enzimas de restriccion

5/17/2018 enzimas de restriccion - slidepdf.com

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Enzimas de restricción y

electroforesis



Enzimas de restricción

• Son endonucleasas específicas capaces de

reconocer secuencias palindrómicas de

DNA y cortar los enlaces fosfodiéster delmaterial genético en un punto específico.

• Palindrómicas quiere decir que leen en

direcciones opuestas el mismo orden denucleótidos.

5’ G T T A A C 3’

3’ C A A T T G 5’



Tipos de endonucleasas

• Endonucleasa Tipo I – corta lejos de lasucuencia que reconoce, ya sea río arriba o

río abajo.• Endonucleasa Tipo II – cortan dentro de la

secuencia que reconocen.

• Endonucleasa Tipo III – cortan de 5-8bases antes o después de la secuencia quereconocen.




• Son suceptibles a cambios en temperatura, pH, etc.

• Estas enzimas se obtienen de células bacterianas.

• El nombre de estas está dado según el género y laespecie de la bacteria de dónde se aisló por

primera vez esta enzima.

• La primera letra representa el género de labacteria, las próximas dos indican la especie, la

cuarta letra indica la cepa y el número al final

indica el número de enzima que se ha aislado de

esa cepa.




• Por ejemplo:

EcoRI

• Otros ejemplos:

– BamHI – la primera que se aisló de la cepa H de Bacillus amyloliquefaciens

– SmaI – la primera que se aisló de Serratia marcesens

– HindIII – la tercera que se aisló de la cepa d de

Haemophilus influenzae

Escherichia

(género)coli

(especie) cepa R

Primera enzima aislada

de ese organismo.



Tipos de corte• “Sticky” o pegajosos – es

más fácil para volver a

ligarse los extremos.

– Ejms.• EcoRI

• Bam HI

• HindIII

• “Blunt” o abruptos – Ejm.

• SmaI




• Las endonucleasas son de gran importancia

para la ingeniería genética, ya que permiten

desarrollar técnicas de clonación.

• Además, te permite realizar mapas de

restricción y determinar si existe homología

entre otras moléculas de DNA.



Electroforesis

• Se define como elmovimiento departículas de cargabajo la influencia deun campo eléctrico através de un mediosemisólido.

• Este medio puede serde agarosa o depoliacrilamida.



Electroforesis

• El DNA es de carganegativa, por lo quelas partículas migran

del electrodo negativo(cátodo) al electrodopositivo (ánodo).

• Esta migración es

inversamenteproporcional al pesomolecular de lasmuestras.



Electroforesis

• Materiales necesarios para

llevar a cabo una

electroforesis:

– Gel de agarosa – generalmente se utiliza de

1% - 2% de agarosa.

– Cámara de electroforesis

– contiene los electrodos – “Power supply” – genera

el campo eléctrico



Electroforesis – Amortiguador de

electroforesis - usualmenteTBE 1X; facilita la

migración de DNA ymantiene una estabilidad

– Bromuro de etidio – compuesto carcinógeno quese entrecruza entre lasmoléculas de DNA y cuandose irradia con luz ultravioletaemite fluorescencia.



Electroforesis

– “Loading dye” – compuesto

que se añade a las muestras de

DNA; contiene glicerol, que le

da peso a la muestra y nopermite que se salgan de la fosa,

y bromofenol azul que tiñe la

muestra de color azul y sirve

como indicador de migración

– Lámpara de UV – permite ver

las bandas generadas

– Cámara – para tomar una foto

de la gel



Electroforesis

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