ESPECTROSCOPÍA RAMAN AMPLIFICADO POR … · EQUIPO RAMAN LABORATORIO DE ESPECTROSCOPIA VIBRACIONAL...

ESPECTROSCOPÍA RAMAN AMPLIFICADO PORESPECTROSCOPÍA RAMAN AMPLIFICADO PORSUPERFICIE: ESTUDIO DE TEJIDOSSUPERFICIE: ESTUDIO DE TEJIDOS

DEL MANGO ROTADOR DEL HOMBRO TRATADO DEL MANGO ROTADOR DEL HOMBRO TRATADO CON ONDAS DE CHOQUECON ONDAS DE CHOQUE

J. J. Cárcamo, E. Clavijo, M. BrañesJ. J. Cárcamo, E. Clavijo, M. Brañes11, H. Contreras, H. Contreras22, , R. ArocaR. Aroca33 and M.M. Campos Vallette. and M.M. Campos Vallette.

Universidad de Chile, Facultad de Ciencias POBox 653 Santiago 21. ChileUniversidad de Chile, Facultad de Ciencias POBox 653 Santiago 21. Chile11 Unidad de Biocirugía, Clínica Arauco Salud, Avda. Presidente Kennedy 5413B, Las Condes. Chile. Unidad de Biocirugía, Clínica Arauco Salud, Avda. Presidente Kennedy 5413B, Las Condes. Chile.

2 2 Universidad de Chile, Inst. Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Inst. Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina,

Avda. Avda. Independencia 1027, Santiago, ChileIndependencia 1027, Santiago, Chile33University of Windsor, Materials & Surface Science Group, N9B3P4 Ontario, Canada.University of Windsor, Materials & Surface Science Group, N9B3P4 Ontario, Canada.

UNIVERSIDAD DE CHILEFACULTAD DE CIENCIAS

GRUPO DE ESPECTROSCOPIA VIBRACIONAL

MATERIALS AND SURFACE SCIENCE GROUP

DEPARTMENT OF CHEMISTRY & BIOCHEMISTRY

UNIVERSIDAD DE CHILEFACULTAD DE MEDICINAGRUPO DE FISIOLOGÍA

Y BIOFÍSICA

http://www.clinicaarauco.cl/main.php

http://www.uwindsor.ca/

¿Ondas de Choque, Medicina, Tendinosis y ahora Química?

Biopsias humanas del mango rotador del hombro

?

• Trabajo dirigido a hacer una contribución Médica/Clínica consistente Trabajo dirigido a hacer una contribución Médica/Clínica consistente en la aplicación de Ondas de Choque sobre tendinopatias crónicas, no en la aplicación de Ondas de Choque sobre tendinopatias crónicas, no consolidación de fracturas y otras efermedades relacionadas.consolidación de fracturas y otras efermedades relacionadas.

• Se ha observado que la exposición al tratamiento de Ondas de Choque Se ha observado que la exposición al tratamiento de Ondas de Choque produce una inducción biológica que trae como consecuencia neoproduce una inducción biológica que trae como consecuencia neoangiogenesis e hipervascularicación en los pacientes tratados.angiogenesis e hipervascularicación en los pacientes tratados.

• El objetivo de este trabajo esta dirigido a dar una explicación a estos El objetivo de este trabajo esta dirigido a dar una explicación a estos bioprocesos.bioprocesos.

Muestras en estudioMuestras en estudio

Cortes histológicos de 2 Cortes histológicos de 2 µm de µm de espesor espesor del mango rotador del del mango rotador del hombro.hombro.

Los cortes son:Los cortes son:

Patológicos tratados y no tratados Patológicos tratados y no tratados con Ondas de Choque.con Ondas de Choque.

Muestras de tejidos humanoMuestras de tejidos humano• Las biopsias son tratadas bajo las tecnicas habituales de Las biopsias son tratadas bajo las tecnicas habituales de

histología para tejidos, esto es: Elaboración de tacos en histología para tejidos, esto es: Elaboración de tacos en parafina solida, corte en microtomo, Tinción con HE, parafina solida, corte en microtomo, Tinción con HE, Tricromo de Masson y Azul de ToluidinaTricromo de Masson y Azul de Toluidina

Biología Bioquímica

SingerNicholson model

Composición Química de la Matriz Extracelular

Componentes Fibrosos: Las proteínas fibrosas son los elementos básicos estructurales de los tejidos conjuntivos. Los más importantes son: colágeno, elastina, fibronectina, laminina.

Componentes fluidos: glicosaminoglicanos y proteoglicanos.

Los glicosaminoglicanos son polisacáridos complejos. Los mas importantes son:

• Ácido hialurónico (es el de mayor tamaño y no se encuentra sulfatado),• condroitín sulfato, • dermatán sulfato, • heparán sulfato y • queratán sulfato.

Estos, al combinarse con proteínas, pasan a llamarse proteoglicanos. También reciben en general la denominación de "mucopolisacáridos".

Los glicosaminoglicanos son moléculas muy ácidas, con numerosas cargas negativas que atraen grandes cantidades de iones sodio y, por lo tanto, de agua.

Componentes enzimático: Constituido principalmente por metaloproteinas, las que son las responsables del equilibrio homeostático en la remodelación de los tejidos

Collagen proteins

25 to 33 % of the total proteins in humans equivalent to 6 % of the weight

Contains:33% gly, 21% proline and its hydroxil derivatives in position 3 and 4, and 11% alanine. Collagen contains hydroxiproline and 5hydroxilisine.

Fibers interact each other through glucosamineglicans

5Hidroxilisina.

Prolina

Glicina

Aminoacids (collagen constituents)

Estudios de tejidos Estudios de tejidos patológicos !!!patológicos !!!

¿Hay información de estructura molecular de estos sistemas?

• Clasificación Riley

I II III IV

Normal vasodilatación metaplasia focos angiogénesis disminución focos angiogénesis neoangiogénesis inicial mayor alteración matriz apoptosis progresiva aumento nº fibroblastos / otras metaplasia condral pérdida estructura matriz aumento cel´s. endoteliales microcalcificación / calcificación expresión céls. mesenquimales microrupturas alteración relación col I : III

en homeostasis inflamación reactiva inflamación crónica consecuencia

Información obtenida por tinción y microscopía

Información obtenida por Información obtenida por ensayos Inmunohistoquímicosensayos Inmunohistoquímicos

ji_ome

¿Que hay en espectroscopía?

Relacion de Colagenos I y IIIRelacion de Colagenos I y III

Disciplina que estudia la componente estructural: Raman y SERS

ν 0

Raman Stokes Raman AntiStokes

ν 0ν R ν 0+ν R

Espectro Raman

ESPECTROSCOPÍA VIBRACIONAL

ν 0ν 0ν R ν 0+ν R

EFundamental

EVirtuales

ESPECTROSCOPÍA RAMAN

Sección eficaz pequeñaN° fotones dis./Area

10 millones incidente1 dispersados

ESPECTROSCOPIA RAMAN ESPECTROSCOPIA RAMAN

AMPLIFICADA POR SUPERFICIEAMPLIFICADA POR SUPERFICIE

•Raman permite el estudio de materiales biológicos en Raman permite el estudio de materiales biológicos en condiciones fisiològicas. condiciones fisiològicas.

•Alta intensidad puede ser alcanzada por SERS, donde el Alta intensidad puede ser alcanzada por SERS, donde el analito es puesto sobre la superficie de una analito es puesto sobre la superficie de una nanoparticula metalica, amplificando las señales en 10nanoparticula metalica, amplificando las señales en 1066 – – 101088 y en algunos casos a 10 y en algunos casos a 101515..

ESPECTROSCOPÍA VIBRACIONAL ESPECTROSCOPÍA VIBRACIONAL AMPLIFICADA POR SUPERFICIEAMPLIFICADA POR SUPERFICIE

Características del efecto:Características del efecto:

• Alta sensibilidad: aumento de la sección eficaz Raman.Alta sensibilidad: aumento de la sección eficaz Raman.• Atenuación de la fluorescencia.Atenuación de la fluorescencia.• Mayor efecto cerca de la superficie.Mayor efecto cerca de la superficie.

hν O hν R

I = I0x106

Ventajas de SERS:Ventajas de SERS:

• Minima preparación de muestraMinima preparación de muestra• Alta resolución espacial en el caso de microscopía RamanAlta resolución espacial en el caso de microscopía Raman• Detección de una molecula (ppm–ppb, atomomol), bajas Detección de una molecula (ppm–ppb, atomomol), bajas

concentraciones en solución acuosaconcentraciones en solución acuosa• Bajo poder de laser (100 Bajo poder de laser (100 µµ W y 10 mW), capacidad no W y 10 mW), capacidad no

invasiva sobre la muestrasinvasiva sobre la muestras• Alta sensibilidad, sencibilidad a pequeños cambios Alta sensibilidad, sencibilidad a pequeños cambios

estructuralesestructurales• Rapida capacidad de detecciónRapida capacidad de detección• Espectro único para un analito en matrices complejasEspectro único para un analito en matrices complejas

EQUIPO RAMAN LABORATORIO DE ESPECTROSCOPIA VIBRACIONAL

Espectrometro Micro-Raman Renishaw laser 514 nm y 633 nm. Detector CCD.

ESTUDIOS SOBRE MATERIAL ESTUDIOS SOBRE MATERIAL BIOLOGICO EN EL BIOLOGICO EN EL

LABORATORIOLABORATORIODE ESPECTROSCOPIADE ESPECTROSCOPIA

VIBRACIONALVIBRACIONAL

31

65

29

22

19

73

15

69 1

50

6

14

56 1

37

1

13

28

12

24

11

65

11

31

98

1

91

8

85

2

76

8

60

4

55

0

48

0

38

0

34

45

32

81

32

19

31

71

30

64 29

25

17

39

15

58

14

32

13

21

11

78

15

99

15

45

14

51 1

33

3

12

32

11

15

10

25

97

99

41

89

2

66

1

43

3

29

22

16

23

15

78

15

02

13

59

13

12

12

68

11

44

10

72

10

16

68

5

55

01800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200

W avenumber, cm 1

Ra

ma

n I

nte

sit

y,

a.u

.

Espectros SERS del aminoacido lisina sobre Espectros SERS del aminoacido lisina sobre coloide de Ag medido en distintos tiempos coloide de Ag medido en distintos tiempos

SERS proteinas azules de cobre SERS proteinas azules de cobre concholepas concholepas y megathura concholepas concholepas y megathura

crenulatacrenulata

• Difrenciación de las subunidades A and B fueron tambien Difrenciación de las subunidades A and B fueron tambien identificadas, comcluyendo que la subunidad A es responsable de la identificadas, comcluyendo que la subunidad A es responsable de la

actividad inmunogenica actividad inmunogenica

500 1000 1500

CCH_A

Ra

ma

n I

nte

nsit

y a

.u.

Wavenumber (cm 1)

CCH_B

CCH_AB

Bacterias genéticamente modificadas para los procesos de Bacterias genéticamente modificadas para los procesos de lixiviación de metales. Los espectros de las membranas lixiviación de metales. Los espectros de las membranas

muestran diferencias según el medio en que se desarrollanmuestran diferencias según el medio en que se desarrollan

• ESPECTROSPÍA RAMAN AMPLIFICADA POR ESPECTROSPÍA RAMAN AMPLIFICADA POR SUPERFICIESUPERFICIE

TEJIDOS HUMANOSTEJIDOS HUMANOS

ONDAS DE CHOQUEONDAS DE CHOQUE

• Nosotros proponemos en términos de hipótesis, que estos procesos Nosotros proponemos en términos de hipótesis, que estos procesos estarían relacionados a aspectos estructurales resultado de cambios estarían relacionados a aspectos estructurales resultado de cambios biomecánicos, originados por las Ondas de Choque.biomecánicos, originados por las Ondas de Choque.

• Las herramientas utilizadas para este estudios son: Espectroscopía Las herramientas utilizadas para este estudios son: Espectroscopía Raman y Raman amplificados por superficie metálica (SERS)Raman y Raman amplificados por superficie metálica (SERS)

PROPOSICIONPROPOSICION

• Sobre la base de los conceptos anteriores, nos proponemos Sobre la base de los conceptos anteriores, nos proponemos a través de la espectroscopia vibracional, dar algunas a través de la espectroscopia vibracional, dar algunas luces acerca de los sistemas biológicos y los mecanismos luces acerca de los sistemas biológicos y los mecanismos que participan en los procesos bioquímicos, como que participan en los procesos bioquímicos, como resultado del tratamiento de ondas de choque en Medicina resultado del tratamiento de ondas de choque en Medicina

RESULTADOSRESULTADOS

• Es fundamental para identificar los espectros de cada Es fundamental para identificar los espectros de cada producto químico, especies que coexisten en la muestra producto químico, especies que coexisten en la muestra biológicabiológica

• Una base de datos con las especies más comunes debe ser Una base de datos con las especies más comunes debe ser construidoconstruido

Estudio Raman Y SERS de Estudio Raman Y SERS de Componentes aisladosComponentes aislados

ColágenoColágeno Aminoacidos: Prolina, Hidroxiprolina, Aminoacidos: Prolina, Hidroxiprolina,

Glicina, Hidroxiglicina, Alanina. Glicina, Hidroxiglicina, Alanina.

¿Por qué Raman y SERS?

Hay bases de datos para las frecuencias de vibraciones Raman pero muy poco para SERS

Primeras Imágenes de tejidos

k = Muestra sin coloide

a = Coloide de Plata preparado con borohidruro b = Coloide de Oro preparado con citrato

c = Coloide de Plata preparado con citrato

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

W a v e n u m b e r ( c m 1 )

a464631 (Counts) b464631 (Counts) c464631 (Counts) k464631 (Counts)

LL = 514 nm

Muestra 46463, biopsia de manguito rotador

a = Coloide de Plata preparado con borohidrurob = Coloide de Oro preparado con citratoc = Coloide de Plata preparado con citratok = Muestra sin coloide

Condiciones:

A = 1T = 10 sL = 25 % SbObj = 50x

FLUORESENCIA

Imágenes muestra 46463

a = Coloide de Plata preparado con borohidruro

Hemos registrado más de 1000 espectros de 52 biopsias preparadas. Hemos registrado más de 1000 espectros de 52 biopsias preparadas. Este espectro muestra que coexisten varios materiales biológicos. Hemos Este espectro muestra que coexisten varios materiales biológicos. Hemos

identificado proteinas, aminoacidos, fosfolipidos y particularmente identificado proteinas, aminoacidos, fosfolipidos y particularmente colageno.colageno.

Las principales diferencias son más bien relacionadas con aspectos conformacionales de proteínas principalmente de colágeno.

• La técnica de inmuno-histoquímica nos dará una La técnica de inmuno-histoquímica nos dará una información adicional sobre el lugar y la información adicional sobre el lugar y la composición de la muestra de tejido. En ese lugar composición de la muestra de tejido. En ese lugar determinado haremos un espectro SERS del ya determinado haremos un espectro SERS del ya reconocido sistema molecular.reconocido sistema molecular.

IIICIICIC

IIIBIIBIB

IIIAIIAIA

¿Como estudiar el colágeno en una matriz tan compleja como un tejido?

•Mapa histologicoMapa histologico

Lo que hemos hecho:Raman Colágeno

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

Colageno Cola de Bovino Sólido

Inte

ns

ity

, a

u

W avenumber,cm 1

Colageno Cola de Rata Sólido

Raman y SERS ColágenoRaman y SERS Colágeno

Raman y SERS ProlinaRaman y SERS Prolina

500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

W avenumber, cm 1

Inte

nsity,

ua

SERS Solución Prolina 10 5 M

Raman Prolina Sólido

Raman y SERS GlicinaRaman y SERS Glicina

Raman y SERS AlaninaRaman y SERS Alanina

Próximos PasosPróximos Pasos

• Construcción de bases de datos con los componentes individuales

•Análisis y asignación de todos los espectros obtenidos.

•Procesamiento estadístico de los datos espectrales

•Maping de tejidos

Por último, estamos aún lejos de Por último, estamos aún lejos de proponer mecanismos bioquímicos proponer mecanismos bioquímicos que expliquen los buenos resultados que expliquen los buenos resultados observados después de aplicar el observados después de aplicar el tratamiento de Ondas de Choquetratamiento de Ondas de Choque

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