Epidemiologia molecular do vírus da raiva no estado do Pará no ...

CA D. S A Ú D E C O L E T . , R I O D E JA N E I R O , 15 (3 ) : 329 - 348, 2007 – 329

EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DO VÍRUS DA RAIVA NO ESTADO DO PARÁ NO PERÍODO DE

2000 A 2005: EMERGÊNCIA E TRANSMISSÃO POR MORCEGOS HEMATÓFAGOS

(DESMODUS ROTUNDUS)Molecular epidemiology of rabies virus in Para state during 2000 to 2005:emergence and transmission by hematophagous bats (Desmodus rotundus)

Taciana Fernandes Souza Barbosa1, Elizabeth Salbé Travassos da Rosa2,Daniele Barbosa de Almeida Medeiros3, Livia Medeiros Neves Casseb4,Armando de Sousa Pereira5, Alberto Lopes Begot6, Reynaldo J. S. Lima6,Márcio Roberto Teixeira Nunes7, Pedro Fernando da Costa Vasconcelos8

RESUMO

A ocorrência recente de surtos de raiva humana transmitida por morcegos hematófagosDesmodus rotundus vem sendo registrada no Estado do Pará desde 2004. Neste artigo,é realizado um estudo retrospectivo de caracterização genética de 37 cepas do vírusrábico de diferentes mamíferos, incluindo o homem, isoladas de 2000 a 2005, dediferentes regiões paraenses. Foi obtido o seqüenciamento nucleotídico parcial do geneN e construída árvore filogenética baseada no método Neighbor-Joining. A análisefilogenética determinou a formação de cinco clades principais e agrupou as cepasisoladas no Estado do Pará em três distintas clades: clade I, cepas da variante antigênica3 (VAg3), comumente encontrada nos morcegos D. rotundus; clade II, cepa relacionadaà VAg3, porém com topologia diferenciada isolada de morcego frugívoro Uroderma

bilobatum; e clade IV, cepas da variante antigênica 2 (VAg2), comumente isoladas decães domésticos. No Pará, no período estudado, circularam as variantes VAg2 eVAg3. A VAg3 da clade I se encontra subdividida em três linhagens virais (I-a, I-b, eI-c) associadas à distribuição geográfica: duas delas (I-a e I-b) circulam no continentenas regiões paraenses do Sudeste, Nordeste e Baixo Amazonas, enquanto a linhagemI-c restringe-se à ilha do Marajó. A associação dos dados genéticos com os ecológicosfornece uma melhor compreensão da epidemiologia molecular da raiva no Estado do

1 Mestranda em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários da Universiadade Federal do Pará. Seçãode Arbovirologia e Febres Hemorrágicas, Instituto Evandro Chagas, Belém, Brasil. Endereço: AvenidaAlmirante Barroso 492 - Marco - CEP: 66090-000 - E-mail: [email protected]

2 Doutoranda em Biologia Parasitár ia/FIOCRUZ.

3 Doutoranda em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários pela Universidade Federal do Pará.

4 Mestranda em Patologia das Doenças Tropicais pela Universidade Federal do Pará.

5 Técnico da Seção de Arbovírus do Instituto Evandro Chagas.

6 Médico Veterinário. Especialista em Saúde Pública pela Escola Nacional de Saúde Pública RJ/UFPA.Secretaria Executiva de Saúde Pública do Estado do Pará.

7 Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários. Pesquisador da Seção de Arbovirologia eFebres Hemorrágicas do Instituto Evandro Chagas.

8 Doutor em Medicina. Pesquisador e chefe da Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas doInsti tuto Evandro Chagas.

330 – CA D . SA Ú D E CO L E T . , R I O D E JA N E I R O , 15 (3 ) : 329 - 348, 2007

TA C I A N A F E R N A N D E S SO U Z A B A R B O S A , E L I Z A B E T H S A L B É T R A V A S S O S D A R O S A , D A N I E L E B A R B O S A D E

AL M E I D A M E D E I R O S , L I V I A M E D E I R O S N E V E S C A S S E B , A R M A N D O D E S O U S A P E R E I R A , A L B E R T O L O P E S B E G O T ,R E Y N A L D O J . S . L I M A , M Á R C I O R O B E R T O T E I X E I R A N U N E S , P E D R O F E R N A N D O D A C O S T A VA S C O N C E L O S

Pará e sugere que duas distintas variantes antigênicas isoladas do vírus da raiva foramassociadas com a transmissão da doença por morcegos hematófagos entre 2000 e2005. Finalmente, foi demonstrado neste estudo a presença de pelo menos três distintaslinhagens genéticas da VAg3 no estado, e a emergência de uma possível nova variante,que foi isolada de um morcego frugívoro U. bilobatum capturado na localidade deAjará, município de Portel, durante o surto ocorrido em 2004.

PALAVRAS-CHAVE

Epidemiologia molecular, vírus da raiva, morcegos hematófagos

ABSTRACT

The occurrence of human rabies outbreaks transmitted by bites of the vampire batsDesmodus rotundus have been recently reported in the Para state. In this work a retrospectivestudy was conducted in order to genetic characterize thirty-seven rabies virus strainsobtained from different hosts (including humans), time (between 2000 and 2005) andgeographic regions of the Para state. The N gene nucleotide sequences were partiallyobtained from all studied strains and used for phylogenetic reconstruction by theNeighbor-joining method. The phylogenetic analysis depicted five major clades (I toV) and grouped the strains isolated in the Para state in three distinct clades: clade Irelated to strains associated with the hematophagous bat Desmodus rotundus antigenicvariant (AgV3); clade II, which included a single strain isolated from a frugivorous bat(Uroderma bilobatum); and clade IV represented by the dog-related antigenic variantstrains (AgV2). Within the clade I, three distinct lineages (I-a, I-b, and I-c) wereidentified and their dispersion appeared to be geographically related: two of them(I-a and I-b) were found in the continental area of the Para state (Southeast, Northeastand Baixo-Amazonas regions), whereas the lineage I-c was restricted to the MarajoIsland. The association of genetic and ecological data provided a better understand ofthe molecular epidemiology of rabies virus strains isolated in the Para state suggestingthat two distinct antigenic variants have been associated with bat-transmitted rabiescases between 2000 and 2005. Finally, it was demonstrated in this study the presence of atleast three distinct AgV3 genetic lineages in the region, and the emergence of a possiblenew antigenic variant distinct from AgV3 strains isolated from the Uroderma bilobatum

bat captured in the Portel municipality where rabies outbreak was reported in 2004.

KEY WORDS

Molecular epidemiology, rabies virus, hematophagous bats

1. INTRODUÇÃO

A raiva é uma encefalite viral aguda, progressiva e incurável (Rupprechtet al., 2002). O agente causador é um vírus de RNA neurotrópico, o vírus daraiva, que pertence à ordem Mononegavirales, família Rabdoviridade e gênero Lyssavírus

(Dietzschold et al., 1996; Wagner & Rose 1996; Wu et al., 2002; Fauquet et al.,2005; Finke & Conzelmann, 2005). Morfologicamente, o vírus da raiva ésemelhante a um projétil, com aproximadamente 180 nm de comprimento por75 nm de diâmetro (Tordo & Badrane, 2003; Gonçalves J. L. S. et al., 2002;Woldehiwet, 2002; Guyatt et al., 2003; Fauquet et al., 2005).


E P I D E M I O L O G I A M O L E C U L A R D O V Í R U S D A R A I V A N O E S T A D O D O P A R Á N O P E R Í O D O D E 2 0 0 0 A 2 0 0 5 :E M E R G Ê N C I A E T R A N S M I S S Ã O P O R M O R C E G O S H E M A T Ó F A G O S ( D E S M O D U S R O T U N D U S )

A organização genômica do vírus da raiva consiste de um ácido ribonucléicode fita única, sentido negativo, não segmentado. Cinco genes (3’-N-P-M-G-L-5’)monocistrônicos estão relacionados a cinco proteínas virais, são elas:Nucleoproteína (N); Fosfoproteína (P); Proteína Matriz (M); Glicoproteína (G); eRNA-Polimerase (L) (Fauquet et al., 2005).

Com o advento de técnicas moleculares, foram realizados numerosos estudosbaseados em comparações na seqüência nucleotídica dos genes N e G, e depseudogenes (Ψ) de numerosos isolamentos de Lyssavirus, que permitiram aidentificação e caracterização de sete genótipos (GTs), denominados GT

1 a GT

7

(Badrane et al., 2001), quais sejam: vírus da raiva Clássico (RV, GT1); Lagos bat virus

(LBV, GT2) (Boulger & Porterfield, 1958); Mokola virus (MOKV, GT

3) (Shope et al.,

1970); Duvenhage virus (DUVV, GT4) (Meredith et al., 1971); European bat lyssavirus

tipo 1 (EBLV-1, GT5); (Amengual et al.,1997); European bat lyssavirus, tipo 2 (EBLV-

2, GT6) (Lumio et al, 1986); e Australian bat lyssavirus (ABLV, GT

7) (Gould et al.,

2002; Guyatt et al., 2003).A raiva é uma enfermidade que ocorre de maneira endêmica em diversos

países do mundo, e seu ciclo epidemiológico pode ser didaticamente dividido em:ciclo urbano, ciclo rural, silvestre terrestre e silvestre aéreo (Velasco-Villa et al., 2006).O ciclo urbano é principalmente mantido pelos cães e sua transmissão ocorre decão para cão, e este é considerado o principal transmissor de raiva para ohomem, constituindo, esta forma, um grave problema de saúde pública, devidoao estreito relacionamento entre as pessoas e seus animais de companhia(Rezende et al., 1997; Fernandes, 2001).

O ciclo rural é mantido principalmente no campo por morcegos hematófagos,que transmitem o vírus em especial para animais de produção. Das três espéciesde morcegos hematófagos existentes no Brasil, Desmodus rotundus é o mais importantetransmissor da doença em herbívoros (Uieda et al., 1998; Rezende et al., 1997;Fernandes, 2001; Gonçalves M. A. S. et al., 2002).

No ciclo silvestre terrestre, a transmissão do vírus ocorre entre animais, comoraposa, lobo, guaxinim, macaco e quati. É o ciclo de maior prevalência nos paísesdesenvolvidos, em especial nas regiões em que a raiva urbana está sob controle.O ciclo silvestre aéreo ocorre entre as diferentes espécies de morcegos, hematófagosou não, e apresenta, atualmente, grande importância na manutenção e disseminaçãodo vírus. Por serem os únicos mamíferos que voam, se deslocando em velocidade,os morcegos têm a capacidade de transpor grandes distâncias e barreiras geográficas(Wada et al., 2004).

O ataque de morcegos hematófagos a humanos parece comum em algumasregiões da América Latina. No Brasil, ano de 1986, município de Boca da Mata,Estado de Alagoas, na região nordeste, dois casos de raiva humana transmitidas




por morcegos hematófagos foram registrados. Entre os anos de 1990 e 1992,foram registrados mais seis casos humanos no Estado da Bahia, sendo umocorrido no município de Pintadas, três no município de Aporá e dois casosno município de Conde (Scheneider & Santos-Burgoa, 1995; GonçalvesM. A. S, et al., 2002).

Mais recentemente, nos anos de 2004 e 2005, foi relatada a ocorrência demais três surtos de raiva humana transmitida por morcegos hematófagos, noEstado do Pará. Os primeiros surtos ocorreram nos meses de março e maio de2004, nos municípios de Portel (mesorregião do Marajó), onde foram relatados15 óbitos, sendo 10 confirmados laboratorialmente, e Viseu (mesorregiãoNordeste), com seis óbitos, dois dos quais confirmados laboratorialmente. Oterceiro surto ocorreu em junho de 2005, no município de Augusto Corrêa,onde ocorreram 15 óbitos e 10 foram confirmados por análises laboratoriais(Wada et al., 2004; Travassos da Rosa et al., 2006). Neste mesmo ano, foramrelatados outros surtos nos municípios de Godofredo Viana, Cândido Mendes,Carutapera e Turiaçú, Estado do Maranhão, com uma ocorrência de 24 casoshumanos (Brasil, 2005) (Figura 1).

No presente estudo, nós descrevemos a caracterização genética de 37 cepasde vírus rábico isoladas no Estado do Pará, de diferentes espécies animais incluindoo homem, ocorridas no período de 2000 a 2005.

Figura 1Mapa dos estados do Pará e Maranhão onde ocorreram surtos de raiva humana transmitidapor morcegos hematófagos nos anos de 2004 e 2005. Fonte: Ministério da Saúde, Secretariade Vigilância em Saúde, 2005.



2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. AMOSTRAS

O total de 37 cepas do vírus da raiva foram caracterizadas geneticamente nesteestudo (Tabela 1), sendo as mesmas obtidas a partir de tecido nervoso humano eanimal, recebidas pelo laboratório de Diagnóstico de Raiva, da Seção deArbovirologia e Febres Hemorrágicas do Instituto Evandro Chagas. Os casos foramprovenientes das seguintes mesorregiões do Estado do Pará: Baixo Amazonas; Marajó;Metropolitana de Belém; Nordeste Paraense; Sudeste Paraense; e Sudoeste Paraense.

Tabela 1Relação das cepas do vírus da raiva examinadas neste estudo, isoladas no Estado do Pará,2000 a 2005, e outras previamente publicadas.

Continua




Tabela 1 (Continuação)



2.2. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL

As amostras estudadas foram inicialmente diagnosticadas como positivas paraa raiva pela Técnica de Imunofluorescência Direta (IFD) para a detecção deantígenos virais, e/ou Prova Biológica (PB) obtendo-se o isolamento do vírus rábico.

2.3. EXTRAÇÃO DO RNA VIRAL E OBTENÇÃO DO DNA COMPLEMENTAR (CDNA)

O RNA viral das 37 amostras foi extraído utilizando o método do reagenteTRIZOL LS (Invitrogen, San Diego, EUA) a partir de uma suspensão preparadacom 1g do tecido nervoso macerado em 1000 µL da suspensão de albuminabovina a 0,75% em Solução Salina Tamponada, de acordo com as instruçõesdo fabricante.

A obtenção do cDNA foi feita utilizando a técnica de transcrição Reversaseguida da Reação em Cadeia mediada pela Polimerase (RT-PCR), na qual obteve-se a amplificação parcial do gene N, mediante RT-PCR em dois passos (Barbosaet al., 2008). O par de iniciadores específicos utilizados, RABV NF (G G A A G AG A T A A G A A G A A T G T T T G) e RABV NR (T T G G A G C T G AC T G A G A C A T A), foram desenhados com base em regiões altamenteconservadas do gene N de diferentes cepas virais e com capacidade de hibridizarna posição compreendida do nucleotídeo 868 ao 1359. O produto obtido foiestimado em 491 pb.

Para a obtenção do DNA complementar (cDNA), inicialmente realizou-se areação de transcrição reversa (RT) ajustada para o volume final de 10ML, constituídapor: 5µL de RNA (~2-5 ng) e 5µL da mistura de reação que inclui tampão RT 1x(250mM Tris-HCl pH 8,3; 100mM NaCl; 15mM MgCl

2; 0,1 mM EDTA), 0,5

mM dNTP, 10mM, DTT, 10 U/µL de enzima RT (Superscript-II, ReverseTranscriptase, Invitrogen San Diego, CA); 2,5 µM do iniciador 868 NF(5’-GGAAGAGATAAGA AGAATGTTTG-3´), e 20 U de inibidor de RNAse(RNaseOUT – Invitrogen). A RT foi processada em um ciclo de 42ºC durante90 minutos.

A amplificação do produto da RT foi realizada pela técnica de PCR,cujo volume da reação foi ajustado para 25µL, contendo: 5µL do produto daRT (cDNA) e 20 µL da mistura de reação constituída por tampão de PCR10x (250mM Tris-HCl pH 8,3; 100mM NaCl; 0,1 mM EDTA); 1,5mM MgCl

2, 0,2 µM dNTPs, 1 µM de cada iniciador (NF) e 1359 NR

(5´-TTGGAGCTGACTGAGACATA-3´) e 0,05U/µL de DNA polymerase(Platinum Taq DNA Polymerase). A reação de PCR foi executada com 35 ciclos,cada um composto por ciclos de 94°C/40 segundos, 55°C/40 segundos, e 74°C/1 minuto, seguidos de um ciclo adicional de extensão de 72°C/10 minutos. Osamplicons foram visualizados em gel de agarose a 1,5%, sendo estes produtos




posteriormente purificados utilizando o kit comercial QIAquick Gel Extraction (Qiagen,Valência, EUA), de acordo com instruções do fabricante.

2.5. SEQÜENCIAMENTO NUCLEOTÍDICO

A obtenção das seqüências nucleotídicas a partir dos cDNA purificados foirealizada utilizando o kit ABI PRISM Dye Terminator (Applied Biosystems, FosterCity, EUA), cujas reações foram processadas em seqüenciador automático, modeloABI PRISM 377 (Applied Biosystens).O seqüenciamento foi realizado utilizandoo mesmo par de iniciadores empregados nas reações de RT e PCR.

2.6. ANÁLISE FILOGENÉTICA

As seqüências nucleotídicas das 37 amostras de vírus da raiva foram alinhadasentre si e com outras seqüencias homólogas disponíveis no banco de dados doGenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) usando o programa Clustal X (Thompsonet al., 1997). As árvores filogenéticas foram construídas usando os métodos deagrupamento de vizinhos (Neighbor Joining: NJ) (Saitou & Nei, 1987) e máximaparcimônia (MP) (Swofford, 1999), implementados nos programas computacionaisMega 3.0 (Kumar, 2004) e PAUP 4.0 (Swofford, 1999). Valores de confidênciaforam calculados baseados na divergência nucleotídica de cepas do vírus rábicoisoladas de morcegos, cães, raccon e cepas laboratoriais (vírus fixo), sendo tais valoresdeterminados em < 3% e < 1% para o grupamento das cepas em clades e sub-clades, respectivamente.

3. RESULTADOS

3. 1. DETECÇÃO DO GENOMA VIRAL E ANÁLISE DAS SEQÜÊNCIAS

O genoma do vírus rábico isolado nas 37 amostras utilizadas neste estudoforam amplificadas pela técnica de RT-PCR, obtendo-se produtos, que apósseqüenciamento nucleotídico geraram seqüências parciais do gene N com aproxi-madamente 490 nt e determinadas entre as posições 868 e 1359 do genoma dovírus da raiva. As seqüências obtidas foram analisadas pelo programa BLASTsearch (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), e identificadas como cepas do vírus da raivapertencentes às variantes antigênicas 3 (VAg3) e 2 (VAg2) relacionadas a morcegoshematófagos da espécie Desmodus rotundus e ao cão doméstico, respectivamente.

3. 2. ANÁLISE FILOGENÉTICA RELACIONADA A VARIANTES ANTIGÊNICAS

A filogenia comparativa foi realizada entre as 37 cepas seqüenciadas nesteestudo e cepas do vírus da raiva provenientes de outros estados brasileiros, cepasde vírus fixos (AV01; GeneBank: X13357 e CVS: GeneBank: D42112); bem



como com cepas da variante de “raccoon” (GeneBank: U27218, U27219, U27220e U27221). A filogenia mostrou a relação de todas as cepas analisadas com ogenótipo I do vírus rábico, sendo separadas em cinco clades principais relacionadasàs distintas variantes antigênicas segundo os critérios de inclusão em clades (diver-gência genética < 3%) e sub-clades (divergência genética < 0,9%) (Figura 2):Clade I – cepas relacionadas VAg3 (bootstrap > 80%); Clade II – uma únicacepa isolada de morcego Uroderma bilobatum (Quiropt 18867), capturado na loca-lidade de Ajará, município de Portel, Estado do Pará (bootstrap > 86%); CladeIII cepas relacionadas à variante de “raccoon” (bootstrap > 99%) – Clade IVcepas relacionadas à VAg2 (bootstrap > 95%); Clade V cepas de vírus fixos(bootstrap >99%). Embora a amostra do U. bilobatum esteja geneticamenterelacionada às cepas da VAg3 associadas a D. rotundus (Clade I), essa forma umaclade isolada, o que parece constituir uma nova variante, uma vez que o valorde divergência genética de 5% foi superior ao valor limítrofe para a formaçãode clades (3%).

3. 3. ANÁLISE FILOGENÉTICA RELACIONADA À DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA

Quanto à distribuição geográfica, observa-se que dentro da Clade I sãoidentificadas três subclades distintas (I-a, I-b e I-c), sustentadas por um elevadovalor de bootstrap (>70%) e valores de inclusão de grupo < 0,9%. Observou-se a formação de dois grupos geográficos distintos: o grupo Continental, oqual compreende duas linhagens circulantes representadas pelas subcladesI-a e I-b, cuja divergência genética entre elas é de 1,5%; e o grupo da Ilhado Marajó onde circula a linhagem relacionada na subclade I-c e queapresenta uma divergência genética de 2,5% e 2% com as linhagens I-a e I-b,respectivamente (Figura 2).

Na subclade I-a foram agrupadas as amostras provenientes das mesorregiõesdo Baixo Amazonas, representada pela amostra de Belterra (Bov 14664); nordesteparaense, dos municípios de Augusto Correa, Bragança e Viseu; e sudeste paraense(municípios de Eldorado dos Carajás, Conceição do Araguaia, Marabá e Xinguará),além das amostras provenientes do sudeste brasileiro. Enquanto que a subclade I-b,na qual estão relacionadas as cepas isoladas de morcegos frugívoros do gêneroArtibeus sp. (BR-AL1, BR-AL-2, BR-AL3 e BR-AP1), encontram-se agrupadas quatroamostras da mesorregião nordeste do Pará, sendo três cepas de Augusto Correa(Hum 22931, Hum 22899 e Hum 22903) e uma de Viseu (Hum 19222), e duasamostras da mesorregião do sudeste paraense, sendo uma amostra de São João doAraguaia (Sui 17738) e uma de Jacundá (Eq 18727). Na subclade I-c encontram-seagrupadas todas as amostras da mesorregião do Marajó, incluindo os isolamentosdo surto de Portel e uma cepa de Breves (Bov 19671).




Figura 2Análise filogenética construída pelo método de NJ utilizando seqüências parcias do gene Nde cepas do VR isoladas no Estado do Pará entre os anos de 2000 a 2006. Valoresacimade cada nó correspondem aos percentuais de bootstap. O valor representado na escalacorrespondente a divergência genética de 20% (0,02).



A clade IV pode ser dividida em duas subclades (bootstrap > 90%, valor deinclusão de 0 a 0,5%), cujo valor de divergência genética entre elas é de 2,5%. Nasubclade IV-a, estão agrupadas todas as amostras do Pará e uma amostra daregião nordeste do Brasil (Hum 428M), enquanto que na subclade IV-b agrupam-se as cepas isoladas nos estados de Goiás, Minas Gerais e São Paulo. As amostrasde VAg-2 provenientes do Estado do Pará foram isoladas das mesorregiões BaixoAmazonas (municípios de Oriximiná e Santarém), Metropolitana de Belém(município de Belém), Nordeste do Pará (municípios de Ipixuna do Pará, Mãe doRio, Peixe-boi, Salinópolis e Viseu), Sudeste do Pará (municípios de Dom Eliseu,Jacundá, Marabá, Itupiranga e Ulianópolis) e Sudoeste do Pará (município deRondon do Pará).

3. 4. ANÁLISE FILOGENÉTICA X ANÁLISE TEMPORAL E DE HOSPEDEIRO

Nos anos de 2004 e 2005, a maioria dos isolamentos do vírus da raiva foiproveniente dos municípios de Portel (2004), Viseu (2004) (Travassos da Rosa et al.,2006) e Augusto Correa (2005) (Barbosa et al., 2008), os quais foram identificadoscomo VAg3. Esses resultados caracterizam os três surtos ocorridos nestes municípioscomo sendo associados a morcegos hematófagos (D. rotundus). Entre os isolamentosobtidos, observou-se uma grande variedade de hospedeiros infectados (bovinos,felinos, eqüinos, humanos, quirópteros e suínos). A identificação da VAg3 naamostra Fel 23167 isolada de um felino procedente de Augusto Correa, que foicaracterizada tanto a nível genético quanto através da tipificação antigênica porpainel de anticorpos monoclonais (AcM), demonstra a circulação dessa varianteem diversas espécies animais. Um ano após o surto de Viseu, ainda detectou-se acirculação da VAg3 da linhagem I-a nesse município, a partir de isolamentos deuma amostra humana (Hum 23433) e de duas bovinas (Bov 23625 e Bov 23717),muito embora tenha sido também identificada uma cepa de VAg2 de umaamostra canina (Can 22186).

4. DISCUSSÃO

É notória, de longa data, a distribuição cosmopolita do genótipo I do vírus daraiva, bem como o seu impacto na saúde pública e na economia mundial, porpromover números significativos de óbitos em humanos e animais de interesseeconômico, respectivamente (Belotto, 2001; Rupprecht et al., 2002). Por isso, ogenótipo I do vírus rábico continua sendo objeto de vários estudos, muito emborainúmeras pesquisas realizadas tenham melhorado o entendimento sobre esse agenteviral. De fato, vários aspectos do ciclo biológico, modo de transmissão, caracteri-zação molecular e epidemiologia, produção de vacinas, dentre outros têm sidoamplamente descritos e recentemente revistos (Rupprecht et al., 2002).




Por outro lado, os estudos moleculares do vírus rábico têm claramentedemonstrado a importância da obtenção de seqüências nucleotídicas quepossibilitem traçar estratégias moleculares para uma detecção rápida, sensível eespecífica do vírus rábico. Em termos de filogenia, o gene N vem sendoamplamente utilizado mostrando-se eficaz em ressaltar pequenas variaçõesfilogenéticas que permitem a identificação dos diferentes genótipos virais (Heatonet al., 1997) o que tem permitido uma abordagem mais completa da caracterizaçãoviral e o reconhecimento do relacionamento das espécies hospedeiras e tambémsua distribuição geográfica, contribuindo de forma decisiva na compreensãoda epidemiologia molecular da raiva (Kissi et al., 1995; Nadin-Davis, 1998;Badrane et al., 2001).

O complexo ciclo de manutenção do vírus rábico envolve diversos hospedeiros,que apresentam uma estreita relação às variantes antigênicas específicas, determinadasatravés de um painel de AcM produzidos pelo CDC/Atlanta(EUA). No Brasil,são encontradas quatro variantes: VAg2, VAg3, VAg4 e VAg6. Na espécie canina(Canis familiaris) é comumente identificada a VAg2. A VAg 3 é característica demorcego hematófago da espécie Desmodus rotundus, também sendo comumenteencontrada em animais de produção (bovino, eqüino, suíno, caprino, etc.), vistoque o D. rotundus apresenta um hábito alimentar eletivo, obtendo preferencial-mente sangue desses animais. As variantes VAg4 e VAg6 têm sido encontradas emmorcegos insetívoros das espécies Tadarida brasiliensis e Lasiurus cinereus, respectiva-mente (Favoretto et al., 2002; Diaz et al., 1994). O homem e os felinos domésticossão considerados hospedeiros acidentais, podendo ser infectados pelas variantesVAg2 e VAg3, sendo que cães e morcegos hematófagos D. rotundus são os principaistransmissores dessas variantes, respectivamente (Kobayashi et al., 2006). O estudorealizado com amostras isoladas no Estado do Pará corrobora os dados da literatura,onde se verifica a circulação da variante VAg2 entre humanos (Hum 11950 eHum 13597) e gatos domésticos, além do cão, e da variante VAg3 das espécieshumana, felina (Fel 23167), bovina, eqüina e suína.

A análise filogenética dos 37 isolamentos estudados identificou linhagensdistintas entre as variantes circulantes no Pará, demonstrando uma importantecorrelação dessas linhagens com a distribuição geográfica, dentro do estado e emrelação ao restante do país. Com efeito, todas as amostras de VAg2 do Estado doPará estudadas, independente da mesorregião, são estreitamente relacionadas entresi e com a amostra VAg2 proveniente do nordeste brasileiro (Hum 428M; GeneBank:AY563516), o que se deve, provavelmente, à proximidade geográfica do Parácom o estado nordestino do Maranhão e o intenso fluxo de imigrantes e seusanimais domésticos entre as duas regiões (Norte-Nordeste). Tais amostras, por suavez, são claramente distintas da linhagem VAg2 circulante no centro-oeste e



sudeste do país, sugerindo que ambos os grupos filogenéticos (IV-a e IV-b)apresentam origem evolutiva diferente.

Quanto a VAg3, o filograma mostrou um ancestral comum que deu origem atrês linhagens no Estado do Pará, sendo duas circulantes na região continental euma restrita à ilha do Marajó. Os dados demonstraram que na parte continentaldo Pará circulam duas linhagens da variante de D. rotundus: uma (I-b) que serelacionou às amostras isoladas de morcegos frugívoros do gênero Artibeus,capturados no Estado de São Paulo, em 1998 (Shoji et al., 2004) e uma outra (I-a)isolada de morcegos D. rotundus capturados também no Estado de São Paulo (Itoet al., 2003). Ambas as linhagens encontram-se circulantes nas mesorregiõesNordeste e Sudeste do Estado do Pará, muito embora possa se observar umapredominância da linhagem I-a, sobretudo nas amostras isoladas nos municípiosde Augusto Correa e Viseu.

A inserção da amostra Bov 19671 proveniente do município de Brevesjuntamente com as amostras do surto de Portel, em 2004, ambos os municípioslocalizados na mesorregião paraense do Marajó, reforça a idéia de que a Ilha doMarajó constitui um nicho singular para a manutenção do ciclo silvestre aéreo dovírus da raiva com a circulação de uma linhagem distinta da VAg3, como foidescrito em outros trabalhos (Travassos da Rosa et al., 2006; Barbosa et al., 2008).Interessante, além da VAg3, pode estar circulando no Marajó uma possível novavariante antigênica (Quiropt 18867) isolada a partir de um morcego frugívoro daespécie Uroderma bilobatum capturado na localidade de Ajará, em Portel, durante aocorrência do surto em 2004. Vale ressaltar que essa informação baseia-se tantona tipificação antigênica, visto que esta amostra apresentou um padrão de leituradiferenciado das variantes antigênicas circulantes na América Latina, reagindocom os oito AcM disponíveis (C1, C4, C9, C10, C12, C15, C18, e C19), quantopelo seqüenciamento parcial do gene N, já que a análise filogenética sugeriu queesta amostra está relacionada com a variante de D. rotundus, porém apresentandodivergência genética suficiente para ser considerada como uma nova variante.

Os dados da literatura têm mostrado que morcegos frugívoros são hospedeirosde variantes antigênicas específicas, tal como a VAg4 identificada em morcegosda espécie Tadarida brasiliensis e a VAg6 identificada em morcegos Lasiurus cinereus

(Uieda, 1998; Velasco-Villa et al., 2006). Vale ressaltar que com base no estudodas caracterizações antigênicas têm sido sugeridas possíveis novas variantes comoobservado para a amostra de sagüi Callithrix jacchus isolado no Estado do Ceará(Morais et al., 2000; Favoretto et al., 2001). É interessante assinalar, no entanto,que para confirmação da hipótese de uma nova variante do vírus da raiva circulandona ilha do Marajó, estudos adicionais tornam-se necessários, incluindo acaracterização molecular completa do gene N.




De acordo com dados da Organização Pan-Americana de Saúde (OPAS),Belotto (2003) cita que entre os anos de 1995 e 2000 os morcegos hematófagosocuparam o segundo lugar na transmissão da raiva humana na América Latina,superados apenas pelos cães, e ainda mostraram que, no período, foram notificados105 casos de raiva humana transmitida por D. rotundus nas Américas, representando20% do total. A emergência dos casos de raiva transmitida por morcegos deve-seem parte à melhoria das ações dos programas de controle da raiva de animaisdomésticos, o que permitiu a redução progressiva do número de casos positivos,principalmente de cães. Em decorrência disso, o morcego tem emergido como omais importante transmissor da raiva atualmente na América Latina, como temsido descrito para os países que controlam a raiva transmitida pelos animaisdomésticos (Rupprecht, et al., 2002; Toporovski et al., 2005).

Esta situação também se reflete no Brasil, e, em particular, no Estado doPará, que, com base em um levantamento atualizado da raiva realizado no períodode 2000 a 2005, foi demonstrada uma importante diminuição do número decasos de raiva humana relacionados ao cão e um aumento considerável de casosassociados à transmissão por morcego (Travassos da Rosa, comunicação pessoal/IEC), conseqüência dos surtos notificados nos municípios paraenses de Viseu ePortel, em 2004 (Travassos da Rosa et al., 2006), e Augusto Correa, em 2005(Barbosa et al., 2008).

Finalmente, a associação de dados genéticos e ecológicos pode fornecerinformações mais precisas e melhorar o entendimento a respeito da evolução dovírus rábico e, talvez, explicar a emergência de novas variantes e linhagensgenéticas deste agente viral como resultado de fatores seletivos associados aohospedeiro, auxiliar na prevenção de futuros surtos de raiva, bem como auxiliarna melhora e desenvolvimento de medidas de controle mais eficazes para a região.

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