzione di autocorrelazione descritta nell’equazione

(2.4). Alla fine della procedura di fitting otteniamo il coefficiente di diffusione D e

la concentrazione della specie C.

Per gli esperimenti relativi ai nanocanali abbiamo invece utilizzato il modello

di diffusione anomalo e di Wirth. Abbiamo quindi utilizzato la funzione di auto-

correlazione relativa alla diffusione anomala e al modello di Wirth, descritte nelle

equazioni (2.5) e (2.7).

Emanuele Zappia 53

Capitolo 2 Elaborazione dei dati sperimentali

I parametri fondamentali utilizzati per la procedura iterativa di fitting (i quali, a

parte α, ricordiamo essere anche i parametri di lettura degli esperimenti FCS) sono

N , τdiff e α; per il modello di Wirth si aggiungono anche funbound e τdes.

Figura 2.10: Curve di autocorrelazione a diverse concentrazioni molecolari.

Il tempo di diffusione τdiff varia al variare della temperatura in quanto, fornendo

energia al sistema, le molecole tenderanno a muoversi piu velocemente. Ricordiamo

che N e il numero di molecole e deriva dalla equazione (2.6); abbiamo infatti nor-

malizzato le curve di autocorrelazione sui primi 10 µs ricavando il valor medio 〈N〉.Da una ispezione delle curve d’autocorrelazione e possibile quindi risalire alla con-

centrazione del sistema (vedi figura 2.10).

Emanuele Zappia 54

Capitolo 3

Risultati e discussione

Indice

3.1 Misure di diffusione del PEG in soluzione . . . . . . . . . . . . . 55

3.2 Comportamento del PEG in nanocanali a varie temperature . 57

3.3 Meccanismo di separazione proposto . . . . . . . . . . . . . . . . 64

In questo capitolo verranno prima considerati i risultati ottenuti dalle misure di

diffusione del PEG 40, 30 e 20 kDa in soluzione, al fine di valutare la variazione del

raggio idrodinamico a seconda del peso molecolare ed al variare della temperatura;

in seguito verranno trattati i risultati delle misurazioni effettuate sul PEG 20 kDa

e sul PEG 40 kDa nel dispositivo nanofluidico alle temperature di 23, 37 e 45C.

Verranno prima riportatate le curve di autocorrelazione normalizzate trattate con il

modello anomalo e di Wirth, al fine di confronatre la dinamica diffusiva del PEG a

varie temperature; in seguito verranno presentate le curve di autocorrelazione non

normalizzate per osservare gli andamenti del numero di particelle medio rilevato 〈N〉in funzione della temperatura ottenuti con il PEG 20 kDa e con il PEG 40 kDa.

Si proporra infine un meccanismo di separazione molecolare innovativo sulla base

dell’interpretazione dei risultati sperimentali ottenuti.

3.1 Misure di diffusione del PEG in soluzione

Sono state effettuate misurazioni in soluzione utilizzando molecole di PEG a diverso

peso molecolare (20, 30 e 40 kDa) alla temperatura di 23C.

I risultati ottenuti sono stati elaborati con il modello di diffusione classica, da cui si

e ricavato il tempo di diffusione τdiff .

Abbiamo quindi calcolato il coefficiente di diffusione D attraverso l’equazione (2.8),

nota la dimensione wxy2 da precedenti misure di calibrazione del volume confocale

55

Capitolo 3 Misure di diffusione del PEG in soluzione

D =wxy

2

4τdiff

Noto D possiamo ricavare il raggio idrodinamico rh delle molecole attraverso la

Stokes-Einstein (2.9)

rh =kbT

6πDη

Dove kb e la costante di Boltzmann pari circa a 1.38·10−23 m2kgKs2

, T la temperatura

assoluta e η la viscosita del solvente.

Dalle procedure di fitting, utilizzando il modello classico, si e ricavati il coefficiente

D a varie temperature e, attraverso la Stokes-Einstein, abbiamo ricavato il raggio

idrodinamico delle molecole.

Sono riportati nella tabella 3.1 i dati cosı ottenuti

MW [kDa] D [ cm2

s ] rh [nm]

20 4,53 ·10−7 5,1130 4,37 ·10−7 5,3140 3,46 ·10−7 6,69

Tabella 3.1: Raggi di girazione e coefficienti di diffusione del PEG misurati a seconda delpeso molecolare a 23C.

Molecole con raggio idrodinamico piu piccolo hanno coefficiente di diffusione piu

grande poiche i due parametri sono tra loro inversamente proporzionali; in generale

all’aumentare del peso molecolare aumenta il raggio idrodinamico del polimero.

Sono state inoltre effettuate misurazioni in soluzione utilizzando molecole di PEG

40 kDa e PEG 20 kDa a varie temperature (23, 37 e 45C), al fine di valutare

l’andamento del raggio idrodinamico rh al variare della temperatura.

I risultati ottenuti sono stati elaborati con il modello di diffusione classica, da cui si

e ricavato il tempo di diffusione τdiff e, analogamente alla misurazioni precedenti,

abbiamo calcolato il coefficiente di diffusione D attraverso l’equazione (2.8); nota la

dimensione wxy2 da precedenti misure di calibrazione del volume confocale, abbiamo

ricavato il raggio idrodinamico rh delle molecole attraverso la Stokes-Einstein (2.9)

al variare della temperatura

rh =kbT

6πDη

Sono riportati nella tabella 3.2 i dati cosı ottenuti

Emanuele Zappia 56

Capitolo 3 Comportamento del PEG in nanocanali a varie temperature

T D rh[C] [ cm

2

s ] [nm]

PEG 40 kDa 23 3,46 ·10−7 6,69

37 4,38 ·10−7 7,48

45 4,97 ·10−7 7,87

PEG 20 kDa 23 4,53 ·10−7 5,11

37 5,42 ·10−7 6,05

45 6,94 ·10−7 5,63

Tabella 3.2: Raggi di girazione e coefficienti di diffusione del PEG 40 kDa e 20 kDamisurati a varie temperature.

Si osserva come all’aumentare della temperatura aumenti il raggio idrodinamico

delle molecole; in particolare per il PEG 40 kDa abbiamo riscontrato un aumento

del raggio idrodinamico del 15% da 23C a 45C.

3.2 Comportamento del PEG in nanocanali a varie tempe-

rature

Sono state effettuate misurazioni nel dispostivo nanfluidico descritto nel capitolo 2

utilizzando molecole di PEG a diverso peso molecolare (20 e 40 kDa) e a diverse

temperature di esercizio (23, 37 e 45C a 45C dopo 14 ore). Abbiamo registrato le

funzioni di autocorrelazione sia all’interno del nanocanale, posizionandoci sempre a

50 µm di distanza dalla parete del reservoir, che nel reservoir stesso. Queste misure

sono state effettuate al fine di confrontare la dinamica del PEG all’aumentare della

temperatura e per valutare la variazione del numero di particelle medio 〈N〉 al va-

riare della temperatura.

In figura 3.1 sono riportate le curve di autocorrelazione a varie temperature per il

PEG 40 kDa; tali curve sono state ottenute attraverso il modello di fitting anomalo

e di Wirth e sono normalizzate per valutare al meglio l’andamento del tempo di

diffusione a seconda della temperatura.

Dall’andamento di queste curve si evince che all’aumentare della temperatura dimi-

nuisce il tempo di diffusione delle molecole. Tale fenomeno e stato riscontrato anche

per il PEG 20 kDa.

Abbiamo ipotizzato la presenza di fenomeni di adsorbimento e desorbimento alla

parete anche come giustificazione energetica per la presenza delle molecole all’interno

del nanocanle.

Emanuele Zappia 57


Figura 3.1: Funzioni di autocorrelazione normalizzate del PEG 40 kDa a diversetemperature utilizzando il modello di fitting anomalo (sinistra) e di Wirth (destra).

Le procedure di fitting per queste curve con il modello anomalo e di Wirth risultano

valide e quindi si deduce che il fenomeno nei nanocanali e subdiffusivo, con α ∼= 0, 5÷0, 6. Il comportamento subdiffusivo e interpretabile come il sovrapporsi di fenomeni

con tempi caratteristici diversi; cioe il fenomeno assume caratteristiche diverse a

seconda del tempo di osservazione. In particolare si puo spiegare tale andamento

attraverso la competizione da un lato di fenomeni diffusivi, con tempi caratteristici

dell’ordine dei µs, e dall’altro di fenomeni di adsorbimento e desorbimento, dai tempi

caratteristici dell’ordine dei ms.

Per la trattazione dei dati sperimentali abbiamo quindi eseguito le procedure di

fitting con il modello di Wirth, che prevede la presenza di entrambi i fenomeni.

In tabella 3.3 alcuni parametri ricavati dalla procedura di fitting con il modello di

Wirth per il PEG 40 kDa a varie temperature.

PEG 40 kDa - Fitting Wirth

T [C] τdiff [µs] τdes [µs] funbound

23C 2922 9244 137C 962,8 49570 0,7745C 879,3 50280 0,82

45C-t2 622,7 38400 0,76

Tabella 3.3: Parametri di fitting per il PEG 40 kDa a varie temperature.

Emanuele Zappia 58


Abbiamo poi ricavato le curve di autocorrelazione medie non normalizzate del

PEG 40 kDa alle temperature di 23, 37 e 45C e a 45C dopo 14 ore. Abbiamo visto

come le funzioni a τ = 0 assumono valori maggiori all’aumentare della temperatura

e quindi, ricordando che il numero di particelle medio risulta essere inversamente

proporzionale a G(0) (come mostrato nell’equazione (2.6)), abbiamo constatato che

il numero di particelle medio rilevato 〈N〉 all’interno dei nanocanali decresce all’au-

mentare della temperatura.

Figura 3.2: Funzioni di autocorrelazione non normalizzate del PEG 40 kDa a diversetemperature.

Come mostrato in figura 3.3 abbiamo ricavato le curve di autocorrelazione medie

non normalizzate alle temperature di 23, 37 e 45C e a 45C dopo 14 ore anche per

il PEG 20 kDa. Anche per questa serie di esperimenti si nota che all’aumentare

della temperatura le funzioni assumono valori maggiori e quindi come il numero di

particelle medio rilevato 〈N〉 all’interno dei nanocanali decresce all’aumentare della

temperatura.

Emanuele Zappia 59


Figura 3.3: Funzioni di autocorrelazione non normalizzate del PEG 20 kDa a diversetemperature.

Emanuele Zappia 60


Analizzando l’andamento del numero di particelle medio 〈N〉, ricavato dal fitting

delle curve con il modello di Wirth, in funzione della temperatura, e evidente come

〈N〉 decresce all’aumentare della temperatura. Per il PEG 40 kDa si nota infatti

un netto fenomeno di svuotamento gia nel primo passaggio da 23 a 37C, come mo-

strato in figura 3.4.

Figura 3.4: Numero di particelle medio rilevato 〈N〉 in funzione della temperatura per ilPEG 40 kDa.

Analizzando l’andamento del numero di particelle medio rilevato 〈N〉 in funzio-

ne della temperatura osserviamo in figura 3.5 come, anche per il PEG 20 kDa, e

presente una cinetica di svuotamento del canale con 〈N〉 decrescente all’aumentare

della temperatura.

Emanuele Zappia 61


Figura 3.5: Numero di particelle medio rilevato 〈N〉 in funzione della temperatura per ilPEG 20 kDa.

Emanuele Zappia 62


Dal confronto in figura 3.6 delle due curve 3.4 e 3.5 normalizzate, si nota come

〈N〉 decresce molto prima nel PEG 40 kDa che nel PEG 20 kDa. Questo diverso

trend delle due curve e dovuto alle diverse condizioni entropiche delle due molecole

all’interno dei nanocanali e rappresenta il fenomeno alla base del principio di sepa-

razione proposto.

Figura 3.6: Curve a confronto del PEG 20 kDa e PEG 40 kDa del numero di particellemedio rilevato 〈N〉 in funzione della temperatura.

In figura 3.6 e stato evidenziato il punto di massima efficienza, che sopraggiunge

a 37C.

Gia da queste prove preliminari, facendo riferimento al PEG 40kDa, si evince come

l’efficienza di questo ipotetico dispositvo sia del 38%, poiche, anche a temperature

elevate, rimane una concentrazione di equilibrio all’interno del nanocanale.

La mancanza di una ulteriore diminuzione del numero di molecole per il PEG 40

kDa potrebbe essere dovuta a fenomeni di degradazione termica.

Emanuele Zappia 63

Capitolo 3 Meccanismo di separazione proposto

3.3 Meccanismo di separazione proposto

Il meccanismo di separazione ipotizzato in questa tesi fa riferimento alle diverse

cinetiche di svuotamento del PEG 40 kDa e PEG 20 kDa riscontrate nei nanocanali

all’aumentare della temperatura.

Infatti osservando la figura 3.6 e evidente come il PEG 40 kDa abbia una cinetica

di svuotamento piu veloce del PEG 20 kDa. Infatti le molecole di peso molecolare

piu alto, all’aumentare della temperatura, tendono ad uscire piu velocemente dal

nanocanale.

Per interpretare questo comportamento e stato utilizzato il modello per polimeri

confinati in soluzione proposto da De Gennes [11] e sono stati elaborati i risultati

ottenuti in una precedente tesi [27] in cui si sono valutate le variazioni entropiche

ed entalpiche del sistema PEG-nanotubo al calcolatore, permettendo di prevedere

qualitativamente un possibile confinamento spontaneo del PEG.

Attraverso lo studio dell’andamento dei contributi entropico ed entalpico in funzione

del coefficiente R0

Dsi e visto come il punto d’instabilita termodinamica (∆G = 0 per

∆S = ∆H) che caratterizza le condizioni energetiche di confinamento spontaneo sia

influenzato dalla temperatura, come mostrato in figura 3.7.

E’ evidente come l’aumento della temperatura influenza il contributo entalpico

nel sistema; in particolare l’inclinazione della retta, rappresentante il contributo en-

talpico, diminuisce cosı che il punto di instabilita termodinamica sara relativo ad un

valore minore di R0

D. Tutto cio si traduce in una maggiore tendenza delle molecole

a fuoriuscire dal canale all’aumentare della temperatura.

E’ stato inoltre riscontrato che, in range di confinamento piu spinto, molecole

a piu alto peso molecolare impiegano meno tempo per uscire dal canale rispetto a

molecole a piu basso peso molecolare; questo fenomeno avviene sia perche la fuoriu-

scita delle molecole a piu alto peso molecolare e un processo favorito dal punto di

vista entropico; sia perche, a causa della natura casuale dei moti browniani, molecole

a piu basso peso molecolare impiegano piu tempo nel percorrere il canale. Infatti

queste ultime hanno maggiore possibilita di movimento in direzioni non efficaci per

lo svuotamento rispetto alle molecole a piu alto peso molecolare.

Questo principio e stato sfruttato anche in un recente lavoro per manipolare mole-

cole di DNA confinate a diverso peso molecolare [37].

In conclusione il meccanismo di separazione proposto sfrutta questo fenomeno

termodinamico separando le molecole per via entropica, permettendo una piu veloce

fuoriuscita dai nanocanali delle molecole a piu alto peso molecolare, fenomeno a sua

Emanuele Zappia 64

Capitolo 3 Meccanismo di separazione proposto

Figura 3.7: Effetto della temperatura nei contributi entalpico ed entropico in funzione diR0D .

volta regolabile termicamente.

Questo meccanismo di separazione molecolare e stato valutato, allo stato attuale,

solo in maniera preliminare, tuttavia un tale sistema avrebbe il significativo vantag-

gio di superare alcuni dei limiti dei sistemi di filtrazione molecolare nanostrutturati

in uso.

Infatti gli esperimenti sono stati eseguiti su di una macromolecola modello elettrica-

mente neutra e quindi in assenza di un campo elettrico imposto, inoltre, per questo

metodo di separazione, non e necessario un flusso imposto all’interno del dispositi-

vo. Questo meccanismo potrebbe essere quindi di piu facile sviluppo tecnologico in

quanto non prevede l’imposizione di campi elettrici e flussi applicati.

Emanuele Zappia 65

Conclusioni e sviluppi futuri

Al fine di verificare la validita di un nuovo principio di separazione molecolare su

base entropica abbiamo eseguito delle misure di diffusione del PEG (polietilenglico-

le), una macromolecola modello flessibile, elettricamente neutra e solubile in acqua.

Le misure sono state effettuate a diverse temperature d’esercizio (23, 37 e 45C) ed

utilizzando preparati di PEG a diversi pesi molecolari (20 kDa e 40 kDa), sia in

soluzione, per valutare la variazione del raggio idrodinamico del polimero a seconda

della temepratura, che in dispositivi nanofluidici con nanocanali di 10 nm di spes-

sore.

Al fine di valutare la concentrazione e i tempi di diffusione del PEG all’interno dei

nanocanali, in funzione dei differenti pesi molecolari del polimero e delle differenti

temperature, e stata utilizzata la tecnica di spettroscopia di correlazione di fluo-

rescenza FCS abbinata alla microscopia confocale, che ci ha permesso di eseguire

misurazioni accurate su un numero ridotto di molecole.

Dagli esperimenti di diffusione del PEG 20 kDa e 40 kDa nei nanocanali e emerso

che all’aumentare della temperatura diminuisce il tempo di diffusione delle molecole.

Abbiamo inoltre osservato che le funzioni di autocorrelazione, per τ = 0, assumo-

no valori maggiori all’aumentare della temperatura e quindi decresce il numero di

particelle medio rilevato 〈N〉. Si ha quindi una cinetica di svuotamento regolata

termicamente; questo fenomeno e evidente analizzando l’andamento del numero di

particelle medio rilevato 〈N〉 in funzione della temperatura.

Abbiamo poi confrontato le cinetiche di svuotamento del PEG 20 kDa e del PEG

40 kDa, osservando come il numero di particelle medio 〈N〉 decresce molto prima

nel PEG 40 kDa che nel PEG 20 kDa ed individuando tale fenomeno come base del

principio di separazione proposto.

Per interpretare questo comportamento e stato utilizzato il modello per polimeri

confinati in soluzione proposto da De Gennes; attraverso lo studio dell’andamento

dei contributi entropico ed entalpico in funzione del coefficiente R0

Dsi e visto come

66

l’aumento della temperatura influenza il contributo entalpico del sistema risultando

in una maggiore tendenza delle molecole a fuoriuscire dal canale all’aumentare della

temperatura.

E’ stato inoltre riscontrato che, in range di confinamento piu spinto, molecole a piu

alto peso molecolare impiegano meno tempo per uscire dal canale rispetto a mole-

cole a piu basso peso molecolare; questo fenomeno avviene sia perche la fuoriuscita

delle molecole a piu alto peso molecolare e un processo favorito dal punto di vista

entropico; sia perche, a causa della natura casuale dei moti browniani, molecole a

piu basso peso molecolare impiegano piu tempo nel percorrere il canale. Infatti que-

ste ultime hanno maggiore possibilita di movimento in direzioni non efficaci per lo

svuotamento rispetto alle molecole a piu alto peso molecolare.

In conclusione e stata verificata sperimentalmente la validita del principio al-

la base di un possibile metodo nanostrutturato di separazione molecolare su base

entropica, regolato dalla temperatura. Il dispositivo ipotizzato potrebbe essere di

facile sviluppo tecnologico, in quanto non prevede l’imposizione di campi elettrici e

flussi applicati, ed utilizzato per separare molecole elettricamente neutre.

E’ necessaria ulteriore sperimentazione per sviluppare il discorso qui iniziato e

porre le basi per lo sviluppo del dispositivo di separazione molecolare innovativo

qui descritto. La risoluzione di problemi legati all’efficienza, all’ingegnerizzazione

del dispositivo, allo studio del range di temperatura adeguato e in generale il su-

peramento di altre problematiche legate all’applicabilita del principio qui trovato,

nonche una sperimentazione con altri sistemi modello a diverso peso molecolare,

potrebbero rappresentare il logico proseguo dello studio qui presentato.

67

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71

Elenco delle tabelle

1.1 Sommario di sistemi nanostrutturati artificiali per la separazione mo-

lecolare [16]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

2.1 Raggi di girazione e relativo rapporto con l’altezza del PEG, secondo

Kawaguchi [24]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

3.1 Raggi di girazione e coefficienti di diffusione del PEG misurati a

seconda del peso molecolare a 23C. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

3.2 Raggi di girazione e coefficienti di diffusione del PEG 40 kDa e 20

kDa misurati a varie temperature. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

3.3 Parametri di fitting per il PEG 40 kDa a varie temperature. . . . . . 58

72

Elenco delle figure

1.1 Discipline collegate alla nanofluidica ed alcuni importanti settori cor-

relati. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.2 Alcune forze significative in sistemi nanofluidici. . . . . . . . . . . . . 9

1.3 Membrane nanoporose (pori di 100 e 200 nm) e particolare di mole-

cola di DNA attraverso un nanoporo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

1.4 Barriera energetica nel meccanismo di trasporto del DNA attraverso

un nanoporo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.5 Modello randomwalk di una particella in un moto Browniano. . . . . 14

1.6 Il cammino quadratico medio in funzione del tempo nel modello Fic-

kiano. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

1.7 Il cammino quadratico medio in funzione del tempo nel modello della

diffusione anomala. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

1.8 Rappresentazione del modello single-file. . . . . . . . . . . . . . . . . 16

1.9 Il cammino quadratico medio in funzione del tempo per il modello

classico e deviazioni. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

1.10 Cinetiche di diffusione in vitro dell’albumina bovina a confronto. . . . 18

1.11 Analisi lineare del DNA che migra in dei microcanali attraverso una

tecnica di microscopia laser [38]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

1.12 Rappresentazione dell’angolo di valenza α e l’angolo di rotazione

interna ϕ nei polimeri [25]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

1.13 Una rappresentazione del gomitolo statistico. . . . . . . . . . . . . . . 22

1.14 Una rappresentazione del raggio di girazione. . . . . . . . . . . . . . . 23

1.15 Una rappresentazione del vettore testa-coda. . . . . . . . . . . . . . . 23

1.16 Random-walk di una catena polimerica in un reticolo bidimensionale 24

1.17 Catena polimerica confinata in un canale. . . . . . . . . . . . . . . . . 26

1.18 Debole adsorbimento di una catena polimerica confinata in un canale. 27

1.19 Andamento dei contributi entalpico ed entropico in funzione di R0

D, a

varie temperature e pesi molecolari [27]. . . . . . . . . . . . . . . . . 29

1.20 Schema e fenomeni fisici rilevanti nel trasporto confinato. . . . . . . . 32

73

1.21 Meccanismi di separazione in matrici gel(in alto) e in sistemi nano-

strtturati (in basso). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

1.22 (a) SEM ( Scanning Electron Micrograph) di ostacoli nanometrici

per la sparazione del DNA [1]; (b) Nanocolonne per la separazione

del DNA (scala 500 nm). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

1.23 (A destra) struttura anisotropa per la separazione molecolare in flusso

continuo, (a sinistra) un mezzo isotropo in cui non avviene separazione. 36

1.24 Schema esemplificativo dell’ANA (Anisotropic Nanofilter Array). . . . 36

1.25 Schema del sistema di trappole entorpiche per la separazione del DNA

[26]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

1.26 Schema, immagine al microscopio e grafico dell’energia libera di con-

finamento nell’entropoforesi. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

2.1 Panoramica del sistema di misura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

2.2 Microscopio confocale Confocor II utilizzato per gli esperimenti. . . . 43

2.3 Dispositivo nanofluidico utilizzato. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

2.4 Schema del chip nanofluidico apoderato. . . . . . . . . . . . . . . . . 44

2.5 Il chip inserito nel supporto e posizionato sull’obiettivo. . . . . . . . . 45

2.6 Schema del nanocanle con particolare dell’effettivo volume di misura. 48

2.7 Volume confocale. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

2.8 Rappresentazione schematica dell’evoluzione nel tempo della funzione

di autocorrelazione associata ad un segnale. . . . . . . . . . . . . . . 50

2.9 Procedura di fitting. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

2.10 Curve di autocorrelazione a diverse concentrazioni molecolari. . . . . 54

3.1 Funzioni di autocorrelazione normalizzate del PEG 40 kDa a diverse

temperature utilizzando il modello di fitting anomalo (sinistra) e di

Wirth (destra). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

3.2 Funzioni di autocorrelazione non normalizzate del PEG 40 kDa a

diverse temperature. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

3.3 Funzioni di autocorrelazione non normalizzate del PEG 20 kDa a

diverse temperature. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

3.4 Numero di particelle medio rilevato in funzione della temperatura per

il PEG 40 kDa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

3.5 Numero di particelle medio rilevato in funzione della temperatura per

il PEG 20 kDa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

3.6 Curve a confronto del PEG 20 kDa e PEG 40 kDa del numero di

particelle medio rilevato in funzione della temperatura. . . . . . . . . 63

74

3.7 Effetto della temperatura nei contributi entalpico ed entropico in

funzione di R0

D. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

75

Ringraziamenti

Volge al termine questo lavoro con un, fisiologico quanto sentito, spazio riservato

alla gratitudine verso le persone che, inconsapevoli e non, hanno reso possibile tutto

cio.

Durante questo percorso molte sono state le persone che mi hanno accompagnato

tenendomi per mano e spronandomi ad andare avanti; senza di loro sarei stato in

balia di gioie e dolori, trainato dai successi ma abbattuto dalle difficolta, senza avan-

zare verso la meta, come una nave senza ciurma. Ed e quindi a questa straordinaria

e numerosa ciurma che e rivolta tutta la mia gratitudine e riconoscenza.

In prima battuta ritengo doveroso ringraziare il professore Paolo Netti, che mi

ha accettato quale tesista e mi ha permesso di svolgere questo avvincente lavoro.

Poi i miei ringraziamenti non possono che andare alla mia correlatrice, la dottoressa

Ilaria De Santo, per la sua pazienza, l’allegria e la grande disponibilita; senza i suoi

preziosi consigli e la sua guida questa tesi non sarebbe mai stata realizzata.

Voglio poi ringraziare la mia ragazza Barbara, che mi ha sostenuto e mi ha rega-

lato, e continua a regalarmi, indimenticabili momenti di gioia, necessario carburante

per affrontare le mie giornate; senza il suo amore mi sarei perso molte volte.

C’e poi da ringraziare il gruppo di Rolemaster, grazie alle avventure di Arnold,

Marcus, Sir Kain, Haldir, Illidy, Maedros e Kela’ad Maleten dei verdi prati di bosco

Pecchio ho compreso come la mente e l’immaginazione dell’uomo non abbiano con-

fini e possano farci vivere irripetibili avventure ed epiche storie, essi sono al tempo

stesso amici ed eroi leggendari; Gennaro Z., Marco T., Peppe, Daniel, Marco C.,

Davide e Gennaro C.: grazie di cuore.

Un ringraziamento speciale va poi fatto a Marco Cappa, le cui conoscenze informa-

tiche, la disponibilita e gentilezza hanno reso possibile questo lavoro; sono certo che

mi ricordero per molto tempo degli infiniti errori del mio documento Latex.

Sinceri ringraziamenti vanno anche ai miei compagni di universita Roberta, Mar-

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tina, Gianluca e Giuseppe; grazie mille per tutti i consigli, gli appunti e la disponi-

bilita durante questo corso di studi.

Devo anche ringraziare tutti i miei compagni e maestri di Taekwondo, con loro sono

cresciuto sotto un altro profilo, condividendo sudore e sangue, imparando cosa sia

lo spirito di squadra e il legame tra compagni, dentro e al di fuori della pedana.

Voglio poi ringraziare tutti i miei ex compagni di classe la cui vera natura di grandi

amici si e rivelata soprattutto dopo l’esperienza scolastica; grazie Gennaro, Massi-

mo, Riccardo, Marco T., Gianluca, Marco R., Carlo, Lino, Lorenzo e Fabrizio so che

il nostro legame perdurera al di la del tempo e delle difficolta.

Come poi non ringraziare tutte le meravigliose persone che ho incontrato grazie

a MYGENERATION, entusiasmante e stimolante esperienza editoriale e di vita; vi

ringrazio di cuore, fiducioso che il futuro ci riservera molte gradite sorprese.

Ringrazio poi tutti gli amici che, per ragioni di memoria e spazio, ho omesso da

questi ringraziamenti ma che continueranno indelebili ad essere presenti nella mia

vita.

Un particolare ringraziamento va ad Antonio Barone, prima caro amico di fa-

miglia e poi straordinario accademico, esemplare e sensibile; ho avuto l’onore di

conoscerti ed i tuoi preziosi consigli e la tua umanita sono rimasti incisi nel mio

cuore anche se non sei piu tra noi, grazie.

Ultimi, ma di certo non in ordine di importanza, ci sono i ringraziamenti alla

mia famiglia.

Ringrazio mia nonna Laura che, con il suo costante amore e le sue premurose at-

tenzioni, colora le mie giornate con le tinte della felicita; ringrazio poi mio nonno

Vincenzo che mi ha sempre sostenuto, in particolar modo in questa fatica finale,

elargendomi preziosi consigli e spingendomi a fare sempre del mio meglio. Ringrazio

poi mio zio Marcello che, insieme ai miei zii Beatrice, Fabio ed allo zio “acquisito”

Pierluigi, mi ha aiutato nei momenti bui di questo percorso, facendomi arrivare dove

sono ora.

Ringrazio poi mi mamma Elena per avermi sempre infuso coraggio, insegnandomi

a seguire il mio cuore, ed avermi mostrato il brillante cammino della fede buddista;

nonostante le grandi distanze so che mi sei sempre vicina. Ci sono ringraziamenti

anche per i piccoli di famiglia senza la cui allegria e dolcezza il mondo sarebbe di

certo piu pesante, grazie ai miei fratellini Adama e Lamp, al mio cuginetto Gabriele

ed alla piccola Alice.

Infine ringrazio Nietzsche e Maya, che hanno riempito d’amore e gioia la mia esi-

stenza facendomi passare gli anni piu belli della mia vita; anche se non siete piu tra

noi rimarrete per sempre nel mio cuore.

Evaluation of a nanofluid device for the separation of confined macromolecules on an entropic basis...

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