DU GENOTYPE AU PHENOTYPE.TRANSCRIPTION

UNIVERSITE CADI AYYAD FACULTE DES SCIENCES SEMLALIA DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

BIOLOGIE MOLECULAIRE COURS S4 (TROISIEME PARTIE)

DU GENOTYPE AU PHENOTYPE

[ TRANSCRIPTION ]

PROFESSEUR A A BENSLIMANE

2006

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DU GENOTYPE AU PHENOTYPE [ TRANSCRIPTION ]

SOMMAIRE

1 REPERES HISTORIQUES

2

2 MECANISME GENERAL DE LA SYNTHESE DES PROTEINES

4

3 LA TRANSCRIPTION 6 I LA TRANSCRIPTION CHEZ LES PROCARYOTES 7

1 INITIATION (et caracteacuteristiques de la RNA-polymeacuterase) 7 2 ELONGATION 10 3 TERMINAISON 11

α- REGULATION DE LrsquoEXPRESSION GENIQUE CHEZ LES PROCARYOTES

12

β- OPERONS CONCEPT DE BASE 13 γ- REGULATION GENIQUE NEGATIVE lsquoREPRESSIBLErsquo ou

bien lsquoINDUCTIBLErsquo 14

δ- REGULATION GENIQUE POSITIVE

15

II LA TRANSCRIPTION CHEZ LES EUCARYOTES 17 1 INITIATION (RNA-POLYMERASE II) 18 2 ELONGATION 23 3 TERMINAISON 23 4 MODIFICATIONS DU PRE-MESSAGER MATURATION DU

mRNA 23

α- LA FIXATION DE LA COIFFE EST TRES PRECOCE 23 β- LES RNA SONT LE PLUS SOUVENT POLYADENYLES 24 γ- LrsquoEPISSAGE ELIMINE LES INTRONS DU TRANSCRIT

PRIMAIRE 25

MECANISME GENERAL DE LrsquoEPISSAGE 26 CAS PARTICULIERS DE LrsquoEPISSAGE DES INTRONS 27

LrsquoEPISSAGE EN TRANS (laquo trans-splicing raquo) 27 LrsquoEPISSAGE ALTERNATIF (OU DIFFERENTIEL) 28 LrsquoAUTO-EPISSAGE (NOTION DE RYBOZYMES) 29

δ- lsquoRNA-EDITINGrsquo (CORRECTION DU RNA) 30 5 TRANSPORT DU mRNA VERS LE CYTOPLASME 31

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Un zygote humain possegravede dans le DNA de son noyau les instructions essentielles agrave la construction drsquoune personne particuliegravere avec ses caractegraveres propres Le pheacutenotype de chaque individu reacutesultera de la combinaison de son bagage geacuteneacutetique unique et des influences du milieu Le DNA controcircle le meacutetabolisme en commandant aux cellules de fabriquer des enzymes speacutecifiques et drsquoautres proteacuteines Crsquoest en dictant la synthegravese de ces proteacuteines que le DNA heacuteriteacute drsquoun organisme va produire les caractegraveres speacutecifiques drsquoun individu le pheacutenotype Remarque terminologique on deacutesigne les gegravenes avec des minuscules en lettres italiques (ou souligneacutees) On eacutecrira par exemple les gegravenes lac (ou lac) Pour chaque gegravene particulier on fera suivre drsquoune majuscule (exemple gegravene lacZ lacY lacA) Les mecircmes lettres sont utiliseacutees pour le produit du gegravene ou bien pour le pheacutenotype mais la premiegravere lettre sera eacutecrite en majuscule et lrsquoensemble en lettres droites On eacutecrira ainsi la proteacuteine LacZ (il srsquoagit de la βndashgalctosidase) et la bacteacuterie Lac+ ou lac- selon qursquoil srsquoagit de bacteacuterie sauvage (+) ou mutante (-)

Les proteacuteines forment le lien entre le geacutenotype et le pheacutenotype

1 REPERES HISTORIQUES La geacuteneacutetique moderne remonte aux travaux de Mendel qui le premier eacutetablit les lois de lheacutereacutediteacute Il publie ses reacutesultats en [1866] mais ils passent alors agrave peu pregraves inaperccedilus Leur redeacutecouverte naura lieu quen [1900] Emergence de la geacuteneacutetique formelle Les lois de Mendel impliquent lexistence deacuteleacutements autonomes et reproductibles qui controcirclent de faccedilon discregravete les caractegraveres heacutereacuteditaires de geacuteneacuteration en geacuteneacuteration Chaque caractegravere est repreacutesenteacute dans loeuf feacutecondeacute par deux - et seulement deux - eacuteleacutements provenant lun du pegravere lautre de la megravere Ces eacuteleacutements autonomes uniteacutes de lheacutereacutediteacute se verront en [1909] attribuer par le biologiste danois Wilhem Johannsen la deacutenomination de laquo gegravenes raquo Support de lrsquoheacutereacutediteacute le chromosome Ce sont les travaux de Morgan [1904] (Prix Nobel 1933) sur la drosophile (Drosophila melanogaster) qui conduisent au deacuteveloppement de la laquo theacuteorie chromosomique raquo de lheacutereacutediteacute Les gegravenes sont alors localiseacutes sur les chromosomes et avec Sturtevant ils pourront mecircme y ecirctre ordonneacutes par leacutetude de la seacutegreacutegation des caractegraveres constituant les premiegraveres laquo cartes geacuteneacutetiques raquo Cest encore dans le laboratoire de Morgan que sont deacuteveloppeacutees les proceacutedures de laquo mutagenegravese expeacuterimentales raquo par Muller [1927] (Prix Nobel 1946) (induction artificielle de mutations par les rayons X) Convergence de la biochimie et de la geacuteneacutetique Si la preacutesence des gegravenes sur les chromosomes est alors eacutetablie rien nrsquoest connu de la nature biochimique des gegravenes ou de leur mode drsquoaction

La premiegravere relation entre gegravene et un enzyme est eacutetablie en [1909] par Garrod agrave partir drsquoune observation portant sur une maladie humaine lrsquolaquo alcaptonurie raquo Cette maladie se manifeste par le noircissement des urines lorsquelles sont exposeacutees agrave lair Le noircissement est ducirc agrave la preacutesence dans les urines dacide homogentisique qui est un produit intermeacutediaire de la deacutegradation de la tyrosine et de la pheacutenylalanine Cette substance est deacutegradeacutee chez les individus normaux mais pas chez les alcaptonuriques chez lesquels elle saccumule Le seacuterum des premiers contient lenzyme capable de la meacutetaboliser laquo lhomogentisate 12 deacutesoxygeacutenase raquo mais cet enzyme nest pas preacutesent dans le seacuterum des seconds Garrod propose que chaque enzyme serait le fruit de lactiviteacute dun gegravene

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Cette correacutelation allait ecirctre geacuteneacuteraliseacutee par Beadle et Tatum [1941] (Prix Nobel 1958) gracircce aux mutants meacutetaboliques de Neurospora crassa un systegraveme plus accessible agrave lrsquoexpeacuterimentation Lensemble de ces travaux aboutissent finalement agrave la conclusion que les gegravenes controcirclent la synthegravese des enzymes et que chaque proteacuteine est codeacutee par un gegravene diffeacuterent drsquoougrave lrsquoexpression laquo un gegravene harrune enzyme raquo geacuteneacuteraliseacute par la suite en laquo un gegravene harr un polypeptide raquo

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Des travaux similaires seront par la suite produits selon cette strateacutegie par de nombreux autres chercheurs Tous confirment que chaque eacutetape des voies biochimiques est controcircleacutee par un gegravene unique codant lenzyme impliqueacutee agrave cette eacutetape DNA comme support de lrsquoinformation geacuteneacutetique Le premier pheacutenomegravene qui allait permettre de progresser dans lidentification du support de lheacutereacutediteacute est celui de la transformation bacteacuterienne rapporteacute en [1928] par langlais Griffith (travaux sur Diplococcus pneumomiae ndash souris) Ce pheacutenomegravene repreacutesente alors un test dactiviteacute biologique gracircce auquel il est possible de deacuteterminer la nature du mateacuteriel geacuteneacutetique Ce test ne sera pas mis agrave profit par Griffith lui mecircme mais par Avery [1944] qui lutilise pour eacutelucider la nature biochimique du mateacuteriel geacuteneacutetique il sagit de DNA Cette deacutecouverte est toutefois accueillie avec beaucoup de scepticisme Il faudra de nombreux autres travaux pour que cette reacutealiteacute soit accepteacutee en particulier ceux de Chargaff [1950] (rapports A+TC+G et AT CG) ou de Hershey [1946] (travaux meneacutes sur les bacteacuteriophages phage T2 en particulier) Lacceptation deacutefinitive ne viendra quavec leacutelucidation de la structure du DNA par Watson et Crick [1953] (Prix Nobel 1962) Crsquoest agrave partir de ce moment que la biologie moleacuteculaire va connaicirctre son apotheacuteose et son deacuteveloppement dans presque tous les domaines et disciplines scientifiques


Qursquoest ce qursquoun gegravene La deacutefinition du gegravene a eacutevolueacute au fur et agrave mesure de lrsquoavancement scientifique des connaissances En fait chacune des deacutefinitions a son utiliteacute selon le contexte dans lequel on eacutetudie les gegravenes Les concepts mendeacuteliens deacutefinissent le gegravene en tant qursquouniteacute heacutereacuteditaire discontinue posseacutedant une influence sur un caractegravere pheacutenotypique Morgan et ses collaborateurs ont localiseacute le gegravene sur un endroit preacutecis du chromosome locus Ensuite une deacutefinition fonctionnelle du gegravene a eacuteteacute formuleacutee laquo le gegravene est une seacutequence de DNA codant pour une chaicircne polypeptidique speacutecifique raquo laquo un gegravene - un polypeptide raquo Cette derniegravere deacutefinition doit ecirctre utiliseacutee avec discernement

En effet la plupart des gegravenes eucaryotes comprennent des reacutegions non codantes laquo introns raquo cest-agrave-dire de grands segments qui nrsquoont pas drsquoeacutequivalents dans les polypeptides

Les biologistes moleacuteculaires incluent eacutegalement dans le gegravene les promoteurs et drsquoautres reacutegions reacutegulatrices qui ne sont pas transcrites mais on peut consideacuterer que ces seacutequences font partie du gegravene parce que le gegravene ne sera exprimeacute qursquoen leur preacutesence

A lrsquoeacutechelle moleacuteculaire la deacutefinition du gegravene doit eacutegalement englober le DNA qui code pour le RNA ribosomal RNA de transfert et autres petits RNA Ces gegravenes ne produisent pourtant pas de polypeptides

La deacutefinition suivante srsquoapplique donc agrave lrsquoeacutechelle moleacuteculaire drsquoune faccedilon plus geacuteneacuterale

laquo Un gegravene est une reacutegion du DNA essentielle agrave la fabrication drsquoune moleacutecule de RNA raquo Langage utiliseacute du DNA au polypeptide Nous verrons dans cette partie du cours comment se fait lrsquoexpression de lrsquoinformation geacuteneacutetique gracircce agrave la synthegravese des proteacuteines La synthegravese des proteacuteines comprend 2 eacutetapes importantes

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La transcription (mecircme langage nucleacuteotidscrire = recopier en utilisant le mecircme langage)

ique) (Tran

La traduction (nucleacuteotides rarr acides amineacutes) (Trad te) uire = Lire ou eacutecrire en utilisant une langue diffeacuteren

En geacuteneacuteral les meacutecanismes sont semblables dans les cellules procaryotes et eucaryotes La principale diffeacuterence est la maturation des RNA qui se produit dans le noyau des eucaryotes

3 LA TRANSCRIPTION Deacutefinition La transcription est le meacutecanisme par lequel les RNA cellulaires sont syntheacutetiseacutes

Lrsquoenzyme responsable de cette synthegravese est la laquo RNA polymeacuterase raquo

Puisque la RNA polymeacuterase ne peut fonctionner sans DNA on dit qursquoelle est laquo DNA deacutependante raquo Le DNA sert de modegravele Le RNA produit est une copie compleacutementaire et antiparallegravele du DNA

La RNA polymeacuterase utilise comme substrat les 4 types de nucleacuteotides sous forme de triphosphate (ATP GTP CTP et UTP)

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Tout le DNA nrsquoest pas transcrit mais seulement certaines portions

Seul lrsquoun des deux brins de DNA est copieacute mais ce nrsquoest pas toujours le mecircme brin qui est copieacute tout au long de la moleacutecule de DNA Pour certains gegravenes ce sera un brin pour drsquoautres ce sera lrsquoautre brin

La transcription se deacuteroule en trois eacutetapes

1 Lrsquoinitiation

2 Lrsquoeacutelongation

3 La terminaison

Par convention on appelle laquo +1 raquo le premier nucleacuteotide agrave partir duquel la transcription deacutemarre laquo site drsquoinitiation raquo et laquo -1 raquo le nucleacuteotide qui le preacutecegravede

SCHEMA GENERAL DE LA TRANSCRIPTION

Brin transcrit ou brin antisens

Brin codant ou brin sens

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eacute

I LA TRANSCRIPTION CHEZ LES PROCARYOTES

1 INITIATION (et caracteacuteristiques de la RNA-polymeacuterase) Le signal de deacutebut de transcription est le laquo promoteur raquo Crsquoest une reacutegion du DNA comprenant environ 40 paires de nucleacuteotides situeacutee juste avant le deacutebut de la reacutegion ougrave deacutemarrera la transcription Les seacutequences de nucleacuteotides ont eacuteteacute deacutetermineacutees pour plus de 100 promoteurs de diffeacuterents gegravenes de E coli Ces promoteurs comportent des seacutequences de composition tregraves voisine dites laquo seacutequences conserveacutees raquo ou laquo seacutequences homologues raquo Il srsquoagit en particulier de courtes seacutequences de 6 paires de nucleacuteotides seacutepareacutees lrsquoune de lrsquoautre par environ une vingtaine de paires de nucleacuteotides laquo seacutequence -35 raquo et laquo seacutequence -10 raquo

quence -35 TTGACA (T82T84G78A65C54A45) S Seacuteq Pribnow box raquo NB Les lettres en gras correspondent agrave des reacutesidus hautement conserveacutes (gtgt75)

uence -10 TATATT (T80A95T45A60T50T96) Appeleacutee aussi laquo

On peut consideacuterer cette laquo boicircte Pribnow raquo comme une reacutegion drsquoavertissement pour la RNA polymeacuterase Le compte agrave rebours est commenceacute -10 -9hellip-2 -1 et agrave +1 la transcription deacutemarre

Les diffeacuterences entre les promoteurs de diffeacuterents gegravenes augmentent les diffeacuterences drsquoefficaciteacute de lrsquoinitiation de la transcription et contribuent dans la reacutegulation de lrsquoexpression des gegravenes

Les courtes seacutequences conserveacutees agrave lrsquointeacuterieur des promoteurs sont les sites auxquels la RNA-polymeacuterase et facteurs de transcription se fixent pour lancer ou reacuteguler la transcription Chez E coli La RNA-polymeacuterase est composeacutee de sous-uniteacutes Lrsquoensemble laquo α2ββrsquo raquo forme le noyau (ou cœur) de lrsquoenzyme Ce noyau contient le site catalytique responsable de lrsquoeacutelongation Lrsquoensemble laquo α2ββrsquoσ raquo forme lrsquoenzyme complegravete appeleacutee laquo holoenzyme raquo

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lsquoCore enzymersquo

lsquoholoenzyme

β

σ70 σ54

Afin de permettre au brin matrice drsquoecirctre utiliseacute po double heacutelice du DNA doit ecirctre localement deacuterocommence au site d nu par la RNfixe sur une reacutegion couvrant environ 60 pb La po de RNA agrave partir du site drsquoinitiation (nucleacuteotide +1 une purine G ou A dans 90 des gegravenes) Aucune amorce nrsquoest requise pour la synthegravese du RNA La sous-uniteacute σ ou laquo facteur sigma raquo permet agrave la RNA-polymeacuterase de reconnaicirctre les sites promoteurs Lrsquoenzyme complegravete (holoenzyme α2ββrsquoσ) est neacutecessaire pour lrsquoinitiation de la transcription Cependant le facteur σ nrsquoest pas requis pour lrsquoeacutelongation Il est libeacutereacute du complexe de transcription apregraves lrsquoinitiation d ci (le facteur σ se dissocie du cœur de lrsquoenzyme lo le tr 9 nucl de longueur) Ces premiers nucleacuteotides

Remarque La structure de la majoriteacute des

encodeacutees par les bacteacuteriophages T3 et T7 sont des chaicircnes polypeptidiques monoteacutenaires

e du

α2 βrsquo RNA-polymeacuterases procaryotes est une structure agrave plusieurs sous-uniteacutes Ceci nrsquoest en fait pas une neacutecessiteacute absolue Les RNA-polymeacuterases

reconnaissant leurs propres DNA agrave des seacutequences speacutecifiques (vitesse de synthegravesRNA 200 nucleacuteotides seconde agrave 37degC)

u promoteur recon

e celle-rsque anscrit atteint 8 agrave eacuteotides

ur lrsquoappariement de bases (DNA-RNA) lauleacutee sur environ 17 pb Le deacuteroulement A-polymeacuterase La totaliteacute de lrsquoenzyme se

lymeacuterase lance ensuite la synthegravese du brin

sont incorporeacutes sans recourir au deacuteplacement de la polymeacuterase En fait la polymeacuterase va entreprendre plusieurs initiations de chaicircnes avorteacutees A partir du moment ougrave lrsquoinitiation est reacuteussie le facteur σ est libeacutereacute et la polymeacuterase cœur commence lrsquoeacutelongation en se deacuteplaccedilant le long du DNA (vitesse de synthegravese 40 nucleacuteotides seconde agrave 37 degC)

La RNA-polymeacuterase de E coli neacutecessite la preacutesence drsquoions Mg pour son fonctionnement

2+

Les deux sous uniteacutes α sont identiques encodeacutees par le gegravene laquo rpoA raquo ne jouent pas de rocircle concret dans la transcription mais sont indispensables pour lrsquoassemblage de lrsquoenzyme cœur et semblent jouer un certain rocircle dans la reconnaissance du promoteur

La sous-uniteacute β constitue le centre catalytique de la RNA-polymeacuterase La laquo rifampicine raquo et les laquo streptolydigines raquo sont des antibiotiques qui se fixent sur la sous-uniteacute β 1) La rifampicine bloque lrsquoinitiation mais pas lrsquoeacutelongation 2) les streptolydigines inhibent lrsquoeacutelongation Les mutations qui

ous-uniteacute β) Ceci montre que la sous-uniteacute β contient deux domaines responsables chacun de lrsquoinitiation et de lrsquoeacutelongation

augmentent la reacutesistance agrave ces antibiotiques sont cartographieacutees en laquo rpoB raquo (gegravene codant la s

La sous-uniteacute βrsquo encodeacutee par le gegravene laquo rpoC raquo est lieacutee agrave deux ions de Zn2+ Lrsquo laquo lrsquoheacuteparine raquo un polyanion se fixe agrave cette sous-uniteacute Elle inhibe la transcription in vitro en entrant en compeacutetition avec le DNA pour la fixation de la RNA-polymeacuterase Il ressort de cela que la sous-uniteacute βrsquo peut ecirctre responsable de la fixation au DNA matrice

Le facteur sigma le plus freacutequent dans E coli est laquo σ70 raquo (PM=70 Kda) Celui-ci joue un rocircle tregraves important dans la reconnaissance du promoteur mais nrsquoest pas requis pour lrsquoeacutelongation il reacuteduit lrsquoaffiniteacute de lrsquoenzyme cœur pour les sites non speacutecifiques du DNA par un facteur de 104 et augmente lrsquoaffiniteacute pour le promoteur

E coli possegravede plusieurs facteurs σ diffeacuterents (σ28 σ32 σ54hellip) Ces derniers participent agrave la reconnaissance de classes speacutecifiques de promoteurs

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ou CAP

(C ple

2 ELONGATION Lorsque lrsquoinitiation est lanceacutee correctement lrsquoenzyme libegravere le facteur σ et forme un complexe ternaire (DNA-RNA-polymeacuterase) L polymeacuterase quitte le promoteur et avance le long du DNA laquo clairance du promoteur raquo permettant la relance drsquoune nouvelle initiation

Les promoteurs reacuteguleacutes sont activeacutes par la fixation de facteurs drsquoactivation accessoires tels que la proteacuteine reacuteceptrice drsquoAMPc CPR

atabolite Activator Protein) dans le cas du promoteurs lac par exem

a

ribosomes

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La reacutegion deacuterouleacutee du DNA appeleacutee laquo bulle de transcription raquo semble se deacuteplacer le long du DNA avec la polymeacuterase La taille de cette bulle reste constante (17 pb environ) Lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo du RNA naissant forme un hybride drsquoenviron 12 pb avec le brin antisens (transcrit) La RNA-polymeacuterase ajoute des ribonucleacuteotides de maniegravere covalente agrave lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo de la chaicircne croissante de RNA (preacutecurseurs = ribonucleacuteosides triphosphates) 40 nucleacuteotides seconde agrave 37 degC

Lrsquoeacutenergie neacutecessaire pour former les liaisons ester entre les diffeacuterents nucleacuteotides du RNA est

ture rquer un

apporteacutee par les nucleacuteotides eux-mecircmes Seul le premier nucleacuteotide du RNA consrve son groupement triphosphate

3 TERMINAISON La terminaison de la transcription a lieu au niveau de seacutequences speacutecifiques appeleacutees laquo terminateurs raquo Il srsquoagit de reacutegions auto-compleacutementaires qui forment une strucsecondaire RNA en laquo eacutepingle agrave cheveux raquo Cette reacutegion pousse la polymeacuterase agrave matemps drsquoarrecirct et par conseacutequent agrave cesser la transcription

Cette reacutegion agrave symeacutetrie imparfaite est immeacutediatement suivie par une courte seacutequences riche en bases A et T (le brin du DNA transcrit contient agrave ce niveau une seacutequence de plusieurs A)

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facilement se deacutetacher Certaines seacutequences termque drsquoautres seacutequences term α- REGULATION DE LrsquoEXPRELes mutations et les divers meacutecanispartie du cours engendrent unePar son action sur un grand nombrnaturelle augmente la proportion drsquoindividus adpreacutesence drsquoun certain antibiotique par exem Cependant une bacteacuterie qui a heacuteriteacute un geacutenom son environnem

n milieu extrecircmement instable En effet son approvisionnement en nutriments deacutepend des

on hocircte absorbe un repas riche en tryptophane la cellule cesse drsquoen yntheacutetiser pour elle-mecircme eacutevitant ainsi de gaspiller ses ressources pour produire une

a reacutegulation meacutetabolique srsquoexerce de deux faccedilons

Il srsquoagit drsquoune reacutegion ougrave les appariements sont plus lacircches et drsquoougrave la polymeacuterase peut plus

inateurs peuvent agrave elles seules mettre fin agrave la transcription alors inateurs requiegraverent un facteur accessoire la proteacuteine rho laquo ρ raquo

SSION GENIQUE CHEZ LES PROCARYOTES mes de recombinaison geacuteneacutetique eacutetudieacutes dans la premiegravere

variation geacuteneacutetique qui rend possible la seacutelection naturelle e de geacuteneacuterations drsquoune population bacteacuterienne la seacutelection

apteacutes agrave certaines conditions du milieu telle la ple

e preacutecis va devoir faire face aux fluctuations deent Prenons lrsquoexemple drsquoune cellule drsquoE coli vivant dans un intestin humain

uhabitudes alimentaires capricieuse et variables de son hocircte Si la bacteacuterie manque de tryptophane par exemple un acide amineacute dont elle a besoin pour survivre elle reacuteagit en activant une voie meacutetabolique qui lui permet de syntheacutetiser cette substance agrave partir drsquoun autre composeacute Plus tard si sssubstance deacutejagrave toute precircte dans le milieu environnant L

En premier lieu les cellules peuvent faire varier le nombre de moleacutecules drsquoune enzyme donneacutee en controcirclant lrsquoexpression du gegravene correspondant

En deuxiegraveme lieu les cellules peuvent modifier lrsquoactiviteacute des enzymes deacutejagrave preacutesentes

Ce re

rsquoenzymes agrave des facteurs chimiques qui font augmenter ou diminuer leur activiteacute catalytique Par exemple lrsquoactiviteacute de la premiegravere enzyme de la voie de biosynthegravese du tryptophane est

second mode de reacutegulation plus immeacutediat repose sur la sensibiliteacute drsquoun grand nombd

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inhibeacutee par la preacutesen ule dans la et agrave la

cellule de srsquo

ce du produit final de la voie Donc si le tryptophane srsquoaccumcellule il met fin agrave sa propre synthegravese reacutetro-inhibition raquo Ce mode de reacutegulation perm

adapter aux fluctuations agrave court terme de la concentration drsquoune substance dont

ple le milieu continue de fournir tout le tryptophane neacutecessaire la cellucesse de produire les enzymes de la voie du tryptophane Cette reacutegu

n (synthegravese du RNA messager codant pour ces enzymes)

De faccedilon plus geacuteneacuterale de nombreux gegravenes du geacutenome bacteacuterien sont activeacutes ou inactiveacutes par les fluctuations de lrsquoeacutetat meacutetabolique de la cellule Le meacutecanisme fondamental de ce mreacutegulation de lrsquoexpression geacutenique appeleacute laquo modegravele de lrsquoopeacuteron raquo a eacuteteacute deacutecouvert par Jacob

[1961] (Prix Nobel 1965)

ple de la reacutegulation de la synthegravese du tryptophane nous allons voir en quoi comment il fonctionne

elle a besoin Si dans notre exem le

lation srsquoexerce sur agrave lrsquoeacutetape de la transcriptio

ode de

et Monod A partir de lrsquoexemconsiste un opeacuteron et β- OPERONS CONCEPT DE BASE E coli syntheacutetise le tryptophane agrave partir drsquoun substrat initial en passant par une seacuterie drsquoeacutetapes chaque reacuteaction eacutetant catalyseacutee par un enzyme speacutecifique

es gegravenes codant pour les chaicircnes polypeptL idiques de ces enzymes sont regroupeacutes sur le hromosome Un seul promoteur dessert lrsquoensemble de ces gegravenes qui forment une seule et ecircme uniteacute de transcription La transcription produit donc une longue moleacutecule de mRNA

osynthegravese du tryptophane La cellule pourra traduire

es gegravenes qui codent pour des polypeptides sont appeleacutes laquo gegravenes de structure raquo Le fait que des gegravenes de structure aux fonctions connexes (lieacutees assdocieacutees) se trouvent dans la mecircme uniteacute de transcription repreacutesente un avantage majeur car il suffit drsquoun seul lsquointerrupteurrsquo pour commander lrsquoensemble des gegravenes laquo lrsquoopeacuterateur raquo celui-ci se trouve agrave lrsquointeacuterieur du promoteur ou entre le promoteur et les gegravenes de structure Il commande lrsquoaccegraves de la RNA-polymeacuterase aux gegravenes de structure

Lrsquoensemble gegravenes de structure opeacuterateur et promoteur constitue un opeacuteron

cmqui repreacutesente lrsquoensemble de la voie de bice transcrit en polypeptides distincts parce que le mRNA porte les signaux de deacutepart et drsquoarrecirct qui marquent le deacutebut et la fin de traduction de chacun drsquoeux L

Si lrsquoopeacuterateur repreacutesente la zone de DNA ougrave srsquoexerce la reacutegulation de la transcription quel est le facteur qui deacutetermine si lrsquoopeacuterateur sera activeacute ou inactiveacute Seul en lui-mecircme lrsquoopeacuterateur est activeacute la transcription a lieu Lrsquoopeacuteron est inactiveacute par une proteacuteine appeleacutee laquo reacutepresseur raquo Quand le reacutepresseur se lie agrave lrsquoopeacuterateur il empecircche la RNA-polymeacuterase de srsquoattacher au promoteur Les reacutepresseurs sont speacutecifiques ils ne reconnaissent et ne se lient qursquoagrave lrsquoopeacuterateur drsquoun certain opeacuteron Le reacutepresseur provient lui-mecircme drsquoun gegravene appeleacute laquo reacutegulateur raquo qui se trouve en geacuteneacuteral agrave une certaine distance de lrsquoopeacuteron qursquoil controcircle Les gegravenes reacutegulateurs se font transcrire de faccedilon continue (de maniegravere constitutive) agrave rythme lent et par conseacutequent il y a toujours des moleacutecules de reacutepresseur dans la cellule Si tel est le cas pourquoi lrsquoopeacuteron nrsquoest pas inactif de faccedilon permanente Pour deux raisons

La liaison entre les reacutepresseurs et les opeacuterateurs est reacuteversible

Le reacutepresseur peut adopter deux formes une forme active qui peut reconnaicirctre lrsquoopeacuterateur et une forme inactive Le passage drsquoune forme agrave une autre deacutepend de la fixation ou non sur le reacutepresseur drsquoune moleacutecule appeleacutee selon les cas laquo coreacutepresseur raquo ou laquo inducteur raquo Il srsquoagit drsquoun meacutetabolite qui collabore avec le reacutepresseur pour inactiver ou bien activer un opeacuterateur Le meacutetabolite en question est une petite moleacutecule

er la synthegravese de ces enzymes Le meacutecanisme est illustreacute ur la f

organique qui repreacutesente un preacutecurseur un intermeacutediaire ou le produit final drsquoune voie meacutetabolique Exemples tryptophane allolactose)

γ- REGULATION GENIQUE NEGATIVE lsquoREPRESSIBLErsquo ou bien lsquoINDUCTIBLErsquo Le tryptophane est un acide amineacute produit par lrsquointermeacutediaire drsquoune voie anabolique catalyseacutee par des laquo enzymes reacutepressibles raquo Lrsquoaccumulation du tryptophane le produit final de cette voie a pour effet de reacuteprims igure ci-dessous

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Par contre la synthegravese des laquo enzymes inductibles raquo se trouve stimuleacutee et non inhibeacutee par la preacutesence de meacutetabolites particuliers Tel est le cas de lrsquoopeacuteron lactose chez E coli

ents

- REGULATION GENIQUE POSITIVE ans les deux exemples preacuteceacutedents les gegravenes subissent une reacutegulation neacutegative parce que s opeacuterons sont inactiveacutes par la conformation active du reacutepresseur Techniquement on peut

onsideacuterer lrsquoinducteur (lrsquoallolactose par exemple) davantage comme un lsquodeacutereacutepresseurrsquo que omme un inducteur de gegravene

n ne parle de reacutegulation geacutenique positive que dans le cas ougrave une moleacutecule drsquoactivateur teragit directement avec le geacutenome pour entraicircner la transcription Lrsquoexemple de reacutegulation

ositive illustreacute ci-dessous se rapporte eacutegalement agrave lrsquoopeacuteron lactose

our que les enzymes de deacutegradation du lactose (en galactose + glucose) se fassent syntheacutetiser n grande quantiteacute la preacutesence de lactose (rarr allolactose) ne suffit pas Lrsquoabsence de glucose st eacutegalement indispensable

i on lui laisse le choix des substrats pour la glycolyse et drsquoautres voies meacutetaboliques E coli e sert en prioriteacute du glucose le glucide le plus souvent preacutesent dans le milieu nutritif La lupart des gegravenes neacutecessaires au catabolisme du glucose sont des gegravenes constitutifs cest-agrave-ire des gegravenes dont la transcription se fait de faccedilon continue

Ces deux exemples montrent comment lrsquoexpression geacutenique peut reacutepondre aux changemqui surviennent dans les milieux internes et externes de la cellule δDlecc Oinp Pee Sspd

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omment la cellule drsquo E coli perccediloit-elle la concentration de glucose et comment cette formation est transporteacutee jusqursquoau geacutenome

ne proteacuteine appeleacutee CAP laquo Proteacuteine activatrice du catabolisme raquo (eacutegalement appeleacutee roteacuteine reacuteceptrice drsquoAMPc CRP) est une proteacuteine qui acceacutelegravere la transcription drsquoun opeacuteron

eut parler ici de reacutegulation ositive

rsquoabsence de glucose dans la

plexe AP-AMPc se lie au promoteur de

ent les romoteurs de lac

gulation positive par la CAP

le)

Cin Upen srsquounissant au promoteur et en facilitant la fixation de la RNA-polymeacuterase Comme la CAP se fixe directement au DNA afin de stimuler la transcription on pp Lcellule entraicircne lrsquoaccumulation drsquoune moleacutecule appeleacutee AMP cyclique (AMPc) un deacuteriveacute de lrsquoATP La CAP possegravede un site de liaison pour lrsquoAMPc Le comClrsquoopeacuteron lactose et stimule la transcription des gegravenes pour le catabolisme du lactose Si on ajoute du glucose la concentration drsquoAMPc diminue et les moleacutecules de la CAP quittp Lrsquoopeacuteron lac subit donc une double reacutegulation une reacutegulation neacutegative par le reacutepresseur lac et une reacute

ien que nous ayons pris lrsquoopeacuteron Blac comme exemple la CAP agit contrairement aux reacutepresseurs speacutecifiques sur plusieurs opeacuterons diffeacuterents Lorsque le glucose est preacutesent et que la CAP est inactive il y a ralentissement geacuteneacuteral de la synthegravese des enzymes neacutecessaires agrave lrsquoutilisation de tous les catabolites sauf du glucose Quand il y a peacutenurie de glucose les catabolites reacutesents (lactose par exempp

deacuteterminent alors quels opeacuterons deviendront activeacutes Tout se passe comme si lrsquoopeacuteron en question est agrave la fois commandeacute par un interrupteur et un bouton de volume (intensiteacute)

- 16 -

- 17 -

TES e meacutecanisme de la transcription eucaryote est similaire agrave celui des procaryotes Cependant

lexe

gegravenes Elles ont eacuteteacute identifieacutees par la purification hromatographique et lrsquoeacutelution agrave diffeacuterentes concentrations de sel Chaque RNA-polymeacuterase

toxine fongique laquo α-amanitine raquo

II LA TRANSCRIPTION CHEZ LES EUCARYOLle grand nombre de polypeptides associeacutes agrave la machinerie de la transcription eucaryote rend celui-ci bien plus comp Chez les eucaryotes trois complexes de RNA-polymeacuterases sont responsables de la transcription des diffeacuterents types decpossegravede une sensibiliteacute diffeacuterente agrave la

1 ARN Polymeacuterase de Type I (ou A)

nes rRNA (RNA ribosomiaux)

I (ou B)

Transcription de la plupart des gegraveLocalisation Nucleacuteole Insensible agrave lrsquoα-amanitine Activiteacute 50-70 2 ARN Polymeacuterase de Type I

tous les gegravenes codant les Proteacuteines (mRNA) et certains snRNA Localisation Nucleacuteoplasme Tregraves sensible agrave lrsquoα-amanitine Activiteacute 20-40 3 ARN Polymeacuterase de Type III (ou C)

Transcription de

Transcription des gegravenes pour les tRNA le rRNA 5S le snRNA U6 Localisation Nucleacuteoplasme Modeacutereacutement sensible agrave lrsquoα-amanitine Activiteacute 10

REMARQUES En plus de ces RNA-polymeacuterases nucleacuteaires les cellules eucaryotes possegravedent des RNA-polymeacuterases suppleacutementaires dans les mitochondries et les chloroplastes Les trois RNA-polymeacuterases sont de grosses enzymes contenant chacune au moins 12 sous-uniteacutes Elles contiennent des sous-uniteacutes homologues aux sous-uniteacutes de la RNA-polymeacuterase cœur de E coli (α2ββrsquo) Au moins cinq petites sous-uniteacutes sont communes aux trois diffeacuterentes RNA-polymeacuterases Chacune contient eacutegalement 5 agrave 7 sous-uniteacutes suppleacutementaires qui sont uniquement preacutesentes dans un seul type Comme les RNA-polymeacuterases bacteacuteriennes chacune des enzymes eucaryotes catalyse la transcription dans la direction 5rsquo rarr 3rsquo et syntheacutetise le RNA compleacutementaire au brin matrice

- 18 -

a TP GTP CTP et UTP) et ne

essentiellement au meacutecanisme de transcription catalyseacute par la NA-polymeacuterase II Celle-ci est responsable de la transcription de tous les gegravenes codant pour

gers laquo preacute-mRNA raquo es derniers doivent subir une laquo maturation raquo par la formation drsquoune laquo coiffe raquo (ou capsule)

agrave lrsquoextreacutem laquo introns raquo par laquo eacutepissage raquo

ntisens La reacuteaction neacutecessite les nucleacuteotides preacutecurseurs (Arequiert pas drsquoamorce pour lrsquoinitiation de la transcription Nous allons nous inteacuteresser Rles proteacuteines eucaryotes Neacuteanmoins et dans la mesure du possible nous allons exposer certains eacuteleacutements comparatifs concernant les deux autres RNA-polymeacuterases I et III En fait la RNA-polymeacuterase II syntheacutetise des preacutecurseurs de RNA messaC

iteacute 5rsquo du RNA lrsquoajout drsquoune laquo queue poly A raquo et lrsquoenlegravevement des

1 INITIATION (RNA-POLYMERASE II) En amont du premier nucleacuteotide transcrit (+1) drsquoun gegravene de structure eucaryote se trouve toute une laquo reacutegion 5rsquo raquo non transcrite qui joue un rocircle essentiel dans le controcircle de la transcription Cette reacutegion appeleacutee laquo promoteur proximal raquo srsquoeacutetend sur environ une entaine de paires de bases On y trouve essentiellement la laquo TATA box raquo preacutesente dans c

presque tous les gegravenes ainsi que la laquo CCAAT box raquo et la laquo GC box raquo moins systeacutematiquement retrouveacutees

- 19 -

e reconnaicirctre directement le promoteur Il semble qursquoelle

a eacuteteacute deacutemontreacute que ces facteurs srsquoassemblent sur les

La RNA-polymeacuterase eucaryote est incapable agrave elle seuledreconnaicirct plutocirct un complexe multiproteacuteique Ce complexe est formeacute drsquoau moins 5 proteacuteines TFIIA TFIIB TFIID TFIIE TFIIF et TFIIH (TF = lsquotranscriptional factorrsquo) Ilpromoteurs de base en un ordre speacutecifique et sont sujets agrave de multiples niveaux de reacutegulation Seul TFIID (TBP +TAFII) se fixe sur la TATA box par

intermeacutediaire de la laquo TATA binding protein raquo (ou TBP)

transcTFIIH)

heacutelicas

com

ent le tre les

Ce m up plus omplexe que chez les procaryotes est ducirc agrave la seacutelectiviteacute de la transcription chez les ucaryotes Seuls les promoteurs ayant fixeacutes certains laquo facteurs trans-reacutegulateurs raquo seront nctionnels

En alrsquo la transcription des gegravenes

lrsquo

TFIIA stabilise le complexe TFIID-DNA et neutralise les effets des facteurs inhibiteurs auxquels TFIID peut ecirctre lieacute

TFIIB agit comme un facteur permettant le recrutement de la RNA-polymeacuterase avec un facteur suppleacutementaire TFIIF

Apregraves fixation de la RNA-polymeacuterase drsquoautres facteurs de ription se lient rapidement au complexe (TFIIE

La TFIIH contient une activiteacute kinase et une activiteacute e permettant la phosphorylation du laquo domaine

terminal-carboxyle raquo (CTD) de la RNA-polymeacuterase et de deacutenaturer la double heacutelice du DNA au site drsquoinitiation de la transcription Cette phosphorylation conduit agrave la formation drsquoun

plexe De RNA-polymeacuterase fonctionnel et permet agrave la RNA-polymeacuterase de quitter la reacutegion du promoteur Ce groupe de facteurs geacuteneacuteraux de la transcription ainsi que la RNA-polymeacuterase constitu

laquo complexe drsquoinitiation raquo Celui-ci catalyse la formation de la premiegravere liaison endeux premiegravers nucleacuteotides du preacute-mRNA La transcription commence agrave quelques nucleacuteotidesen aval de la TATA box au laquo site drsquoinitiation raquo de la transcription (+1)

eacutecanisme de reconnaissance et de fixation de la RNA-polymeacuterase beauco

TAFII

CTD

CTD

CTD phosphoryleacute

cefo

plus de la reacutegion de controcircle appeleacutee lsquopromoteur proximeucaryotes peut ecirctre moduleacutee par une seacuterie drsquoautres seacutequences de DNA laquo eacuteleacutements cis-reacutegulateurs raquo constitueacutees de quelques nucleacuteotides (6 agrave 8 le plus souvent voire une vingtaine) Ces seacutequences forment ce qursquoon appelle laquo seacutequences distales raquo du promoteur Ces seacutequences peuvent se trouver aussi bien en amont qursquoen aval du gegravene voire mecircme au milieu dans certains cas (au niveau des introns)

egravenes de nombreuses

- 20 -

ur ces lsquoseacutequences cis-reacutegulatricesrsquo eacutetonnamment conserveacutees dans les gSespegraveces vont se fixer des lsquofacteurs trans-reacutegulateursrsquo La Fixation de ces facteurs provoquera selon les cas un deacutemarrage une activation ou plus rarement une diminution de la transcription Dans le cas drsquoune activation ou drsquoune inhibition de la transcription les seacutequences cis-reacutegulatrices sont appeleacutees respectivement laquo enhancers raquo (activatrices en franccedilais) ou laquo silencers raquo (exctinctrices) Leur particulariteacutes est 1 drsquoecirctre parfois localiseacutees agrave de tregraves grandes distances (1 agrave 30 Kb) 2 drsquoagir indeacutependemment de leur position (aval ou amont) ou de leur orientation

Il Existe Plusieurs Niveaux de Compaction du DNA criptionnelle Diffeacuterents

Transcription Possible

Correspondant agrave des Niveaux d rsquoActiviteacute Trans

Transcription Impossible Zone Accessible

Histone aceacutetylase lsquoChromatin remodeling complexrsquo

Les facteurs de transcription possegravedent une structure modulaire constitueacutee de

- 21 -

Domaines de fixation au DNA lsquoheacutelice-tour-heacutelicersquo lsquoagrave doigt de zincrsquo lsquoLeu zipperrsquohellip Domaines drsquoactivation lsquoriche en prolinersquo riches en glutaminersquo lsquoheacutelice-α-acidersquohellip

Parmi les meacutethodes utiliseacutees pour caracteacuteriser les seacutequences cis-reacutegulatrices et les facteurs trans-reacutegulateurs on peut citer les techniques laquo retard sur gel raquo laquo chromatographie drsquoaffiniteacute du DNA raquo laquo immunopreacutecipitration de la chromatine raquo hellip

Exemple avec un facteur de transcription agrave trois doigts de zinc

- 22 -

Retard sur gel

Chromatographie drsquoaffiniteacute du DNA

2 ELONGATLrsquoeacutelongatio

3

lue sur le brin non transcrit mais contintermineront par le signal

4

ION n du preacute-mRNA se fait selon le mecircme meacutecanisme que chez les procaryotes

TERMINAISON Le signal de fin de gegravene (et non de fin de transcription) est la seacutequence consensus AATAAA

(brin sens) La RNA-polymeacuterase reconnaicirct ce signal sur le DNA ue agrave transcrire encore au-delagrave Toutefois les transcrit seront ensuite racourcis et se

laquo AAUAAA raquo suivi de 10 agrave 15 nucleacuteotides

MODIFICATIONS DU PRE-MESSAGER MATURATION DU mRNA

α- LA FIXATION DE LA COIFFE EST TRES PRECOCE Ceci repreacutesente la premiegravere eacutetape de maturation du RNA messager La coiffe (capsule capuchon chapeau ou cap) se met en place degraves le deacutebut de la transcription avant que 30 nucleacuteotides ne soient assembleacutes La coiffe est un GMP ayant un groupe meacutethyle sur lrsquoazote en position 7 (ce qui apporte une charge positive) Il est relieacute au premier nucleacuteotide par une liaison anhydride drsquoacide Les deux premiers nucleacuteotides du RNA peuvent eacutegalement ecirctre meacutethyleacutes sur les hydroxyles en position 2rsquo du ribose La coiffe proteacutegerait ainsi lrsquoextreacutemiteacute 5rsquo des mRNA de lrsquoattaque par des enzymes (phosphatases et nucleacuteases) La coiffe joue eacutegalement un rocircle important dans le transport du mRNA et lrsquoinitiation de la traduction En effet la petite sous-uniteacute du ribosome aideacutee par la reconnaissance de la coiffe se fixera ainsi agrave lrsquoextreacutemiteacute 5rsquo dumRNA

Structure des mRNA diffeacuterences entre procaryotes et eucaryotes

- 23 -

β- LES RNA SONT LE PLUS SOUVENT POLYADENYLES Une fois syntheacutetiseacutes les preacute-RNA (ou transcrits primaires) sont coupeacutes du cocircteacute 3rsquo agrave une vingtaine de nucleacuteotides en aval de la seacutequence lsquoAAUAAArsquo deacutejagrave signaleacutee plus haut Cette seacutequence qui fut consideacutereacutee au deacutebut comme une seacutequence de reconnaissance pour la polyadeacutenylation nrsquoest en fait que le signal pour la coupure lsquoAAUAAArsquo est suivie 11 agrave 20 nucleacuteotides par 5rsquoYA3rsquo (Y = pyrimidine) et tregraves souvent drsquoune seacutequence riche en GU en aval Un certain nombre de facteurs proteacuteiques reconnaicirct ces eacuteleacutements de la seacutequence et se fixe au preacute-mRNA Lorsque le complexe est rassembleacute le coupure a lieu et lrsquoun des facteurs laquo La poly A

agers drsquohistones sont deacutepourvus de queue poly A

ABP se fixe sur la queue polyA ns la stabilisation des messagers

polymeacuterase raquo (ou PAP) ajoute jusqursquoagrave 250 A conseacutecutifs chez les mammifegraveres et 100 chez les eucaryotes infeacuterieurs Vraisemblablement seuls les mess Une proteacuteine de 70 KDa la laquo poly A binding protein raquo ou PLa queue poly A associeacutee agrave la PABP semble jouer un rocircle daet dans lrsquoinitiation de la traduction

- 24 -

- 25 -

Il est im mRNA eucaryotes a permis lrsquoisolem es permettant

γ

discontinue (ou fragm

portant de signaler que la preacutesence de cette queue poly A sur lesent et la purification de ces moleacutecules des autres RNA cellulair

ainsi la construction de laquo banques de cDNA raquo (voir cours S3) desquelles des gegravenes speacutecifiques ont eacuteteacute caracteacuteriseacutes et leurs fonctions analyseacutees

- LrsquoEPISSAGE ELIMINE LES INTRONS DU TRANSCRIT PRIMAIRE Robert et Sharp ont obtenu le Prix Nobel 1993 pour leur deacutecouverte de la structure

enteacutee) des gegravenes eucaryotes Le gegravene eucaryote comprend

des laquo exons raquo qui contiennent lrsquoinformation heacutereacuteditaire qui srsquoexprimpolypeptides (Le mot exon deacuterive en fait de lsquoexitrsquo en relation avec la partie du RNA qui sortira du noyau vers le cytoplasme)

era en donnant des

des laquo introns raquo qui sont intercaleacutes entre les exons Ils seront transcrits mais ne seront pas traduits

Structure de deux gegravenes humains

Crsquoest au cours de la maturation dueacutelimineacutes par un meacutecanisme appesoudeacutes bout agrave bout

preacute-mRNA (lsquoprocessingrsquo en anglais) que les introns seront leacute laquo eacutepissage raquo (lsquosplicingrsquo en anglais) Les exons vont ecirctre t eacutepisseacutes les introns sont exciseacutesles exons son

Lrsquoeacutepissage est une opeacuteration deacutelicate qui doit ecirctre parfaitement preacutecise et fiable En effet une erreur drsquoun seul nucleacuteotide au niveau de lrsquoexcision changerait le laquo cadre de lecture raquo lors de la traduction et aboutirait agrave des proteacuteines incorrectes Il est important de ne pas confondre les introns au niveau du DNA avec ceux au niveau du preacute-mRNA Les introns exciseacutes sont ceux du RNA et non du DNA Nous deacutecrirons drsquoabord le meacutecanisme geacuteneacuteral de lrsquoeacutepissage et nous eacutevoquerons ensuite quelques cas particuliers (eacutepissage en trans eacutepissage alternatif auto-eacutepissage)

MECANISME GENERAL DE LrsquoEPISSAGE Trois eacuteleacutements du preacute-mRNA jouent un rocircle important lors de lrsquoeacutepissage

Le laquo site donneur drsquoeacutepissage raquo situeacute agrave la jonction 5rsquoexon-intron3rsquo Se site commence par lsquoGUrsquo au niveau de

- 26 -

lrsquointron

Le laquo site accepteur raquo situeacute agrave la jonction 5rsquointron-exon 3rsquo ce site se

termine par lsquoAGrsquo au niveau de lrsquointron

Le laquo site de branchement raquo situeacute agrave environ -30 nucleacuteotide de lrsquoextreacutemiteacute 3rsquo

branchement raquo

de lrsquointron Sur ce site se trouve un lsquoArsquo appeleacute laquo A du Lasso ou

lsquolariatrsquo Le meacutecanisme drsquoeacutepissage peut ecirctre deacutecomposeacute en deux eacutetapes comprenant chacune unereacuteaction de laquo transesteacuterification raquo Dans notre cas la transesteacuterification est une reacuteaction ougrave une liaison ester phosphate est transfeacutereacutee drsquoun sucre agrave un autre sans hydrolyse et donc sans neacutecessiteacute drsquoun apport drsquoeacutenergie 1egravere eacutetape Premiegravere coupure en 5rsquo de lrsquointron Lrsquoattaque de cette liaison ester est due au lrsquohydroxyle en position 2rsquo du A du branchement Ainsi le G en position 5rsquo de lrsquointron se soude par une liaison covalente au A du branchement formant une structure en laquo lasso raquo (lsquolariatrsquo en anglais) 2egraveme eacutetape Deuxiegraveme coupure en 3rsquo de lrsquointron Soudure des deux exons et libeacuteration du lasso qui sera deacutegradeacute par les nucleacuteases

Ce processus est controcircleacute et guideacutec

par un om nucleacute

laquo spsnRNchacu snR

doivent pas ecirctre traduites Le spliceosom aire ont pour fonction de retenir le preacute-m nt encombrants qursquoils empecirc

plexe oproteacuteique appeleacute liceosome raquo comprenant plusieurs

A (U1 U2 U4 U5 et U6) associeacutes n agrave plusieurs proteacuteines appeleacutees NP raquo laquo

U1 reconnaicirct le site donneur U2 reconnaicirct le site de branchement et U5 reconnaicirct le site accepteur U6 et U4 sont associeacutes par des liaisons compleacutementaires U6 est vraisemblablement impliqueacute dans la catalyse et serait reacuteguleacute par U4 qui pourrait jouer le rocircle de lsquoRNA antisensrsquo U4 se dissocie du spliceosome juste avant ou pendant la premiegravere coupure Lrsquoeacutelimination des introns srsquoeffectue dans le noyau Le preacute-messager (muni de la coiffe et de la queue poly A) doit ecirctre tenu agrave lrsquoeacutecart tant qursquoil contient des seacutequences qui ne

e situeacute au niveau de chaque intron tout au long du transcrit primRNA dans le noyau Les spliceosomes sont telleme

chent le passage du RNA tant qursquoil y a un seul intron non exciseacute

- 27 -

CAS PART

ICULIERS DE LrsquoEPISSAGE DES INTRONS

nt des exons

appartenant au m ral deacutecrit plus haut Chez quelq eacutecanisme

prim

LrsquoEPISSAGE EN TRANS (laquo trans-splicing raquo) Lrsquoeacutepissage des exons apregraves excision des introns concerne geacuteneacuteraleme

ecircme transcrit primaire laquo cis-splicing raquo Crsquoest le cas geacuteneacute

ues organismes (trypanosome et une espegravece de neacutematode) un mdrsquoeacutepissage en trans a eacuteteacute deacutecrit Dans ces cas lrsquoeacutepissage drsquoexons a lieu entre des transcrits

aires diffeacuterents et donnant ainsi un mRNA mosaiumlque

- 28 -

Ce meacutecanisme araison avec le meacutecanisme

particulier drsquoeacutepissage est deacutecrit sur la figure ci-dessous en comp geacuteneacuteral

LrsquoEPISSAGE ALTERNATIF (OU DIFFERENTIEL) ermet agrave un gegravene posseacutedant plusieurs exons de srsquoexplique par le fait qursquoun mecircme transcrit exemple certains exons seront choisis dans un nt retenus dans un autre type de cellules

s exons produit ainsi plusieurs sortes de mRNA et donc plusieurs

Lrsquoeacutepissage alternatif est un meacutecanisme qui pcoder plus drsquoune proteacuteine Cette possibiliteacuteprimaire peut ecirctre eacutepisseacute diffeacuteremment Par type de cellules tandis que drsquoautres exons sero

rsquoutilisation alternative deLproteacuteines diffeacuterentes Ce meacutecanisme permettant drsquoaugmenter la capaciteacute de codage des gegravenes se rencontre en particulier dans le muscle et le cerveau

LrsquoAUTO-EPISSAGE (NOTION DE RYBOZYMES)

Altm

Ces ribozymle clivag Tetrahymena thermophilu itochondrie et

prempar Tom

thermophilu

exteacuterieur qumagneacutesium

lattaque ind

apitulatif des eacutetapes dauto-

Jusqursquoaux anneacutees 1980 on pensait que les enzymes ne pouvaient ^ecirctre que des proteacuteines an et Cech [1981] Prix Nobel 1989 ont deacutecouvert que certains RNA pouvaient ecirctre

doueacute de proprieacuteteacutes enzymatiques Ces RNA ont eacuteteacute appeleacutes laquo ribozymes raquo

es ont eacuteteacute mis en eacutevidence dans certains cas particuliers ougrave ils interviennent dans e de preacute-tRNA (chez E coli) ou dans lrsquoeacutepissage de preacute-rRNA (chez

s un protozoaire) et de certains preacute-mRNA (champignons mchloroplastes de plantes)

Les introns exciseacutes par auto-eacutepissage sont subdiviseacutes en deux groupes (I et II)

Les introns de groupe I ont eacuteteacute les iers ribozymes a ecirctre deacutecouverts

Cech dans le preacutecurseur du rRNA 26S du protozoaire Tetrahymena

s Ils ont la capaciteacute dauto-eacutepissage sans aucun autre apport

e celui drsquoun GMP et de lion Cet eacutepissage est reacutealiseacute par

2 reacuteactions de trans-esteacuterification apregraves itiale du GMP sur le site

eacutepissage 5

Scheacutema reacuteceacutepissage des introns de groupe I

Les diffeacuterents introns de groupe I bien quayant peu de similariteacute dans leur seacutequence ont en commun des eacuteleacutements courts de structure primaire Ces eacuteleacutements appartiennent agrave des domaines indispensables pour le repliement correct de lensemble amenant agrave la structure atalytique active Le site actif de la catalyse naicirct ici principalement de 3 eacuteleacutements

osides Elle permet de positionner le MP pour une attaque nucleacuteophile sur le site deacutepissage en 5

Lpyrim e

ent

c Le premier eacuteleacutement important est la creacuteation dune poche de fixation pour le GMP Cette poche peut discriminer entre le GMP et les autres nucleacuteG

alignement du site deacutepissage est reacutealiseacute par lappariement dune seacutequence riche en idine de lexon en 5 avec une seacutequence guide laquo IGS raquo de lintron (lsquoInternal Guid

Sequencersquo)

Le site deacutepissage en 3 bien queacuteloigneacute dans la seacutequence est aussi preacutesent dans le site catalytique pour permettre lors de la 2egraveme transesteacuterification la soudure des 2 exons et la libeacuteration de lintron

La reacuteaction conduit agrave 2 produits le premier est constitueacute par les 2 exons correctemeacutepisseacutes Le second est libeacutereacute Ce dernier apregraves perte de 19 nucleacuteotides donne un RNA lineacuteaire (RNA L-19) Cet RNA L-19 contient lIGS et la poche de fixation du GMP ce qui suffit pourlui confeacuterer une activiteacute enzymatique

- 29 -

Scheacutemas des eacutetapes de leacutepissage des introns de groupe I

Les introns de groupe II quant agrave eux sont trouveacutes majoritairement dans les champignons et dans les mitochondries et chloroplastes de plantes Leur meacutecanisme dauto-eacutepissage se

leacutepissage des mRNA en ce sens quil fait intervenir n phosphodiester 2-5 Neacuteanmoins agrave linstar des

introns de groupe I les introns de groupe II font intervenir un repliement preacutecis de la structure

nce diffegravere de

tides

rapproche plus de meacutecanisme geacuteneacuteral dela forme lasso comprenant une liaiso

pour obtenir une forme catalytique active

- lsquoRNA-EDITINGrsquo (CORRECTION DU RNA) δLrsquoexpression anglaise laquo RNA-editing raquo est le plus souvent traduite par lsquoeacutedition du RNArsquo ce qui est en fait inexact lsquoto editrsquo en anglais signifie lsquocorriger une eacutepreuve avant lrsquoimpression finalersquo

EFINITION Le lsquoRNA Deacuteditingrsquo concerne tout traitement du mRNA aboutissant agrave un mRNA ont la seacutequed

celle du brin de DNA sens addition suppression substitution drsquoune ou de lusieurs nucleacuteop

Lrsquoexcision drsquointrons est bien eacutevidemment exclue de cette deacutefinition

es modifications peuvent C

- 30 -

- 31 -

Homme le roteacuteine B et

syntheacutetiseacutee agrave partir

AUG et se terminant par un laquo codon stop raquo

3 une reacutegion 3 lsquonon traduitersquo se terminant par une queue poly A

Chez les eucaryotes la transcription et la traduction se deacuteroulent dans deux comdiffeacuterents puisque la premiegravere a lieu dans le noyau et la seconde dans le cytoplasm continu laquo pores nucleacuteaires raquo Les

avoir une incidence consideacuterable sur lexpression des gegravenes Par exemple chez lremplacement de C par U modifie la seacutequence de certains mRNA de lapolipopprovoque lapparition dun codon stop preacutematureacute De ce fait la proteacuteine des mRNA ldquomodifieacutesrdquo sera environ deux fois plus courte Un mecircme gegravene peut donc donner naissance agrave deux mRNA diffeacuterents traduits en apoB100 dans le foie ou en apoB48 dans lintestin (Greeve et al [1993])

5 TRANSPORT DU mRNA VERS LE CYTOPLASME Conseacutecutivement agrave ces diffeacuterentes eacutetapes le mRNA mature dun eucaryote est composeacute de seacutequences exons et contient trois parties

1 une reacutegion 5 lsquonon traduitersquo portant une coiffe

2 une reacutegion lsquotraduitersquo deacutebutant par un laquo codon dinitiation raquo de la traduction

partiments e La

iteacute entre le noyau et le cytoplasme est assureacutee par lesstructures multi-proteacuteiques de ces pores nucleacuteaires ancreacutees dans la membrane se comportent comme des sites de transport actif permettant les eacutechanges macromoleacuteculaires entre le noyau et le cytoplasme

est formeacutee de 2 e continuent avec le que la membrane

soit continue les deux position en proteacuteines

cytoplasme et le proteacuteines qui ont

cluant les histones les s proteacuteines reacutegulateurs

nes permettant les traitements de importeacutees du cytosol ougrave

Lrsquoenveloppe nucleacuteaire renfercompartiment nucleacuteaire Ellemembranes concentriques qui sreacuteticulum endoplasmique Bieninterne et externe du noyau membranes ont une comdiffeacuterentes

Le trafic bidirectionnel entre le noyau est incessant La plupart desune fonction dans le noyau (inADN et ARN polymeacuterases lee gegravenes les proteacutei

me lrsquoADN et deacutefini le

ddes RNA) sont seacutelectivement

- 32 -

du noyau ne sont pas toutes exporteacutees vers le cytoplasme ertaines sont strictement nucleacuteaires et se deacutetachent du mRNA avant le transit par les pores ucleacuteaires et drsquoautres restent lieacutees au mRNA et peuvent jouer un rocircle important dans le ansport vers le cytoplasme et lrsquoinitiation de la traduction

importeacutees dans le noyau (ougrave elles sont assembleacutees n particules avec des rRNA nouvellement syntheacutetiseacutes) et ensuite reacuteexporteacutees vers le

cytoplasm es eacutetapes implique un transport eacutelectif au travers de la membrane nucleacuteaire

elles ont eacuteteacute syntheacutetiseacutees vers lrsquointeacuterieur du compartiment nucleacuteaire Dans le mecircme temps les tRNA et mRNA qui ont eacuteteacute syntheacutetiseacutes dans le noyau sont eux exporteacutes vers le cytoplasme

Comme le processus drsquoimportation le processus drsquoexportation est seacutelectif les mRNA par exemple sont exporteacutes seulement apregraves qursquoils aient eacuteteacute modifieacutes correctement Les proteacuteines fixeacutees sur les mRNA au niveauCntr

Dans certain cas le processus de transport est complexe les proteacuteines ribosomales par exemple sont syntheacutetiseacutees dans le cytosole

e en tant que sous-uniteacute ribosomale Chacune de cs

Scheacutema reacutecapitulatif des eacutetapes dauto-eacutepissage des introns de groupe I

- 1 -


SOMMAIRE

1 REPERES HISTORIQUES

2


4

3 LA TRANSCRIPTION 6 I LA TRANSCRIPTION CHEZ LES PROCARYOTES 7

1 INITIATION (et caracteacuteristiques de la RNA-polymeacuterase) 7 2 ELONGATION 10 3 TERMINAISON 11

α- REGULATION DE LrsquoEXPRESSION GENIQUE CHEZ LES PROCARYOTES

12

β- OPERONS CONCEPT DE BASE 13 γ- REGULATION GENIQUE NEGATIVE lsquoREPRESSIBLErsquo ou

bien lsquoINDUCTIBLErsquo 14

δ- REGULATION GENIQUE POSITIVE

15

II LA TRANSCRIPTION CHEZ LES EUCARYOTES 17 1 INITIATION (RNA-POLYMERASE II) 18 2 ELONGATION 23 3 TERMINAISON 23 4 MODIFICATIONS DU PRE-MESSAGER MATURATION DU

mRNA 23

α- LA FIXATION DE LA COIFFE EST TRES PRECOCE 23 β- LES RNA SONT LE PLUS SOUVENT POLYADENYLES 24 γ- LrsquoEPISSAGE ELIMINE LES INTRONS DU TRANSCRIT

PRIMAIRE 25

MECANISME GENERAL DE LrsquoEPISSAGE 26 CAS PARTICULIERS DE LrsquoEPISSAGE DES INTRONS 27

LrsquoEPISSAGE EN TRANS (laquo trans-splicing raquo) 27 LrsquoEPISSAGE ALTERNATIF (OU DIFFERENTIEL) 28 LrsquoAUTO-EPISSAGE (NOTION DE RYBOZYMES) 29

δ- lsquoRNA-EDITINGrsquo (CORRECTION DU RNA) 30 5 TRANSPORT DU mRNA VERS LE CYTOPLASME 31

- 2 -






- 3 -


- 4 -









- 5 -


ique) (Tran







- 6 -




1 Lrsquoinitiation


3 La terminaison





- 7 -

eacute








- 8 -


lsquoholoenzyme

β

σ70 σ54




e du



u promoteur recon






2+








- 9 -

- 10 -

ou CAP

(C ple




a

ribosomes

- 11 -



ture rquer un




- 12 -














Ce re



- 13 -


cellule de srsquo






[1961] (Prix Nobel 1965)




ode de













- 14 -


ents








- 15 -








le)




- 16 -

- 17 -


lexe






I (ou B)



Transcription de



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- 19 -





transcTFIIH)

heacutelicas

com

ent le tre les



lrsquo









TAFII

CTD

CTD


cefo



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- 21 -




- 22 -

Retard sur gel



3


4








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- 24 -

- 25 -


γ







era en donnant des








- 26 -

lrsquointron




branchement raquo












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CAS PART


nt des exons


prim





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Altm


prempar Tom

thermophilu


lattaque ind












eacutepissage 5




Lpyrim e

ent



Sequencersquo)



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nce diffegravere de

tides








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partiments e La











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- 2 -






- 3 -


- 4 -









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