Détection rapide des résistances bactériennes
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Détection rapidedes résistances bactériennes
DUACAI18 février 2021
Dr. Caroline Loïez
Les bases du diagnostic bactériologique
Extraction de l’ADN
Diagnostic moléculaire
PCR classique PCR en temps réel
Détection du produit amplifié
Électrophorèse24 – 48 h
Pas d’antibiogramme
Résultat en3 – 4 h
Pas d’antibiogramme
Techniques classiques parfois trop longues
?
Culture
Diagnostic « classique »
Incubation à 37°C 24h
Identification en 24 h (MALDI-TOF)
Antibiogramme en 48 h
Examen microscopique avec Gram
Orientation diagnostiquerapide
ANTIBIOGRAMME AUTOMATISE
ANTIBIOGRAMME EN DIFFUSION
Antibiogrammes en routineR
éfér
entie
ls :
CA-
SFM
/ EU
CAS
T
β
Méthodes phénotypiques vs génotypiquesM
étho
des
phén
otyp
ique
s
Mét
hode
s gé
noty
piqu
es
Avantages– Peut-être réalisée sur tout type de prélèvement
parfois sans culture préalable– Possibilité d'une réponse rapide < 2 heures– Antibiothérapie adaptée précoce
Inconvénients– On ne détecte que ce que l'on connaît– Réponse : présence ou absence– On ne détecte pas le niveau d'expression (sauf
quantification des ARNm)– Coût variable mais > méthode phénotypique– Faux négatifs : variabilité génique– Faux positifs : ADN INFECTION
Délai– Meilleure prise en charge du patient
(isolement, traitement)– Diminution du coût de l’antibiothérapie, des
complications– Bactéries à croissance difficile (M.tuberculosis,
H. pylori)
Efficacité– Détection des SARM, des ERV, -lactamases
Mécanisme de résistance (épidémiologie)– -lactamases
Avantages– Rendu du résultat en catégorie clinique S, I, R– Appréciation du niveau d'expression– Détection de nouveaux mécanismes– Faible coût
Inconvénients– Nécessite une culture pure– Délai : 24-48H– Antibiothérapie probabiliste parfois non adaptée– Problème de détection de certaines résistances
Phénotype ≠ GénotypeAttention : l’information génétique n’est pas suffisanteInteraction entre les gènes (sensibilité aux ATB) nécessite une analyse simultanée du phénotype
Pourquoi être plus rapide ?
Collectif : Repérer les patients colonisés à BMR
Individuel : Adapter le plus rapidement possible le traitement antibiotique au microorganisme en cause pour permettre
Diminution de la mortalité Prévention de l’émergence de résistance aux ATB Diminution de la durée d’hospitalisation
Am J Med. 2003 Nov;115(7):529-35.
Résistance due à l’acquisition d’une PLP additionnelle PLP2a, → codé par le gène mecA inclus dans un élément génétique mobile la cassette
SCCmec
→ expression hétérogène→ mauvaise affinité pour les β -lactamines (résistance croisée)
Résistance à la méticilline : SARM
Test Latex : technique d’agglutination• Principe : agglutination latex-anticorps monoclonaux anti-PLPL2a• A partir des colonies isolées• Délai : 5 min• Avantages : Test simple, rapide, non onéreux• Limites : manque de sensibilité et de spécificité
Test PBP2a : technique immunochromatographique• Principe : bandelettes avec Ac anti-PLP2a• A partir des colonies isolées• Délai : 5 min • Avantages : test simple, rapide, coût raisonnable• Limites : nécessité d’une induction par une β-lactamine
Test BinaxNow® : technique immunochromatographique• Principe : carte avec Ac anti-PLP2a / Ac Staphylocoque• A partir des hémocultures directement• Délai : 30 min • Avantages : test simple, rapide, • Limites : coût et lourdeur technique et organisationnelle
Milieux chromogènes• Principe : Milieu chromogénique sélectif contenant des substrats chromogènes
permettant la coloration des colonies à la suite de sa dégradation par des enzymes bactériennes spécifiques et de la libération du chromophore, et des antibiotiques.
• A partir du prélèvement• Délai : 18-24 heures• Avantages : test simple, onéreux• Limites : ne présume pas toujours du mécanisme de résistance en cause
Détection phénotypique des SARM
Détection génotypique des SARM
Technique d’hybridation• Principe : utilisation de bandelettes avec sondes biotinylées
permettant la détection d’un fragment spécifique du SARM combiné à la détection des SCCmec de type I-IV
• A partir des colonies et/ou du prélèvement• Délai : 4 heures• Limites : test lourd et coûteux• Nécessité d’un inoculum suffisant quand sur les prélèvements
Techniques moléculaires• Principe : mise en évidence du support génétique (mecA et
SSCmec)
• A partir des colonies et/ou du prélèvement et/ou hémocultures• Délai : 1 heure • Avantages : test simple, rapide, sensible• Limites : coût (attention : mélange bactérien)
Résistance à la vancomycine : ERV
Résistance due à une modification de la cible (modification enzymatique du site de fixation du glycopeptide
→ synthèse de précurseurs du peptidoglycane de faible affinité (DAla-DLacPP ou Dala-DSerPP au lieu de Dala-DAlaPP)
→ élimination des précurseurs de faible affinité
P. Courvalin 2004
→ codé par les gènes van : vanA, B, D, G, E, C
- plasmidique (vanA, vanB) - chromosomique (vanC)
Milieux chromogènes
• Principe : Milieu chromogénique sélectif contenant des substrats chromogènes permettant la coloration des colonies à la suite de sa dégradation par des enzymes bactériennes spécifiques et de la libération du chromophore, et des antibiotiques.
• bleu-vert = E. faecalis
• violet = E. faecium
• Milieu contenant 8 mg/l de vancomycine et 2 substrats α-glucosidaseet ß-galactosidase d’où inhibition de la croissance des entérocoques naturellement résistants et de bacilles à Gram négatif)
• A partir du prélèvement• Délai : 18-24 heures• Avantages : test simple • Limites : test onéreux
Détection phénotypique des ERV
Détection génotypique des ERV
Technique d’hybridation• Principe : • Principe :
• extraction d’ADN à partir des cultures• amplification avec des amorces biotinylées• Hybridation sur bandelettes• Révélation colorimétrique (streptavidine – PAL + substrat)
• A partir des colonies • Délai : < 5 heures• Limites : test lourd et coûteux
Techniques moléculaires
• Principe : mise en évidence du support génétique (vanA et vanB)
• A partir des colonies et/ou du prélèvement de dépistage• Délai : 45 min• Limites : test simple, rapide mais coûteux • Attention : présence du gène vanB chez d’autres bactéries
Résistance à la rifampicine : M. tuberculosis
Résistance liée à : des mutations ponctuelles dans la région 507-533 du gène rpoB codant la sous-unité β de
l’ARN polymérase : Ser531Leu et His526Tyr (93 % entre les codons 511 et 533) des petites insertions et des délétions → modification de l'enzyme, diminuant ainsi la fixation ou l'accessibilité de la rifampicine, et sont associées à un haut niveau de résistance.
90% des souches RIF-R sont résistants à l’isoniazide. La détection de la résistance à la rifampicine est donc un marqueur pour la
détection des souches MDR.
511 533
22%
48%
526 531His Ser
Détection génotypique des MDR
Technique d’hybridation
• Principe : Principe du reverse dot-blot• Les produits d'amplification marqués à la biotine sont hybridés avec
des oligonucléotides spécifiques, immobilisés sur une membrane de nitrocellulose. Les hybrides ainsi formés sont détectés par méthode colorimétrique.
• A partir des colonies et/ou du prélèvement dont l’ED est très positif• Délai : 4 heures• Avantage : détection rapide et facile des mutations les plus
fréquentes du gène rpoB• Limites : test lourd, coûteux qui ne détecte que les mutations connues
Faux positifs positifs
Techniques moléculaires
• Principe : mise en évidence du support génétique rpoB
• A partir des colonies et/ou du prélèvement (crachat)• Délai : 1 heure • Limites : test simple, rapide mais coûteux (attention : mélange
bactérien)
Résistance aux carbapénèmes : EPC
Pénicillinases (TEM, SHV) BLSE de type TEM, SHV, CTX-M, PER, VEB, GES… Sérine carbapénémases (KPC, GES…)
Métallo-bêta-lactamases (VIM, IMP, NDM)
Céphalosporinases (AmpC)
Oxacillinases (OXA) BLSE de type OXA Oxa-carbapénémases (OXA-48, variants)
β-lactamines
Pénicillines Céphalosporines5 générations
MonobactamsAztréonam
Carbapénèmes
β-lactamases
Classification d’Ambler
β CARBA Test : technique colorimétrique• Principe : test d’hydrolyse des carbapénèmes• A partir des colonies isolées• Délai : 10 min• Avantages : test simple, rapide, non onéreux• Limites : parfois couleur douteuse
Test RAPIDEC Carba NP : technique colorimétrique (valable pour P.aeruginosa)
• Principe : Détection de l’acidification (virage indicateur coloré) liée à l’hydrolyse de l’imipéneme par les carbapénémases → identification des carbapénémases (A, B et D)
• A partir des colonies isolées• Délai : 30 min à 2 h• Avantages : test rapide, se / spe = 97,8%• Limites : lecture parfois difficile
Test Coris : technique immunochromatographique• Principe : détection avec des anticorps monoclonaux• Directement à partir des colonies• Délai : 5-10 minutes• Avantage : test simple, rapide
Milieux chromogènes• Principe : Milieu chromogénique sélectif contenant des substrats chromogènes
permettant la coloration des colonies à la suite de sa dégradation par des enzymes bactériennes spécifiques et de la libération du chromophore, et des antibiotiques.
• A partir du prélèvement• Délai : 18-24 heures• Limites : Test simple, +/- onéreux
Détection phénotypique des EPC
Détection génotypique des EPC
Test unitaire
Tests par série
Principe : mise en évidence du support génétique= KPC, NDM, VIM, IMP-1, OXA-48 et variants (y compris OXA-181 & OXA-232)
• A partir des colonies et/ou du prélèvement de dépistage
• Délai : 1 heure• Limites : test simple, rapide mais coûteux
Techniques moléculaires
Résistance aux β-lactamines : E-BLSE
Résistance due à la production de β-lactamases (enzymes capables d’hydrolyser le cycle β -lactam)
Pénicillinases (TEM, SHV) BLSE de type TEM, SHV, CTX-M, PER, VEB, GES… Sérine carbapénémases (KPC, GES…)
Métallo-bêta-lactamases (VIM, IMP, NDM)
Céphalosporinases (AmpC)
Oxacillinases (OXA) BLSE de type OXA Oxa-carbapénémases (OXA-48, variants)
β-lactamines
Pénicillines Céphalosporines5 générations
MonobactamsAztréonam
Carbapénèmes
β-lactamasesClassification d’Ambler
Milieux chromogènes
• Principe : Milieu chromogénique sélectif contenant des substrats chromogènes permettant la coloration des colonies à la suite de sa dégradation par des enzymes bactériennes spécifiques et de la libération du chromophore, et des antibiotiques (dont le cefpodoxime).
• → Isolement et identification des micro-organismes cibles en une seule étape, ce qui permet de raccourcir le temps de rendu du résultat
• A partir du prélèvement• Délai : 18-24 heures• Limites : Test simple, onéreux• mais ne présume pas toujours du mécanisme de résistance en
cause
Détection phénotypique des E-BLSE
A partir desécouvillons de dépistage
A partir des prélèvements
A partir des flacons d’HC positifs
A partir des colonies
SARM Milieux chromogènes
Biologie moléculaire
Milieux chromogènes
Biologie moléculaire
Hybridation
Milieux chromogènes
Immunochromatographie
Biologie moléculaire
Agglutination
Immunochromatographie
Hybridation
ERV Milieux chromogènes
Biologie moléculaire
Milieux chromogènes Milieux chromogènes Hybridation
Biologie moléculaire
EPC Milieux chromogènes
Biologie moléculaire
Milieux chromogènes Milieux chromogènes Colorimétrie
Immunochromatographie
Biologie moléculaire
E-BLSE Milieux chromogènes Milieux chromogènes Milieux chromogènes
M. tuberculosis Hybridation
Biologie moléculaire
Hybridation
Biologie moléculaire
T0 T12-15 h T18-24 h
Synthèse
Détection phénotypique multiple
• Principe : Recherche d’une modification du spectre d’un antibiotique
• → après mise en contact pendant quelques heures de la souche à tester avec une solution d’antibiotique, mise en évidence de la disparition du pic correspondant à cet antibiotique et de l’apparition d’un pic correspondant au(x) produit(s) d’hydrolyse de ce même antibiotique.
• A partir de la souche ou directement d’un prélèvement
• Délai : 2-3 heures
• Avantages : peu coûteux si on dispose déjà de l’instrument• Limites : Test nécessitant une mise au point fine
•
MALDI-TOF
Technique qui va probablement se développer
• Principe : détection de cibles d’acides nucléiques multiples : 16 à 27 cibles en fonction des panels (bactéries, parasites, virus et marqueurs de résistance)
• A partir des hémocultures positives• Délai : 1 h environ (2 min de préparation)• Avantages : test unitaire, totalement automatisé• Limites : coût 100-150 € / test + coût instrument (50k€)
Approche syndromique : PCR automatisée multiplex
• Principe : détection de cibles d’acides nucléiques multiples : 30aine de cibles en fonction des panels (bactéries, levures, virus et marqueurs de résistance)
• A partir des prélèvements (hémocultures, pulmonaires, abdominaux, matériel et tissus)
• Délai : 5h environ• Avantages : test unitaire• Limites : coût 270 € / test + coût instrument
Accessible à tous les laboratoires, quel que soit le personnel
FilmArray® (bioMérieux)
Unyvero® (Curetis)
Culture = technique de référence pour la plupart des bactéries→ accès aux souches
sensibilité aux antibiotiques données épidémiologiques mise en évidence de nouveaux mécanismes de résistance
Validation technique = de plus en plus facile Développement des kits commerciaux marqués CE-IVD +++ Accessible à tous : plus de nécessité d’un personnel dédié et qualifié Problème de coût
Validation clinique = problème d’interprétation la présence d’ADN n’est pas synonyme de présence de bactéries vivantes la présence du gène ne signifie pas que ce gène s’exprime→ importance de la relation bio-clinique
Coût +++ ↔ Indications limitées (mais développement des approches syndromiques) Sepsis Méningites Dépistage BMR …
Limites des techniques moléculaires
Obtenir dans un délai bref
un diagnostic de quasi-certitude
ou d’exclusion d’une colonisation,
dans une situation
épidémiologique particulière
SARM
EPC
ERV
Gain pronostique pour les
patients
Impact économique
Impact clinique
Domaines d’applicationsA
visé
e ép
idém
iolo
giqu
e
A vi
sée
thér
apeu
tique
Isolement rapide des patients porteurs de BMR
Levée d’isolement plus rapide des patients non porteurs de BMR
Gestion des épidémies / Limiter la propagation de la résistance bactérienne
Décolonisation des patients SARM
Adaptation de l’antibiothérapie probabiliste en fonction de la présence ou non d’un gène de résistance
Epargne thérapeutique
En routine = association des différents outils détection rapide des SARM dans le dépistage nasal détection rapide des E-BLSE et des EPC dans le dépistage anal détection des ERV dans le dépistage anal détection rapide des carbapénèmases à partir des souches isolées (plusieurs outils) détection rapide de la résistance à la rifampicine à partir des crachats (ED +)
En développement détection des résistances enzymatiques sur MALDI-TOF antibiogramme par génotypage détection génotypique des E-BLSE (puces→ problème : coût +++)
Conclusion
ON NE PEUT DETECTER RAPIDEMENT que : la résistance à un antibiotique le support de résistance
JAMAIS, on ne pourra affirmer la sensibilité à un antibiotique avec les tests rapides actuels
PROBLEME PRINCIPAL : le coût +++Nécessité de cibler certains patients dans certains services : réanimation…Nécessité d’évaluations médico-économiques