Evaluación de la variación somaclonal entre individuos clonados de Phalaenopsis in vitro, mediante marcadores moleculares basados en PCR

Phalaenopsis es una orquídea epífita originaria del sureste de Asia, India, Indonesia y parte de Australia (Rittershausen y Rittershausen, 2004). Estas representan uno de los grupos de plantas ornamentales más apreciados a nivel mundial por el colorido, forma y duración de sus flores, pero a diferencia de otros géneros de orquídeas, su sistema de reproducción es difícil ya que su crecimiento monopodial es lento, lo cual ha dificultado su multiplicación vegetativa y la reproducción sexual se ha visto agravada por la presencia de altos índices de esterilidad en algunos de sus híbridos (Jiménez y Guevara, 1996).

Las orquídeas tienen dos tipos básicos de crecimiento: simpodial, en las que el nuevo crecimiento se produce a partir de una yema axilar en sentido horizontal, y monopodial, en las que el nuevo crecimiento se produce a partir de una yema apical en sentido vertical, como es el caso de Phalaenopsis (Escobar y Múnera, 1990).

Debido a su gran interés comercial se han desarrollado varias formas de propagación clonal in vitro de phalaenopsis como: la descrita por (Ishii et al 1998), formando embriones somáticos a partir de callos, otra técnica es la formación de cuerpos similares a protocormos (PLBs, Protocorm Like Bodies) a partir de tejidos como hojas, ápices radicales ápices de vástagos y callos para su posterios regeneraion en plántulas.

Los protocormos son cuerpos que se encuentran en un estadio morfológico entre un embrión cigotico y un vástago.

La variación somaclonal se refiere a la variación que ocurre in vitro en cultivos celulares, de tejidos y órganos, así como en plantas regeneradas de los mismos. La variación somaclonal generalmente es espontánea y los cambios pueden ser heredables o no (Larkin y scowcroft 1981)

Cuando la variación somaclonal es heredable se le asocia con rearreglos cromosomales, deleciones y mutaciones (sánchez-Teyer et al. 2003)Si bien las causas de este fenómeno aún no están bien establecidas y, probablemente, sean muchos los mecanismos involucrados en la aparición de estas mutaciones (Vázquez, 2001), se ha determinado que la variación somaclonal está asociada a cambios en el número y la estructura de los cromosomas (traslocaciones, deleciones, duplicaciones), mutaciones puntuales, variaciones en la expresión de genes como resultado de los cambios estructurales en los cromosomas, activación de elementos transponibles, pérdida de cromatina, amplificación del ADN, o cambios en el ADN de organelos (Bordallo et al., 2004) Estas variaciones se

 

transmiten a las plantas regeneradas y a su progenie y afectan caracteres morfológicos, bioquímicos, de herencia simple o cuantitativa.

La variación somaclonal puede ser utilizada como herramienta para inducir variabilidad genética y, en el mejor de los casos, obtener características agronómicas deseables (araújo et al. 2001) han utilizadas comercialmente por sus características de resistencia a enfermedades, mejora en la apariencia de la planta, flores y frutos, tamaño, sabor, fragancia y presencia de metabolitos de interés.

Sin embargo, estos cambios constituyen uno de los principales inconvenientes en la micropropagación masiva de genotipos, en la que se debe garantizar la pureza genética (Soniya et al., 2001), uniformidad y características con valor agronómico. en estos casos es deseable reducir o, al menos, estimar la tasa de variación somaclonal.

Por otro lado, cuando la variación somaclonal es epigenética, puede ser resultado de un cambio en la expresión de los genes, reversible y no heredable.

Factores que inducen la variación somaclonal

Existen factores externos que pueden inducir la variación somaclonal además de la que las células pueden tener de manera normal. En los cultivos in vitro se pueden acumular variaciones genéticas y epigenéticas que se presentan en el fenotipo (Neiva, C; Jimenes, V. 2009).

El método de cultivo in vitro y el patrón de desarrollo

La variación somaclonal se puede generar en todos los métodos comúnmente empleados para el cultivo in vitro de plantas (cultivo de yemas, organogénesis y embriogénesis somática) (George 1993). sin embargo, el patrón de desarrollo que sigue un explante durante su morfogénesis in vitro es un elemento clave que se relaciona con la variación somaclonal.

Edad del cultivo y subcultivos

La proporción de variantes somaclonales aumenta en cultivos envejecidos y en plantas con varios subcultivos. Esto probablemente se debe a la acumulación de alteraciones genéticas, cambios epigenéticos y mutaciones (Cardone et al. 2004).

Componentes del medio de cultivo

La composición del medio de cultivo es un factor que puede inducir variación somaclonal. se ha encontrado que los reguladores de crecimiento, principalmente aquellos con naturaleza auxínica, pueden promover la metilación del ADN, causando así cambios epigenéticos (george 1993).

 

El estado físico del medio de cultivo (líquido o sólido) también influye en la aparición de variantes somaclonales, ya que un mismo tejido se comporta de diferente manera frente a los factores físicos asociados (oxigenación, tensión superficial y daños mecánicos). Por ejemplo, una deficiencia en la oxigenación del callo causa la producción de etanol que puede actuar como mutagéno (cardone et al. 2004).

La variación somaclonal es detectable por cambios fenotipicos visibles como resistencia a enfermedades, pigmentación y producción. La detección es posible al comparar las diferencias entre el fenotipo parental y el fenotipo donde ha ocurrido el cambio (Brar y Brar 1998). La variación también puede detectarse por medio de marcadores bioquímicos o moleculares.

Marcadores moleculares basados en PCR

La técnica de PCR se basada en la síntesis de millones de copias de un fragmento de ADN comprendido entre secuencias complementarias a dos oligonucleotidos llamados imprimadores este proceso es realizado por una enzima ADN polimerasa termoestable (aravano-poulos 2003).

Amplificación aleatoria del ADN polimórfico o RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

La RAPD consiste en la amplificación de secuencias de ADN con un iniciador de una longitud de diez pares de bases con secuencia aleatoria (decámero), que se hibrida con el ADN (Araújo et al. 2001). Posteriormente, los fragmentos de ADN son separados según su movilidad electroforética y visualizados en un gel de agarosa o poliacrilamida (Hames y rickwood 1990). Diferencias en el patrón de bandas detectadas entre individuos evidencia diferencias en su secuencia de bases (Picca et al. 2004). Esta técnica es simple y efectiva, y permite determinar los polimorfismos en gran cantidad de muestras.

Región amplificada de una secuencia caracterizada o SCAR (Sequence Characterized Amplified Region)

Los SCAR son fragmentos de ADN amplificados por PCR mediante la utilización de imprimadores específicos de 15 a 30 pares de bases, diseñados de acuerdo con la secuencia obtenida de marcadores RAPD polimórficos que se desea hacer aún más específicos (Chaves-Bedoya y Núñez 2007).

Polimorfismo de amplificación sensible a metilación o MSAP (Methylation-sensitive amplification polymorphism)

 

Esta técnica está basada en una doble digestión, primero con una enzima sensible a la presencia de sitios de metilación (HpaII o MspI) y luego con una enzima inse-nsible a la metilación (EcoRI). Después, los fragmentos son ligados a adaptadores en la doble banda y se amplifica la secuencia con imprimadores complementarios a éstos.

Objetivo

Evaluar la variación somaclonal entre individuos clonados de Phalaenopsis in vitro, mediante Amplificación aleatoria del ADN polimórfico (RAPD).

Materiales y métodos Material vegetal La inducción de la Protocormos de la hoja de plántulas in vitro A partir de una hoja de Phalaenopsis obtenida de una sola planta de vivero, se esteriliza y se cultiva con el lado adaxial en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) al 50% solidificado. El medio MS solidificado es suplementado con 100 mg / l de myo-inositol, 0,5 mg / l de niacina, 0,5 mg / l piroxidina HCL, 0,1 mg / l de tiamina HCL, 2,0 mg / l de glicina (Tokuhara y Mii, 2.003; Chen y Chang, 2004), 3 mg / l TDZ, 2% de sacarosa y 3 g / l gelrite con extracto de plátano madure fresca 10%. El pH de la mezcla se ajusta a 5,6 (Islam et al., 2003), antes de la esterilización en autoclave durante 15 min a 121 ° C. De igual forma las hojas de esta planta se utilizan para la extraer su ADN. Los cultivos de hoja se mantienen durante 3 meses para inducir los protocormos. Estos protocormos obtenidos formarían parte del subcultivo cero S0. Los protocormos se mantienen aun mas y se dejan proliferar durante 6 meses con dos subcultivos uno a los 3 meses (S1) y otro a los 6 meses (S2). La muestra de la planta madre, y de los subcultivos S0, S1 y S2 se lavan primero con agua del grifo y luego se esterilizan superficialmente con solución de hipoclorito de sodio 10%(v/v) durante 5 min, posteriormente se lavan tres veces con agua destilada. Extracción de ADN El ADN genómico se extrae de la hoja de la planta madre y de los protocormos (S0, S1 y S2)mediante el método de bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB)(Doyle y Doyle, 1990). Doscientos miligramos de material joven fresca se liofilizan con nitrógeno líquido y 700 ml de CTAB buffer [2% (w / v) CTAB;1,4 M NaCl; 0,5% (v / v) 2-mercaca-ptoetanol; 20 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA); 100 mM Tris-HCl, (pH = 8,0); 4% (w / v) PVP] se añade al polvo de tejido. La mezcla se precalienta a 65 ° C durante 20 min y 5 ml de Sevag [Cloroformo-isoamylalchohol (24: 1)] se añade y se centrifuga a 10.000 rpm durante 15 min a temperatura ambiente para obtener un sobrenadante claro que contiene el ADN genómico. El

 

sobrenadante es transferido a un nuevo tubo, el ADN se precipita con 2/3 volumen de isopropanol, y la mezcla se centrifugó a 10.000 rpm durante 20 min a 4 ° C. El sedimento de ADN se lava con 5 ml de tampón de lavado [76% (v / v) de etanol, acetato de amonio 10 mM] y se retiene en el tampón de lavado durante 20 min a temperatura ambiente. Posteriormente, la mezcla se centrifuga a 10.000 rpm durante 5 min, y el sedimento se disuelve con 500 ml de TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM) buffer. A continuación, se añade 1 ml de ARNasa (10 mg / ml) a la solución de ADN, se centrifugaron a 12.000 rpm durante 5 min a temperatura ambiente, y la extracción fenol / cloroformo / alcohol isoamílico (PCI) se repitie para la capa acuosa superior. Posteriormente, el acetato de sodio 3 M (pH 5,2) y un volumen igual de isopropanol frío se añaden a la extracción de PCI, se centrifugan a 12.000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente. El sedimento de ADN obtenido se lava con 500 ml de etanol al 70%, se centrifugaron a 12.000 rpm durante 5 min a temperatura ambiente, y el sedimento se seca. El sedimento se disuelve en 500 ml tampón TE. Proyección de cebadores Doce cebadores RAPD oligonucleótido han sido utilizados para esta especie de plantas como: (OPU 08, OPU 09, OPU 10, OPU 11, OPU 12, OPU 13, OPU 14, OPU 15, OPU 16, P 12, P 14 y P 16) y se utiliza para el análisis de la estabilidad genética entre la planta madre y plantas producidas después de la inducción y la proliferación: S0, S1 y S2. Los cebadores que producen bandas polimórficas reproducibles, seguido de la determinación del tamaño de los fragmentos en pares de bases. La amplificación por PCR Se utiliza una mezcla de reacción amplificada de ADN polimórfico al azar que contiene: Muestra de 1 microlitro de ADN, PCR buffer 500 mM, desoxinucleótidos trifosfato 20 ml (dNTPs), 2,5 unidades de ADN Taq polimerasa (Fermentas) y 2 µml de MgCl2 (Fermentas), 1,4 µml de cada cebador ( England and Wales) hecha hasta un volumen final de 25 ml. El termociclador se programa con 1 ciclo de 94 ° C durante 5 min, 94 ° C durante 30 s y 42 ° C durante 1 min, seguido de un programa ejecutado a través de 35 ciclos de 72 ° C durante 2 min. La extensión final se realiza a 72 ° C durante 5 min. Los productos de amplificación se separan en geles de agarosa 2% (w / v) en tampón 1 × TAE a 80 V durante 1 h. El tamaño de los productos de amplificación se puede estimar usando 1 escalera de ADN kb (Fermentas). Tiñendo el gel con 2 mg / L de bromuro de etidio durante 5 min. Es necearoi repetir los análisis RAPD unas cuantas veces para comprobar la reproducibilidad. Gel de puntuación Bandas pueden ser visualizadas bajo luz UV y fotografiadas. Datos de RAPD y análisis de conglomerados El módulo SIMQUAL se utiliza para generar una matriz de similitud utilizando el coeficiente de Jaccard con la fórmula:

 

Sij = a / a + b + c Donde, Sij es la medida de similitud genética entre dos individuos, i y j. 'a' se define como el número de bandas presentes tanto en i y j; 'b' se define como el número de bandas presentes en i. A continuación, la matriz de distancia se utiliza para el análisis de clúster y el aglomerativo secuencial, Hierachila y la agrupación anidada (SAHN) (Sneath y Sokal, 1973) Resultados esperados Evaluación utilizando análisis RAPD El método RAPD ofrece un gran potencial para la generación de un gran número de marcadores que representan una muestra aleatoria del genoma y de manera eficiente se ha utilizado para dar resultados fiables y reproducibles capaces para la estimación de la variación genética. El éxito para el uso del análisis por RAPD se basa principalmente en la selección de cebadores correctos que puedan ser reproducibles que proporcionen productos claros y legibles en todos los tratamientos propuestos ya que mientras mayor sea el numero de bandas legibles en el gel mejor podrá ser el análisis de comparación entre uno y otro tratamiento otro factor importante en el estudio es el tiempo de proliferación, así como el numero de subcultivos realizados, ya que se sabe que mientras mas subcultivos se realicen existe una mayor probabilidad de que se presentes variaciones somaclonales. Los resultados esperados serian similares a un estudio realizado por (W. H. Chen et al 1998) del departamento de ciencias biologicas, National Sun Yat-Sen University, Kaohsiung City, Taiwan en el que analizan variacines somaclonales en phalaenopsis true lady, 78 de100 cebadores dieron 1 a 10 bandas distintas por imprimación, lo que resulta en un total de 1116 bandas. La imagen muestra cuatro conjuntos de perfiles RAPD de este estudio que demuestra la heterocigosidad revelado en variantes somaclonales de Phalaenopsis.

 

Referencias

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