Esame standard del liquido seminale e rivisitazione delle conclusioni raggiunte nella Consensus...

Esame del liquido seminale

WHO 1999

WHO 2009 Loredana Gandini

Master Medicina della Riproduzione

Abano 25-27 / 03/ 2009

1980

1987

1992

1999

2009

WHO Laboratory manual for the examination and processing of human semenWHO Laboratory manual for the examination and processing of human semen

Chapter 1 Chapter 1 IntroductionIntroduction

Part IPart I Semen analysisSemen analysisChapter 2Chapter 2 Standard proceduresStandard proceduresChapter 3Chapter 3 Optional proceduresOptional proceduresChapter 4Chapter 4 Research proceduresResearch procedures

Part IIPart II Sperm preparationSperm preparationChapter 5Chapter 5 Sperm preparation techniquesSperm preparation techniquesChapter 6Chapter 6 Cryopreservation protocolsCryopreservation protocols

Part IIIPart III Quality AssuranceQuality AssuranceChapter 7Chapter 7 Quality Assurance and ControlQuality Assurance and Control

Part IVPart IV AppendicesAppendices

WHO 2009

……with some changeswith some changesNew FormatNew Format

Detailed methodsDetailed methods - minimal cross reference to other sections- minimal cross reference to other sectionsNotesNotes - explanations of methodology- explanations of methodologyCommentsComments - interpretation of results- interpretation of resultsBoxesBoxes - additional explanatory material- additional explanatory material

New ChapterNew ChapterCryopreservationCryopreservation

New AppendixNew AppendixMicroscopyMicroscopy

Reference ranges for semen parameter variablesReference ranges for semen parameter variablesFrom fertile men with TTP From fertile men with TTP <<12 months12 months

……much remains as in WHO 1999:much remains as in WHO 1999:Old conceptsOld concepts

Standard - robust procedures for routine variablesStandard - robust procedures for routine variablesOptional - may be used in certain situations / by choice of instituteOptional - may be used in certain situations / by choice of instituteResearchResearch- tests that are not considered routine- tests that are not considered routine

WHO 2009

Workshop

Protocollo standard per la corretta esecuzione dello spermiogramma

7- 8 Novembre 2003

Università di Roma “La Sapienza”

Workshop Protocollo standard per la corretta esecuzione dello

Spermiogramma

• SOCIETA’ SCIENTIFICHE

• Associazione Italiana di Patologia Clinica (AIPaC) • Società Italiana di Biochimica Clinica e Biologia Molecolare

Clinica (SIBioC)• Società Italiana di Medicina di Laboratorio (SIMeL)• Società Italiana di Andrologia Medica (SIAM)• Società Italiana di Andrologia (SIA)• Società di Endocrinologia (SIE)• Società Italiana Embriologia, Riproduzione e Ricerca (SIERR)• Società Italiana di Fisiopatologia della Riproduzione (SIFR)• Società Italiana di Fertilità e Sterilità (SIFES)• Società Italiana della Riproduzione (SidR)

STANDARDIZZAZIONE DELLE PROCEDURE PER L’ESAME DEL LIQUIDO SEMINALE

FASE PRE-ANALITICA

FASE ANALITICA

FASE POST-ANALITICA

STANDARDIZZAZIONE DELLE PROCEDURE PER L’ESAME DEL LIQUIDO SEMINALE

FASE PRE-ANALITICA

– Norme per la raccolta

– Norme per la processazione

STANDARDIZZAZIONE FASE PRE-ANALITICA

NORME PER LA RACCOLTA DEL L.S.

1. GIORNI DI ASTINENZA

2. MODALITA’ DI RACCOLTA

3. TIPO DI CONTENITORE

4. MODALITA’ DI CONSEGNA

5. MODALITA’ DI COMUNICAZIONE DELLE ISTRUZIONI

NO

MODIFICHE

NORME PER LA PROCESSAZIONE

Porre il contenitore in termostato a T controllata (35-37°C) per almeno 15 min.

Miscelare il campione delicatamente e valutare se è completato il processo di fluidificazione.

Trasferire il campione, mediante una pipetta, in una provetta conica trasparente e graduata.

STANDARDIZZAZIONE FASE PRE-ANALITICA

NO

MODIFICHE

STANDARDIZZAZIONE FASE ANALITICA

Valutazione del campione


VALUTAZIONE MACROSCOPICA

caratteristiche reologiche

VALUTAZIONE MICROSCOPICA

componente gameticacomponente cellulare non nemaspermica

VOLUME

pH

Aspetto

Fluidificazione

Viscosità



VALUTAZIONE MODIFICATA

Volume (valore di riferimento WHO 1999 ≥ 2,0 ml)

• Il volume dell’eiaculato si valuta in ml in una provetta conica graduata.

• Se il volume dell’eiaculato è inferiore o uguale al millilitro deve essere valutato mediante una micropipetta a volume variabile.



WHO 2009WHO 2009Il volume viene valutato in modo indiretto, Il volume viene valutato in modo indiretto, mediante il peso mediante il peso

Densità del liquido seminale ( Densità del liquido seminale ( ~ ~ 1 g/ml)1 g/ml) (1.014 g/ml)(1.014 g/ml)

Peso del contenitore (g)Peso del contenitore (g)Peso del contenitore con liquido seminale (g)Peso del contenitore con liquido seminale (g)

Calcolare la differenza di peso (g = mlCalcolare la differenza di peso (g = ml)) x

Volume del liquido seminale: WHO 2009Volume del liquido seminale: WHO 2009Trasferire il liquido seminale dal contenitoreTrasferire il liquido seminale dal contenitore

Il trasferimento del LS dal contenitore Il trasferimento del LS dal contenitore mediante pipetta determina:mediante pipetta determina:

• volumi più bassivolumi più bassi• -0.4 a -0.9 ml (14%)-0.4 a -0.9 ml (14%)

X X X


Componente Cellulare Nemaspermica

• Concentrazione

• Motilità

• Morfologia


• Concentrazione/ml

• Concentrazione/eiaculato

v.r. ≥ 20 x 106/ml v.r. ≥ 40 x 106/eiac.


(WHO, 1999)


NUMERO SPERMATOZOI

/


CONCENTRAZIONE NEMASPERMICA

Camere di conta

Makler

Thoma

Burker

Neubauer

Fare 2 diluizioniFare 2 diluizioni

Non riempire le 2 camere con la stessa diluizione Non riempire le 2 camere con la stessa diluizione

Non contare la stessa camera 2 volteNon contare la stessa camera 2 volte

Errore di campionamentoErrore di campionamento Errore di pipettamentoErrore di pipettamento Errore di diluizioneErrore di diluizione

Diluizione # 2

Diluizione # 1

WHO 2009 NeubauerNeubauer

Quante cellule contare : intervallo di confidenza Quante cellule contare : intervallo di confidenza

N spermatozoi contati

50 100 150 200 250 300 350 400 450

Per

cen

tag

e

0

25

50

75

100

125

150

intervallo di confidenza al 95% 1.96 x %SE% Errore Standard (%SE)

10

CR 120% 0.4 – 1.6 20 - 80

CR 20%

CR 28%

CR 40%

in 50 µl (50x103)

45 - 55

43 - 57

40 - 60

per 1x106/ml

0.9 - 1.1

0.86 - 1.14

0.8 - 1.2

In caso di assenza di spermatozoi in

sospensione è necessario centrifugare

l’eiaculato



AZOOSPERMIA

FORZA CENTRIFUGA ?TEMPO ?

Sperm in the pellet of 14 “azoospermic” samples increases withSperm in the pellet of 14 “azoospermic” samples increases with• Centrifugation time (10 - 15 min)Centrifugation time (10 - 15 min)• Centrifugation force (600 – 3600Centrifugation force (600 – 3600gg))Lindsay et al., 1995 Lancet 345: 1642Lindsay et al., 1995 Lancet 345: 1642

Not all sperm brought down: at 3000Not all sperm brought down: at 3000gg for 15 min for 15 min23/25 non-azoospermic samples have sperm in supernatant23/25 non-azoospermic samples have sperm in supernatant

Dilute semen 1+1 mit Formalin +Dilute semen 1+1 mit Formalin +Hoechst 33342 dyeHoechst 33342 dyeFluorescence microscopyFluorescence microscopy

Leja 100 µm deepLeja 100 µm deep

disposable chamberdisposable chamber


Lineare veloce

Lineare lenta

Discinetica o Non Lineare

Agitatoria in loco o In Situ

Immobili

v.r. ≥ 50% (1+2+3 = a+b secondo WHO 1999)

≥ 25% ( 1+2 = a secondo WHO 1999 )

MOTILITA’

WHO 1999WHO 1999 WHO 2009 WHO 2009

ImmotileImmotile Grade d Grade d IM IMNon-progressiveNon-progressive Grade c Grade c NP NPProgressive Progressive PR PR-slow-slow Grade b Grade b optional optional-fast-fast (> 25 µm/s at 37°C) (> 25 µm/s at 37°C) Grade a Grade a optionaloptional


MOTILITA’

Valutare solo : spermatozoi immobili, non-progressivi e progressivi Valutare solo : spermatozoi immobili, non-progressivi e progressivi

LA VALUTAZIONE DELLA VELOCITÀ PUÒ ESSERE INACCURATALA VALUTAZIONE DELLA VELOCITÀ PUÒ ESSERE INACCURATA

TEST DI VITALITA’

È consigliabile inserirlo nella

valutazione seminale in caso

di motilità ≤ 30%


TEST DI VITALITA’

WHO 1999: old methodWHO 1999: old method% stained + % motile % stained + % motile >> 100% 100%

WHO 2009: one step methodWHO 2009: one step method% stained + % motile % stained + % motile << 100% 100%

Valutare la vitalità solo quando la motilità è <40%Valutare la vitalità solo quando la motilità è <40%

Utilizzare metodo eosina-nigrosina (Utilizzare metodo eosina-nigrosina (one-step)one-step)

No falsi positiviNo falsi positivi

TEST DI VITALITA’


La morfologia nemaspermica può essere valutata su un preparato a fresco utilizzando

un obiettivo 40x. E’ necessario a questo scopo avere a disposizione un microscopio con un

sistema ottico di alta qualità che consenta una precisa rilevazione delle alterazioni

morfologiche delle cellule vitali.

MORFOLOGIA

Per eseguire uno “spermiocitogramma“ è

necessario allestire per ogni campione più

vetrini che verranno poi processati

secondo la tecnica di preparazione più

appropriata e valutati al microscopio ottico

con l’obiettivo 100X.


MORFOLOGIA

Shorr

Colorazione di Papanicolau

Colorazione Diff Quik

Colorazione di May-Grünwald-Giemsa

Tecniche di colorazione


MORFOLOGIA


MORFOLOGIA

Forme tipiche

Forme atipicheTesta

Collo

Codav.r. ≤ 70% forme atipiche (WHO 1992)

WHO 2009WHO 2009 cosa viene raccomandato ???cosa viene raccomandato ???

Riportare solo le forme morfologiche normali

Valutare il preparato 2 volte

Cambiamenti nella dimensione a fresco più piccoliCambiamenti nella dimensione a fresco più piccoli

Forza di distorsione Forza di distorsione espansione delle teste immature espansione delle teste immature

Insulto osmotico perdita di residui citoplasmaticiInsulto osmotico perdita di residui citoplasmatici

ATTENZIONE AGLI ARTEFATTI !!!

WHO 2009

Valori di norma

Valori di Riferimento

Distribuzione normale:

Media e DS

Distribuzione asimmetrica:

Mediana e Percentili

La distribuzione dei parametri seminali non è simmetrica ma asimmetrica

Un approccio alternativo per descrivere dati come questi è

l’uso della MEDIANA.

La MEDIANA è quel valore rispetto al quale, metà dei valori della

popolazione risultano superiori e l’altra metà inferiori

Dal momento che il 50% della popolazione cade al di sotto della

mediana, questa è anche chiamata 50° percentile

Si possono utilizzare il 5° e il 95° o indifferentemente il 5°, 25°, 50° e il

95° percentile

http://it.wikipedia.org/wiki/File:Moda.jpg

http://it.wikipedia.org/wiki/File:Moda2.GIF

WHO WHO yearyear 1987 1987 19921992 19991999 20092009 designation normaldesignation normal normalnormal referencereference Percentiles (non-parametric methods)Percentiles (non-parametric methods)

2.52.5 55 5050 9595 97.597.5

Semen vol. (ml)Semen vol. (ml) 2.02.0 2.02.0 2.02.0 1.21.2 1.51.5 3.73.7 6.86.8 7.67.6

Total numbers (M)Total numbers (M) 4040 4040 4040 2323 3939 255255 802802 928928

Sperm conc. (M/ml)Sperm conc. (M/ml) 2020 2020 2020 99 1515 7373 213213 259259

Progr. motility (%)Progr. motility (%) 5050 5050 5050 2828 3232 5555 7272 7575

Vitality (%)Vitality (%) 5050 7575 7575 5353 5858 7979 9191 9292

Normal forms (%)Normal forms (%) 5050 3030 (15)(15) 22 33 1111 2121 2424

WHO 2009 Valori di Norma , valori di RiferimentoWHO 2009 Valori di Norma , valori di Riferimento

Valori di Riferimento : 8 Paesi, 3 Continenti

IN FUTURO : studiare varianti geniche

Uomini giovani fertili – meno di 12 mesi dalla gravidanza

Valori di Riferimento del Vol misurato in ml:

descritti da mediana e percentili(metodi non-parametrici)

Curva asimmetrica a destra

VOLUME

Valori di Riferimento della Concentrazione misurata in milioni / ml

Concentrazione/ml

Valori di Riferimento della Concentrazione misurata in milioni / eiaculato

Concentrazione/Eiac.

Valori di Riferimento della Motilità misurata in % di motilità progressiva

Motilità Progressiva

Valori di Riferimento della Morfologia misurata in % di forme normali

Forme normali

WHO WHO yearyear 1987 1987 19921992 19991999 20092009 designation normaldesignation normal normalnormal referencereference Percentiles (non-parametric methods)Percentiles (non-parametric methods)

2.52.5 55 5050 9595 97.597.5

Semen vol. (ml)Semen vol. (ml) 2.02.0 2.02.0 2.02.0 1.21.2 1.51.5 3.73.7 6.86.8 7.67.6

Total numbers (M)Total numbers (M) 4040 4040 4040 2323 3939 255255 802802 928928

Sperm conc. (M/ml)Sperm conc. (M/ml) 2020 2020 2020 99 1515 7373 213213 259259

Progr. motility (%)Progr. motility (%) 5050 5050 5050 2828 3232 5555 7272 7575

Vitality (%)Vitality (%) 5050 7575 7575 5353 5858 7979 9191 9292

Normal forms (%)Normal forms (%) 5050 3030 (15)(15) 22 33 1111 2121 2424

WHO 2009 Valori di Norma , valori di RiferimentoWHO 2009 Valori di Norma , valori di Riferimento

Valori di Riferimento : 8 Paesi, 3 Continenti

IN FUTURO : studiare varianti geniche

Uomini giovani fertili – meno di 12 mesi dalla gravidanza

NormozoospermiaNormozoospermia Numero totale di spermatozoi, percentuale di motilità progressiva (PR) e Numero totale di spermatozoi, percentuale di motilità progressiva (PR) e morfologia nella norma, al di sopra del limite di riferimento più bassomorfologia nella norma, al di sopra del limite di riferimento più basso

OligozoospermiaOligozoospermia Numero totale di spermatozoi al di sotto del limite di riferimento più basso Numero totale di spermatozoi al di sotto del limite di riferimento più basso

AstenozoospermiaAstenozoospermia Percentuale di motilità progressiva (PR) al di sotto del limite di riferimento Percentuale di motilità progressiva (PR) al di sotto del limite di riferimento inferioreinferiore

TeratozoospermiaTeratozoospermia Percentuale di spermatozoi con forme normali al di sotto del limite Percentuale di spermatozoi con forme normali al di sotto del limite inferiore di riferimentoinferiore di riferimento

WHO 2009 WHO 2009 Nomenclatura seminaleNomenclatura seminale

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