Especies reactivas de oxígeno

Abstract (Reactive oxygen species and antioxidantsystems: basic concepts)Molecular oxygen is indispensable for aerobic organisms, asthe final acceptor of electrons derived from the normalcellular metabolism at the end of the mitochondrial respira-tory chain. However, oxygen also is toxic under some con -ditions. The “oxygen paradox” is that oxygen is dangerousto the same life-forms for which it has become an essentialcomponent of energy production.

Oxygen toxicity may be explained by the formation ofreactive oxygen species (ROS) (including oxygen free radi-cals) which may oxidize biological macromolecules whenthere is an excessive ROS production and/or when the anti-oxidant systems are decreased. Excessive ROS production isassociated with several pathological diseases.

This review provides a basic overview of the ROS chemistryand the antioxidant systems and will introduce the reader tothe most important concepts of this broad topic of study.

IntroducciónEl oxígeno molecular (O2) o dioxígeno es uno de los gasesmás importantes de la Tierra. Constituye el 21% de laatmósfera, 89% del peso del agua del mar y al menos el 47%de la corteza terrestre. La atmósfera terrestre está constituidapor los siguientes componentes:

• Nitrógeno: 78.08%• Oxígeno: 20.95%• Argón: 0.93% • Bióxido de carbono: 0.03%• Neón: 0.0018%• Helio: 0.0005%• Criptón: 0.0001%• Hidrógeno: 0.00006%

• Ozono: 0.00004 %• Xenón: 0.000008 %

El oxígeno atmosférico es producido por la oxidación delagua por el complejo de ruptura del agua del fotosistema Ide las células fotosintéticas durante la fase luminosa de lafotosíntesis:

2H2O → O2 + 4H+ + 4e– (1)

En los organismos aerobios el oxígeno es el último aceptorde los electrones en la cadena respiratoria en donde se formaagua. La enzima citocromo c oxidasa, el complejo IV detransporte de electrones, reduce completamente el oxígenoa agua por la adición de cuatro protones y 4 electrones.

O2 + 4H+ + 4e– → 2H2O (2)

A esta reacción también se le conoce como reducción tetra-valente del oxígeno, indicando que este complejo reducecompletamente al oxígeno y no libera especies parcialmentereducidas. Las reacciones 1 y 2 establecen un ciclo entre losorganismos productores y consumidores de oxígeno.

Dado el uso frecuente de los términos oxidación yreducción en esta revisión, éstos se definen en la tabla 1 juntocon los términos agente oxidante y agente reductor

Acoplado al proceso de respiración o consumo de oxí-geno, las células sintetizan la mayor parte del adenosíntrifosfato (ATP) que se requiere para los diversos procesoscelulares. A estos dos procesos acoplados (la oxidación delos acarreadores de electrones reducidos NADH y FADH 2

y el transporte de los electrones hasta el O2 para formar H2Oy la síntesis de ATP a partir del ADP) se le conoce comofosforilación oxidativa.

El oxígeno no sólo se requiere en la respiración; haymuchas enzimas que también lo utilizan. Una lista parcial deestas enzimas se presenta en la tabla 2.

Además el oxígeno juega un papel esencial en la quími-ca de los radicales libres, razón por la cual resulta de impor-tancia definir algunos conceptos básicos para entender laimportancia del mismo no sólo en el proceso respiratoriosino también en el metabolismo celular.

PROFESORES AL DÍA (BIOMEDICINA)

Especies reactivas de oxígeno y sistemas antioxidantes: aspectos básicosNoemí Cárdenas-Rodríguez y José Pedraza-Chaverri*

Autor para recibir correspondencia. Departamento de Biología, Facul-tad de Química, Edificio B, Lab 209, Ciudad Universitaria, UNAM 04510México, D.F. México. Teléfono y fax: (55) 56 22 35 15Correo electrónico: [email protected]: 23 de junio de 2005; aceptado: 2 de agosto de 2005.

Trabajos de revisión deun campo de frontera, demanera que sea utilizablepara la docencia

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Radicales libresUn radical libre ( RL) se define como cualquier especiequímica, ya sea atómica o molecular, capaz de existir inde -pendientemente, que contenga uno o más electrones desa-pareados (que ocupan por sí mismos un orbital molecular oatómico), ya sea por ganancia o pérdida de un electrón deun no radical o por la ruptura homolítica de una molécula:

X → e– + X.+ Radical formado por la pérdida de un electrón de un no radical.

Y + e– → Y.– Radical formado por la ganancia de un electrón de un no radical.

A:B → A + B. Radicales formados por la rupturahomolítica de una molécula.

La presencia de electrones desapareados modifica la reacti-vidad química de un átomo o de una molécula, y suele sermás reactiva que su correspondiente no radical. Sin embar-go, la reactividad química de los diferentes tipos de radicaleslibres es muy variable.

Es importante mencionar que los RL existen comoderivados de muchos elementos o moléculas químicas, y losmás importantes desde el punto de vista biológico son losderivados del oxígeno y del nitrógeno principalmente, aun-que también destacan los derivados del hidrógeno y delcarbono, así como los formados por los metales de transicióncomo el hierro y el cobre, entre otros.

Toxicidad del oxígenoAunque el oxígeno es indispensable para la vida de losorganismos aerobios, a altas concentraciones o bajo ciertascondiciones a la concentración normal llega a ser tóxico. Aeste hecho contrastante se le conoce como la “paradoja deloxígeno”. La toxicidad del oxígeno se puede explicar por laformación de las especies reactivas de oxígeno (ERO). Estasespecies, como posteriormente se explicará, son más reacti-vas que el oxígeno en su estado basal de triplete. Las princi-pales especies son: (a) las que se producen por la ruptura ola excitación del oxígeno (oxígeno atómico, ozono y eloxígeno singulete) y (b) las parcialmente reducidas (anión


Tabla 1. Diferencias entre el proceso de oxidación y el proceso de reducción (Halliwell y Gutteridge, 1999).

Término Definición Ejemplo

Oxidación Proceso químico que implica: • Ganancia de oxígeno

• Pérdida de electrones

C + O2 → CO2 (El átomo de C se oxida a dióxidode carbono).

Na → Na+ + e– (El atómo de Na se oxida al catiónNa con pérdida de un electrón).

Reducción Proceso químico que implica:

• Pérdida de oxígeno

• Ganancia de hidrógeno

• Ganancia de electrones

CO2 + C → 2 CO (El CO2 es reducido a CO mientrasque el C es oxidado a CO).

C + 2H2 → CH4 (El átomo de C es reducido ametano).

Cl + e– → Cl– (El átomo de Cl es reducido al ión Clcon ganancia de un electrón).

Agente oxidante Es un compuesto químico que oxida a otro compuesto, ya seatomándole electrones o hidrógeno o bien adicionándoleoxígeno con su correspondiente reducción.

Agente reductor Es un compuesto químico que reduce a otro compuesto, ya seadonándole electrones o hidrógeno o bien removiéndoleoxígeno con su correspondiente oxidación.

Tabla 2. Algunas enzimas que requieren oxígeno.

Sintasa de óxido nítrico

Hemo oxigenasa

Xantina oxidasa

NADPH oxidasa

Acil CoA desaturasa

Triptofano 2,3 dioxigenasa

Citocromo P450

Escualeno monooxigenasa

Desmolasa

Fenilalanina hidroxilasa

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superóxido, peróxido de hidrógeno y radical hidroxilo)(Hansberg, 2002).

Así, la presencia de las ERO ha sido asociada al procesode envejecimiento, a los daños ocasionados por la isquemia-reperfusión y a una amplia diversidad de estados patológicoscomo la enfermedad de Alzheimer, la artritis reumatoide, lahipertensión, la catarogénesis y la carcinogénesis, entreotros.

ERO: estructura electrónica y formaciónComo ya hemos visto, el oxígeno es indispensable para lavida de los organismos aerobios pero también puede formardiversas ERO, cuya excesiva producción está asociada amuchos desórdenes patológicos.

Debido a lo anterior, es muy importante analizar lasestructuras del oxígeno y la estructura y la formación delas especies reactivas de oxígeno y conocer las más impor-tantes pues a lo largo de esta revisión serán mencionadascontinuamente.

Estructura electrónica del dioxígeno y del oxígeno singuletePara entender la reactividad del oxígeno molecular o dioxí-geno (porque son dos átomos de oxígeno atómico unidos porun enlace covalente, O2), debemos entender su estructuraelectrónica. Una de las características interesantes del oxíge-no es el hecho de que tiene dos electrones desapareados (queno están unidos cada uno con otro electrón) ocupando cadauno de ellos dos diferentes orbitales moleculares externos(en el orbital π* —pi antienlace— ver tabla 3). Este tipo deestructura es llamado estado basal o estado triplete y significaque el oxígeno es un birradical, pues los radicales sonusualmente más reactivos tratando de encontrar otro elec-trón con quien establecer un par (recordando que un RL pordefinición tiene al menos un electrón desapareado). Sinembargo, como se observa en la tabla 3, el dioxígeno poseeestos dos electrones en giro paralelo (el espín nuclear —re-presentado por la punta de la flecha— se encuentra hacíaarriba) y esto le dificulta tomar dos electrones libres con giroantiparalelo (donde el espín nuclear —representado por lapunta de la flecha— se encuentra hacia bajo) a la vez, por ellosólo puede recibir estos electrones de uno en uno para cadaorbital molecular externo. Esto explica por qué en su estadobasal y a temperatura ambiente el oxígeno reacciona muypoco, a pesar del hecho de ser un birradical.

A la adición sucesiva de electrones a la molécula deoxígeno se le conoce como reducción univalente (reacción3) y esto produce especies parcialmente reducidas de oxíge -no. Esto contrasta con la reducción tetravalente del oxígenocatalizada por la citocromo oxidasa en donde no se producenestas especies parcialmente reducidas.

Cuando uno de los electrones desapareados del oxígeno

absorbe energía e invierte su rotación (giro), se forma eloxígeno singulete (1O2). Existen dos formas del oxígenosingulete: la sigma (Σ) que es un radical libre, debido a queconserva los dos electrones desapareados en los orbitalesmoleculares externos 2π* (cada electrón en un orbital) comoen el caso del dioxígeno, la diferencia radica en que unelectrón tiene giro paralelo y otro electrón tiene giro antipa-ralelo, y la delta (Δ), la cual también posee dos electrones,aunque en este caso se encuentran apareados en un soloorbital 2π*, por lo que no es un radical libre (de acuerdo conla definición de RL no posee ningún electrón desapareado,por ello ya no se considera radical). El oxígeno singulete ensu forma Σ posee una energía de 37.5 kcal, mientras que en suforma Δ es de 22.4 kcal. La forma Σ es muy inestable y porello en los sistemas biológicos sólo tiene importancia elsegundo. En la tabla 3 se puede observar la configuraciónelectrónica del dioxígeno, oxígeno singulete y del aniónsuperóxido.

Formación de las ERO

La expresión “especies reactivas de oxígeno” es un términocolectivo que involucra no sólo los RL derivados del oxíge-no, sino también a los no radicales derivados de la reducciónmolecular del oxígeno, y que además son muy reactivos,como el H2O2 y el ácido hipocloroso (HOCl). En la tabla 4se presenta una lista más completa de radicales y no radicales

Oxígeno singulete: Como ya vimos anteriormente, existendos formas, la sigma Σ y la delta Δ, y que es la primera la quees un RL. Esta especie se forma por la inversión en el espínde uno de los electrones desapareados de uno de los orbitalesmoleculares externos de la molécula de oxígeno (recordan-do que un electrón tiene un giro paralelo en un orbital y otroelectrón tiene un giro antiparalelo en otro orbital), como seexplicó anteriormente.


Tabla 3. Configuración electrónica de algunas moléculas deoxígeno diatómico en el orbital 2π*

Especie de oxígeno Configuración electrónica en el orbital 2π*

Dioxígeno (O2)

Oxígeno singulete (1O2)

forma 1 Σ

forma 1Δ

Superóxido (O2.–)

↑ ↑

↑↓

↑ ↓↑↓

+e– +e– +e– +e–

O2 → O2⋅— → H2O2 → OH⋅ → H2O (3)

Dioxí- Anión Peróxido de Radical Aguageno superóxido hidrógeno hidroxilo


De la misma forma, la formación de oxígeno singuletees llevada a cabo por fagocitos activados, los cuales soncélulas que forman parte del sistema inmunológico de losseres vivos (por ejemplo los monocitos y macrófagos), y queson estimuladas cuando ya existe o hay posibilidad de dañoa las células (como bien sería la inhalación o consumo decompuestos tóxicos y/o colonización bateriana) pues liberanenzimas tal como proteasas y ERO para combatir este daño.A continuación se muestran algunas de las reacciones deproducción de esta ERO (Eberhardt, 2001):

2O2.– + 2H+ → H2O2 + 1O2 (4)

HOCl + H2O2 → HCl + H2O + 1O2 (5)

OCl– + H2O2 → H2O + Cl– + 1O2 (6)

Anión superóxido: La formación del radical superóxidoocurre por la reducción univalente del oxígeno; es decir,cuando el oxígeno acepta un electrón, reacción que se puedellevar a cabo después de varios eventos. Esta especie esrelativamente inestable y se encuentra en equilibrio con suácido conjugado, el radical hidroperoxilo. El anión super -óxido tiene una función importante in vivo, ya que participaen la descarga respiratoria (aumento súbito del consumo deoxígeno) de las células fagocíticas activadas por contacto conpartículas extrañas en los eventos inmunológicos. Cuandoestas células se activan, el complejo enzimático NADPH(forma reducida de nicotinamida adenín dinucleótido fosfa-to) oxidasa, localizado en la membrana citoplasmática, re-duce parcialmente el oxígeno de la siguiente forma:

NADPH oxidasa

2O2 + NADPH + H+ → O2.– + NADP+ + 2H+ (7)

De la misma forma, la xantina oxidasa (XO) es capaz dereducir la molécula de oxígeno para dar el anión radicalsuperóxido de acuerdo a la siguiente reacción:

XO

Xantina + O2 + H2O → Ácido úrico O2.– + H+ (8)

Peróxido de hidrógeno: El peróxido de hidrógeno es for -mado por la enzima superóxido dismutasa SOD). Aunque noes un radical libre, tiene una gran lipofilicidad que le permiteatravesar las membranas celulares y reaccionar con el aniónsuperóxido en presencia de metales de transición, paragenerar el radical hidroxilo. Por esta razón se le consideraun oxidante importante en las células de los organismosaerobios.

SOD2O2

.- + 2H+ → O 2 + H2O2 (9)

Un grupo de flavoenzimas localizadas en el retículo endo-plasmático del hígado y el riñón son importantes en elmetabolismo de los aminoácidos y producen peróxido dehidrógeno, de acuerdo con las reacciones (Eberhardt, 2001):

D-aminoácido + H2O + E-FAD → α-cetoácido + NH 3 + E-FADH2

E-FADH2 + O2 → E-FAD + H2O2

L-aminoácido + H2O + E-FMN → α-cetoácido + NH3

+ E-FMNH2

E-FMNH2 + O2 → E-FMN + H2O2 (10)

Radical hidroxilo: El radical hidroxilo es considerado unade las especies oxidantes más dañinas por su vida mediacorta y alta reactividad, y suele actuar en los sitios cercanosa donde se produce. La formación del radical hidroxilopuede lograrse fácilmente por la reacción de Haber-Weissentre el anión superóxido y el peróxido de hidrógeno cata -lizada por un metal de transición (Halliwell y Gutteridge,1999).

Fe2+/Fe3+O2

.– + H2O2 → O2 + OH– + OH⋅ (11)

La reacción (11) es la suma de la reacción de Fenton(reacción 12) y de la reacción (13):

Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH – + OH. (12)

Fe3+ + O2.– → Fe2+ + O2 (13)

Ahora bien, el radical hidroxilo también se puede for-mar a partir del ácido hipocloroso:

HOCl + O2.– → OH. + Cl– + 1O2 (14)

Anión peroxinitrito (ONOO–): Este anión puede formarsepor la combinación del radical óxido nítrico (NO .) y O2

.–:

NO⋅ + O2⋅— → ONOO– (15)

El ONOO– es un potente oxidante que induce nitraciónde tirosina, lipoperoxidación y citotoxicidad. Se ha encon-


Tabla 4. Especies reactivas de oxígeno.

Radicales No-radicales

Superóxido (O2⋅ —) Oxígeno singulete (1O2) forma1Δ

Hidroxilo (OH⋅) Peróxido de hidrógeno (H2O2)

Peroxilo (RO2⋅) Ozono (O3)

Alcoxilo (RO⋅) Anión peroxinitrito (ONOO–)

Hidroperoxilo (HO2⋅) Ácido hipocloroso (HOCl)

Ácido hipobromoso (HOBr)

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trado involucrado en varios estados patológicos (Chirino,Hernández-Pando y Pedraza-Chaverrí, 2004). Un exceso enla producción de O2

.– puede contrarrestar los efectos vasodi-latadores del NO. (por medio de la reacción 15) induciendovasoconstricción.

Ácido hipocloroso: Las peroxidasas son un grupo de enzi-mas que remueven el peróxido de hidrógeno para oxidar aotro sustrato. Una peroxidasa, en este caso, la mielo-peroxi-dasa (MPO), presente en altas concentraciones en los gránu-los de los neutrófilos, cataliza la conversión de peróxido dehidrógeno a ácido hipocloroso de acuerdo a la siguientereacción:

MPOCl– + H2O2 → HOCl + OH– (16)

La MPO también cataliza la oxidación de los iones Br–,I– y SCN–.

El sistema MPO-H2O2-Cl– ha sido estudiado amplia-mente, porque la reacción de ácido hipocloroso y peróxidode hidrógeno puede producir oxígeno singulete (Eberhardt,2001).

Ozono: El ozono (O3) es un gas triatómico de color azulpálido y constituye una capa protectora de la radiación solaren la atmósfera superior. El ozono es producido por lafotodisociación de la molécula de oxígeno lo que genera dosátomos de oxígeno monoatómicos, los cuales posteriormen-te reaccionan con el dioxígeno. Energía solar

O2 → 2OO2 + O → O3 (17)

Sin embargo, el ser humano también está expuesto alO3 pues éste se puede formar por las reacciones fotoquímicasentre los óxidos de nitrógeno y los hidrocarburos. Ya que esun poderoso agente oxidante puede producir inflamación ydaño pulmonar.

Hidroperoxilo: Este radical es formado cuando se lleva acabo la dismutación espontánea del superóxido, y esto ocu-rre sólo cuando uno de los dos superóxidos se protona.

Peroxilo, alcoxilo: Estos radicales se forman durante laruptura de los peróxidos orgánicos y durante la reacción deradicales con átomos de carbono con oxígeno (RO2

.)

Efectos de las ERO sobre las macromoléculasbiológicasEn los organismos aerobios, la producción de ERO estácontrolada por los mecanismos antioxidantes de defensa(como posteriormente se describirán). Sin embargo, esteequilibrio se pierde cuando hay una excesiva producción deERO o una deficiencia de los mecanismos antioxidantes loque conlleva a daños a las moléculas. Muchas de estas

moléculas deben ser reparadas (tal como el ADN) o inclusoreemplazadas (tal como muchos tipos de proteínas oxida-das). Así, por ejemplo, algunas proteínas en cuya estructurase encuentra el grupo prostético hierro-azufre (Fe-S) impor -tantes para el metabolismo de E. coli pueden ser dañadas porla niveles de 0.1-0.2 μM de O2

.– (Halliwell y Gutteridge,1999).

De acuerdo con lo anterior, es importante dar un pano-rama general sobre el daño oxidativo de las ERO a lasmacromoléculas biológicas más abundantes: ADN, lípidos yproteínas, por el papel tan importante que desempeñan enel organismo, recordando que en forma principal el ADNconstituye el material genético, los lípidos son una rica fuentede energía durante el ayuno y las proteínas tienen funciónestructural, entre muchas otras.

Efectos sobre los ácidos nucleicosLas ERO dañan al ácido desoxirribonucleico (ADN) al reac-cionar con las bases nitrogenadas y con la desoxirribosa. Eldaño oxidativo al ADN es de extrema importancia, debidoa que las bases nitrogenadas dañadas pueden generar muta-ciones que a su vez pueden resultar en carcinogénesis,apoptosis, necrosis y aun enfermedades hereditarias. Enrelación con esto, se han detectado más de 20 tipos demodificaciones estructurales de las bases. Se ha observadoque en presencia de las ERO se fragmenta el ADN y aparecenfragmentos internucleosomales, formados por la ruptura deADN entre los nucleosomas (estructuras fundamentales parala organización del ADN dentro de los cromosomas), ocasio-nando con ello problemas en la compactación y enrolla -miento del ADN dentro de la cromatina y con ello, alteracio-nes en las propiedades funcionales de la misma cromatina,la cual juega un papel importante en la regulación de latranscripción génica.

Existen mecanismos de reparación del ADN que seactivan en el momento en que éste sufre modificacionesoxidativas. Cuando las ERO alcanzan el núcleo o se generandentro de este por reacción de Fenton, estos mecanismos dereparación funcionan de manera eficiente, ya que continua-mente revisan que exista una adecuada secuencia de basesen la molécula de ADN y en caso de existir alguna mutación(ya sea ruptura, entrecruzamiento o eliminación de bases)reparan el daño causado. Se ha reportado que el mecanismode reparación por escisión de bases es el más importante enel caso de la modificación oxidativa. Cuando la modificaciónafecta regiones más extensas del ADN, actúa el sistema dereparación por escisión de nucleótidos, removiendo todo elsegmento dañado a través de una nucleasa, para ser reem-plazado por la ADN polimerasa I y la ligasa.



Efectos sobre los lípidosEl efecto principal de las ERO sobre los lípidos es la lipope-roxidación, que se produce al contacto con los lípidos de lasmembrana con un agente oxidante, como cualquiera delas ERO. En esta reacción el radical libre formado oxida unacadena insaturada de lípido, dando la formación de un lípidohidroperoxidado y un radical alquilo. El alquilo reaccio-na con una molécula de oxígeno y regenera la especie inicial,constituyendo una reacción que se repite. Esta lipoperoxi-dación trae como consecuencia alteraciones en la estructurade la membrana, afectando su fluidez y provocando daño ensu integridad. La peroxidación de los lípidos genera especiescomo el malondialdehído y el 4-hidroxi-2-nonenal, los cualesson considerados como citotóxicos, ya que pueden funcionarcomo agentes electrofílicos capaces de interactuar con otros com-ponentes celulares, principalmente proteínas y ADN. Cabemencionar que la lipoperoxidación es un proceso identificadoen enfermedades cardiovasculares. Uno de los procesos impor-tantes es la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad,efecto que se ha correlacionado con la aterosclerosis.

Efectos sobre las proteínasUno de los aspectos más críticos del estrés oxidativo es eldaño causado a las proteínas, debido a que puede causar lapérdida de la actividad catalítica de enzimas, daños enla integridad de proteínas estructurales o interrumpir la re -gulación de las vías metabólicas. A diferencia de los ácidosnucleicos, los sistemas de reparación de las proteínas sólo selimitan a los residuos de metionina, por lo que las proteínasoxidadas deben ser hidrolizadas para evitar su difusión en lared metabólica o su interacción con otras proteínas.

Los efectos de las ERO sobre las proteínas son: la oxidaciónde residuos de los aminoácidos, el rompimiento de los e lacespeptídicos y la agregación entre proteínas. Se ha vinculadouna amplia diversidad de enfermedades con la presencia delas proteínas oxidadas, algunas de ésas son: la enfermedadde Alzheimer, la artritis reumatoide y la catarogénesis.

Estrés oxidativoPor diversas causas puede perderse el balance entre condi -ciones oxidantes y defensas antioxidantes. Lo anterior puededeberse a un aumento en la producción de ERO o bien, ouna disminución en los sistemas antioxidantes o de repara-ción, o a una combinación de estos factores. A tal condiciónse le denomina estrés oxidativo. En esta situación se presen-tan daños de las macromoléculas por el rompimiento omodificación de su estructura, trayendo como consecuenciauna alteración en la función o incluso, la muerte de la célula.

El estudio del estrés oxidativo ha cobrado considerableimportancia debido a las consecuencias que puede tener enla salud. También se ha observado que diversos factores

ambientales, como los contaminantes en el aire y la radiaciónionizante pueden favorecer el desbalance oxidante/antioxi-dante. En la clínica se han desarrollado diversos métodospara evaluar las condiciones de estrés oxidativo basados enla acumulación de productos oxidados (tabla 5).

Mecanismos antioxidantes de defensa anivel celular y extracelularUn antioxidante es cualquier sustancia que a bajas concen -traciones, comparado con el sustrato oxidable, retarda opreviene significativamente la oxidación de ese sustrato. Losantioxidantes se pueden clasificar de la siguiente manera(Halliwell y Gutteridge, 1999):

(a) Agentes que catalíticamente remueven los RL y a otrasespecies reactivas. Ejemplos: enzimas SOD, catalasa, pero-xidasas y antioxidantes específicos para el grupo tiol.

(b) Proteínas que abaten la disponibilidad de los prooxidan -tes tal como los iones de hierro o cobre, y el grupo hemo.Ejemplos: ferritina, transferrina, haptoglobinas, hemo-pexina y metalotioneína. Esta clasificación incluye pro-teínas que oxidan el ion ferroso, como la ceruloplas-mina. La ferritina es una proteína intracelular quealmacena hierro. La transferrina transporta hierro en losfluidos extracelulares.

(c) Proteínas que protegen biomoléculas contra el daño(incluyendo estrés oxidativo) por otros mecanismos.Ejemplo: proteínas de choque térmico localizadas enretículo endoplásmico, periplasma y citoplasma. Tienencomo función la estabilización y cobertura de la estruc-tura proteica parcialmente plegada.

(d) Agentes de bajo peso molecular que atrapan ERO y ERN(Especies reactivas de nitrógeno). Ejemplos: glutatión,α-tocoferol, bilirrubina y ácido úrico. Algunos agentes

Tabla 5. Algunos marcadores de estrés oxidativo.

Determinación Fundamento

Niveles plasmáticos demalondialdehído

El malondialdehído se forma comoproducto de la lipoperoxidación. A travésde su reacción con el ácido tiobarbitúricose forma un derivado cuantificable porcolorimetría.

Alcanos exhalados La oxidación de los ácidos grasosinsaturados presentes en las membranasda como productos alcanos como eletano, el propano y el pentano.

Grupos carbonilo en elplasma

Se cuantifican por colorimetría, a travésdel producto de reacción entre la 2,4-dinitrofenilhidrazina y los gruposcarbonilo generados por oxidación debiomoléculas.

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antioxidantes de bajo peso molecular que provienen dela dieta, especialmente la vitamina C y el α-tocoferol,están íntimamente relacionados con la nutrición y ladefensa antioxidante.

Debido a que la producción de ERO ocurre espontáneamen-te en los organismos aerobios, se hace necesario la presenciade un sistema de defensa que contrarreste los efectos oxidan-tes de estas especies. Este sistema de defensa para su poste -rior explicación puede ser dividido en dos partes: Agentesantioxidantes de alto peso molecular y agentes antioxi-dantes de bajo peso molecular. A continuación, se dan susprincipales características:

Agentes antioxidantes de alto peso molecular

Superóxido dismutasa (SOD): Cu-Zn SOD y Mn SOD

Es una enzima que se encuentra en el citoplasma (Cu-ZnSOD), mitocondria (Mn-SOD) y en el fluido extracelular(Cu-Zn SOD).

La SOD cataliza la conversión del anión superóxido aperóxido de hidrógeno:

2O2.– + 2H+ → H2O2 + O2 (18)

Catalasa (CAT)Esta enzima se encuentra en las mitocondrias y los peroxiso-mas, y cataliza la reducción del peróxido de hidrógeno a agua:

2H2O2 → 2H2O + O2 (19)

Cabe mencionar que esta enzima también tiene activi-dad de peroxidasa:

H2O2 + RH2 → 2H 2O + R (20)

Glutatión peroxidasa (GPx)Es una selenoenzima presente en varias isoformas, entre lasque se encuentran la GPx citosólica, la GPx plasmática yla GPx de fosfolípidos. Es posible encontrarla en citoplasma,mitocondria y membrana plasmática. Esta enzima catalizala reducción de peróxidos empleando dos moléculas deglutatión reducido (GSH). Los productos de la reacción sonel glutatión oxidado (GSSG) y el agua.

H2O2 + 2GSH → GSSG + H2O (21)

ROOH + 2GSH → GSSG + ROH + H2O (22)

Glutatión reductasa (GRs)Es una enzima que se encuentra en citoplasma y tiene a lacoenzima FAD en su sitio activo. Esta enzima cataliza lareducción de GSSG empleando la coenzima NADPH:

GSSG + NADPH + H+ → NADP+ + 2GSH (23)

Aparentemente el NADPH reduce el FAD, el cual trans-fiere dos electrones a la unión disulfuro (—S—S—) entre dosresiduos de cisteína del sitio activo. Los dos grupos —SHformados interactúan entonces con el GSSG reduciéndolo ados moléculas de GSH.

Glutatión S-transferasa (GST) Hasta el momento se han encontrado las isoformas GSTcitosólicas y GST microsomales. Las GST citosólicas estándivididas en cuatro familias principales: α, μ, π y θ, y encuatro familias minoritarias: ζ, σ, κ y ω). Las GST citosólicasestán constituidas por dos subunidades proteínicas idénticas,mientras que las GST microsomales son trímeros (Sharma,Yang, Sharma, Awasthi y Awasthi, 2004)

Su función primaria es catalizar la conjugación de GSHcon una gran cantidad de compuestos orgánicos ( RX). Lareacción general de esta enzima es:

RX + GSH → RSG + HX (24)

Se ha demostrado que las GST pueden reducer hidrope-róxidos de lípidos por medio de una actividad de glutatiónperoxidasa independiente de selenio y que estas enzimastambién pueden detoxificar al 4-hidroxinonenal un produc-to de la peroxidación de lípidos.

Tiorredoxina (Trx)Es un polipéptido con un peso molecular de 12 kDa, espe -cialmente distribuido en el retículo endoplásmico (Nakamu-ra, 2005). Esta proteína contiene dos grupos tiol adyacentesen su forma reducida (SH) que se pueden oxidar a su formadisulfuro (S2 o S—S):

Trx-(SH)2 + proteína-S2 → Trx-S2 + proteína-(SH)2 (25)

De acuerdo con la reacción anterior, la Trx puede suplirlos electrones en diversas reacciones de óxido-reducción, dela misma manera puede reaccionar directamente con elperóxido de hidrógeno. Por estas razones se considera quela Trx es una proteína antioxidante.

Trx-(SH)2 + 2H2O2 → Trx-S2 + 2H2O + O2 (26)

Tiorredoxina reductasa (TrxR)Es una selenoproteína que contiene en su penúltimo carbonoun residuo de selenocisteína, necesario para su actividadcatalítica. Existen dos isoformas: la TrxR1 citosólica y laTrxR2 mitocondrial, razón por la cual se ubica principalmenten el citosol y la mitocondria (Nordberg y Arner, 2001). Lasdos isoformas son homodiméricas con u FAD por subunidad,el cual reduce el grupo disulfuro del sitio activo. Su función



es catalizar la reducción del polipéptido tiorredoxina (Trx):

Trx-S2 + NADPH + H+ → NADP+ + Trx-(SH)2 (27)

Peroxirredoxinas (Prxs)Este grupo de enzimas se caracteriza por poseer residuos decisteína en su centro catalítico, lo cual las identifica comoenzimas antioxidantes específicas para el grupo tiol. Losgrupos cisteínas son oxidados a ácido sulfénico en formareversible por los sustratos de estas enzimas (peróxidos).Están subdivididas en tres subclases: Prx 2-cisteína típica(Prx I-IV), Prx 2-cisteína atípica (Prx V) y Prx 1-cisteína (PrxVI). Su localización varía en función de la subclase. Suelenencontrarse en el citoplasma, peroxisoma y mitocondria (PrxI y V), núcleo y citoplasma (Prx II), citoplasma y lisosomas(Prx IV), mitocondria (Prx III), citoplasma (Prx VI) (Im-menschuh y Baumgart-Vogt, 2004).

Están envueltas en la degradación enzimática de peró-xido de hidrógeno, hidroperóxidos y peroxinitrito, por lotanto, las Prxs asumen un papel importante contra el estrésoxidativo.

Prx (–SH)2 + 2H2O2 → Prx –S2 + 2H2O + O2 (28)

La tiorredoxina puede regenerar la forma reducida de las Prx

Prx– S2 + Trx-(SH)2 → Prx (—SH)2 + Trx-S2 (29)

Hemo oxigenasa (HO)Esta enzima está presente en dos isoformas: una constitutiva(HO-2) y una inducible (HO-1). Se localiza en el retículoendoplásmico. La HO cataliza el paso limitante de la degra-dación del grupo hemo proveniente de las hemoproteínas,produciendo biliverdina, monóxido de carbono y hierro. Labiliverdina es reducida a bilirrubina por la biliverdina reduc-tasa (BR) (Barrera y cols., 2003).

HO

Hemo + O2 + NADPH + H+ → Biliverdina + CO + Fe + NADP+

BR

Biliverdina + NADPH → Bilirrubina + NADP+ (30)

La expresión de HO-1 aumenta en respuesta a muchosagentes que inducen estrés oxidativo como lo es el mismogrupo hemo. La actividad antioxidante de la HO-1 se puedeexplicar, al menos en parte, por el hecho de que esta enzimadegrada a un prooxidante (grupo hemo) y genera un com-puesto con actividad antioxidante (biliverdina) el cual estransformado a otro antioxidante (bilirrubina).

Agentes antioxidantes de bajo peso molecularEn la tabla 6 se muestran algunas de las principales caracte-rísticas de antioxidantes de bajo peso molecular. Es impor-tante señalar que tanto la vitamina C como la vitamina E sonobtenidos de la dieta. De la misma manera, se conocen otrosantioxidantes que son obtenidos también de algunos alimen-tos, principalmente frutas y verduras, y que contribuyen aprevenir el estrés oxidativo, por ejemplo compuestos caro-teneoides como el licopeno, la luteína y el β-caroteno ycompuestos fenólicos como los flavonoles, flavonas, flavo-nonas, antocianidinas, y fenilpropanoides

Determinación de ERO: radical superóxido y peró xidode hidrógeno (Tarpey, Wink y Grisham, 2004)A lo largo de esta revisión ha quedado de manifiesto laimportancia de los RL y ERO. Es importante destacar queno todas las ERO aumentan necesariamente en un procesooxidativo o en un estado patológico. Por lo tanto es impor -tante precisar cuál o cuáles son las ERO que están involucra-


Tabla 6. Características generales de algunos compuestos de bajo peso molecular que integran al sistema antioxidante (Halliwell y Gutteridge, 1999).

Compuestos hidrosolubles Compuestos liposolubles

Vitamina C. También se conoce con el nombre de ácido ascórbico. Selocaliza en el citosol y en los fluidos extracelulares. Tiene lacapacidad de aceptar electrones y reaccionar directamente con elanión superóxido y el radical hidroxilo.

Vitamina E: La isoforma más abundante es el α-tocoferol. Es elantioxidante más distribuido en los seres vivos. Se encuentra en lasmembranas biológicas y tiene la capacidad de interrumpir lalipoperoxidación en la fase de propagación.

Glutatión. El glutatión reducido protege los grupos sulfhidrilo de lasproteínas de la acción antioxidante de los RL y tiene la capacidad dereaccionar con el peróxido de hidrógeno, el anión superóxido y elradical hidroxilo.

Vitamina A: Se encuentra en las membrana se impide lalipoperoxidación al reaccionar principalmente con el 1O2 y el OH..

Ácido úrico. Es producto final del metabolismo de las purinas en losprimates y funciona como un buen atrapador de RL. Cuando el ácidoúrico reacciona con ERO (RO2

., OH., O3, NO2. y 1O2) se generan

alantoína, ácidos cianúrico y parabénico y otros productos. Además,algunos informes sugieren que el ácido úrico forma complejos conlos metales de transición cuando interacciona con el ascorbato.

Bilirrubina. Es el producto de degradación del grupo hemo enmamíferos; su precursor es la biliverdina. Es un poderoso atrapadorde radicales peroxilo y de 1O2. La bilirrubina unida a la albúminaprotege a esta última molécula contra el daño por RL.

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das en algún proceso oxidativo o enfermedad. Dicha infor -mación es importante para conocer más a fondo el mecanis-mo del daño y puede ser muy importante para tratar deestablecer una terapia con un antioxidante que neutralicedicha ERO con el propósito de detener el daño oxidativo.Esto es importante en el contexto de que no se conoce aúnun antioxidante “universal” que prevenga todo tipo de dañooxidativo. Algunos de estos métodos descritos a continua-ción para identificar a alguna ERO, también pueden serusados para estudiar y caracterizar el potencial antioxidantede alguna sustancia o extracto. Por lo anterior es importan -te contar con métodos que nos permitan identificar y cuan -tificar dichas especies.

Detección del superóxido

Reducción del citocromo cEste método se basa en la reducción de ferricitocromo c (Fe3+ citc) a ferrocitocromo c (Fe2+ cit c) razón por la cual ha sido utili-zado para medir el tiempo de formación del superóxido pornumerosas enzimas, células y tejido vascular. La reacción es:

Fe3+ cit c + O2– → Fe2+ cit c + O2 (31)

La reducción del citocromo se cuantifica espectrofoto-métricamente a 550 nm, utilizando un coeficiente de extin-ción molar para el ferricitocromo c de 0.89 × 104 M—1/cm—1.

Inhibición de aconitasaLas alteraciones en la actividad de la aconitasa han sidoutilizadas como un indicador sensible de los cambios en laactividad del superóxido in vivo e in vitro. La aconitasa catalizala interconversión de citrato a isocitrato y está presente tantoen el citosol como en la mitocondria. El superóxido, inactivaa la aconitasa debido a la oxidación seguida por la pérdidareversible de hierro (el cual es el cofactor de la enzima); porlo tanto, con la formación de superóxido, una fracción de laaconitasa en algún momento es inactiva, pero capaz de reacti-varse, así la relación de aconitasa inactiva/aconitasa activaes un indicador de la producción de superóxido.

Oxidación de hidroetidinaLa hidroetidina (HE) es un compuesto permeable a lascélulas que puede transferir dos electrones al superóxidoprovocando la oxidación de la hidroetidina. La reacción esrelativamente específica para superóxido, con una mínimaoxidación del compuesto inducida por la presencia de peró-xido de hidrógeno o ácido hipocloroso. La oxidación intra-celular de HE a etidio por el superóxido puede analizarsepor citometría de flujo en suspensiones celulares y pormicrofluorometría in vivo en cortes de tejidos y sangre.

Reacciones de quimioluminiscenciaLos métodos de quimioluminiscencia para la detección desuperóxido han sido frecuentemente empleados porque sonpotencialmente accesibles a los sitios intracelulares donde esgenerado este radical, por lo cual son altamente específicos.El compuesto quimioluminiscente utilizado más ampliamen-te es la lucigenina, aunque ya se han desarrollado otroscompuestos como la coelenterazina y el 2-metil-6-[4-metoxi -fenil]-3,7-dihidroimidazo[1,2-α] pirazin-3-ona (MCLA) que seutilizan para medir la formación de superóxido en neutrófi-los, macrófagos, cultivos celulares y tejido vascular

Resonancia del espín electrónico y atrapamiento del espínLa espectroscopía por resonancia de electrón-espín (RES)también conocida como Resonancia paramagnética electró-nica (RPE), es un método analítico que permite la deteccióndirecta de los radicales libres. Cabe mencionar de manerageneral, que esta técnica se basa en las propiedades magné-ticas de los electrones no apareados y su ambiente molecular.Los electrones desapareados pueden existir en dos orienta -ciones en paralelo o antiparalelo con respecto al campomagnético aplicado; por ello es posible observar diferenciasde energías en los estados correspondientes a la región demicroondas del espectro electromagnético; así se puedendiferenciar especies tal como el NO ⋅, superóxido y radicalhidroxilo en sistemas biológicos en bajas concentraciones.

Detección de peróxido de hidrógeno

Ensayos ligados a peroxidasa de raíz fuerte (HRP)Estos ensayos dependen de la oxidación de un compuestodonador de átomos de hidrógeno. Así, bajo la presencia deperóxido de hidrógeno, los donadores de átomos de hidró-geno son oxidados por la HRP:

HRP + H2O2 → HRP-H2O2 (Compuesto 1)

HRP-H2O2 + AH2 → HRP + 2H2O + A (32)

La cantidad de peróxido de hidrógeno presente se midepor la disminución de la fluorescencia de un compuestofluorescente como la escopoletina, o bien observando elaumento de la fluorescencia de un donador de átomos dehidrógeno, previamente no fluorescente, como la diacetildi-clorofluoresceína, p-hidroxifenilacetato, ácido homovainílli-co y el rojo de fenol.

Fluorescencia de la diclorofluoresceínaLa oxidación de la 2-7-diclorofluorescína (DCFH) al com-puesto fluorescente 2-7- diclorofluoresceína oxidada (DCF)por la presencia de peróxido de hidrógeno, permite utilizaresta reacción como indicador específico de la formación de



esta especie reactiva. Este método se utiliza ampliamente enla detección de peróxido de hidrógeno en neutrófilos. Lafluorescencia producida por la DCF se mide a 498 nm deexcitación y 522 nm de emisión.

Inhibición de la catalasa por el aminotriazolEl aminotriazol es un inhibidor irreversible de la catalasa,que reacciona con el complejo intermediario H2O2-catalasa,por ello inhibe a la catalasa sólo en presencia de peróxidode hidrógeno; de ahí que esta reacción pueda utilizarse comoindicador de la presencia de H2O2.

ConclusionesLas ERO son producidas continuamente en nuestro organis-mo como parte del metabolismo celular. Nuestras célulasestán equipadas con sistemas antioxidantes de defensa quele permiten mantener en bajas concentraciones dichas espe-cies y así evitar el daño oxidativo sobre las macromoléculasbiológicas. La excesiva producción de ERO por los fagocitosjuega un papel fisiológico muy importante en la proteccióndel organismo contra muchas infecciones. Así, las EROconstituyen verdaderas armas químicas para la destrucciónde los agentes infecciosos. Sin embargo, cuando se pierde elequilibrio oxidante-antioxidante y se genera estrés oxidativose dañan macromoléculas esenciales para llevar a cabo lasfunciones normales de una célula lo cual se puede traduciren diversos procesos patológicos.

Algunos ejemplos de patologías asociadas al estrés oxi-dativo que aquejan al ser humano y que actualmente se hanvuelto tan comunes son: artritis reumatoide, aterosclerosis,diabetes, cáncer, hipertensión, enfermedades neurodegene-rativas como Alzheimer y Parkinson, degeneración de laretina, etcétera. Dado que es muy difícil de evitar el estrésoxidativo con la vida actual que llevamos donde en lasgrandes ciudades predominan factores que agravan o inclusoinducen el estrés oxidativo (por ejemplo, contaminantes delaire y radiaciones) es necesario seguir estudiando la activi-dad de muchas sustancias que ya se conocen por tenerpropiedades antioxidantes e incluso fomentar su consumo(por ejemplo aquellas que se encuentran en frutas, verdurasy algunas plantas) ya que en muchos casos una dieta pobreen antioxidantes contribuye al daño oxidativo. �

AgradecimientosEste trabajo fue posible gracias a los donativos del ConsejoNacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt, 40009-M) y dela Dirección General de Asuntos del Personal Académico(DGAPA, PAPIIT IN227103) de la UNAM.

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Bibliografía recomendadaHansberg, W., La biología del dioxígeno en singulete, TIP

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Especies reactivas de oxígeno

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