Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ
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Étude du décalage de phase de Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæSaccharomyces cerevisiæ
Michaël Bekaert
Université Pierre et Marie Curie
Directeur de thèse : Jean-Pierre RoussetInstitut de Génétique et Microbiologie
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La levure Saccharomyces cerevisiae
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Un messager, un polypeptide
P A
ECAU AUG GAU UAC AUG GUC UAA GAU
ribosome
ARNm
La traduction
ARNt
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Un messager, un polypeptide
P A
ECAU AUG GAU UAC AUG GUC UAA GAU
La traduction
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Un messager, un polypeptide
P A
ECAU AUG GAU UAC AUG GUC UAA GAU
La traduction
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Un messager, un polypeptide
P A
ECAU AUG GAU UAC AUG GUC UAA GAU
La traduction
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Un messager, un polypeptide
P A
ECAU AUG GAU UAC AUG GUC UAA GAU
La traduction
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Un messager, un polypeptide
P A
ECAU AUG GAU UAC AUG GUC UAA GAU
La traduction
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Un messager, un polypeptide
P A
ECAU AUG GAU UAC AUG GUC UAA GAU
La traduction
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Un messager, un polypeptide
P A
ECAU AUG GAU UAC AUG GUC UAA GAU
La traduction
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Un messager, un polypeptide
P A
ECAU AUG GAU UAC AUG GUC UAA GAU
La traduction
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Un messager, un polypeptide
P A
E
CAU AUG GAU UAC AUG GUC UAA GAU
La traduction
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Le recodage
Saut de ribosome
Translecture
Décalage de phase de lecture en -1
Décalage de phase de lecture en +1
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Un messager, deux polypeptides
Le recodage
• Dépend de séquences et de structures sur l’ARNm
• Observé principalement dans des petits éléments génétiques autonomes (virus et transposons)
Vestige d’un monde à ARN… Compacité des génomes Biais des analyses
• Pourquoi des virus et des transposons ?
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Recherche de sites de décalage de phase de lecture dans les génomes
Le décalage de phase de lecture en -1
Développer des outils d’identification d’événements de recodage eucaryote
Caractériser le décalage de phase de lecture en -1
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Virus HIV
Le décalage de phase de lecture en -1
.
.
rev tat
nef
vif
vpr vpu
pol pro env gag
LTR LTR int
ARNm
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Le décalage de phase de lecture en -1
gagpol
Protéine Gag95%
Protéine Gag-Pol5%
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Site canonique de décalage de phase de lecture
Le décalage de phase de lecture en -1
Modèle Jacks et Varmus, 1985 et 1988
1000
1000
2000
2000
3000
3000
4000
4000
+1
0
-1
X XXY YYZ
Heptamère Brilerly, 1993
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Les expériences
Décalage de phase de lecture en -1
Nouveaux gènes Mécanisme
Impact del’environnement
Virus
Site EHMM
Modélisation
Similarité
Espaceur
TransposonsLevure
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Aujourd’hui
Nouveaux gènes
Virus
Site EHMM
Similarité
Décalage de phase de lecture en -1
Mécanisme
Impact del’environnementModélisation
Espaceur
TransposonsLevure
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Recherche de sites de décalage de phase de lecture dans les génomes
Le décalage de phase de lecture en -1
Recherches à partir de ce modèle Hammell et al., 1999 Liphardt, 1999
1000
1000
2000
2000
3000
3000
4000
4000
+1
0
-1
![Page 22: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/22.jpg)
Deux approches complémentaires
Le décalage de phase de lecture en -1
• Modèle pas assez précis (ou incomplet)
• Modèle trop rigide (mécanismes différents ou dégénérés)
Affiner le modèle
Approche sans a priori sur le mécanisme
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Affiner le modèle
Le décalage de phase de lecture en -1
• Identifier de nouveaux attributs
Composition de l’espaceur Dissymétrie entre un appariement C-G et G-C
(Bekaert et al., Bioinformatics, 2003)
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Recherche basée sur le modèle affiné
Le décalage de phase de lecture en -1
X XXY YYZP SP
S1
L1
S2
L2
L’1
5’
3’
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Rechercher un heptemère
Le décalage de phase de lecture en -1
AUG
N NNN
NN XXX YYY Z
![Page 26: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/26.jpg)
Rechercher un pseudonoeud
Le décalage de phase de lecture en -1
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Affiner le modèle
Le décalage de phase de lecture en -1
X XXY YYZP SP
S1
L1
S2
L2
L’1
5’
3’
![Page 28: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/28.jpg)
Valider des sites putatifs (Bekaert et al., Mol Cell, sous presse)
Le décalage de phase de lecture en -1
Cucurbit aphid-borne yellows virus
Turnip yellows virus
Potato leafroll virus
Cereal yellow dwarf virus-RPV
Cocksfoot mottle virus
Human T-cell lymphotropic virus 1
Simian T-cell lymphotropic virus 1
Bovine leukemia virus
Mouse mammary tumor virus Enzootic nasal tumor virus Simian type D
Rous sarcoma virus
Visna virus
Feline immunodeficiency virus Equine infectious anemia virus
Human immunodeficiency virus 2
Simian immunodeficiency virus
Simian retrovirus type 2
Human immunodeficiency virus 1
L-A virus
Giardia virus
Trichomonas vaginalis virus II
Human astrovirus PRRSV
Human coronavirus
Murine hepatitis virusSARS Avian infectious bronchitis virus
Red clover necrotic mosaic virus
Barley yellow dwarf virus-PAS
Carrot mottle mimic virus
Groundnut rosette virus
Pea enation mosaic virus 2
Human T-cell lymphotropic virus 2
Mason-Pfizer monkey virus
CoronaviridaeCoronavirus
ArteriviridaeArterivirus
AstrovirideaMamadtrovirussTombusviridea
Dianthovirus
Umbravirus
LuteovirideaPolerovirus
LuteoviridaeLuteovirus
RetrovirideaDeltaretrovirus
RetrovirideaBetaretrovirus Retroviridea
Alpharetovirus
RetrovirideaLentivirus
TotiviridaeTotivirus
TotiviridaeGiardiavirus
Retrovirus
Virus à ARNdouble brin
Virus àARN positif
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pAC99 : évaluation in vivo
Le décalage de phase de lecture en -1
-galactosidase
-galactosidase-luciférase
Région de décalage
lacZluc
+1
0
-1
![Page 30: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/30.jpg)
Plus de virus
Le décalage de phase de lecture en -1
Pseudo-consensus
13,0%±2SRV1 gag/pro
0,7%±0ScYLV
10,3%±1SARS
15,7%±1PRRSV
17,8%±2PLRV-W
19,0%±1PLRV
31,0%±2PEMV1
20,2%±2MMTV gag/pro
13,1%±1LDV
13,0%±2L-BC
10,0%±1L-A
19,3%±1IBV
6,0%±1HIV1
9,0%±1FIV
7,0%±1EIAV
17,5%±1CABYV
12,2%±1BYDV
12,0%±1BWYV
8,1%±1BLV gag/pro
15,8%±2BChV
GGGGGGAAACUC
gGa.GGgAAAC.ca
gaG.GGgAAAu.ca
gGG.uuuAAAC.Uu
UGc.uuuAAAC.Ug
gGG.uuuAAAu.cC
gGG.GGgAAAu.cC
gGa.GGgAAAC.UC
UuG.aaAAAAC.UC
UGc.uuuAAAC.gC
cGu.GGauuuu.Uu
gGa.GGguuua.ca
gGG.uuuAAAC.Ua
gGG.uuuuuua.aa
UGG.GGgAAAC.UC
gGG.aaAAAAC.cC
gGG.GGgAAAC.UC
UaG.GGguuuu.gu
gGG.GGgAAAC.UC
Uaa.aaAAAAC.UC
gGa.GGgAAAu.cC
Heptamère DécalageVirus
Profil HMM
![Page 31: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/31.jpg)
Identifier de nouveaux virus
Le décalage de phase de lecture en -1
1500 génomes
285 candidats
74 séquences
profil HMM
inspection manuelle- pas dans la bonne phase- pas de structure secondaire
![Page 32: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/32.jpg)
biais nucléotidique
Le décalage de phase de lecture en -1
0
20
40
60
80
-9/-10 -8/-9 -7/-8 -6/-7 -5/-6 -4/-5 -3/-4 -2/-3 -1/-2
dinucléotide
Chi2
![Page 33: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/33.jpg)
Dinucléotide en amont du site glissant
Le décalage de phase de lecture en -1
![Page 34: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/34.jpg)
Dinucléotide en amont du site glissant
Le décalage de phase de lecture en -1
0%
5%
10%
15%
20%
25%
AA AC UA UC UG UU AG AU CA CC CG CU GA GC GG GU
dinucléotide
Taux décalage de phase
![Page 35: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/35.jpg)
Propriété de Pus3p
Le décalage de phase de lecture en -1
Réaction catalysée par Pus3p
uridine pseudouridine ()
H+ OHHOH
NH
OCH2
O OH
O
O
O
P-O
OO
5
1HN
NO
CH2
O OH
O
O
O
PO
-O
O
H5
1
180°
HN
38-39
Pus3p(Lecointe et al, 1998)
![Page 36: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/36.jpg)
Effet de l’absence de pseudouridine en position 39
Le décalage de phase de lecture en -1
0%
5%
10%
15%
20%
25%
CG GA UA UC
WTpus3
dinucléotide
taux de décalage de phase
![Page 37: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/37.jpg)
Et le site E ?
Le décalage de phase de lecture en -1
P AE
![Page 38: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/38.jpg)
La traduction
Influence de l’ARNt au site E sur la traduction
Adapté de Frank et al., 1999
![Page 39: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/39.jpg)
Un site de décalage de phase étendue…
Le décalage de phase de lecture en -1
L’ARNt est éjecté prématurément ?
L’ARNt reste?
• Influence de la pseudouridine sur le l’ARNt au site E
Influence la phase d’accommodation au site A ?
Déstabilise l’ARNt au site P ?
• Influence de l’ARNt au site E
![Page 40: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/40.jpg)
Le décalage de phase de lecture en -1
Affiner le modèle : mécanisme
• Influence de la modification 39 de l’ARNt au site E
• Impact sur la fidélité de la traduction
![Page 41: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/41.jpg)
Le décalage de phase de lecture en -1
Affiner le modèle : bioinformatique
• Identifier de nouveaux attributs
Composition de l’espaceur Dissymétrie entre un appariement C-G et G-C Site E / Dinucléotide en amont de l’hepamère
![Page 42: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/42.jpg)
Approches sans a priori sur le mécanisme
Le décalage de phase de lecture en -1
• Regarder le décalage de phase sous un angle différent
• Identifier de nouveaux sites
sans a priori sur le site de décalage lui-même définition génomique
FonctionnelLinguistique/statistique
![Page 43: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/43.jpg)
Implémentation
Le décalage de phase de lecture en -1
Stockage des séquences
Découpage du génome
HMM
Motifs
RT-PCR
Evaluation in vivo
Classement
![Page 44: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/44.jpg)
Quelques outils
Le décalage de phase de lecture en -1
(Bekaert et al., Bioinformatics, soumis)
![Page 45: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/45.jpg)
Découpage
Le décalage de phase de lecture en -1
START
> 99 nt
STOP1 STOP2 STOP3
phase 0phase -1
> 99 nt
> 150 nt
ORF0ORF-1
22 445 régions chez S. cerevisiaeGenbank – rel. 27/10/2002
10 régions chez le virus L-AGenbank – rel. 03/08/2002
![Page 46: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/46.jpg)
Motifs
Le décalage de phase de lecture en -1
START
Motif protéique ?
STOP1 STOP2 STOP3
Motif protéique ?
ORF0ORF-1
84 régions chez S. cerevisiae1 région chez le virus L-A
Banques de motifs: Interpro 7.0 Application: GenRecode
![Page 47: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/47.jpg)
Modèle de Markov
Le décalage de phase de lecture en -1
0
-1
0
-1
![Page 48: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/48.jpg)
Modèle de Markov
Le décalage de phase de lecture en -1
0
-1
0
-1
![Page 49: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/49.jpg)
Classement
Le décalage de phase de lecture en -1
110 régions chez S. cerevisiae1 région chez le virus L-A
Probabilité de déphasage > 95% 0
100
200
300
400
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
21000
≥0.95
probabilité
Nombre de régions
![Page 50: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/50.jpg)
Vers de nouveaux sites eucaryotes : synthèse
Le décalage de phase de lecture en -1
79
5
105• Le site du virus L-A est retrouvé
• Identification de 189 régions chez S. cerevisiae
• Classement des candidats
HMM
Motifs
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ARNm
Le décalage de phase de lecture en -1
ADN
ARNmAAAAAA
2MM
RT-PCR
43 5 6 7 8 9 10 11 12 13 161 1714 15 18
1 kb
500 b
![Page 52: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/52.jpg)
pAC99 : évaluation in vivo
Le décalage de phase de lecture en -1
-galactosidase
-galactosidase-luciférase
Région de décalage
lacZluc
+1
0
-1
![Page 53: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/53.jpg)
Décalage in vivo
Le décalage de phase de lecture en -1
0%
2%
4%
6%
8%
10%
12%
14%
2 11 16 21 30 32 40 41 43 48 50
HMM
Motifs
candidat
Taux décalage de phase3
6
2
![Page 54: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/54.jpg)
De nouveaux sites eucaryotes ?
Le décalage de phase de lecture en -1
Stockage des séquences
Découpage du génome
HMM
Motifs
RT-PCR
Evaluation in vivo
Classement
1 génome
22 445 régions
110 candidats
84 candidats
28 ARNm /50
11 sites /28
![Page 55: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/55.jpg)
Les 11 candidats
Le décalage de phase de lecture en -1
fsORF % Sage Canonique ORF0 ORF-1 Notes2 6% Oui heptamère SCO2 - SCO2 (involved in stability of Cox1p and Cox2p)11 11% Oui heptamère YDL038C PRM7 PRM7 (pheromone-regulated membrane protein)16 9% - - AAD6 AAD16 AAD6 (high similarity with the AAD of P. chrysosporium)21 13% - Oui - - Intergénique / PRF1330 12% Oui - YKL033W-A - -32 7% Oui - SRL3 SRL3 (Suppressor of Rad53 null Lethality)40 5% - - YMR084W YMR085W putative glutamine--fructose-6-phosphate transaminase41 5% Oui - ADE17 - ADE17 (AICAR transformylase/IMP cyclohydrolase)43 10% - - MRPL24 - MRPL24 (Mitochondrial ribosomal protein)48 5% Oui - STE4 - STE4 (GTP-binding protein beta subunit of the pheromone pathway)50 7% Oui - - RAD17 RAD17 (DNA damage checkpoint control protein)
![Page 56: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/56.jpg)
Perspectives
Le décalage de phase de lecture en -1
• Recherche dans d’autres levures
• Recherche dans des organismes plus complexes
Cette stratégie peut être appliquée à d’autres organismes.
Applicable à d’autres types de recodage.• Décalage de phase de lecture en +1
• Translecture
Nouveaux types de recodage
![Page 57: Étude du décalage de phase de lecture dans le génome de Saccharomyces cerevisiæ](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022070400/56813595550346895d9d06f2/html5/thumbnails/57.jpg)
Analyse des génomes
Le décalage de phase de lecture en -1
Le décalage de phase de lecture en -1 n’est pas un phénomène limité aux gènes viraux, il pourrait être sous-évalué dans les génomes eucaryotes.
HMM
Motifs
2 3
5
-
1 2-
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Merci !!!
Institut de Génétique et Microbiologie
Laboratoire de Recherche en Informatique
Laboratoire de Statistique et Génome
Agnès Baudin-BaillieuLaure BidouBruno CosnierMuriel Decraene Céline FabretMaryse Godon
Isabelle HatinMarta Kwapisz Olivier NamyJean-Pierre RoussetMichel Termier
Alain DeniseJean-Paul ForestChristine Froidevaux
Bernard PrumHugues Richard