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Produção e Manipulação de Pré-embriões

Biotecnologia da Reprodução

Marcel Frajblat Universidade Federal do Rio de Janeiro

Fertilização in vitro

Inseminação artificial Transferência de embriões

Criopreservação de gametas

Biotecnologia da Reprodução

Biopsia de embrião

Cultura de folículos pré-antrais

Clonagem

Produção de animais transgênicos

Cultura de células-tronco

Banco genético de espécies em

extinção

ICSI

Determinação genética pré-implante

Cultura de espermatogônias

Sexagem de espermatozóides em

embriões

Vitrificação de Oócitos e ovários

Controle hormonal da reprodução

ü Oócitos ü Fertilização ü Pró-núcleos ü Singamia ü Zigoto ü Clivagens ü Mórula ü Blastocisto ü Eclosão ü Implantação

Biotecnologia da Reprodução

Produção Animal

Reprodução Humana

Pesquisa Básica

Biologia da Conservação

Biotecnologia da Reprodução Produção animal

ü Inseminação artificial ü Transferência de embriões. ü Produção in vitro de embriões. ü Utilização de animais inférteis. ü Utilização de maior variedade de machos. ü Sincronização do Cio. ü Detecção da ovulação. ü Criopreservação de sêmen e embriões. ü Clonagem

Biotecnologia da Reprodução Biologia da Conservação

ü Criopreservação ü Sêmen ü Testículo ü Oócito ü Tecido ovariano ü Embriões

ü Inseminação. ü Fertilização in vitro. ü Clonagem

Biotecnologia da reprodução Infertilidade humana

ü  Infertilidade ü  Baixo número de espermatozóides ü  Inseminação artificial ü  Fertilização in vitro, ICSI ü  PGD - diagnostico genético pré-implante ü  Eclosão assistida. ü  Punção de epidídimo e testículo ü Criopreservação

ü  Sêmen ü Oócito ü  Tecido ovariano

Biotecnologia da Reprodução Pesquisa cientifica

Pesquisa básica ü  Ferramenta/modelo de pesquisa ü  Embriologia, angiogênese, implantação, placentação,

toxicologia, farmacologia, biologia celular, fisiologia, metabolismo celular, mutação cromossômica entre outras.

Pesquisa Aplicada ü  Aumento das taxas de fertilização. ü Meios de cultura específicos. ü  Fatores que afetam os gametas ü  Produção de animais geneticamente modificados.

Desenvolvimento Embrionário

•  Fertilização •  Clivagem •  Compactação da mórula •  Cavitação •  Expansão do blastocisto •  Eclosão do blastocisto

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Fisiologia Reprodutiva Camundongo

Mus musculus

Excelente estratégia reprodutiva Ciclo extremamente inteligente

Dados Reprodutivos Puberdade macho 28-49 dias Puberdade fêmea 28-49 dias Período de cruzamento Todo o ano Gestação 19-21 dias # filhotes 4 – 12 filhotes Peso ao nascer 1,0-1,5 gm Desmama 21 dias Ciclo estral 4-5 dias Ovulação Período escuro Ovulação pós nascimento

14-24 hr após nascimento

4-5 dias

Cruzamento com vasectomizado

Ov Ov Ov

4-5 dias 4-5 dias 4-5 dias 4-5 dias 4-5 dias

Ov Ov Ov Ov Ov Ov

12-14 dias

Ciclo estral com e sem cruzamento

4-5 dias

Ov Ov Ov

21 dias

Cruzamento com macho fértil

Pseudoprenhes

Prenhes

Citologia do

Ciclo Estral

Ø Proestro Ø Estro Ø Metaestro Ø Diestro

Citologia Vaginal Esfregaço vaginal

Lavado vaginal

Estimulação Hormonal

Superovulação

Superovulação ü O camundongo é um dos animais que

melhor responde a superovulação. ü Utilização de hormônios para induzir o

crescimento e ovulação de um maior número de folículos ovarianos.

Hormônios mais utilizados Estímulo do crescimento folicular: ü Gonadotrofina coriônica eqüina (eCG) ou gonadotropina de égua prenhe (PMSG). ü Novormon (Syntex – Tecnopec) ü Folligon (Intervet)

FSH Estímulo do pico de LH e ovulação: ü Gonadotrofina coriônica humana (hCG). ü Vetecor (Callier)

v 2,5 – 10 UI de eCG v 2,5 – 10 UI de hCG 46-48

horas após eCG. v Colocar fêmeas em contato

com machos durante a noite. v Verificar presença de tampão

vaginal na manhã seguinte. Indicativo de cópula (dia 0,5).

Protocolo de superovulação

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eCG

46 - 48 horas

hCG

Dia 0,5

Dia 1,0

Dia 1,5 Dia 2,0

Dia 2,5

Dia 3,0

Dia 3,5

Dia 4,0

Oócitos Zigotos

Macho

Duas células (bloqueio)

2- 4 células

6-8 células

Até 10 células

Mórula

Blastocisto

q Coleta de oócitos, zigotos e estágios iniciais de clivagem

q Dias 0,5 – 3,0 q Requer treinamento

para encontrar infundíbulo.

Almeida et al., 2001

Coleta de Embriões – Tuba uterina

Microgotas de Meio de cultura cobertas com óleo mineral e mantidos em incubadora de CO2 a 37°C.

Fatores que podem afetar a superovulação

o  Linhagem. o  Horário (42 – 48 horas. Começar a tarde).

o  Idade das fêmeas (3-4 semanas).

o  Idade dos machos (diminui com idade).

o  Freqüência de cruzamento (2 dias de descanso).

o  Número de fêmeas (1-2 por macho).

o  Dosagem (2,5; 3,5; 5; 7,5; 10 UI).

o  Desconhecidos.

Produção de Animais Geneticamente Modificados

Futuro do uso de animais de laboratório

Produção de Animais Transgênicos e Geneticamente Modificados

Métodos

ü Cooperação de dois grupos de pesquisa.

Biotecnologia da Reprodução ü Produção e micromanipulação de embriões.

Biologia molecular

ü Construção de transgênes ü Modificações de sítios específicos do genoma de células.

Produção de Animais Transgênicos e Geneticamente Modificados

técnicas

v  Injeção de transgêne no pronúcleo.

v  Lentivírus

v  Injeção de células-tronco geneticamente modificadas em blastocistos.

v  Agregação de CTEs à mórulas.

Injeção de transgênes em pronúcleo

ü Prónucleo masculino. ü Prónucleo feminino. ü Singamia. ü Fusão dos pronúcleos

origina núcleo diplóide. ü Momento propício para

incorporação de DNA exógeno.

Fator da coagulação humana

Promotor da lactose caprina

Glândula mamária caprina

ü Promotor da lactose é ativado ü Induz produção do fator

Leite caprino contendo o fator da coagulação

humana

Injeção pronuclear

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Camundongo - 25 mil genes

Duplos e triplos knockout 2-4 fundos genéticos

50 mil linhagens

Injeção de Células-Tronco em Blastocistos

ü Células-tronco pluripotentes.

ü Cultivo em laboratório.

ü Mutação de um gene específico.

ü Transferência para um outro blastocisto. células-tronco

embrionárias

Recombinação homóloga

Mutação dirigida

Células-tronco knockout

Injeção em blastocisto

Transferência para receptora

Injeção de Células-Tronco em Blastocistos

Células-tronco após a Recombinação homóloga. Parte delas foi geneticamente modificada. Como selecionar?

Ampicilina

Células-tronco após a seleção. Somente células geneticamente modificadas

Blastocisto

Células-tronco geneticamente modificadas

Células-tronco Naturais

do blastocisto

Testículos e ovários formados por células

Geneticamente modificadas

Filhotes geneticamente modificados

Formação de quimeras •  Embriões com duas populações de células-

tronco embrionárias!!

Células-tronco do embrião receptor

Células-tronco geneticamente modificadas (knockout)

Camundongos chimeras Criopreservação de espermatozóides e fertilização in

vitro na preservação de linhagens de

animais de laboratório

Transferência nuclear/Clonagem ü Célula embrionária. ü Célula somática adulta.

Dolly 1997 - †2003

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ü Ovócitos maduros

ü Enucleação

ü Visualização do núcleo através de coloração.

ü Cultura de células somáticas (2n).

ü Transferência da célula (inteira) somática

ü Fusão celular

ü Ativação para iniciar o desenvolvimento embrionário.

Reprodução Humana Assistida

Crescimento e dominância folicular Infertilidade

Causas de Infertilidade

Fatores femininos: problema ovulatório; fator tubo-peritoneal;

endometriose; problema uterino;

deficiência fase lútea; problema do muco

30%

Fatores masculinos: ausência total ou parcial

de espermatozóides; alteração na motilidade, forma; anticorpos anti-

espermáticos; varicocele 30%

Fatores feminino e masculino

30%

Idiopático 10%

Fp

F1

F2

F3

Reg

Reg

Reg

Fp

F1

F2

F3

Reg

Reg

Reg

F3

Reg

Fp

F1

F2

F3

Reg

Reg

Reg

F3

Reg

Fp

F1

F2

F3

Reg

Reg

Reg

F3

Reg

Ovulação

Fetal Pré-púbere Pós-púbere

3 mm

25 mm

Fp

F1

F2

F3

Reg

Reg

Reg

Fp

F1

F2

F3

Reg

Reg

Reg

Fp

F1

F2

F3

Reg

Reg

Reg

Crescimento folicular Independente do LH e FSH

Crescimento folicular Dependente do LH e FSH

Antagonista do GnRH

FSH

LH Ovulação 38h após

Aspiração Folicular de oócitos 2°s

Controle total do desenvolvimento pelo clínico

Estratégia na fertilização in vitro Aumento do #

de oócitos

Estimulação Hormonal

Crescimento folicular e aspiração

Fertilização in vitro

Cultivo embrionário

Seleção e transferência de embriões

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ICSI (Injeção intracitoplasmatica de espermatozóide)

ü Baixa produção de espermatozoides.

ü Defeitos na morfologia ü Altas taxas de fertilização

mesmo em homens com sêmen normal.

Técnica Auxiliar de escolha de espermatozóide Super ICSI

Qual método é mais natural?

Qual deve ser mais utilizado? Qual é o mais utilizado?

FIV ou ICSI?

Testes cromossomiais e genéticos

•  PGD – Uma doença cromossomial •  PGS – Um srceening cromossomial •  PCR – Doenças gênicas •  CGH – Analisa todos cromossomos,

adiçao, deleçao, microdeleçao, algumas translocações

Diagnóstico genético Pré-implante - PGD

FISH CGH PCR

Biópsia de embrião

Identificação de genes Aneuploidias

Determinação do sexo.

Qual o melhor embrião ?

v  Necessidade de uma avaliação quantitativa. v  Metabolismo?

Critérios de Seleção Embrionária

"  Grau de compactação "  Grau e tipo de fragmentação "  Simetria de Blastômeros

"  Multinucleação "  Espessura da Zona Pelúcida

Metabolismo Embrionário

Ø  Primeiras clivagens – consumo de piruvato e lactato

Ø  Compactação e cavitação – consumo de glicose

Transferência dia 3 ou dia 5?

•  Duas escolas. •  Onde o embrião prefere/deve ficar?

– Menor tempo possível na placa/incubadora. – Maior tempo possível na incubadora para

permitir seleção. •  Meio único até o dia 5 ou troca de meio? •  Qual o melhor meio para o meu embrião? •  Melhor seleção permite a transferência de

um único embrião.

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Nutrição e qualidade embrionária

Nolan et al., Therio, 1998

41% 73%

Kakar et al., 2005

A potencial use of embryonic stem cell medium for the in vitro culture of

preimplantation embryos

Áreas com potencial para pesquisa

Humana Ø Métodos de avaliação de embriões. Ø Efeitos ambientais e nutricionais na qualidade de

gametas e embriões. Ø Meios de cultivo embrionário individualizados.

Animal Ø Maior eficiência nas técnicas de transgênia. Ø Maior eficiência e rapidez no processo de produção de

animais knockout.