Ethylmethansulfonat (EMS) + CH 2 CH 3. recessive mutants by ethyl methane sulfonate (EMS)...
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Ethylmethansulfonat (EMS)
+
CH2CH3
CH3
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recessive mutants by ethyl methane sulfonate (EMS) mutagenesis
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Punktmutation
G C
wildtype
EMS
Et-G C
replication
Et-G T
replication
Et-G T
G C
wildtype
A T
mutation
Fixed mutation can be isolated by
gene mapping
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1. Chemische Mutagenese
Zur chemischen Mutagenesewerden oft Samen mit EMSbehandelt.
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Das Ti-Plasmid und die Integrationin die chromosomale DNA
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Das Ti-Plasmid und die Integrationin die chromosomale DNA
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Schnelle Zellteilung Opinsynthese
Auxin
Cytokinin
Phytohormone
Ungewöhnliche Aminosäuren
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1. Bindung an Verwundungsstelle
2. Verwendung der Phenole zur Erkennung durch Sensorproteine
VIR A und VIR G
3. Aktivierung der Gene der VIR-Region: VIR B, C, D und E
4. Diese VIR-Proteine stellen eine freie Kopie der T-DNA her und
5. Verpacken die T-DNA zu einem T-Transportkomplex und leiten In Zelle
6. Signalsequenzen in VIR E2 und VIR D2 dirigieren durch nukleären
Porenkomplex (NPC) in den Zellkern
7. T-DNA wird in Chromosom integriert und der Komplementärstrang
wird durch ein Reparatursystem synthetisiert.
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4. Mutation durch Transposons
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4. Mutation durch Transposons
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Nachweis der MutationSiehe PCR
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1. Chemische Punktmutation
4. Insertion von Transposons
3. Das Agrobakterium-System
2. Energiereiche Strahlung
A
B
Die Erzeugung und Analyse von Mutanten ist einwichtiges Werkzeug der Entwicklungsphysiologie
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Identifizierung mutierter Gene:Was kann man über die Wahrscheinlichkeit von crossing over sagen?
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Mit einer Hybridisierungssonde kann man Mutationen nachweisen
Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus
2. Ansatz: Molekulare MarkerRespriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP)
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Erfolgreicher Gentransfer durch Agarobacterium tumefaciens
Nutzpflanzen
Magnolisopsida Rosopsida („Eudicots“)Liliospsida
(„Monocots“
? TabakTomateKartoffelRapsBlumenkohlSalatSonnenblumeApfelRübe
AsparagusYamwurzel
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Da gibt es noch ein Problem ! WT ca. 200 kb!
Zwei-Vektor-Verfahren
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Da gibt es noch ein Problem !
Cointegration
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Agrobakterium
Selektion von der transformierten Zellen
Transformation
Transgene Pflanze
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Komplikationen beim Einsatz des Agrobacterium-Systems
1. Insertion von T-DNA in wesentliche Gene oder in Kontrollelemente
2. Insertion der T-DNA an verschiedenen Loci des Genoms
3. Insertion von Concatameren in einen Locus
4. Insertion eines Teiles der T-DNA
5. Insertion des Plasmidgerüstes des einfachen oder binären Vektors
6. Nicht erfolgreiche Insertion von T-DNA
7. Insertion zufälliger DNA-Fragmente von E. coli oder Agrobacterium
8. Aktivierung von Transposons
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1. Insertion von T-DNA in wesentliche Gene oder in Kontrollelemente
- T-DNA von Agrobacterium insertiert bevorzugt an Stellen transkriptional
hoher Aktivität. Gilt auch für „nackte“ DNA.
- Ursache: solche Stellen sind partiell denaturiert (Strangaufspaltung) für
Transkription. Offensichtlich lassen solche Stellen Rekombination leichter
zu.
- Solche Stellen sind meist Gene (oder sehr nahe daran), so dass mit hoher
Wahrscheinlichkeit Insertion in Gene erfolgt – das damit „knocked out“ ist.
- Nahezu alle transformierten Pflanzen enthalten auch ein oder sogar mehrere
ausgeschaltete Gene. Wegen Redundanz muss das nicht unbedingt einen
Einfluss auf den Phänotyp habe.
- Mit Agrobacterium werden gezielt T-DNA-Mutanten erzeugt.
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2. Insertion der T-DNA an verschiedenen Loci des Genoms
- Mehrfache Insertion ist nicht selten, aber nicht vorhersehbar.
Die Häufigkeit hängt vom Protokoll ab, sogar von Agrobacterium-
Stamm und stark von der Pflanze.
- Wenn einmal der Widerstand gegen eine Insertion in das Pflanzengenom
überwunden ist, dann gibt es meist auch multiple Insertionen. Eine
Einzelinsertion ist möglich, muss aber nachgewiesen werden.
- Concatamere T-DNA-Insertion nennt man, wenn Kopf-Schwanz-Insertionen
an derselben Stelle erfolgen. (3. Insertion von Concatameren in einen Locus)
- Dass „nackte“ DNA leichter mehrfach insertiert werden als mittels Agrobacterium
ist ein widerlegtes Gerücht. Beide Komplikationen sind häufig.
- Die Anzahl der Insertionen sollte ermittelt werden.
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4. Insertion eines Teiles der T-DNA
- Der Nachweis von T-DNA-Stücken kann schwieriger sein als die Insertion
der vollständigen Sequenz. Die Wirkung beim „knock out“ kann aber dieselbe sein.
- RNAi (Gene silencing) tritt oft auf, wenn multiple identische Gene zur selben
Zeit transkribiert werden. Dazu sind nicht vollständige Sequenzen erforderlich,
Teilsequenzen können sogar effektiver sein – ein ernstes Problem.
Der Mechanismus ist nicht genau bekannt: Insertion kleiner Teilstücke oder
Ablesefehler bei der Transkription.
- Das historisch erste Agrobacterium-Plasmid pBIN19 hatte den Selektionsmarker
(gegen Kanamycin) an der rechten T-DNA-Grenze. Da in Agrobacterium der
Transfer von der rechten zur linken Grenze erfolgt (der Einbau allerdings von
links nach rechts) konnte der Selektionsmarker ohne Gen von
Interesse transferiert werden. Viele moderne Vektoren sind von pBIN19 abgeleitet.
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5. Insertion des Plasmidgerüstes des einfachen oder binären Vektors
- Linke und rechte Grenzen sind nahezu Palindrome, d.h. Spiegelbilder.
- Die linke Grenze wird daher mitunter als rechte Grenze missverstanden.
Folglich wird ein Teil oder das ganze Plasmidskelett transferiert. Das geschieht
auch mit binären Vektoren.
- Nach Initiation des Gentransfers kopieren die VIR-Proteine die
T-DNA von der linken zur rechten Grenze.
- Nur wenn danach speziell gesucht wird kann ein solcher Fehler auch
gefunden werden. Effekte auf den Phänotyp können auf „knock out“ beruhen
und als Einführung eines speziellen Gens fehlinterpretiert werden.
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6. Nicht erfolgreiche Insertion von T-DNA
- VIRD2-Proteine von Agrobacterium schützen die Enden der T-DNA (Verhinderung
der Degradation in Wirtszelle) und unterstützen die Integration durch (1.) Initiation der
DNA-Öffnung und (2.) der Rekombination.
- Die kovalente Bindung erfolgt jedoch nicht immer an der Stelle der Öffnung.
Der überhängende Teil der Wirts-DNA wird eliminiert. Das kann auf beiden Seiten
der Insertion erfolgen.
- Da die DNA-Integration initiiert werden kann ohne erfolgreich sein zu müssen
kommt es so zu einer DNA-Deletion, die nicht durch eingefügte DNA markiert ist.
- Das Ausmaß dieses Effektes lässt sich nur schwer abschätzen,
ist aber an Beispielen nachgewiesen worden.
- E. coli-DNA ist in transformierten Genomen nachgewiesen worden, die mit reiner
DNA transformiert wurden – wahrscheinlich einfach von verunreinigenden
Plasmidextrakten. (7. Insertion zufälliger DNA-Fragmente von E. coli oder Agrobacterium)
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8. Aktivierung von Transposons
- Genome höherer Organismen sind von Transposon-ähnlichen Sequenzen
dominiert und kann mehr als 10 % der Gesamtsequenz ausmachen. Unterschiede
im Ausmaß können für unterschiedliche Genomgrößen mitverantwortlich sein.
- Es gibt Mechanismen, die diese Transposons inaktiv halten.
- Insbesondere unter Stress (dazu gehört Transformation oder Selektionsdruck,
manchmal auch in vitro-Kultivierung) sind diese Inaktivierungsmechanismen
durchbrochen.
- In Tabak ist gezeigt worden, dass Tto1 bei einem Transformationsexperiment
30 – 100 Bewegungen vornehmen kann. In einigen Fällen nimmt man durchaus
1000 Bewegungen von Transposons bei einem Transformationsereignis an.
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1. PEG-vermittelte Aufnahme von DNA
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1. PEG-vermittelte Aufnahme von DNA
Effektivität der Transformation liegt bei 1 : 100.000
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1. PEG-vermittelte Aufnahme von DNA (Protoplastenfusion)
![Page 32: Ethylmethansulfonat (EMS) + CH 2 CH 3. recessive mutants by ethyl methane sulfonate (EMS) mutagenesis.](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022062622/55204d6149795902118b4e87/html5/thumbnails/32.jpg)
2. Electroporation (Aufnahme von DNA oder Protoplastenfusion)
![Page 33: Ethylmethansulfonat (EMS) + CH 2 CH 3. recessive mutants by ethyl methane sulfonate (EMS) mutagenesis.](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022062622/55204d6149795902118b4e87/html5/thumbnails/33.jpg)
4. Biolistic
Vermutlich zweitwichtigste Methode nach Agrobakterium.
![Page 34: Ethylmethansulfonat (EMS) + CH 2 CH 3. recessive mutants by ethyl methane sulfonate (EMS) mutagenesis.](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022062622/55204d6149795902118b4e87/html5/thumbnails/34.jpg)
Rupture disk
Flying disk
DNA-coated gold particles
Stopping screen
Sterile leafPlant regeneration medium
HELIUM HELIUM
Evacuated chamber
Biolistic chloroplast transformation
![Page 35: Ethylmethansulfonat (EMS) + CH 2 CH 3. recessive mutants by ethyl methane sulfonate (EMS) mutagenesis.](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022062622/55204d6149795902118b4e87/html5/thumbnails/35.jpg)
Segregation of chloroplast genomes (Plastom)accelerated gold particle coated with transforming DNA
~50-100 plastids / cell ~10-20 nucleoids / plastid ~5-10 pt genomes / nucleoid
~10,000 pt genomes /cell
4. Biolistic
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Integration of foreign genes into the chloroplast genome
intergenicspacergene A gene B gene C gene D
pt DNA
aadAgene B gene C
transformation vector
A
gene X
gene Xgene A gene B gene C gene D
pt DNA
aadA
gene B gene C
transformation vector
B