-En fase normal -En fase reversa -Cromatografía de ... de... · Determinación del peso molecular...

28
Cromatografía Líquida Tipos de Cromatografía Líquida (LC) - Cromatografía de reparto - En fase normal - En fase reversa - Cromatografía de exclusión molecular - Cromatografía quiral -Cromatografía de adsorción - Cromatografía de intercambio iónico (IEX) - Aniónica - Catiónica - Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) - Cromatografía de afinidad

Transcript of -En fase normal -En fase reversa -Cromatografía de ... de... · Determinación del peso molecular...

Cromatografía Líquida

Tipos de CromatografíaLíquida (LC)

-C

rom

ato

gra

fía d

e r

epart

o

-E

n f

ase

norm

al

-En fase reversa

-C

rom

ato

gra

fía d

e e

xclu

sión m

ole

cula

r

-C

rom

ato

gra

fía q

uira

l

-Cro

mato

gra

fía d

e a

dso

rció

n

-C

rom

ato

gra

fía d

e in

terc

am

bio

ión

ico (

IEX

)

-A

nió

nic

a

-C

atió

nic

a

-C

rom

ato

gra

fía d

e in

tera

cció

n h

idro

fóbic

a(H

IC)

-Cromatografía de afinidad

Cromatografía Líquida

Cromatografíade reparto

-E

l soport

e t

iene n

atu

rale

za in

ert

e.

Los

com

puest

os

de la

muest

ra

no in

tera

ccio

na

n c

on la

matr

iz s

ino c

on e

l flu

ido q

ue la

solv

ata

, que e

s la

verd

adera

fase

est

aci

on

aria.

-C. líquido-líquido.

La f

ase

est

aci

on

aria lí

quid

a s

e r

etie

ne

sobre

la s

uperf

icie

de

l soport

e p

or

adso

rció

n f

ísic

a.

-C. de fase unida químicamente.

La f

ase

est

aci

onari

a s

e

une q

uím

icam

ente

a la

sup

erf

icie

del s

oport

e.

-E

l mate

rial d

e p

art

ida s

op

ort

e p

ara

pre

para

r la

fase

est

aci

onari

a

es

sílic

e.

Part

ícula

s m

ecá

nic

am

ente

resi

sten

tes,

poro

sas

y unifo

rmes

de d

iám

etr

o d

e 3

, 5

o 1

0 µ

m.

-La s

ílice

se h

idro

liza p

ara

lib

era

r gru

pos

sila

nol,

qu

e s

e p

uede

n

deriva

tizar

fáci

lmente

.

En g

enera

l la d

eriva

tizaci

ón

no e

s to

tal p

or

impedim

ento

est

érico

. Los

gru

pos

–O

Hlib

res

se p

ue

den b

loqu

ear

con m

olé

cula

s pequ

eñas

para

evi

tar

efe

ctos

rela

ciona

dos

con la

po

lari

dad

.

-Si-OH

-Si-OH

-Si-OH

-Si-OH

-Si-OH

-Si-OH

-Si-OH

-Si-OH

-Si-OH

-Si-OH

-Si-OH

-Si-OH

-Si-OH

-Si-OH

-Si-OH

-Si-OH

-Si-OH

Cromatografía Líquida

Cromatografíade reparto en fase norm

al

-U

so d

e f

ase

est

aci

onari

a p

ola

r y

de u

n d

iso

lvente

apo

lar

com

o f

ase

m

óvi

l.

-Los

relle

nos

com

erc

iale

s de f

ase

norm

al u

nid

a q

uím

icam

ente

tie

nen

com

o g

rup

o o

rgánic

o e

n la

ca

dena d

el s

iloxa

no

un g

rupo f

unci

on

al

pola

r:

cian

o<

dio

l< a

min

o

-E

l com

pone

nte

menos

po

lar

elu

yepri

mero

debid

o a

qu

e

rela

tivam

ente

es

más

solu

ble

en la

fase

móvi

l.

-El o

rden d

e p

ola

ridad

es

para

los

gru

pos

funci

on

ale

s m

ás

com

unes

en

los

ana

litos

es:

hidrocarburo < éter < cetona < aldehído < amina < alcohol < carboxílico

-U

n a

um

ento

de la

po

lari

dad

de la

fase

móvi

l pro

voca

la d

ism

inuci

ón

del t

iem

po d

e e

luci

ón.

-Los

dis

olv

ente

s util

iza

dos

com

o f

ase

móvi

l son m

uy

apola

res

com

o

cloro

form

o,

die

tilete

r, h

exa

no.

Cromatografía Líquida

Cromatografíade reparto en fase reversa

La

hid

rólis

is d

el

xilo

xan

oo

curr

e a

va

lore

s d

e p

H p

or

en

cim

a d

e 7

.5

-El 7

5%

de

to

da

la c

rom

ato

gra

fía

de

alta

efic

aci

a s

e r

ea

liza

co

n

est

a t

écn

ica

.

-L

a f

ase

est

aci

ona

ria

es

s h

idro

fób

ica

qu

e la

fa

se m

óvi

l.

-E

n r

elle

no

s C8

(oct

ilo)

y C18

(oct

ad

eci

lo)

los

gru

po

s h

idro

carb

uro

se

alin

ea

n u

no

jun

to a

otr

o y

en

pe

rpe

nd

icu

lar

a la

su

pe

rfic

ie d

e la

p

art

ícu

la,

da

nd

o lu

ga

r a

un

a e

stru

ctu

ra s

imila

r a

un

a b

roch

a.

Grupo silanollibre

Grupo octadecilo

Bloqueo de grupos silanol

Cromatografía Líquida

Cromatografíade reparto en fase reversa

-U

so d

e gradientes

de

pro

po

rció

n d

e d

iso

lve

nte

org

án

ico

, d

esd

e u

n a

lto c

on

ten

ido

a

cuo

so e

n c

on

dic

ion

es in

icia

les

a m

ayo

r co

nte

nid

o o

rgá

nic

o p

ara

fa

cilit

ar

la e

luci

ón

de

lo

s co

mp

ue

sto

s m

ás

ap

ola

res.

Aju

sta

los t R

y d

ism

inu

ye e

l en

san

cha

mie

nto

de

ba

nd

a.

-L

a temperatura

es

otr

o f

act

or

crít

ico

en

cro

ma

tog

rafí

a e

n f

ase

re

vers

a.

La

vis

cosi

dad

d

e la

fa

se m

óvi

l dis

min

uye

co

n m

ayo

res

tem

pe

ratu

ras

de

co

lum

na

, y

po

r e

llo la

tra

nsf

ere

nci

a d

e m

asa

en

tre

la f

ase

vil y

la e

sta

cio

na

ria

es

me

jor

y la

re

solu

ció

n

au

me

nta

. L

a t

em

pe

ratu

ra d

e la

co

lum

na

se

co

ntr

ola

y f

ija.

-L

as

ap

lica

cio

ne

s d

e e

sta

cnic

a s

on

mu

cha

s, p

ero

en

ge

ne

ral s

e a

plic

a a

l an

ális

is d

e

mo

lécu

las

pe

qu

eña

s, in

clu

yen

do

me

tab

olit

os

o f

árm

aco

s.

-E

l re

cub

rim

ien

to e

nla

zad

o s

e p

ue

de

tra

tar

com

o s

i fu

era

un

líq

uid

o

con

ven

cio

nal

re

ten

ido

fís

ica

me

nte

sim

ilar

a u

na

fa

se e

sta

cio

na

ria

de

líq

uid

o-l

íqui

do

ord

ina

ria

(C

. d

e r

ep

art

o).

-Lo

s d

isol

ven

tes

s u

tiliz

ad

os

com

o f

ase

vil s

on a

gu

a c

on

p

rop

orc

ion

es

vari

ab

les

de

ace

ton

itrilo

y/o

me

tan

ol.

-El c

om

po

ne

nte

s p

ola

r d

e la

mu

est

ra e

luye

pri

me

ro

-M

od

ifica

r e

l factor de retención, k’

es

lo n

orm

al p

ara

me

jora

r la

re

solu

ció

n d

e la

se

pa

raci

ón

. E

llo s

e h

ace

va

ria

nd

o la

po

lari

da

d d

e la

fa

se m

óvi

l, co

n la

pro

po

rció

n d

e d

isol

ven

tes

po

lare

s/a

po

lare

s. U

na

d

ism

inu

ció

n d

e la

po

lari

da

d d

e la

fa

se m

óvi

l pro

voca

la d

ism

inu

ció

n d

el t

iem

po

de

elu

ció

n.

Cromatografía Líquida

Cromatografíade exclusión molecular / filtración en gel

-C

rom

ato

gra

fía

de r

epart

o e

n la

que la

fase

est

aci

onari

a

est

áco

nst

ituid

a p

or

el l

íqu

ido

atr

apado e

n lo

s poro

s de la

m

atr

iz.

-No h

ay

inte

racc

ión c

on la

matr

iz d

e n

ingún t

ipo p

or

lo q

ue la

co

mposi

ción d

e la

fase

móvi

l no e

s ta

n d

ete

rmin

ante

com

o

en o

tras

técn

icas.

-Elu

ció

n is

ocr

átic

a.

Para

evi

tar

inte

racc

iones

inesp

ecí

ficas

se

suele

añad

ir N

aC

l. C

on

dic

ion

es

norm

ale

s so

n t

am

pón f

osf

ato

dic

o 2

0 m

M,

pH

7.0

, co

n N

aC

l0.1

5 M

.

-U

so d

e d

iso

luci

ones

tam

pon

adas

para

la s

epara

ción d

e

macr

om

olé

cula

s (p

rote

ínas)

en f

unci

ón d

el t

am

año.

-Las

separa

cio

nes

se p

ue

den

lleva

r a c

ab

o e

n la

pre

senci

a

de io

nes

metá

licos

ese

nci

ale

s o c

ofa

ctore

s, y

usa

ndo

dete

rge

nte

s, u

rea o

gua

nid

ina

. T

am

bié

n s

e p

uede v

ari

ar

la

conce

ntr

aci

ón d

e s

ale

s o la

tem

pera

tura

en f

unci

ón d

el

exp

erim

ento

.

Cromatografía Líquida

Cromatografíade exclusión molecular / filtración en gel

-Lo

s co

mp

on

en

tes

s g

ran

de

s d

e la

mu

est

ra

elu

yen

pri

me

ro a

l no

p

en

etr

ar

en

los

po

ros.

L

os

s p

eq

ue

ño

s p

asa

n p

or

tod

os

los

po

ros

y su

tie

mp

o d

e

elu

ció

n (t R

) e

s m

ayo

r.

-La

ma

triz

s h

ab

itua

l es

de

xtra

no

en

tre

cru

zad

o.

Fra

ccio

na

mie

nto

de

pro

teín

as

en

fu

nci

ón

de

su

tam

o.

Cromatografía Líquida

Cromatografíade exclusión molecular / filtración en gel

Ve

= V

0+

Kd�V

i

Kd

= (

Ve-V

0)/

Vi=

c S/c

M

Aplic

aci

ón.

Dete

rmin

aci

ón d

el p

eso

mole

cula

r de p

rote

ínas

Vt=

V0+

Vi+

Vg

V0

Ve

Vt-V0

Vt

Volu

men

Señal

Tam

año

inte

rmed

io

Inyección

Gran tamaño

Pequeño tamaño

(Vo

l. to

tal)

(

Vo

l. m

ue

rto

)

Vt

V0

Vt-V0

Vi(V

ol.

inte

rno)

Vg

(Vol.

del g

el/m

atr

iz)

Cromatografía Líquida

Cromatografíade exclusión molecular / filtración en gel

Aplic

aci

ón.

Dete

rmin

aci

ón d

el p

eso

mole

cula

r de p

rote

ínas

Kav

es

fáci

lme

nte

ca

lcu

lab

le y

pe

rmite

la d

ete

rmin

aci

ón

de

pe

sos

mo

lecu

lare

s só

lo m

idie

nd

o lo

s vo

lúm

en

es

de

elu

ció

n d

e la

m

ue

stra

y e

stá

nd

are

s (i

ncl

uye

nd

o p

ara

V0

y Vt)

.

00

VV

VV

Kte

av

−−=

i

e

gt

ed

V

VV

VV

V

VV

K0

0

0−

=−

−=

V0

Ve

Vt-V0

Vt

Volu

men

Señal

Tam

año

inte

rmed

io

Inyección

Gran tamaño

Pequeño tamaño

Cromatografía Líquida

Cromatografíade exclusión molecular / filtración en gel

Aplic

aci

ón.

Dete

rmin

aci

ón d

el p

eso

mole

cula

r de p

rote

ínas

Pu

rific

ació

n d

e u

na

e

nzi

ma

po

r cr

om

ato

gra

fía

d

e f

iltra

ció

n e

n g

ele

n

de

xtra

no

en

tre

cru

zad

o.

Ka

v

log

Peso

mole

cula

r

Cromatografía Líquida

Cromatografíade exclusión molecular / filtración en gel

-S

ep

ara

ció

n e

n g

rup

os,

m

olé

cula

s p

eq

ue

ña

s fr

en

te a

m

acr

om

olé

cula

s, s

in u

n

fra

ccio

na

mie

nto

de

las

mis

ma

s.

-U

tilid

ad

en

“desalar”

mu

est

ras

bio

lóg

ica

s, p

ara

e

limin

ar

ráp

idam

en

te

tam

po

ne

s o

sa

les

pro

ven

ien

tes

de

pa

sos

de

e

xtra

cció

n o

pu

rific

aci

ón

.

-L

as

ma

triz

s u

tiliz

ad

as

es

sefa

rosa

en

tre

cru

zad

a.

Aplic

aci

ón.

Elim

inaci

ón d

e t

am

pones

y sa

les

(desa

ltin

g)

señal

tiem

po

/ v

olu

me

n

Inyección

V0

Vt

pro

teín

a

sal

Cromatografía Líquida

Cromatografíaquiral

-S

ep

ara

ció

n d

e m

olé

cula

s ó

ptic

ame

nte

act

iva

s (c

on

ce

ntr

os

qu

ira

les)

.

-Q

uir

ale

s a

qu

ella

mo

lécu

la n

o s

upe

rpo

nib

le c

on

su

ima

ge

n

esp

ecu

lar.

-Im

po

rta

nci

a b

ioqu

ímic

a y

po

r e

llo, e

n la

ind

ust

ria

fa

rma

ceú

tica

. E

l 60

% d

e lo

s m

ed

ica

me

nto

s so

n q

uir

ale

s, y

d

e e

llos

el 4

5%

se

ve

nd

en

co

mo

ra

cem

ato

s.

-L

as

ún

ica

s d

ifere

nci

as e

ntr

e e

na

ntió

me

ros

se o

bse

rva

n e

n

entornos quirales

.

-P

ara

la s

ep

ara

ció

n c

rom

ato

grá

fica

se

ne

cesi

ta u

na

fa

se

est

aci

on

ari

a q

uira

l. S-quetoprofeno

R-quetoprofeno

An

alg

ésic

o,

an

tiin

flam

ato

rio

Pre

vie

ne

rdid

a d

e h

ue

so p

eri

od

on

tal

Cromatografía Líquida

Matriz

Cromatografíaquiral

-In

mo

viliz

aci

ón

de

un

a m

olé

cula

qu

ira

lqu

e in

tera

ccio

na

co

n

la m

ue

stra

.

-E

l re

con

oci

mie

nto

imp

lica

inte

racc

ion

es d

e p

ue

nte

de

h

idró

ge

no

, d

ipo

lare

s, t

ran

sfe

ren

cia

de

ca

rga

y/o

de

blo

qu

eo

est

éri

co.

Componente quiral

Aplicación

(R)-

fen

ilglic

ina

ést

ere

s, a

mid

as,

(R

)-n

aft

ilglic

ina

alc

oh

oles

, ce

ton

as

(S)-

valin

c. c

arb

oxí

lico

s(S

)-le

uci

na

(S)-

pro

lina

am

ina

s, a

mid

as,

(S)-

ind

olin

e-c

arb

oxí

lico

am

ino

alc

hol

es

Eje

mpl

os

Cromatografía Líquida

Cromatografíade adsorción

-La m

atr

iz in

tera

ccio

na r

eve

rsib

lem

ente

con

todos

o p

art

e d

e lo

sco

mpon

ente

s de la

muest

ra.

-T

écn

icas

dife

rente

s en f

unci

ón d

el t

ipo d

e in

tera

cció

n q

ue s

e u

tilic

e.

Proceso general:

1. Equilibrado.

Condic

ione

s in

icia

les

para

que

inte

racc

ionen

las

molé

cula

s de

la m

ues

tra

2. Aplicación y

Adsorción.

Los

co

mpone

ntes

que

no s

e u

nen

son la

vados

de

la c

olu

mna

.

3. Desorción.

Condic

ione

s de

elu

ción

que

perju

dic

an la

in

tera

cció

n c

on

la m

atr

iz.

Pas

os

o g

radie

nte

.

4. Lavado.

Condic

ione

s de

elu

ción

más

drá

stic

as

para

que

elu

yael

rest

o d

e co

mpone

ntes

.

5. Regeneración.

Re-e

quili

brado

de

las

cond

icio

nes

inic

iale

s para

la

siguie

nte

separa

ción

crom

atog

ráfic

a.

Cromatografía Líquida

Cromatografíade intercambio iónico (IEX)

-E

s u

na

cro

ma

tog

rafí

a d

e a

dso

rció

n q

ue

se

ba

sa e

n la

s fu

erz

as

ele

ctro

stá

tica

s cr

ea

da

s e

ntr

e la

s e

spe

cies

de

la m

ue

stra

y la

fa

se e

sta

cio

na

ria

.

-L

a s

ep

ara

ció

n d

ep

en

de

de

la a

dso

rció

n r

eve

rsib

le d

e la

s m

olé

cula

s ca

rga

da

s d

e

solu

to e

n lo

s g

rup

os

inte

rca

mb

iad

ore

s d

e io

ne

s d

e c

arg

a o

pu

est

a.

Pro

ceso

:

1. Equilibrado.

2. Aplicación y

Adsorción.

3. Desorción.

4. Lavado.

5. Regeneración.

+++ +

+

++

++

+++

++

-o

++ +

+++

++

++

++

Cromatografía Líquida

Cromatografíade intercambio iónico (IEX)

-Pu

est

o q

ue

la s

ep

ara

ció

n d

ep

en

de

de

la c

arg

a,

el p

H d

e la

fa

se m

óvi

l es

un

fa

cto

r cr

ític

o e

n I

EX

.

Pa

ra la

s m

olé

cula

s d

e la

mu

est

ra,

la c

arg

a e

s m

ayo

r cu

an

to m

ás

ale

jad

o e

sté

el p

H

de

la f

ase

vil d

el v

alo

r d

e s

u p

un

to is

oe

léct

rico

:

pH

= p

I→

z =

0

pH

< p

I→

z =

(+

)p

H >

pI

→z

= (

-)

-Lo

s d

isol

ven

tes

s u

tiliz

ad

os

com

o f

ase

vil s

on a

gu

a c

on

su

sta

nci

as

tam

po

na

do

ras

a b

aja

co

nce

ntr

aci

ón

(2

0-5

0 m

M)

al p

H e

leg

ido

pa

ra la

s co

ndi

cio

nes

in

icia

les.

-La

elu

ció

n d

e la

s e

spe

cies

re

ten

ida

s se

pu

ed

e ll

eva

r a

ca

bo

ca

mb

ian

do

el p

H d

el

me

dio

o a

um

en

tan

do

la f

ue

rza

ión

ica

(g

en

era

lme

nte

). E

l uso

de

sa

les

ap

ort

a lo

s co

ntr

a-i

on

es

ne

cesa

rio

s p

ara

la f

ase

est

aci

on

ari

a.

Así

com

pite

n c

on

las

carg

as

de

lo

s co

mp

on

en

tes

de

la m

ue

stra

.

-E

l co

mp

on

en

te q

ue

te

ng

a m

ayo

r ca

rga

co

ntr

ari

a a

la f

ase

est

aci

on

ari

a q

ue

da

s re

ten

ido

y e

luye

s ta

rde

.

Cromatografía Líquida

Cromatografíade intercambio iónico (IEX)

Matr

ices:

IE

X a

nió

nic

a y

catió

nic

a

Intercambiadores fuertes (Q y S)

-In

tera

cció

n m

ás

fue

rte

-S

ufr

en

me

no

s va

ria

cio

nes

en

su

ca

pa

cid

ad

de

ca

rga

en

fu

nci

ón

de

l pH

-R

an

go

ma

yor

de

pH

de

tra

ba

jo

Intercambiador aniónico,

con c

ontr

aio

nes

--

--

-

-

-

+++ + +

Intercambiador catiónico,

con c

ontr

aio

nes

+

--- - -

+

+ +

++

Intercambiadores aniónicos

Grupo funcional

Die

tilam

inoet

il(D

EA

E)

-O-C

H2-C

H2-N

+H

(CH

2C

H3) 2

Am

onio

cuat

ern

ario

(Q

)-O

-CH

2-C

HO

H-C

H2-

O-C

H2-C

HO

H-C

H2-

N+(C

H3) 3

Intercambiadores catiónicos

Grupo funcional

Carb

oxi

metil

(CM

)-O

-CH

2-C

OO

-

Metil

sulfo

nat

o(S

)-O

-CH

2-C

HO

H-C

H2-

O-C

H2-C

HO

H-C

H2S

O3

-

Cromatografía Líquida

Cromatografíade intercambio iónico (IEX)

Aplic

aci

on

es -E

s la

técn

ica c

rom

ato

grá

fica

más

frecu

ente

en la

en la

se

para

ción y

purific

aci

ón (

fáci

lmente

esc

ala

ble

a e

scala

se

mi-

pre

para

tiva)

de

pro

teín

as,

polip

éptid

os,

áci

do

s nucl

eic

os

y otr

as

bio

mo

lécu

las

carg

adas.

-S

e s

uele

util

izar

com

o p

rim

er

paso

en u

na e

stra

tegia

co

mbin

ada d

e p

urific

aci

ón d

e p

rote

ínas

por

su a

lta c

apaci

da

d

de c

arg

a y

lim

itado e

fect

o e

n la

est

ruct

ura

/ a

ctiv

idad.

Eje

mplo

Pu

rific

ació

n d

e u

na

e

nzi

ma

po

r cr

om

ato

gra

fía

d

e in

terc

am

bio

an

ióni

co,

en

un

a c

olu

mn

a d

em

atr

iz d

e p

olie

stire

no

y d

ivin

ilbe

nze

no

(15

µm

de

ta

ma

ño

de

pa

rtíc

ula

) d

eri

vatiz

ad

aco

n g

rup

os

trim

etil

am

on

io(Q

).

12

34

Cromatografía Líquida

Cromatografíade interacción hidrofóbica(HIC)

-C

rom

ato

gra

fía

de

ad

sorc

ión

qu

e s

e b

asa

en

las

inte

racc

ion

es

hid

rofó

bic

as

cre

ad

as

en

tre

las

esp

eci

es d

e la

mu

est

ra y

un

a f

ase

est

aci

ona

ria

hid

rofó

bic

a.

-L

a s

ep

ara

ció

n d

ep

en

de

de

la a

dso

rció

n r

eve

rsib

le d

e la

s p

art

es

hid

rofó

bic

as

de

las

mo

lécu

las

(“p

arc

he

s h

idro

fób

ico

s”e

n e

l ca

so d

e p

rote

ína

s).

-A

dso

rció

n p

rop

icia

da

po

r sa

les

anti-

cao

tró

pic

as

(pro

pic

ian

el o

rde

n e

n la

s m

olé

cula

s d

e a

gu

a y

est

ab

iliza

n in

tera

ccio

ne

s in

tra

mo

lecu

lare

s d

e t

ipo

no

co

vale

nte

y

no

ión

ico

: h

idro

fób

ica

s, v

an

de

rW

aa

lsy

pu

en

tes

de

hid

róg

en

o),

qu

e s

on

fo

rma

do

ras

de

est

ruct

ura

s. S

on

las

mis

ma

s sa

les

resp

on

sab

les

del

efe

cto

“sa

ltin

g-

ou

t”e

n la

pre

cip

itaci

ón

fra

ccio

na

da d

e p

rote

ína

s.

matriz

matriz

ligando

ligando

Cromatografía Líquida

Cromatografíade interacción hidrofóbica(HIC)

-Matriz -L

a s

ep

ara

ció

n d

ep

en

de

de

la a

dso

rció

n r

eve

rsib

le d

e la

s m

olé

cula

s a

la

ma

triz

qu

e e

stá

de

riva

tiza

da

con

gru

po

s h

idro

fób

ico

sa

lqu

ilo o

ari

lo.

-E

n g

en

era

l, ca

de

na

s lin

ea

les

hid

roca

rbo

na

da

s(a

lqu

ilo)

mu

est

ran

un

ca

ráct

er

hid

rofó

bic

op

uro

, m

ien

tra

s q

ue

los

ligan

do

tip

o a

rilo

tie

ne

n u

n t

ipo

d

e c

om

po

rta

mie

nto

mix

to d

on

de

las

inte

racc

ion

es

aro

tica

sse

su

ma

n a

la

s h

idro

fób

ica

s.

-La

ca

pa

cid

ad

de

ca

rga

au

me

nta

co

n la

lo

ng

itud

de

la c

ad

en

a c

arb

on

ad

a,

pa

ra

un

mis

mo

gra

do

de

su

stitu

ció

n.

-L

a e

lecc

ión

en

tre

lig

an

do

sa

lqu

ilo o

a

rilo

es

em

pír

ica

y d

eb

e s

er

est

ud

iad

a

pa

ra c

ad

a s

ep

ara

ció

n c

rom

ato

grá

fica

.

Cromatografía Líquida

Cromatografíade interacción hidrofóbica(HIC)

-Fase móvil

-L

a a

dic

ión

de

sa

les

an

tica

otr

óp

ica

s(‘‘

salti

ng

ou

t’’)

al t

am

n d

e

eq

uili

bri

o y

a la

mu

est

ra a

nte

s d

e s

u in

yecc

ión

, p

rom

ue

ven

las

inte

racc

ion

es

en

tre

las

mo

lécu

las

de

la m

ue

stra

y e

l lig

an

do

de

la

ma

triz

.

-E

n e

l ca

so d

e p

rote

ína

s, e

l au

me

nto

en

la c

on

cen

tra

ció

n d

e

sale

s p

rovo

ca u

n a

um

en

to e

n la

ca

ntid

ad

de

pro

teín

a u

nid

a d

e

ma

ne

ra li

ne

al h

ast

a u

na

co

nce

ntr

aci

ón

de

sa

l, y

a p

art

ir d

e a

el

au

me

nto

co

ntin

úa

de

ma

ne

ra e

xpo

ne

nci

al a

la c

on

cen

tra

ció

n d

e

sal.

-Se

rie

de

Hofmeister

pa

ra la

pre

cipi

taci

ón

de

pro

teín

as:

Mayo

r efe

cto d

e p

reci

pita

ción (

“sa

lting-o

ut”

)

Anio

nes:

PO

43- ,

SO

42- ,

CH

3-C

OO

- , C

l- , B

r- , N

O3

- , C

lO4

- , I- ,

SC

N-

Catio

nes:

NH

4+,

Rb

+,

K+,

Na

+,

Cs+

, Li+

, M

g2+,

Ca

2+,

Ba2

+

Ma

yor

efe

cto c

aotr

ópic

o(“

salti

ng

in”)

Cromatografía Líquida

Cromatografíade interacción hidrofóbica(HIC)

-A

dso

rció

n p

rop

icia

da

po

r la

s sa

les

“sa

ltin

go

ut”

.

-La

elu

ció

n s

e p

rovo

ca c

on

un

de

sce

nso

en

la c

on

cen

tra

ció

n d

e la

sa

l de

la f

ase

vil.

-S

ep

ara

ció

n d

e lo

s co

mp

on

en

tes

de

la m

ue

stra

en

fu

nci

ón

de

los

gru

po

s h

idro

fób

icos

exp

ue

sto

s e

n la

su

pe

rfic

ie.

-A

ten

ció

n e

n e

l tra

ba

jo c

on

pro

teín

as

pa

ra e

vita

r co

nd

icio

nes

mu

y d

rást

ica

s (t

ipo

de

lig

an

do

pri

nci

pal

me

nte

) q

ue

afe

cte

n ir

reve

rsib

lem

en

te a

la e

stru

ctu

ra d

e la

pro

teín

a

(de

sna

tura

liza

ción

).

1. Equilibrado.

2. Aplicación y

Adsorción.

3. Desorción.

4. Lavado.

5. Regeneración.

↑(N

H4) 2

SO

4↑

(NH

4) 2

SO

4↓

(NH

4) 2

SO

4↑

(NH

4) 2

SO

4(N

H4) 2

SO

4

Cromatografía Líquida

Cromatografíade interacción hidrofóbica(HIC)

-L

a b

ase

pa

ra a

l ad

sorc

ión

de

bio

mo

lécu

las

a lo

s m

ed

ios

de

cro

ma

tog

rafí

a d

e

inte

racc

ión

hid

rofó

bic

ae

s co

mp

lem

en

tari

a a

los

de

la c

rom

ato

gra

fía

de

in

terc

am

bio

ión

ico

y f

iltra

ció

n e

n g

el.

Po

r e

llo p

ue

de

util

iza

rse

en

est

rate

gia

s co

mb

ina

da

s d

e p

uri

fica

ció

n.

-H

IC e

s lo

su

ficie

nte

me

nte

se

nsi

ble

co

mo

pa

ra s

er

influ

en

cia

da

po

r la

p

rese

nci

a d

e g

rup

os

no

-po

lare

s n

orm

alm

en

te e

sco

nd

ido

s e

n la

est

ruct

ura

te

rcia

ria

de

pro

teín

as

pe

ro q

ue

pu

ed

en

se

r e

xpu

est

os

si la

ca

de

na

p

olip

ep

tídic

a n

o e

stá

corr

ect

am

en

te p

leg

ad

a.

Pu

rific

ació

n d

e u

na

e

nzi

ma

po

r cr

om

ato

gra

fía

d

e in

tera

cció

n h

idro

fób

ica

, e

n u

na

co

lum

na

de

ma

triz

de

po

liest

iren

oy

div

inilb

en

zen

o(1

5 µ

md

e

tam

o d

e p

art

ícu

la)

de

riva

tiza

da

con

gru

po

s is

op

rop

ilo(I

SO

).

Eje

mplo

12

34

Cromatografía Líquida

Cromatografíade afinidad

-S

epara

r bio

molé

cula

s(p

rote

ínas)

en b

ase

a u

na in

tera

cció

n r

eve

rsib

le

entr

e u

na p

rote

ínas

(o g

rupo d

e p

rote

ínas)

y u

n li

gand

o e

specí

fico

aco

pla

do a

un

a m

atr

iz c

rom

ato

grá

fica.

-La t

écn

ica e

s id

eal p

ara

la c

aptu

ra d

e b

iom

olé

cula

ssi

em

pre

que e

xist

a

un li

gand

o d

isp

onib

le p

ara

la p

rote

ína d

e in

teré

s.

-T

iene m

uy

alta

sele

ctiv

idad y

por

ello

alta

reso

luci

ón.

Así

mis

mo s

uele

te

ner

gra

n c

ap

aci

da

d d

e c

arg

a d

e la

pro

teín

a d

e in

teré

s, a

lto r

endim

iento

y

mu

y alta

purific

aci

ón d

e la

muest

ra.

-Las

pro

teín

as

obj

etiv

o s

e r

eco

gen e

n u

na f

orm

a p

urific

ada y

co

nce

ntr

ada.

-Las

inte

racc

ion

es

entr

e la

pro

teín

a y

su li

ga

ndo p

ue

den s

er

el r

esu

ltado

de in

tera

ccio

ne

s ele

ctro

státic

as,

hid

rofó

bic

as,

de f

uerz

as

de v

an d

er

Waals

y/o p

ue

nte

de h

idró

ge

no.

Cromatografía Líquida

Cromatografíade afinidad

-Un

a p

uri

fica

ció

n e

xito

sa r

eq

uie

re u

n li

ga

nd

o b

io-e

spe

cífic

o q

ue

pu

ed

a s

er

un

ido

co

vale

nte

me

nte

a u

na

ma

triz

cro

ma

tog

ráfic

a.

-E

l lig

an

do

aco

pla

do

a la

ma

triz

de

be

re

ten

er

su c

ap

aci

da

d d

e u

nió

n e

spe

cífic

a p

or

las

mo

lécu

las

ob

jetiv

o y

, d

esp

s d

e la

var

el m

ate

ria

l qu

e n

o h

a in

tera

ccio

na

do

, la

u

nió

n e

ntr

e e

l lig

an

do

y la

pro

teín

a o

bje

tivo

de

be

se

r re

vers

ible

pa

ra p

erm

itir

elu

ira

la

pro

teín

a e

n u

na

fo

rma

act

iva

.

-C

ua

lqui

er

com

po

ne

nte

se

pu

ed

e u

sar

com

o li

ga

ndo

pa

ra u

nir

a u

na

pa

reja

.

-In

tera

ccio

ne

s b

ioló

gica

s tí

pic

as

usa

da

s e

n c

rom

ato

gra

fía

de

afin

ida

d s

on

:

•E

nzi

ma

↔a

log

o d

e s

ust

rato

, in

hibi

do

r, c

ofa

cto

r

•A

ntic

ue

rpo

↔a

ntí

ge

no

, vi

rus,

lula

•L

ect

ina

↔p

olis

acá

rid

o,

glic

op

rote

ína

, re

cep

tor

de

su

pe

rfic

ie c

elu

lar,

lula

•Á

cid

o n

ucl

eico

↔se

cue

nci

a c

om

ple

me

nta

ria

, h

isto

na

s, p

olim

era

sa,

pro

teín

a d

e u

nió

n a

l AD

N

•H

orm

on

a,

vita

min

a ↔

rece

pto

r, p

rote

ína

tra

nsp

ort

ad

ora

•G

luta

tión

↔p

rote

ína

s d

e f

usi

ón

GS

T o

glu

tatió

n-S

-tra

nsf

era

sa

•Io

ne

s m

etá

licos

(N

i) ↔

pro

teín

as

de

fu

sió

n P

oly

-His

, p

rote

ína

s n

ativ

as

con

h

istid

ina

sci

ste

ína

sy/

o t

rip

tófa

no

se

n s

u s

up

erf

icie

.

Cromatografía Líquida

Cromatografíade afinidad

-A

dso

rció

n p

rop

icia

da

po

r u

n t

am

n d

e u

nió

n

(“b

ind

ing

bu

ffe

r”)

qu

e

fom

en

ta la

inte

racc

ión

.

-Mu

est

ra a

plic

ad

a e

n la

s m

ism

as

con

dic

ion

es.

La

m

olé

cula

ob

jetiv

o s

e u

ne

al

liga

nd

o.

-L

a m

olé

cula

ob

jetiv

o s

e

recu

pe

ra c

am

bia

nd

o la

s co

nd

icio

ne

s p

ara

fa

vore

cer

la e

luci

ón

. P

ue

de

se

r u

na

e

luci

ón

esp

ecí

fica

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1. Equilibrado.

2. Aplicación y

Adsorción.

3. Desorción.

5. Regeneración.

Pro

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Cromatografía Líquida

Cromatografíade afinidad

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Cromatografía Líquida

Ni2+

Matriz

Ni2+

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Proteína

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Cromatografíade afinidad

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Lavado 1

Lavado 2 -

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