Research Collection

Doctoral Thesis

Zur Kenntnis der morphologischen und physiologischenEigenschaften einiger in Brauereibetrieben frisch isolierterkokkenförmiger Bakterien

Author(s): Clausen, Martin

Publication Date: 1957

Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-000090752

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ETH Library

Zur Kenntnis der

morphologischen und physiologischen Eigenschaften

einiger in Brauereibetrieben

frisch isolierter kokkenförmiger Bakterien

VON DER

EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN

HOCHSCHULE IN ZÜRICH

ZUR ERLANGUNG

DER WÜRDE EINES DOKTORS DER

TECHNISCHEN WISSENSCHAFTEN

GENEHMIGTE

PROMOTIONSARBEIT

VON

Martin Clausen, dipl. Ing.-Agr.

von Ernen (VS)

Referent: Herr Prof. T. O. Wikén

Korreferent: Herr Prof. Dr. H. Deuel

1957

Verlag Schweiz. Bierbrauer verein, Zürich

MEINER LIEBEN ERA U

Separatdruck aus Schweiz. Brauerei-Rundschau. Band 69. Heft 1 und 2 (1958)

VORWORT

Die vorliegenden Untersuchungen entstanden durch die Zusammenarbeit zwischen dem

Institut fur landwirtschaftliche Bakteriologie und Garungsbiologie, Eidg Techn Hoch¬

schule, Zurich, und anfänglich dem Laboratorium der Versuchsstation Schweiz

Brauereien in Zurich sowie spater dem I dboratonum der Brauerei Salmenbrau AG

in Rhcinlelden

Diese Arbeit wurde durch das lintgcgcnkom'nui dis Vorstandes und der Direktion

1er Versuchsstation Schweiz Brauereien Zurich ermöglicht An der genannten Ver

Suchsstation wurden aus zur Untersuchung eingesandten Proben die verschiedenen

Kokkenstamme isoliert

Dank der Grosszugigkeit der Direktion der Brauerei Salmenbrau AG Rheinfelden,

konnte die vorliegende Arbeit in deren Laboratorium weitergeführt werden

Meinem sehr verehrten Lehrer, Herrn Prof T Wiken, Vorsteher des Instituts fur

landwirtschaftliche Bakteriologie und Garungsbiologie, Eidg Techn Hochschule,

Zurich, der die Arbeit durch wertvolle Ratschlage, lebhaftes Interesse, standige Unter-

stutzung und umsichtige Leitung sehr forderte, bin ich zu grossem Dank verpflichtet

Mem Dank gebührt auch der Direktion der Brauerei Salmenbrau AG, den Herren

R C Hunziker, R C Habich und A Villinger fur ihr Verständnis und die mir ge

wahrte grosszugige Unterstützung

Ausserdem bin ich dem Präsidenten Herrn Dr H Hurlimann, sowie den übrigen

Vorstandsmitgliedern und Herrn Direktor Dr A Schmal der Versuchsstation Schweiz

Brauereien zu Dank verpflichtet

Ferner danke ich allen Mitgliedern des Instituts fur landwirtschaftliche Bakteriologieund Garungsbiologie, Eidg Techn Hochschule, Zurich, die mir durch wertvolle Rat¬

schlage bei der Durchfuhrung dieser Arbeit behilflich waren

An dieser Stelle mochte ich ebenfalls Herrn E Staubli Laborant der Brauerei Salmen

brau AG, fur seine wertvolle und treue Hilfe herzlich danken

1NHALTSVLRZLILHNIS

EINLEITUNG

MORPHOLOGISCHES 7

Natürliche Substrate 7

Synthetische Substrate 7

1 Herkunft und Isolierung der untersuchten Stamme 7

2 Wachstum und Kolonienform auf verschiedenen Kultursubstraten ^

3 Zeilmorphologie 11

4 Diskussion 11

PHYSIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN 12

1 Bestimmung und Identifizierung wasserdampffluchtiger Sauren m Bier

und synthetischen Nahrsubstraten 12

2 Bestimmung der atherextrahierbaren Sauren 13

3 Bestimmung der Milchsäure 13

4 Bestimmung des Aethanols 13

5 Bestimmung von Glukose in synthetischen Substraten 14

I Hervorgerufene Veränderungen in Bier 14

II Versuche unter Verwendung von synthetischen Nährlösungen 16

1 Garversuch mit Nährlösung 1 (Glukose und Mineralsalze) 16

2 Garversuche mit den Nährlösungen 2 und 3 (Glukose, Casein-

hydrolysat, Mineralslaze, Hefewasser) 18

3 Versuche ubei den Abbau von Aethanol in synthetischen Sub¬

straten 20

4 Diskussion 21

III Untersuchungen über die Eignung verschiedener Kohlehydrateals Kohlenstoffquellen 22

ZUSAMMENFASSUNG 25

LITERATURVERZEICHNIS 26

4

EINLEITUNG

Ueber die durch Mikroorganismen verursachten uner¬

wünschten Veränderungen in Bier wird in der Brauerei¬

fachliteratur in vielen Veröffentlichungen berichtet. Zahl¬

reichen und teilweise verschiedensten Arten von Organis¬men, vor allem Milchsäure- und Essigsäurebakterien, sowie

wilden Hefen bietet Bier ein gutes Entwicklungsmedium,wobei neben den durch das Wachstum bedingten Trü¬

bungen auch chemische, von Stoffwechselprodukten her¬

rührende Veränderungen hervorgerufen werden. Diese

beschränken sich jedoch nicht allein auf das filtrierte und

abgefüllte fertige Produkt, vielmehr können Infektionen

im Brauereibetrieb schon im Verlaufe des Fabrikations¬

prozesses störend wirken.

Eine in den Brauereien gefürchtete Erscheinung ist die

sogenannte «Sarzinakrankheit», die an Trübung, saurem

Geschmack und honigartigem Geruch erkannt und durch

Kokken verursacht wird. Bei der mikroskopischen Unter¬

suchung solchen Bieres zeigen sich Diplokokken, Ver¬

bände von 4 in einer Ebene symmetrisch angeordnetenZellen, genannt Tetraden und unregelmässige Zellagglo-merate. Ursprünglich wurden diese Organismen als Sar-

zinen (Hansen 18), später als Pediokokken (Balke 2) und

in der neueren Literatur werden sie oft als Streptokokken(Shimwell 42) bezeichnet.

In der vorliegenden Arbeit werden einige aus Bier,

Brauereihefe, Brauereibetriebswasser, leeren Bierflaschen,

Bierwürze und lindem Wein isolierte Kokkenstämme nach

morphologischen und physiologischen Gesichtspunktenuntersucht und miteinander verglichen.

Ansichten über die systematische Stellungder im Zusammenhang mit der Bierbereitungauftretenden Kokken

Die Tatsache, dass im normalen Brauprozess gewonne¬

nes Bier zahlreichen Mikroorganismen gute Entwicklungs¬möglichkeiten zu bieten vermag, ist seit langem bekannt.

Bereits Pasteur (31) fand 1876 in verdorbenem Bier

milchsäurebildende Kokken, die in Form von Diplokokkenund Tetraden auftraten. Hansen (18) reihte 1879 diese

Bakterien in die Gattung Sarcina ein. Balke (2) dagegenbezeichnete sie als Pediokokken, da sie sich nicht nach

dem für die Sarzinen charakteristischen Teilungsmecha¬nismus vermehren. Da er «diesen Organismus» auch in

Anstellhefebrei fand, benannte er den «Bierschädling»als Pediococcus cerevisiae.

Die ersten eingehenderen Untersuchungen stammen

von Lindner (24, 25, 26, 27), der die aus Bier, Betriebs¬

luft, Brauereibetriebswasser, Malzstaub, nassen Trebern,

Maische und fadenziehendem Weissbier isolierten ver¬

schiedenen Kokken unter der Gattung Pediococcus zusam-

menfasste. Seine Stämme unterschieden sich teilweise

deutlich in Bezug auf Farbe der Kolonien (weiss, gelb,

rot), Temperaturoptima, Schleimbildung (Stamm aus

fadenziehendem Weissbier) und Milchsäurebildung. Dar¬

aus geht bereits hervor, dass die im Bier sich entwickeln¬

den Bakterien, systematisch gesehen, eine verschiedene

Stellung einnehmen können.

Untersuchungen über Pediokokken wurden weiter

durchgeführt von Schönefeld (37, 38, 39), Reichard (34,35, 36), Brown und Morris (6) sowie Sollied (45).

Claussen (8, 9, 10) arbeitete mit einer neuen Isolie¬

rungsmethode, indem er von Kokken infizierte Bier- und

Hefeproben zur Unterdrückung der Begleitflora mit IV2-

prozentiger Ammoniumbifluoridlösung vor dem Einimpfenin Würzegelatine behandelte. Nach seiner Ansicht wer¬

den die echten «Bierkokken» durch diese Prozedur nicht

geschädigt, während alle anderen Organismen abgetötetwerden. Auf diese Weise erhielt er 2 Arten, die er Pedio¬

coccus damnosus (bildet in Bier nur Bodensatz) und Pedio¬

coccus perniciosus (trübt das Bier) nannte.

1907 isolierte Wibrial (49) aus Pferdeharn und Luft

von Pferdeställen Kokken, die er in Bier zur Entwicklungbrachte. Umgekehrt gelang es ihm, aus Bier stammende

Kokken in sterilem Pferdeharn zu züchten.

Henneberg (20) fand Pediokokken in Kartoffelmaische,

Sauerkraut, Melasse und Gemüsegärungen. Er stellte bei

seinen Stämmen Unterschiede in Bezug auf Milchsäure-,

Kohlensäure- und Schleimbildung fest.

Mees (28) veröffentlichte 1934 eine ausführliche Arbeit

über Pediokokken. Er beschrieb 8 nach der Methode von

Claussen (8, 9, 10) selbst isolierte Stämme nebst 2 Tetra-

coccus-Stämmen von Orla Jensen. Die Gattung Pedio¬

coccus charakterisiert Mees (28) als unbewegliche, gram¬

positive, nichtsporenbildende, katalasenegative Kokken,

die in sauren Medien zur Tetradenbildung neigen und in

neutralen Nährlösungen als Diplokokken erscheinen. Sie

entwickeln sich anaerob in kohlehydrathaltigen Lösungen,wobei verschiedene Zucker restlos in optisch inaktive

Milchsäure umgesetzt werden. Als Gattungstyp stellte er

die Art Pediococcus damnosus Claussen auf, die Glukose,

Fructose, Maltose und Galactose gut vergärt. Schlecht

oder gar nicht vergoren werden Lactose, Saccharose,

Xylose und Arabinose. Mees (28) betrachtete als Varie¬

täten Pediococcus damnosus var. perniciosus und Pedio¬

coccus damnosus var. salicinaceus (vergärt Salicin). Die

beiden Tetracoecus-Stämme von Orla Jensen ordnete er

als Pediococcus pentoaceus (vergärt Pentosen und Lac¬

tose) und Pediococcus halophilus und die aus Pferdeharn

stammenden Kokken als Pediococcus urinae equi in die

Gattung ein. Es gelang ihm aber nie, die letzteren in Bier

zu züchten. Ferner unterschieden sie sich von den übrigenArten in der Bildung von rechtsdrehender Milchsäure.

Die Gattung Pediococcus stellte Mees (28) in die Unter¬

gruppe der homojermentativen Milchsäurebakterien inner-

halb der Gruppe der echten Milchsäurebakterien nach

Orla Jensen (22).In Bergeys Systematik (3), S. 249, ist die Gattung Pedio-

coccus als Anhang unter der Familie der Micrococcaceae

aufgeführt. Es wird hierzu bemerkt, dass die Pediokokken

zwischen den Gattungen Micrococcus, Streptococcus und

Sarcina stehen. Als Gattungstyp gilt Pediococcus Balke.

Neben dieser Art werden 13 weitere Arten genannt.In einer Reihe von Arbeiten befasste sich Shimwell (40,

41, 42, 43, 44) mit den «Brauereibakterien». Ausser den

von ihm frisch isolierten Stämmen untersuchte er auch

einige von Claussen. Shimwell (42) betrachtet kokken- so¬

wie stäbchenförmige Bakterien, die für die Brauerei von

Bedeutung sind, als grampositiv, katalasenegativ, unbe¬

weglich und nicht sporenbildend. Kohlehydrate werden

unter Bildung von Milchsäure als Hauptstoffwechselpro¬dukt vergoren. Er reiht sie daher in die Familie der

Lactobacteriaceae ein, wobei die stäbchenförmigen Bak¬

terien der Gattung Lactobacillus und die «Bierkokken»

der Gattung Streptococcus zugeordnet werden. Zu der

von Mees (28) gegebenen Charakteristik über die GattungPediococcus bemerkt Shimwell (42), dass die aufgeführtenMerkmale alle typisch für die Gattung Streptococcus sind.

Die Bildung von inaktiver Milchsäure und das Auftreten

von Tetraden unter gewissen Bedingungen sind nach ihm

nicht hinreichend genug, um das Aufstellen einer eigenenGattung (Pediococcus) zu rechtfertigen. Es wird ferner

festgestellt, dass die Tetradenbildung nur eine scheinbare

ist und dadurch zustande kommt, dass Ketten aus 4 oder

5 Zellen zusammenklappen und nebst Tetraden und

Diplokokken auch kürzere und längere Ketten oft zu

beobachten sind. Die Streptokokken sollen mehr eine phy¬siologische als eine morphologische Gruppe darstellen.

In Bezug auf Milchsäurebildung stellt Shimwell (42) die

«Bierkokken» zu den homofcrmentativen Streptokokken,da als Hauptstoffwechselprodukt des KohlehydratabbausMilchsäure, neben kleinen Mengen flüchtigen Säuren, CO2

und Diacetyl, auftritt. Da es sich um inaktive Milchsäure

handelt, stehen die «Bierkokken» zwischen den übrigenStreptokokken, die rechtsdrehende, und den heterofer-mentativen Leuconostocarten, die linksdrehende Milch¬

säure bilden. Als Typ der Gattung gilt Streptococcusdamnosus Shimwell (Claussen). Vergoren werden Glu¬

kose, Fructose. Maltose und Saccharose, nicht aber Ara-

binose, Xylose, Lactose und Salicin. Shimwell (42) teilt

die «Bierkokken» nach deren Temperaturoptima in zwei

Gruppen ein. Die Vertreter der ersten Gruppe mit einer

Optimaltemperatur von 40-45° C wachsen nur in Würze,nicht aber in Bier, während die übrigen mit einem Tem¬

peraturoptimum von 40-45° C sich sowohl in Würze wie

auch in gehopftem Bier entwickeln. Die aus Pferdeharn

stammenden Kokken sowie die von Mees (28) beschrie¬

benen Stämme Pediococcus halophilus und Pediococcus

pentoaceus gehören nach Shimwell (42) als Organismen«tierischen Ursprungs» nicht zu den Brauereibakterien.

In einer 1954 veröffentlichten Arbeit beschrieb Peder-

son (32) 121 aus Gemüsegärungen (Sauerkraut, Bohnen

und Salzgurken) frisch isolierte Kokkenstämme, die er

wie folgt charakterisierte: grampositiv, unbeweglich, nicht

sporenbildend, Gelatine nicht verflüssigend und Nitrat

nicht reduzierend. Die Katalasereaktion war teils nega¬

tiv, teils schwach positiv. Die Temperaturoptima lagenzwischen 22° C und 32° C. Alle Stämme vergoren Glu¬

kose, Fructose, Mannose, Galactose, Raffinose, Salicin und

Amygdalin, während nur wenige Stämme Xylose und

Arabinose abbauten. Dagegen wurden Mannit, «-Methyl-

glucosid, Inulin, Dextrin und Stärke nicht angegriffen.Sämtliche Stämme bildeten bei 7° C und 45° C inaktive

Milchsäure, kleine Mengen flüchtige Säuren und Kohlen¬

dioxyd. Mit diesen Organismen verglich Pederson (32) 8

Pediocotcus-Stämme («Bierkokken») aus der Sammlungdes Laboratoriums für Mikrobiologie, Techn. Hochschule

Delft (Holland), von denen sich 5 mit seinen Stämmen

als völlig identisch erwiesen. Ein Stamm von Pediococcus

urinae equi zeigte keine der charakteristischen Eigen¬schaften, so dass er nach Pederson (32) nicht in die

gleiche Gattung eingeschlossen werden sollte.

Auf Grund der Morphologie der untersuchten Stämme,

sowie der Säurebildung, die stärker ist als bei den Strepto¬kokken, und der Bildung von inaktiver Milchsäure

schlägt Pederson (32) in Gegensatz zu Shimwell (42) vor,

diese Organismen als eigene Gattung (Pediococcus) inner¬

halb der Familie der Lactobacteriaceae neben die Gat¬

tungen Streptococcus, Diplococcus und Leuconostoc ein¬

zuordnen. Als Gattungstyp gilt Pediococcus cerevisiae

Balke. Die Unterteilung in verschiedene Arten hält

Pederson der geringen Unterschiede wegen nicht für ge¬

rechtfertigt. Nur bei Schleimbildnern sollten die Namen

Pediococcus viscosus Lindner und bei Stämmen mit höhe¬

ren Optimaltemperaturen (40° C) die Artnamen Pedio¬

coccus aeidi lactici Lindner oder Pediococcus hennebergiSollied gelten.

Die Katalasebildung der Pediokokken (Stämme von

Pederson und der Technischen Hochschule Delft) unter¬

suchten Felton, Evans und Niven (13). Sie stellten fest,dass auf «ATP-Agar» (Hefeextrakt, Trypton, Citrat,Tween 80, Mineralsalze und 1 Prozent Glukose) keine

Katalase gebildet wurde, während auf «YGT-Agar» (wie«ATP», jedoch ohne Citrat, ohne Tween 80 und mit nur

0,05 Prozent Glukose) sämtliche Stämme schwach positivwaren. Ein typischer katalasenegativer Organismus(Streptococcus faecalis) verhielt sich auf beiden Nähr¬

medien eindeutig negativ. Diese Autoren sind der Auf¬

fassung, dass die Gattung Pediococcus, da sich ihre Ver¬

treter als katalasepositiv erwiesen haben, nicht, wie es

Pederson (32) vorschlägt, in die Familie der Lactobac¬

teriaceae einzuordnen ist, sondern gemäss Bergey (3) in

die Familie der Micrococcaceae.

Zu den gleichen Resultaten wie Felton und Mitarbeiter

(13) kamen Jensen und Seeley (21) bei ihren Unter¬

suchungen über die Katalasebildung der Pediokokken.

Ferner entdeckten sie bei diesen Kokken ein Cytochrom-system, das bei den von ihnen untersuchten Streptokokkenfehlte.

Strese und Windisch (48) untersuchten eine Anzahl

frisch isolierter Kokkenstämme verschiedener Herkunft

(Bier, Brauwasser, Pferdeharn und aus Luft von Bier¬

kellern, Pferdeställen, Hühnerställen und Warenhäusern).Sie fanden in verschiedenen Medien gleiche und in ein

und demselben Medium verschiedene Organismen. Die

genannten Autoren lehnen daher eine systematische Ein¬

teilung der Bakterien nach ihrer Herkunft im Sinne

Shimwells (42) und Pedersons (32) ab. Ferner wird einer

Klassierung nach morphologischen Gesichtspunkten wie

Tetraden-, Ketten- oder Paketbildung nicht zugestimmt,da diese Merkmale zu stark umweltbedingt sind. Auf

Grund ihrer Untersuchungen kommen Strese und Win¬

disch (48) zum Schluss, dass es sich bei den sogenannten«Bierkokken» systematisch gesehen um verschiedene Or¬

ganismen handelt und dass der Begriff «Bierkokken» des¬

halb nicht gerechtfertigt ist.

6

MORPHOLOGISCHES

Natürliche Kultursubstrate

a) Hefewasser wurde aus abgepresster Bierhefe von etwa 30

Prozent Trockensubstanz nach der Vorschrift von Bernhauer

(4) mit bzw. ohne Zusatz von 0,5 Prozent Zucker verwendet.

Je nach Bedarf wurde Hefewasseragar (4- 2 Prozent Agar-Agar) oder Hefewassergelatine (+ 15 Prozent Gelatine) her¬

gestellt. Die Sterilisation erfolgte durch dreimaliges Dämpfenwährend 20—30 Minuten im Abstand von 24 Stunden.

b) Ungehopfte Bierwürze mit 18 Prozent Balling wurde mit

Kieselgur versetzt (10g/Liter), während 30 Minuten gekochtund heiss abgenutscht. Die filtrierte Würze wurde sodann mit

destilliertem Wasser auf 8 Prozent Balling eingestellt. Zusatz

von 2 Prozent Agar-Agar oder 15 Prozent Gelatine ergab die

entsprechenden festen Nährböden. Die Sterilisation erfolgte wie

beim Hefewasser.

c) Gehopfte Bierwürze (11 Prozent Balling) wurde während

20 Minuten im strömenden Dampf erhitzt und während min¬

destens 2 Wochen zur Klärung stehen gelassen und anschlies¬

send unter sterilen Bedingungen in Röhrchen abgefüllt. Sie

wurde flüssig oder fest (Agar) verwendet.

d) Das kleistertrübe Bier wurde gemäss der Vorschrift von

Heller und Bettges (19) hergestellt.

Synthetische Substrate

Nährlösung 1 (rein synthetisch) pH 7.1—7.3

Zucker 5g - (NH4)2S04 2g - K2HP04 2 g—

MgS04.7H20 0,30g und Dest. H,0 ad 1000ml

Salze und Zucker wurden separat gelöst und durch dreimali¬

ges Dämpfen sterilisiert. Vor dem Gebrauch wurden die Lösun¬

gen in einem trocken-sterilisierten Gefäss vereinigt und einmal

im strömenden Dampf während 30 Minuten erhitzt.

Nährlösung 2 (halbsynthetisch) pH 6,8 mit NaOH

Zucker 5 g — K2HP04 2 g — MgS04. 7H20 0.30 g

Caseinhydrolysat 10 ml — Hefewasser nach Bern¬

hauer 20 ml und Dest. Wasser ad 1000 ml

Caseinhydrolysat und Hefewasser wurden zur Salzlösung hin¬

zugegeben und anschliessend neutralisiert. Zucker- und Salz¬

lösung wurden, wie bei Nährlösung 1, getrennt sterilisiert.

Nährlösung 3 (halbsynthetisch) ph 6.8 mit NaOH

Zucker 5 g — (NH4)2S04 2 g — K2HP04 2g —

MgS04 . 7H20 0,30 g — Caseinhydrolysat 10 ml —

Hefewasser nach Bernhauer 20 ml und Dest.

Wasser ad 1000 ml

Im übrigen wurde gleich vorgegangen wie bei Nährlösung 2.

Caseinhydrolysat wurde gewonnen aus vitaminfreiem Casein

durch Erhitzen mit Salzsäure nach der von Williams und Mit¬

arbeitern (52) S. 83 beschriebenen Methode.

Die zur Herstellung der Nährlösungen verwendeten anorga¬

nischen Salze waren analysereine Produkte der Firma Siegfried,Zofingen. Das vitaminfreie Casein und die Zucker, soweit nicht

speziell vermerkt, wurden von der Firma Hoffmann-La Roche,

Basel, bezogen.

1. Herkunft und Isolierung der untersuchten Stämme

Die in dieser Arbeit beschriebenen Organismen wurden

im Verlaufe eines Jahres an der Versuchsstation Schweiz.

Brauereien in Zürich aus zur Untersuchung eingesandtenProben verschiedenster Herkunft isoliert. Das Vorgehenfür die Gewinnung der 67 Reinkulturen wurde im einzel¬

nen in einer früheren Arbeit beschrieben (Clausen 7).die erhaltenen Kulturen wurden aus Bier (Gärkellerbier,

Lagerkellerbier und verdorbenes Flaschenbier), Betriebs¬

hefe, Brauereibetriebswasser, Anstellwürze, leeren Bier¬

flaschen (nach dem Passieren der Reinigungsmaschine)und aus lindem Wein (Jeninser 1951) isoliert, wobei für

die Reinzüchtung von einer Kolonie aus Verdünnungs¬reihen ausgegangen wurde (zehnmaliges Aufschlämmen

in sterilem Wasser und Aussäen in Hefewasseragar). Die

Stämme wurden mittels der Gefriertrocknungsmethode

konserviert (Gefriertrocknungsanlage des Instituts für

landw. Bakteriologie und Gärungsbiologie, EidgenössischeTechnische Hochschule, Zürich, Eigenkonstruktion des

Instituts).Zu den Untersuchungen kamen aus jedem Material

einige typische Stämme (total 16) und zwar aus Bier 3 -

Anstellhefe 1 - leeren Bierflaschen 4 - Brauereibetriebs¬

wasser 4 - Anstellwürze 2 und lindem Wein 2.

Eine erste Orientierung über Herkunft und Eigenschaf¬ten enthält Tabelle 1, wobei die aufgeführten Stämme

nach ihrer Zellmorphologie in drei Gruppen eingeteiltwerden.

Aus den Trockenkulturen wurde das Zellmaterial in

Hefewasser eingeimpft, nach 2 Tagen auf Hefewasser-

schrägagar aufgestrichen und während 48 Stunden bei

26° C bebrütet. Die Kulturen wurden sodann bei 8° C

aufbewahrt und alle drei Wochen auf frischen Nähr¬

boden geimpft.

2. Wachstum und Kolonienformen auf verschiedenen

KulturSubstraten

Das zu diesen Versuchen verwendete Impfmaterialwurde von 24 Stunden alten bei 26° C gewachsenen Hefe-

wasserschrägagarkulturen gewonnen. Die Bebrütungstem-peratur für Agarnährmedien und flüssige Kultursubstrate

betrug 26° C, für Gelatinenährböden 20° C. Die Ergeb¬nisse dieser Versuche sind in Tabelle 1 zusammengefasst,sofern die geprüften Organismen auf demselben Medium

unterschiedliches Verhalten zeigten.

a) Agar- und Gelatineplatten: Das Impfmaterial wurde

in sterilem Wasser aufgeschlämmt und aus einer Ver¬

dünnungsreihe in folgende Substrate geimpft: Hefewas¬

seragar, Hefewasseragar mit 0,5 Prozent Glukose, unge-

hopfter Bierwürzeagar, gehopfter Bierwürzeagar, Hefe¬

wassergelatine und ungehopfte Bierwürzegelatine.

Nach 4 bis 5 Tagen waren auf der Oberfläche der

Agarplatten gelbe, weisse, rote oder violette, runde, ganz-

randige Kolonien von 1-3 mm Durchmesser und im Agarlinsenförmige Kolonien von 0,5-1 mm Durchmesser sicht¬

bar. Auf Gelatineplatten zeigte sich nach 8-10 Tagen das

gleiche Bild, jedoch blieben die Kolonien im allgemeinenauf Gelatine etwas kleiner als auf den Agarsubstraten.Die Unterschiede auf den verschiedenen Nährböden

waren allgemein aber gering.

b) Schrägagarstriche: Zu diesen Untersuchungen wur¬

den folgende Nährböden herangezogen: Hefewasseragar,Hefewasseragar mit 0,5 Prozent Glukose, ungehopfterund gehopfter Bierwürzeagar. Nach 24 Stunden konnte

auf allen Nährböden gutes Wachstum beobachtet werden.

Wesentliche Unterschiede in Bezug auf Aussehen des

Striches auf den verschiedenen Nährsubstraten konnten

bei ein- und demselben Stamm nicht festgestellt werden,

abgesehen von Stamm Nr. 7, dessen Strichkulturen auf

Hefewasseragar meistens weiss bis hellviolett, auf Hefe¬

wasseragar mit Glukose dunkelviolett und auf den Bier-

würzeagaren dunkelviolett bis schokoladebraun gefärbtwaren. Allgemein fand auf Hefewasseragar mit Glukose¬

zusatz und auf den Bierwürzeagaren intensiveres Wachs¬

tum statt als auf dem gewöhnlichen Hefewasseragar. Dies

ist auf den Unterschied im Kohlehydratgehalt der Sub¬

strate zurückzuführen. In Tabelle 1 ist die Charakteristik

7

Tabelle 1: Herkunft und Charakterisierung des Wachstums der isolierten Stämme auf verschiedenen Nährböden

Stammnummer (St. Nr.). Herkunft (Kol. 2): Betriebswasser (Wasser), leere Bierflaschen (Flaschen), linder Wein (Wein), Anstell¬

würze (Würze).Zur Beurteilung des Hefewasserschrägagars (Hefews.agar) nach 24 Stunden sind folgende Gesichtspunkte herangezogen worden:

Farbe (Kol. 3) weiss (w.), violett (v.), blassgelb (bl.gb.), hellgelb (h.gb.), zitronengelb (zitr.gb.), grau (gr.). Bei der Randbeurteilung(Kol. 4) wird unterschieden zwischen ganzrandigem (0), fein gefälteltem ('), gefälteltem (") und gelapptem ('") Rand. Beim Wachs¬

tum (Kol. 5) ist angegeben, ob dasselbe nicht spreitend (0), schwach spreitend (') oder spreitend (") war. Zur Beurteilung der

Oberfläche (Kol. 6) wurden die folgenden Begriffe gewählt: glatt (gl.), schuppig (seh.), rauh (rh.), glänzend (gz.), matt (mt).Das Gelatinestichwachstum (Gel.st.) nach 12 Tagen (Kol. 7 und 8) wurde hinsichtlich Vertiefung (Vtiefg.) und Verflüssigung(Verfl.) beurteilt. Es wurden napfförmige (napf.), trichterförmige (tricht.), kraterförmige (krat.) und sackförmige (sack.) Ver¬

tiefungen unterschieden. Bei der Verflüssigung wird angegeben, ob keine (—) oder eine Verflüssigung ( + ) eintritt. Bei Stamm

Nr. 38 und 60 ( + *) trat eine Verflüssigung erst nach 10 Tagen ein.

Das Wachstum in Hefewasser (Hefews.) nach 48 Stunden (Kol. 9) wurde hinsichtlich der Trübung (Tr.) und des Sediments (Sed.)untersucht, wobei eine schwache Trübung oder wenig Sediment (wg.), wie auch starke Trübung oder Sedimentbildung (st.) neben

der Flockenbildung (fl.) besonders gekennzeichnet worden sind. In gleicher Weise wurde auch das Wachstum in ungehopfter Bier¬

würze (ung. Bierw.) nach 48 Stunden (Kol. 10) beurteilt.

Die Wachstumsintensität in gehopfter Bierwürze und in Bettges-Heller-Lösung (Betg.H.Lösung) wurde nach 8 Tagen (Kol. 11 und

12), diejenige in Bier (Kol. 13) nach 10 Tagen festgestellt. Bei den ersten beiden Lösungen wurde zwischen keinem Wachstum

(—), geringem ("), massigem (**) und sehr gutem (***) Wachstum unterschieden. Beim Bier unterblieb die Differenzierung der

Wachstumsintensität. Zum Schluss sind die Ergebnisse der Gramfärbung (Kol. 14) und der Bestimmung der morphologischenGruppe (morfl. Grp.) (Kol. 15) angegeben.

St. Nr. Herkunft Hefews. agar n. 24 Std. Gel. St. ii. 12 Tg. Hefews. n. 2 Tg. ung. Bierw. n. 2 Tg. Bierw. Betg. H.¬ Bier Gram- morll-

Farbe Rand Wach;

tum

î- Ober-

fl

Vtiefg. Verfl. geh. n.

S Tg.

Lösungn. 8 Tg.

nach

10 Tg.

fär-

bung

Grp

1 2 % 4 r, 6 7 S 9 10 11 12 n 14 I )

1 Wasser zitr.gb. 0 0 gl- gz- napf. st. Tr. wg. Sed. st. Tr. wg. Sed. *** *** + + 1

7 Bier w. bis v." '

gl- gz- tricht. — fl. Tr. fl.Tr. *** *** + + 1

9 Flaschen zitr.gb. 0 0 gl- gz- tricht. — fl.Tr. fl.Tr. *** *** + 4- 1

20 Flaschen hellrot 0'

gl- gz- tricht. — wg. Tr. Sed. wg. Tr. Sed. ** *** + — 1

24 Wein zitr.gb. 0 0 gl- gz- napf. Tr. Sed. Tr. Sed. * ** + 3

27 Wein zitr.gb. 0 0 gl- gz- napf. + Tr. Sed. Tr. Sed. *— .—. + 3

30 Wasser w.'

0 gl- gz- napf. — Tr. wg. Sed. Tr. wg. Sed. * ** ***— + 1

31 Flaschen w. 0)»

gl. mt. krat. + wg. Tr. st. Sed. wg. Tr. st. Sed. * *** + + 2

33 Bier bl.gb. h.grün'" "

seh. mt. napf. + fl. Tr. Sed. fl. Tr. Sed. *** + 2

38 Flaschen zitr.gb. 0 0 gl- gz- sack + * Tr. Sed. Tr. Sed. * **— + 3

47 Bier bl.gb. 0'

gl- gz- tricht. — Tr. Sed. Tr. Sed. —

**— + 3

60 Wasser zitr.gb."

rh. mt. napf. + * blank Sed. blank Sed. ** #* + + 2

61 Wasser zitr.gb." "

rh. mt. napf. + blank Sed. blank Sed. + 2

62 Würze h.gb.' "

gl- gz- napf. — wg. Tr. Sed. wg. Tr. Sed. **— + 2

63 Würze w.' "

gl- gz- tricht. — st. Tr. wg. Sed. st. Tr. wg. Sed. ** ***— + 1

65 Bierhefe w. bis gr. 0 gl- gz- tricht. — wg. Tr. Sed. wg. Tr. Sed. * ***— — 3

der Kultur auf Hefewasseragar der untersuchten Stämme

aufgeführt.

c) Gelatinestiche: Stichkulturen wurden in Hefewasser¬

gelatine angelegt und während 12 Tagen beobachtet. Alle

Stämme entwickelten sich gut an der Oberfläche, während

tiefer im Stich kein Wachstum zu beobachten war. Die

Stämme Nr. 27, 31, 33 und 61 verflüssigten Gelatine

innert 3 bis 5 Tagen, während bei den Stämmen Nr. 38

und 60 Verflüssigung erst nach 10 Tagen eintrat. Die Be¬

schreibung der Gelatinestichkulturen enthält Tabelle 1.

d) Flüssige Nährmedien: Hefewasser (mit und ohne

Glukosezusatz), ungehopfte und gehopfte Bierwürze und

kleistertrübes Bier nach Bettges und Heller (19) wurde be¬

impft. Alle Stämme entwickelten sich in Hefewasser (mitund ohne Glukose) und in ungehopfter Bierwürze gut.Nach 24 Stunden konnte Trübung und Sedimentbildungbeobachtet werden. Auffallend war die starke Flocken¬

bildung der Stämme Nr. 7 und 9 (vgl. Abbildung 11).Grössere Unterschiede in Bezug auf Wachstum zeigtendie Proben von gehopfter Bierwürze und kleistertrübem

Bier, die während 10 Tagen beobachtet wurden. Die in

Tabelle 1 mit *** bezeichneten Stämme zeigten schon

nach 48 Stunden gute Entwicklung in den beiden letz¬

teren Substraten. Stämme, die nach 3 bis 4 Tagen deut¬

lich zu wachsen vermochten, sind mit **, und diejenigen,die erst nach 5 Tagen Wachstum zeigten, mit * bezeichnet.

e) Prüfung auf anaerobes Wachstum: Zur Prüfung auf

anaerobes Wachstum wurden Hefewasseragar, mit und

ohne Glukose, und ungehopfter Bierwürzeagar verwen¬

det. Von jedem Nährboden wurden je 4 Schrägagarenbeimpft, davon je 2 Röhrchen anaerob (Pyrogallolösung+ gesättigte Na-Carbonatlösung) verschlossen. Alle Pro¬

ben wurden während 12 Stunden bei 0° C aufbewahrt,um das Wachstum vor der vollständigen Absorption des

Sauerstoffs in den anaerob verschlossenen Proben zu

unterdrücken. Anschliessend erfolgte Bebrütung bei 26° C.

In den mit Wattepfropfen verschlossenen Röhrchen fand

normale Entwicklung statt, während in keiner der anaerob

verschlossenen Proben auch nach 10 Tagen Wachstum zu

beobachten war.

f) Gramfärbung: Die Gramfärbung wurde an 24 Stun¬

den alten, auf Hefewasseragar bei 26° C gewachsenenKulturen ausgeführt. Mit Ausnahme der Stämme Nr. 20

und 65 reagierten alle grampositiv (vgl. Tabelle 1).

g) Wachstum in Bier: Helles Flaschenbier von 11 Pro¬

zent Balling Stammwürze wurde durch ein steriles Seitz-

filter (EK-Schicht von der Firma Filtrox, St. Gallen) fil¬

triert und in trockensterilisierte Reagenzgläser abgefüllt.Von jedem Stamm wurden sodann 3 Proben beimpft und

bei 26° C bebrütet. Nach 5 bis 7 Tagen konnte bei den

Stämmen Nr. 1, 7, 9, 20, 31 und 60 (vgl. Tabellle 1) schwa¬

che Trübung und Sedimentbildung festgestellt werden.

S

Typisches Aussehen von Kokken unterschiedlichen Alters (vergl. S. 7) in verschiedenen NährSubstraten (Hefewasser-

agar Abb. 1—8; Bier Abb. 9 und 10; Hefewasser Abb. 11 und 12)

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Abb. 1 Stämme 30 und 63 in 48stündigerKultur (Vergr. 1600 x)

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Abb. 2 Stämme 1—9 und 20 in

48stundiger Kultur (Vergr. 1600 x)

Abb. 3 Stamm 7 in 48stundiger Kultur

(Vergr. 1600 x)

Abb. 4 Stämme 31—33, 60 und 61 in

48stündiger Kultur (Vergr. 1600 x)

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Abb. 5 Stamm 62 in 48stündiger Kultur

(Vergr. 1600 x)Abb. 6 Stämme 24 und 27 in 48stündiger

Kultur (Vergr. 1600 x)

Abb 7 Stämme 38—47 und 65 in

48stundiger Kultur (Vergr. 1600 x)

Abb 8 Stämme 24—27, 38—47 und 65

in achttägiger Kultur (Vergr. 1600 x)

e-""* ~mjpe*r!t

Abb. 9 Stamm 1 m zehntägiger Kultur

(Vergr 1600 x)Abb 10 Stamm 31 in zehntägiger Kultur

(Vergr 1600 x)

Abb. 11 Stämme 7 und 9 in

48stündiger Kultur (Vergr. 1200 x)Abb. 12 Stamm 60 in 48stündiger Kultur

(Vergr. 1600 x)

10

Tabelle 2: Trübungszunahme vom beimpftem Bier

In 3 voneinander unabhängig durchgeführten Versuchen wurdedie Trübungszunahme am n-ten Tag gemessen. Die folgendenWerte geben die Trübung am n-ten Tag minus die Trübungunmittelbar nach dem Impfen.

Trübungszunahme am n-ten TagStamm

Null-Probe

unbeimpfta

b

c

9

0

0

0

4

0

0

0

7

0

0

0,5

10

0,50

0

14

0,5

0,50

19

0,51

0,5

22

1

0,51

25

1

1

0,5

Stamm

Nr. 1

a

b

c

0,50

0,5

0,51

1

1

1

1

2

1,5

2,5

3,5

2,53.5

4,54,55

4,54,5

6,5

6

6

9,5

StammNr. 7

a

b

c

1,5

1,5

1,5

1,51

1

2

1

2

2

3

4,5

5

4

6,5

7

6

9

7,57

11

10,511

17

Stamm

Nr. 9

a

b

c

1,51

2

1,51

2,5

1

1

2

3,52

4,5

5,5

3,56

8

5

8,5

8,55

8

11,5

5,513

Stamm

Nr. 20

a

b

c

3,52

2,5

4

2,53,5

3,53

3,5

6

6

4,5

7,5

7,55,5

10

11,57

11

12

7,5

15

17

9

Stamm

Nr. 31

a

b

c

2

1

1,5

5

2

3,5

4

2

3

6,5i,5

5,5

10

6,5

8,5

15

8,5

12,5

14,59,5

12,5

20

12

18,5

Stamm

Nr. 60

a

b

c

1,52

1,5

2

2

1,5

2

2,53

3

5

3,5

5

6,55,5

8

9,57

6

9,5

6,5

7

11,5

8,5

Das Wachstum blieb jedoch spärlich. Die übrigen Stämme

zeigten nach 20 Tagen und in weiteren Versuchen keine

Entwicklung in Bier. Ein genaueres Bild über das Wachs¬

tum in Bier wurde durch Trübungsmessungen erhalten.

Die Ermittlung des Wachstums erfolgte durch Trübungs¬messung im Kulturgefäss selbst, was bei Verwendung der

geeigneten Fläschchen (viereckig, 40x40x180 mm, Pa-

tentverschluss etwa 100 ml Inhalt, durch die Firma Fil-

trox, St. Gallen, bezogen) mit dem «Ultraphotometer»UDKD von der Firma Sigrist, Ennetbürgen, möglich ist.

Für die Bestimmung des- Wachstums ist die Trübungszu¬nahme, ein relativer Wert, massgebend. Deshalb werden

die durch das Glas verursachten Fehler bei der Trübungs¬messung dadurch eliminiert, dass die Fläschchen immer

in gleicher Weise in den Messapparat hineingestellt wer¬

den.

Die trocken-sterilisierten Fläschchen wurden am Be¬

triebsfilter (Kieselgurfilter von der Firma Filtrox, Sankt

Gallen) abgefüllt, sodann beimpft und bei 26° C bebrütet

und jeden Tag zweimal gründlich durchgeschüttelt.Tabelle 2 zeigt die Zunahme der Trübung in bestimm¬

ten Zeitabständen (Prozent Trübung gemessen am n-ten

Tag minus Prozent Trübung unmittelbar nach dem Imp¬fen). Die durch das Impfmaterial selbst hervorgerufeneTrübung betrug im Durchschnitt 3 Prozent. Zu diesem

Versuch wurden nur diejenigen Stämme herangezogen,die sich in den vorhergehenden Versuchen in Bier ent¬

wickelten.

3. Zellmorphologie

Die Abbildungen 1 bis 7 sind Aufnahmen von 48 Stun¬

den alten auf Hefewasseragar bei 26° C gewachsenenKulturen verschiedener Stämme. Deutliche Unterschiede

in Bezug auf Grösse der Zellen und Bildung von Zellver¬

bänden sind leicht zu erkennen. Anhand dieser Merk¬

male wurden die untersuchten Kokkenstämme in drei

«morphologische Gruppen» eingeteilt (vgl. Tabelle 1,

letzte Kolonne).

Die erste Gruppe, Abbildungen 1 bis 3, umfasst die

Stämme Nr. 1, 7, 9, 20, 30 und 63, die als kleine Kokken

in Form von Mono- und Diplokokken, sowie Tetraden

oder unregelmässigen Zellagglomeraten in Erscheinungtreten. In Abbildung 1 sind nur Mono- und Diplokokkenzu erkennen, was für die Stämme Nr. 30 und 63 typischist. Tetraden oder kurze Ketten sind bei diesen Organis¬men nur äusserst selten zu finden. Die Stämme Nr. 1, 9

und 20 (Abbildung 2) bilden nebst Mono- und Diplo¬kokken häufiger Tetraden und unregelmässige Zellver¬

bände, während seltener auch kurze Ketten anzutreffen

sind. Abbildung 3 gibt die typische Erscheinungsformvon Stamm Nr. 7 wieder. Neben unregelmässigen Zell-

agglomerierungen treten Tetraden häufig auf, seltener

aber Mono- und Diplokokken.Die Abbildungen 4 und 5 sind typisch für die zweite

Gruppe, die man morphologisch als Sarzinen bezeichnen

kann, da sie regelmässige Pakete von 8 symmetrisch an¬

geordneten Zellen bilden. Abbildung 4 entspricht den

Stämmen Nr. 31, 33, 60 und 61, deren Zellen bedeutend

grösser sind als die von Stamm Nr. 62 in Abbildung 5.

In die dritte Gruppe wurden die Stämme Nr. 24, 27,

38, 47 und 65 eingereiht. Sie bilden meist Diplokokkenund vereinzelt auch Tetraden, wobei die Zellen aber be¬

deutend grösser sind als bei den Vertretern der Gruppe 1,wie aus den Abbildungen 6 und 7 deutlich ersichtlich ist.

Diese Gruppe stellt mehr oder weniger einen Uebergangzwischen den beiden ersten Gruppen dar, da in 6 bis 8

Tage alten Kulturen die Bildung von symmetrischen 8er-

Paketen zu erkennen ist, wie Abbildung 8 deutlich zeigt.Solche Veränderungen sind bei den Vertretern der

Gruppe 1 und 2 nicht festzustellen, wenigstens nicht inner¬

halb der ersten 8 bis 10 Tage nach der Impfung.Die Abhängigkeit der Zellmorphologie vom Alter der

Kultur und vom Substrat ist in der Bakteriologie allge¬mein bekannt. Abbildung 9 zeigt Stamm Nr. 1 nach zehn¬

tägigem Wachstum in Bier. Im Vergleich mit Abbildung2 fällt der Grössenunterschied der Zellen sofort auf.

Demgegenüber verändert sich Stamm Nr. 31 in Bier

kaum merklich, wie aus einem Vergleich der Abbildun¬

gen 10 (Bier 10 Tage alt) und 4 hervorgeht.Auffallend ist bei den Stämmen Nr. 7 und 9 die Bil¬

dung von grossen Zellagglomeraten (Abbildung 11) in

Hefewasser, die bis zur flockigen Trübung führt (Tabelle!)•Abbildung 12 zeigt Zellen von Stamm Nr. 60, gewach¬

sen in Hefewasser nach 48stündigem Bebrüten. Beim Ver¬

gleich mit Abbildung 4 sind keine wesentlichen Unter¬

schiede zu erkennen.

4. Diskussion

Die Untersuchung von 16 aus Bier, Anstellhefe, leeren

Bierflaschen, Brauereibetriebswasser, Anstellwürze und

lindem Wein isolierten Kokkenstämmen hat ergeben, dass

die im Zusammenhang mit der Bierbereitung auftreten¬

den Kokken in Bezug auf Wachstum und Aussehen der

Kulturen auf verschiedenen Nährböden sowie in ihrer

Zellmorphologie unter vergleichbaren Bedingungen teil¬

weise grosse Unterschiede aufweisen (vgl. Tabelle 1 und

Abbildungen 1 bis 12). Es hat sich gezeigt, dass kein Zu¬

sammenhang besteht zwischen morphologischen Merk¬

malen und der Fähigkeit, sich in Bier zu entwickeln, das

heisst als «Bierschädling» aufzutreten. Von den 16 unter¬

suchten Stämmen konnten 6 in Bier zur Entwicklung ge¬bracht werden, die sich aber in Bezug auf morphologische

11

Merkmale keineswegs als identisch erwiesen. So müssen

die beiden Stämme Nr. 31 und 60 anhand ihrer Zellmor¬

phologie als Sarzinen bezeichnet werden (Abbildungen 4,

10 und 12), wogegen die übrigen 4 Stämme Nr. 1, 7, 9

und 20, die sich in Bier vermehren können, nach ihrer

mikroskopischen Erscheinungsform (Abbildungen 1, 2, 3

und 9) als Streptokokken im Sinne Shimwells (42) aufge-fasst werden können. Ferner verflüssigen die beiden erst¬

genannten Stämme Gelatine, was an den 4 anderen Or¬

ganismen nie beobachtet wurde. Bemerkenswert ist weiter,dass alle Stämme, die in Bier zu wachsen vermögen, in

gehopfter Bierwürze massiges bis gutes Wachstum zeig¬ten, mit Ausnahme von Stamm Nr. 31, der im genanntenSubstrat sich kaum zu entwickeln vermochte, jedoch bei

der Wachstumsbestimmung in Bier die höchsten Trü¬

bungswerte aufwies (vgl. Tabelle 2). Dies zeigt auch deut¬

lich, dass diese Organismen nicht nur morphologische,sondern auch physiologische Unterschiede aufweisen.

Anderseits wurde festgestellt, dass morphologisch völ¬

lig identische Stämme sich gegenüber Bier und anderen

Substraten verschieden verhalten. So sind die beiden

Stämme Nr. 60 und 61 übereinstimmend in der Zell¬

morphologie sowie im Aussehen der Kulturen auf den

geprüften festen Nährböden. Ferner verflüssigen beide

Organismen Gelatine, jedoch fehlt dem Stamm Nr. 61 im

Gegensatz zu Nr. 60 wie die Untersuchungsergebnissedeutlich zeigen, die Fähigkeit, sich in gehopfter Bier¬

würze, in kleistertrübem Bier sowie in normalem Bier

zu entwickeln.

Die Stämme Nr. 30 und 63, bei denen in Bier jeglichesWachstum ausblieb, zeigen in morphologischer Hinsicht

grosse Aehnlichkeit mit den Stämmen Nr. 1, 7, 9 sowie

20, die Bier zu trüben und zu verändern vermögen. Fer¬

ner bieten gehopfte Bierwürze und kleistertrübes Bier

allen 6 Stämmen gute Entwicklungsmöglichkeiten.

1. Bestimmung und Identifizierung wasserdampfflüchtigerSäuren in Bier und synthetischen NährlösungenZur Ermittlung und Identifizierung der wasserdampfflüchti-

gen Säuren wurde die von Aebi (1) zur Aufarbeitung von

Clostridien-Gärsubstraten angewandte Methodik übernommen,wonach vorerst 20 ml mit Schwefelsäure gegen Kongorot ange¬säuertes Substrat in einer von Wiken und Mitarbeitern (50)modifizierten MARKHAM-Apparatur destilliert werden. Vor-

schriftsgemäss wurden 300 ml Destillat aufgefangen und davon

10 ml mit 0,025 n NaOH im Stickstoffstrom gegen Phenol¬

phthalein titriert.

Die Identifizierung der Säuren erfolgte mittels der Duclaux-

Destillation (5, siehe Aebi 1) nach vorausgegangener Zerstö¬

rung allfällig auftretender nach Friedemann (15) oxydierbarerSäuren. Bei der FRiEDEMANNschen Oxydation werden Ameisen¬

säure und Brenztraubensäure mit Quecksilberoxyd in schwefel¬

saurer Lösung oxydiert. Da durch dieses Vorgehen auch Alko¬

hole in die entsprechenden Fettsäuren übergeführt werden, wur¬

den diese vor der Oxydation durch alkalische Destillation ent¬

fernt, der Rückstand wieder auf das ursprüngliche Volumen

gebracht, angesäuert, oxydiert und die verbliebenen Fettsäuren

abdestilliert.

Die Brauchbarkeit dieser Methodik zur Untersuchung von

Bier wurde durch Hinzufügen einer bekannten Menge Essig¬säure geprüft. Aus Tabelle 3 ist ersichtlich, dass rund 95 Pro¬

zent der hinzugegebenen Essigsäure durch die Wasserdampf¬destillation zurückbestimmt wurden. Die Differenz zwischen denWerten der Bestimmung von nicht oxydierbarer Säure bei Bier

allein und Bier mit Zusatz von Essigsäure ist wohl darauf zu¬

rückzuführen, dass sich Titrationsfehler bei den vorliegendenniedrigen Konzentrationen stärker bemerkbar machen. Ander¬

seits ist naheliegend, dass Bier kleine Mengen Brenztrauben¬

säure, von der alkoholischen Gärung herrührend, enthält.

Keiner der Vertreter der dritten «morphologischenGruppe» (Abbildungen 6, 7 und 8), der auch die aus lin¬

dem Wein isolierten Kokkenstämme angehören, konnte

jemals in Bier zur Entwicklung gebracht werden. In ge¬

hopfter Bierwürze war das Wachstum allgemein sehr

gering oder blieb ganz aus. Gegenüber kleistertrübem

Bier verhalten sich diese Organismen verschieden.

Dass von den 16 untersuchten Organismen ausser den 6

Stämmen Nr. 1, 7, 9, 20, 31 und 60 unter gewissen Be¬

dingungen noch andere Kokkenstämme Bier zu trüben

und zu verändern vermögen, ist durchaus wahrscheinlich.

Bier stellt in keinem Falle ein definiertes Substrat für

Mikroorganismen dar, denn die Unterschiede in der Zu¬

sammensetzung verschiedener Biere beruhen auf den un¬

gleichen Fabrikationsbedingungen bei der Herstellungverschiedener Biertypen einerseits und auf der uneinheit¬

lichen Arbeitsweise verschiedener Betriebe anderseits.

Für die Entwicklung der Mikroflora ist aber die Zusam¬

mensetzung des Bieres wie Gehalt an vergärbaren Kohle¬

hydraten, Eiweissen usw., von grundlegender Bedeutung.

Ferner erwähnen Strese und Windisch (48) und andere,dass Kokken, die aus Bier isoliert werden, nach mehr¬

maligem Ueberimpfen auf Laboratoriumsnährböden die

Fähigkeit, sich in Bier zu entwickeln, völlig verlieren. So

lässt es sich auch erklären, dass die aus Bier (StämmeNr. 33 und 47) und Brauereihefe (Stamm Nr. 63) isolier¬

ten Kokken nie in Bier zur Entwicklung kamen.

Die in morphologischer Hinsicht orientierenden Ver¬

suche lassen auf die Vielgestaltigkeit der im Zusammen¬

hang mit Bier auftretenden Mikroflora schliessen. Es

scheint daher heikel oder sogar unmöglich, die «Bier¬

schädlinge» vom systematischen Gesichtspunkt aus in

eine Gruppe einordnen zu wollen.

Tabelle 3: Bestimmung von Essigsäure in Bier

Bestimmt wurden die wasserdampfflüchtigen Säuren (Wsdfl.Sr.)pro 20 ml Bier. In der zweiten und dritten Kolonne wird an¬

gegeben, wie viel Essigsäure (Esr.) in der zweiten Versuchsserie

wiedergefunden wurde, wenn 0,142 mäq in Abzug gebrachtwerden. In den beiden letzten Kolonnen wird die nach durch¬

geführter FRIEDEMANN-Oxydation wiedergefundene Säure auf¬

geführt.

Probe Wsdfl. Esr. gef. Sr. gef. n. O:&ydation

Sr. pro n. Friedemann

20 mi Bier

màq màq o/o mäq o/o

Bier a) 0,150 — — 0,134 89,3

b) 0,135 —• — 0,128 94,8

c) 0,142 — — 0,123 86,6

Mittel 0,142 — — 0,128 90,1

Bier + 0,223 a) 0,352 0,202 90,6 0,347 98,6

mäq Essig¬ b) 0,352 0,217 97,3 0,347 98,6säure c) 0,360 0,218 97,8 0,347 96,4

Mittel 0,354 0,212 95,1 0,347 97,9

Tabelle 4: Duclaux-Destillation der Wasserdampfdestillate nach

durchgeführter Oxydation nach Friedemann

Ueberdestillierte Säuremenge in °/o der vorgelegten Menge in

20 ml 40 ml 60 ml 80 ml 100 ml

Destillat

Essigsäure 12,1 24,9 38,2 55,9 78,4Bier 13,5 25,9 39,6 54,2 77,1Bier mit Zusatz

{g 4Q & yvon Essigsaure

PHYSIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN

12

Tabelle 5: Bestimmung von Milchsäure und Essigsäure in Bier

Zu 20 ml Bier wurden bestimmte Mengen Milchsäure (Msr.), respektive Essigsäure (Esr.) in mäq zugesetzt (Kol. 1 und 2). In den

folgenden Kolonnen (3 bis 5) sind die wasserdampfflüchtigen Säuren (Wsdfl. Sr.) in mäq, die Differenz zum Säuregehalt des

Bieres in mäq und die wiedergefundene Essigsäure in % aufgeführt.Die weitern Kolonnen (6 bis 8) enthalten in gleicher Weise die ätherextrahierbare Säuremenge (Aeextr. Sr.).Es folgt dann die Errechnung des Milchsäuregehaltes aus der Differenz zwischen ätherextrahierbaren und wasserdampfflüchtigenSäuren in mäq (Kol. 9) und in mg (Kol. 10), sowie die Milchsäurebestimmung im Aetherextrakt (Kol. 11) und die Differenz

gegenüber dem Gehalt in Bier (Mittel 5,40 mg) (Kol. 12 und 13). Zum Schluss wird die wiedergefundene Milchsäure in % aufge¬führt (Kol. 14).

20 ml Bier +

Msr. Esr. gef.

Wsdfl. Sr.

Diff. zu Bier Esr. gel. gef.

Aeextr. Sr.

Diff. zu Bier Sr gef. ber. Diff. aextr. u.

wsdfl. Sr.

Milchs;

Aeextr.

iure

Diff. zu Bier Msr. gef

mäq

1

mäq

2

mäq

3

mäq

4

».

3

mäq

6

mäq

7

mäq

8

mäq

9

mg

10

mg

11

mg

12

mäq

13

o/o

14

0 0 0,127

0,127

0

0

0

0

0,202

0,202

0

0

0

0

0,075

0,075

6,75

6,75

5,30

5,54—

—

—

0 0,180 0,293

0,307

0,166

0,180

92,2

100,0

0,383

0,383

0,181

0,181

100,6

100,6

0,073

0,068

6,57

6,12

5,54

5,40 —

0,100 0 — — — 0,300

0,293

0,098

0,091

98,0

91,0

0,166

0,173

14,94

15,57 14,36 8,94 0,099 99,3

0,200 0 — — — 0,405

0,390

0,203

0,188

101,5

94,0

0,2780,263

25,0223,67

23,8624,25

18,44

18,83

0,205

0,209

102,4104,6

0,100 0,180 0,310

0,315

0,173

0,188

96,1

104,4

0,495

0,472

0,293

0,270104,6

96,4

0,185

0,168

16,65

15,16

14,02

14,12

8,60

8,70

0,0950,096

95,6

96,7

Tabelle 4 enthält die bei den DucLAUX-Destillationen gefun¬denen Werte, aus denen man auf Essigsäure schliessen kann.

Die Standardwerte für Essigsäure stellen die Durchschnitts¬

zahlen von 5 Paralleldestillationen einer 0,002 n Lösung dar.

Um im Falle von Bier diese Konzentration annähernd zu er¬

reichen, wurden die Destillate von 3 Bestimmungen vereinigt,alkalisch bis auf 120 ml eingeengt, angesäuert und anschlies¬

send 100 ml abdestilliert.

2. Bestimmung der ätherextrahierbaren Säuren

Die ätherextrahierbaren Säuren wurden nach der von Fiech-

ter (14) beschriebenen Methode durch Ansäuren von 20 ml

Substrat mit 3 ml 10 n Schwefelsäure, Extraktion in einer modi¬

fizierten Apparatur nach Kutscher-Steudel während 24 Stun¬

den mit 150 ml Aether und anschliessend zweimaligem Aus¬

schütteln mit 100 ml Aether bei Zusatz von 13,5 g Ammonium¬

sulfat bestimmt. Die Extrakte wurden vereinigt, auf 300 ml ge¬bracht und 10 ml mit 0,025 n NaOH gegen Phenolphthaleintitriert.

Tabelle 5 zeigt, dass die zu Bier hinzugefügten Säuremengendurch dieses Verfahren wieder ermittelt werden konnten.

Tabelle 6 enthält die Ergebnisse eines mit der synthetischenNährlösung durchgeführten Versuches, bei der als Kohlenstoff¬

quelle abwechslungsweise Glukose oder Maltose verwendet

wurde. Die Werte der ermittelten Säuremengen lagen zwischen

96 Prozent und 108 Prozent (Mittel 102,8 Prozent).

3. Bestimmung der Milchsäure

Zur Bestimmung der Milchsäure kam die von Friedemann

und Mitarbeitern (16) beschriebene Methode zur Anwendung,wonach die Milchsäure mit Kaliumpermanganat und Mangan¬sulfat in schwefelsaurer Lösung quantitativ zu Acetaldehyd oxy¬diert und letzterer in Bisulfit-Lösung aufgefangen wird, wo die

jodometrische Ermittlung erfolgt. Die Milchsäurebestimmungenwurden meistens im Aetherextrakt, nach Entfernen des Aethers

durch alkalisches Abdestillieren (Verwenden von gesättigterNa2C03-Lösung) und Ansäuern des Rückstandes mit Schwefel¬

säure, durchgeführt. In den verwendeten synthetischen Sub¬

straten Hess sich die Milchsäure auch direkt bestimmen, jedochmusste bei der Titration ein Blindwert abgezogen werden.

Aus Tabelle 5 geht hervor, dass die angewandte Methodik

für die Milchsäurebestimmung in Bier brauchbar ist, da die-

dem Bier hinzugefügte Säuremenge wieder gefunden wurde.

Die in Tabelle 5 als Milchsäure berechnete Differenz von äther¬

extrahierbaren und wasserdampfflüchtigen Säuren liegt im Mit¬

tel um 1 mg höher als die gefundene Menge Milchsäure. Es ist

möglich, dass es sich hier um eine weitere ätherextrahierbare,nicht wasserdampfflüchtige Säure handelt.

Nach Tabelle 6 wurden im synthetischen Substrat durch¬

schnittlich 96 Prozent der zugesetzten Milchsäure wiederge¬funden.

Tabelle 7 enthält die Resultate eines Versuches, bei dem eine

bekannte Menge Milchsäure in wässriger Lösung sowie in

einem synthetischen Substrat (Nährlösung 1) ohne vorher¬

gehende Aetherextraktion direkt bestimmt wurde. In wässrigerLösung betragen die erhaltenen Werte rund 95 bis 102 Prozent

der zugesetzten Säuremenge. Auch die direkt im synthetischenSubstrat bestimmte Milchsäuremenge stimmt nach Abzug des

Blindwertes gut mit der zugesetzten Menge überein.

4. Bestimmung des Aethanols

Aethanol wurde gemäss der Methode von Stahly (46) und

Mitarbeitern (46, siehe Aebi 1) bestimmt, wobei Alkohole mit

Kaliumbichromat in phosphorsaurer Lösung zu den entspre¬chenden Fettsäuren oxydiert werden.

Tabelle 6: Bestimmung von Milchsäure in synthetischem Sub¬

strat 1

Die Analyse erfolgte in Anwesenheit von Essigsäure nach vor¬

ausgegangener Aetherextraktion Ae.extr. Sr. = ätherextrahier¬

bare Säuren: Msr. best, im Ae. extrakt = Milchsäure bestimmt

im Aetherextrakt.

Synthetisches Substrat I

Kohlenstoff- zugesetzte

quelle Säuremenge

Ae. extr. Sr.

gef.

Msr. best, im Ae. extrakt

Glukose

mäq mäq

0

0

o/o

0

0

mg

0

0

mäq

0

0

o/o

0

0

Maltose — 0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Glukose 0,140 Msr. 0,135

0,143

96,4

102,1

12,00

12,29

0,133

0,136

95,0

97,1

Maltose 0,140 Msr. 0,150

0,143

107,1

102,1

12,29

11,950,136

0,132

97,1

94,3

Glukose 0,280 Msr. 0,304

0,300

108,6

107,1

23,62

24,01

0,262

0,267

93,6

95,4

Maltose 0,280 Msr. 0,2740,274

97,9

97,9

24,2024,68

0,269

0,274

97,1

97,9

Glukose 0,390 Esr. 0,405

0,412

103,8

105,6

0

0

0

0

0

0

Maltose 0,390 Esr. 0,408

0,420

104,7

107,7

0

0

0

0

0

0

Glukose 0,140 Msr.

0,195 Esr.0,320

0,326

95,5

97,3

12,20

11,86

0,135

0,132

96,4

94,3

Maltose 0,140 Msr.

0,195 Esr.0,345

0,3.41

103,0101,8

12,24

12,27

0,1360,142

97,1

101,4

Glukose 0,280 Msr.

0,390 Esr.0,6750,705

103,8

108,5

24,11

24,34

0,268

0,270

95,7

96,4

Mittel 102,8 96,3

13

Zur Ermittlung des Alkoholgehaltes in Bier hat sich folgen¬der Arbeitsgang als zweckmässig erwiesen. Zu 10 ml Bier wur¬

den in einen 500 ml Rundkolben 3—4 Tropfen 33prozentigeNaOH und 70 ml Wasser gegeben. Hernach wurden 50 ml De¬

stillat gewonnen, von denen 20 ml zur Oxydation verwendet

wurden. Im Verlaufe der Untersuchungen hat sich aber gezeigt,dass mit Vorteil nur von 5 ml Bier ausgegangen wird. Der

Destillationskolben ist durch Verwenden einer Asbestschale vor

Ueberhitzung zu schützen.

In Tabelle 8 sind die Resultate eines Versuches aufgeführt,bei dem der Aethanolgehalt von Bier mit und ohne Zusatz von

Aethanol und einer wässrigen Aethanollösung bekannter Kon¬

zentration bestimmt wurde. Die zugesetzten Mengen Aethanol

konnten mit guter Genauigkeit wieder erhalten werden. Die bei

den DucLAUx-Destillationen gefundenen Werte stimmen mit

den Standardzahlen für Essigsäure überein.

Tabelle 7 : Direkte Bestimmung der Mihchsäure in synthetischemSubstrat 1 in Anwesenheit von Essigsäure.In der dritten Kolonne wird die verbrauchte Jodlösung nach

Abzug des Blindwertes für die Nährlösung 1, der zu 0,26 ml

bestimmt worden ist, wiedergegeben. Msr. = Milchsäure; Esr.= Essigsäure.

Probe

Dest. Wasser

Msr. in wässr. Lösg.10 mg

20 mg

30 mg

Nährlösung 1 +

Esr. mg Msr. mg

0 0

Verbrauch 0,1 n J2-Lösg. Milchsäure gef.

11

o

o

n

22

0

10

20

10

20

0,1 n

> - I ösg.

ml

0

2,13

2,19

4,55

4,34

6,70

6,65

0,30

0,28

0,23

0,23

2,62

2,55

4,65

4,50

2,18

2,24

4,80

4,68

minus

ßlindwert

ml mg

0

9,509,85

20,47

19,53

30,15

29,93

2,36

2,29

4,39

4,24

1,92

1,98

4,54

4,42

°/0

0

95,0

98,5

102,4

97,7

100,5

99,8

10,62

10,30

19,75

19,08

8,64

8,91

20,43

19,89

106,2

103,0

98,8

95,4

86,4

89,1

102,2

99,5

5. Bestimmung von Glukose in synthetischen Substraten

Für die Bestimmung der Zucker diente die Methode von

Stiles und Mitarbeitern (47), nach der das durch die reduzie¬

rende Wirkung gebildete Cuprooxyd mit Jod oxydiert, und der

Ueberschuss an Jod mit Thiosulfat zurücktitriert wird. Die

Bestimmung der Glukose erfolgte ohne Vorbehandlung des

Substrates (synthetische Nährlösungen) nach den Angaben von

Aebi (1) in einem Bereich von 0,2 bis 1,80 mg mit einer Genauig¬keit von 0,01 mg.

Die Gleichung der Eichgeraden für Glukose, deren Punkte

je 8—10 Einzelbestimmungen entsprechen, lautet:

Y = 0,1274 . x + 0.097

/. Hervorgerufene Veränderungen in Bier

(Aethanol und Säuren)

VersuchsanordnungZu diesem Versuch wurden die 6 Stämme Nr. 1, 7, 9,

20, 31 und 60, die sich in Bier entwickeln konnten, in

helles Flaschenbier (Stammwürzegehalt 11 Prozent Bal¬

ling) geimpft und während 30 Tagen bei 26° C bebrütet.

Die hierzu verwendeten Bierflaschen (Inhalt 600 ml,

grünes Glas, Patentverschluss) wurden trocken sterilisiert

(8 Stunden bei 140° G) und an einem vorgängig mit

Dampf sterilisierten Betriebsfüller abgefüllt. Das Impfenerfolgte mit 24 Stunden alten, auf gehopftem Bierwürze-

schrägagar gewachsenen Kulturen. Je Flasche wurde das

Bakterienmaterial eines Agarröhrchens verwendet, das

mit 2 bis 3 ml sterilem Wasser sorgfältig durch Schütteln

aufgeschlämmt wurde, so dass kein Agar mit ins Impf¬material gelangen konnte. Von jedem Stamm wurden 3

Flaschen beimpft, bebrütet und während der Versuchs¬

dauer jeden Tag zweimal durchgeschüttelt. Es wurden 3

unbeimpfte Flaschen als Kontrollen in die Versuchsreihe

miteinbezogen.

Versuchsergebnisse

Die Ergebnisse der chemischen Untersuchungen des be¬

impften wie unbeimpften Bieres sind in Tabelle 9 zu¬

sammengestellt. Die ersten Hinweise über allfällig her¬

vorgerufene Veränderungen in Bier geben die gemes¬

senen pH-Werte. Ein pH-Abfall ist bei allen mit den

Stämmen Nr. 1 und 7 beimpften Proben zu verzeichnen,

Tabelle 8: Bestimmung von Aethanol (AI) in Bier

Probe

Bier 10 ml

Mittelwert

Bier 10 ml Aethanol zugesetzt2,17 mäq (100 mg)

Mittelwert

Wässrige Aethanollösungenthaltend 4,34 mäq Aethanol

(200 mg)

Mittelwert

AI gef.

maq

7,35

7,777,57

7,60

7,57

9,78

9,87

9,73

9,77

9,78

4,44

4,40

4,34

4,38

4,39

Diff. zwischen Bier u. Bier

plus AI

mäq °o

2,21

2,30

2,16

2,20

2,21

101,8

106,0

98,6

101,4

101,8

102,3

101,4

100,0

100,9

100,0

Duclaux-Destillation

Ueberdestillierte Säuremenge in °/o der vorgelegten Menge in

20 ml

11,9

11,3

11,8

11,7

11,9

12,2

11,9

12,0

11,6

11,911,8

11,8

40 ml

25,0

24,7

24,7

24,8

24,1

25,1

24,0

24,4

25,325,524,6

25,1

60 ml 80 ml

Destillat

39,2 56,2

38,9 55,639,5 55,8

39,2

38,0

40,0

38,2

38,7

39,3

39,039,4

39,2

55,9

55,6

56,7

53,2

55,2

56,3

56,555,8

56,2

100 ml

77,8

77,6

76,9

77,5

76,6

79,0

76,4

78,7

78,377,777,0

77,7

Standardwerte für Essigsäure 0,01 n Lösung.Mittelwerte von 5 Paralleldestillationen 11,9 25,0 39,6 56,5 78,7

14

Tabelle 9: Versuche über die chemischen Veränderungen des Bieres, verursacht durch verschiedene Stämme

In je 3 voneinander unabhängigen Versuchen a), b) und c) wurden die wasserdampfflüchtigen Säuren (Wsdfl. Sr..) und die äther-

extrahierbaren Säuren (Aeextr. Sr.) pro 20 ml Bier (Kol. 2 bis 5) ermittelt. In Kolonne 2 werden die Gesamtsäure (Ges.sr.), in

Kolonne 3 die nicht nach Friedemann oxydierbare Säure (n. oxydb. Sr.) und in Kolonne 4 die nicht oxydierbare Säure

in % der Gesamtsäure aufgeführt. Die Differenz zwischen ätherextrahierbaren und wasserdampfflüchtigen Säuren ist als Milch¬

säure (Msr.) berechnet worden fKol. 6 und 7). Es folgt in Kolonne 8 die im Aetherextrakt bestimmte Milchsäure pro 20 ml Bier

und in Kolonne 9 die Differenz an Milchsäure zwischen beimpftem (b.) und unbeimpftem (unb.) Bier. In Kolonne 10 ist der

Aethanolgehalt (AI) pro 20 ml aufgeführt.

Probe Wsdfl.

Ges. Sr.

Sr. pro 20 ml Bier

n. oxydb. Sr.

Aeextr. Sr.

pro 20 ml Bier

Diff. zw. äextr. u.

wsdfl. Sr. pro 20 ml Bier

ber. als Msr.

Msr. pro 20 ml Bier

best, im Aeextr. Diff. zwischen

b.u. unb. Bier

AI pro

20 ml Bier

pH

1

Bier unbeimpft a)b)c)

mäq

2

0,1050,105

0,113

mäq

3

0,086

0,091

0,102

o/o

4

81,9

86,7

90,3

mäq

5

0,1720,165

0,180

mäq

6

0,067

0,0600,067

mg

7

6,03

5,40

6,03

mg

8

6,00 ) Mittel5,28 ) 5,485,16)

rag

9

+ 0,52

—0,20

—0,32

mäq

10

12,9512,76

12,29

11

4,70

4,70

4,70

Stamm Nr. 1 a)b)c)

0,113

0,113

0,135

0,102

0,1020,102

90,3

90,3

75,5

0,218

0,270

0,275

0,105

0,1570,145

9,45

14,1312,60

8,3612,86

11,88

+ 2,88+ 7,38+ 6,40

12,29

12,88

11,88

4,454.15

4,10

Stamm Nr. 7 a)b)c)

0,105

0,113

0,120

0,0910,102

0,102

86,7

90,3

85,0

0,255

0,233

0,225

0,1500,120

0,105

13,50

10,80

9,45

13,03

10,49

8,85

+ 7,55+ 5,01+ 3,10

11,40

9,89

10,20

4,35

4,45

4,40

Stamm Nr. 9 a)b)c)

0,124

0,128

0,124

0,090

6,095

0,095

72,674,2

76,5

0,1730,203

0,255

0,0490,075

0,131

4,41

6,75

11,79

4,45

6,21

11,82

—1,03+ 0,73+ 6,34

12,2513,10

12,90

4,704.70

4,45

Stamm Nr. 20 a)b)c)

0,113

0,120

0,143

0,100

0,100

0,105

88,583,3

73,4

0,225

0,1800,188

0,112

0,060

0,045

10,08

5,40

4,05

11,92

5,89

4,10

+ 6,44+ 0,41

—1,24

13,25

13,37

13,23

4,40

4,70

4,70

Stamm Nr. 31 a)b)c)

0,143

0,128

0,128

0,105

0,1000,100

73,4

78,1

78,1

0,233

0,188

0,248

0,090

0,060

0,120

8,10

5,40

10,80

7,88

4,96

9,45

+ 2,40

—,052+ 3,97

13,02

13,03

12,83

4,40

4,70

4,40

Stamm Nr. 60 a)b)c)

0,143

0,135

0,135

0,105

0,100

0,100

73,4

74,1

74,1

0,180

0,1880,180

0,037

0,053

0,045

3,33

4,77

4,05

3,55

5,22

4,59.

—1,93—0,26

—0,89

13,0513,63

13,75

4,754,75

4,80

während Stamm Nr. 31 in zwei und die Stämme Nr. 9

und 20 in je einer Probe eine Senkung des pH-Wertesgegenüber unbeimpftem Bier verursachten. Aus Tabelle

II ist der Zusammenhang zwischen der Zunahme der

ätherextrahierbaren Säuren gegenüber dem unbeimpftenBier und den pH-Werten ersichtlich. Die Zunahme der

ätherextrahierbaren Säuren ist in den meisten Fällen auf

Bildung von Milchsäure, aber anderseits unter Umstän¬

den auch auf eine Erhöhung der wasserdampfflüchtigenSäuren zurückzuführen. Alle mit Stamm Nr. 60 beimpftenProben und die Ansätze 31b und 20c zeigen keine Aen-

derung der pH-Werte, trotzdem hier Milchsäure abge¬baut und wasserdampfflüchtige Säuren gebildet wurden.

Aus Tabelle 11 kann entnommen werden, dass die

Summe der Zunahmen an Milchsäure und wasserdampf¬flüchtigen Säuren im allgemeinen der Zunahme an äther-

Tabelle 10: Duclaux-Destillation der wasserdampfflüchtigennicht oxydierbaren Säuren aus unbeimpftem und; beimpftemBier

Die Destillate der sauren Wasserdampfdestillationen von 3

Parallelproben wurden vereinigt und gesamthaft nach Duclaux

destilliert.

Probe

Essigsäure 0,002

n-LösungBier unbeimpftBier beimpft mit

Stamm Nr. 1

Stamm Nr. 7

Stamm Nr. 9

Stamm Nr. 20

Stamm Nr. 31

Stamm Nr. 60

Ueberdestillierte Säuremenge in °/o der vorgelegten

Menge in

20 ml 40 ml 60 ml 80 ml 100 m]

Destillat

12,1

12,0

13,4

13,2

12,2

13,0

12,2

12,1

24,9

26,1

26,1

26,525,1

25,124,9

25,2

38,2

40,3

39,9

38,9

39,7

38,4

38,838,5

56,0

55,9

56,1

55,655,1

55,7

56,155,9

78,4

77,1

76,7

76,8

77,2

78,1

77,8

77,9

Tabelle 11: Differenzen der Säuremengen zwischen beimpftemund unbeimpftem Bier

In der zweiten und dritten Kolonne wird die Milchsäuredifferenz

(Msrdiff.), resp. wasserdampfflüchtige Säuredifferenz (Wsdfl.Srdiff.) zwischen beimpftem und unbeimpftem Bier pro 20 ml

aufgeführt. In der 4. Kolonne ist die Summe (Milchsäure und

wasserdampfflüchtige Säure) und in der 5. Kolonne die Zu¬

nahme der ätherextrahierbaren Säuren (äextr. Sr.) im beimpf¬ten Bier aufgeführt. Alle Werte sind in mäq angegeben.

Kolonne 1

Probe

Stamm 1 a)b)c)

Mittel

Stamm 7 a)b)c)

Mittel

Stamm 9 a)b)c)

Mittel

Stamm 20 a)b)c)

Mittel

Stamm 31 a)b)c)

Mittel

Stamm 60 a)b)c)

Mittel

2

Msrdiff.

+ 0,032+ 0,082+ 0,071

+ 0,062

+ 0,084+ 0,055+ 0,034

+ 0,057

—0,011+ 0,008+ 0,070

+ 0,022

+ 0,071+ 0,004

—0,015

+ 0,020

+ 0,026

—0,006+ 0,044

+ 0,021

—0,021

—0,003

—0,010

—0,011

3

Wsdfl.

Srdiff.

+ 0,005+ 0,005+ 0,027

+ 0,012

—0,003+ 0,005+ 0,012

+ 0,005

+0,016+ 0,020+ 0,016

+ 0,017

+ 0,005+ 0,012+ 0,035

+ 0,017

+ 0,035+ 0,020+ 0,020

+ 0,025

+ 0,035+ 0,027+ 0,027

+ 0,029

4

Msr. +

Wsdfl. Sr.

0,037

0,087

0,098

0,074

0,0810,060

0,046

0,062

0,0050,028

0,086

0,039

0,076

0,0160,020

0,037

0,061

0,0140,064

0,046

0,0140,024

0,017

0,018

5 6

äextr. Sr. pH

0,046 4,450,098 4,15

0,103 4,10

0,082

0,083

0,0610,053

0,066

0,001

0,031

0,083

0,038

0,0530,008

0,016

0,025

0,0610,016

0,076

0,051

0,008

0,016

0,008

0,010

4,354,45

»4,40

4,704,70

4,45

4,40

4,704,70

4,404,70

4,40

4,75

4,354,80

15

extrahierbaren Säuren entspricht, woraus sich schliessen

lässt, dass neben Milchsäure keine andere ätherextrahier-

bare, nicht wasserdampfflüchtige Säure vorhanden ist.

Dies geht auch aus der in Tabelle 9, aufgeführten Diffe¬

renz von ätherextrahierbaren und wasserdampfflüchtigenSäuren hervor, die weitgehend der Menge der gefun¬denen Milchsäure entspricht. Das Ansteigen der wasser¬

dampfflüchtigen Säuren, das laut Tabellen 9 und 11 be¬

sonders für die Stämme Nr. 9, 20, 31 und 60 typisch ist,muss auf die Bildung von oxydierbaren Säuren (Ameisen¬säure und Brenztraubensäure) zurückzuführen sein, da die

nicht oxydierbare Säuremenge, die anhand der Duclaux-

Destillation (Tabelle 10) als Essigsäure identifiziert wurde,in allen Proben mehr oder weniger unverändert blieb,deren prozentualer Anteil aber an der Gesamtsäuremengegegenüber dem unbeimpften Bier wesentlich gesunken ist

(Tabelle 9, dritte Kolonne). Diese Säuren wurden nicht

identifiziert. Trotzdem liegt die Vermutung nahe, dass

es sich um Brenztraubensäure handeln könnte, da die

Höchstwerte, die für die nicht oxydierbaren Säuren in

den meisten Fällen (vgl. Tabelle 9, Stämme Nr. 60 und

20) (Ansatz 20 c) mit einer deutlichen Abnahme der

Milchsäure gegenüber dem unbeimpften Bier zusammen¬

fallen. Die Menge der fehlenden Milchsäure ist zwar

kleiner als die gebildete, nicht oxydierbare Säuremenge.Bekannt ist jedoch die Beziehung zwischen Brenztrauben¬

säure und Milchsäure im Kohlehydratabbau gemässMeyerhof (29) nach der folgenden Reaktion:

+ H2A

CHs. CO.COOH—=^ CH,-. CHOH

.COOH + A

Tabelle 12: Duclaux-Destillation des oxydierten Alkohols aus

unbeimpftem und beimpftem Bier

a), b), c) bedeuten 3 voneinander unabhängig durchgeführteVersuche

H2A

Brenztraubensäure Milchsäure

wobei A einen Wasserstoffakzeptor darstellt. Der nähere

Zusammenhang zwischen Milchsäure und Brenztrauben¬

säure wird später besprochen (S. 22).Eine weitere chemische Veränderung, die den Aetha-

nolgehalt betrifft, wird hervorgerufen durch Stamm Nr. 7,

welcher den Aethanolgehalt gegenüber dem unbeimpftenBier deutlich zu verringern vermag. Wie aus Tabelle 9

ersichtlich ist, beträgt die Abnahme im Mittel 2,17 mäq.Bei den mit Stamm Nr. 60 beimpften Proben ist dagegeneher eine Erhöhung des Alkoholgehaltes festzustellen. Die

Frage des Alkoholabbaues war Gegenstand von Ver¬

suchen mit synthetischen Substraten und wird an anderer

Stelle besprochen (vgl. S. 20). Die durchgeführte Prüfungergab, dass in allen Fällen einzig Aethanol vorhanden

war (vgl. Tabelle 12).Der in der Literatur oft erwähnte, an Honig erinnernde

Geruch von mit Kokken infiziertem Bier, den Shmwell

(40) auf Diazetyl zurückführt, konnte in einigen Fällen

deutlich festgestellt werden, wurde aber bei diesen Unter¬

suchungen nicht näher untersucht.

Zusammenfassend konnten im Bier folgende Verände¬

rungen festgestellt werden:

1. Bildung von Milchsäure allein (pH-Abfall)(Stamm Nr. 1)

2. Bildung von Milchsäure unter gleichzeitigem Aethanol-

abbau (pH-Abfall) (Stamm Nr. 7)3. Bildung kleiner Mengen Milchsäure und wasserdampf-

flüchtiger nach Friedemann (15) oxydierbarer Säuren

(pH-Abfall) (Stamm Nr. 31)4. Verringerung der Milchsäurekonzentration bei gleich¬

zeitiger Bildung der unter 3 genannten wasserdampf¬flüchtigen Säuren (keine Veränderung des pH-Wertes)(Stamm Nr. 60)

Probe Ueberdestillierte Sauremenge in °0der

20 ml

vorgel40 ml

legten Mei

60 ml

Destillat

age m

80 ml 100 ml

0.01 n Essigsäurelösung 11,9 25,0 39,6 56,5 78,7

Bier unbeimpft a)b)c)

12,4

12,1

12,7

24,7

25,4

26,7

38,7

39,7

40,9

55,4

55,957,8

76,576,8

78,9

Mittel 12,4 25,6 39,8 56,4 77,4

Bier beimpft m. St. 1 a)b)c)

11,8

11,7

12,1

25,2

24,7

25,0

39,639,1

39,6

56,6

55,6

56,4

78,477,679,0

Mittel 11,8 25,0 38,4 56,2 78,3

Bier beimpft m. St. 7 a)b)c)

11,8

11,8

11,8

24,9

24,7

24,8

39,9

39,0

39,4

55,855,6

56,5

78,1

78,078,1

Mittel 11,8 24,8 39,4 55,9 78,0

Bier beimpft m. St. 9 a)b)c)

11,8

12,0

12,2

24,5

24,8

25,1

38,8

40,2

39,5

54,9

56,5

55,0

75,5

78,3

76,5

Mittel 12,0 24,8 39,5 55,5 76,7

Bier beimpft m. St. 20 a)b)c)

12,2

12,0

12,3

25,625,023,7

39,5

38,6

37,8

55,855,3

52,8

77,4

76,672,1

Mittel 12,2 24,8 38,7 54,6 75,4

Bier beimpft m. St. 31 a)b)c)

12,0

12,0

12,1

24,8

24,7

24,9

39,2

39,0

39,2

55,4

55,8

77,576,1

77,0

Mittel 12,0 24,8 39,1 55,6 76,8

Bier beimpft m. St. 60 a)b)c)

11,9

11,6

11,8

24,9

24,524,6

39,0

38,638,6

55,354,5

54,9

77,075,3

75,2

Mittel 11,8 24,7 38,7 ••4 9 75,8

//. Versuche unter Verwendung von synthetischenNährlösungen

Um weitere Kenntnisse über die Physiologie der Kok¬

kenstämme, die sich in Bier entwickeln konnten, zu er¬

halten, wurden mit den Stämmen Nr. 1, 7, 9, 20, 31 und

60 Versuche in synthetischen Nährlösungen durchgeführt.In mehreren Vorversuchen mit Nährlösung 1 (Zusammen¬setzung S. 7), die als Kohlenstoffquelle Glukose, als Stick¬

stoffquelle Ammonsulfat, ferner sekundäres Kaliumphos¬

phat und Magnesiumsulfat enthielt, vermochten sich die

Stämme Nr. 1, 7, 9 und 20 bei starker Impfung gut zu

entwickeln, während der Stamm Nr. 60 in einigen Ver¬

suchen geringes und Stamm Nr. 31 kein Wachstum zeig¬ten. Der nachstehende Gärversuch mit Nährlösung 1, der

über den Abbau von Glukose orientiert, wurde daher

nur mit den vier ersten Stämmen durchgeführt.

1. Gärversuch mit Nährlösung 1

(Glukose und Mineralsalze)

Mit den Stämmen Nr. 1, 7, 9 und 20 wurden je 3 Gär¬

versuche angestellt unter Verwendung von je 400 ml

Nährlösung 1 mit Glukose als Kohlenstoffquelle in 500 ml

fassenden Jenaer - Steilbrustflaschen. Als Impfmaterialdienten 24 Stunden alte, bei 26° C auf Hefewasserschräg-agar gewachsene Kulturen, wobei das Zellmaterial eines

Röhrchens mit 2 bis 3 ml sterilem Wasser sorgfältig durch

Schütteln suspendiert und zu je einer Flasche gegeben

16

Tabelle 13: Gärversuch mit Nährlösung 1 (Glukose und Mineralsalze)Bestimmt wurden die wasserdampfflüchtigen Säuren (Wsdfl. Sr.), wobei die Unterteilung in nicht oxydierbare Säuren (Kol. 4 und

5) und Essigsäure (Kol. 6) vorgenommen wurde. In Kolonne 7 sind die ätherextrahierbaren Säuren pro 20 ml Substrat aufgeführt,und es wird in Kolonne 8 und 9 die Differenz zwischen ätherextrahierbaren und wasserdampfflüchtigen Säuren in mäq und als

mg Milchsäure berechnet angegeben. Im weitern sind die im Aetherextrakt (Kol. 10) und die im Substrat (Kol. 11) bestimmteMilchsäure pro 20 ml Substrat in mg und die ebenfalls in 20 ml Substrat bestimmte Menge Aethanol (Kol. 12 und 13) in mäqund mg aufgeführt. Für diese Bestimmungen wurden 3 voneinander unabhängige Versuche a), b) und c) durchgeführt; jederWert ist der Durchschnittswert einer Doppelbestimmung.Bei der Zuckerbestimmung sind Durchschnittswerte von 5 Parallelbestimmungen aufgeführt. In Kolonne 14 ist die pro 1 ml

Substrat bestimmte, in Kolonne 15 die pro 20 ml Substrat vergorene und in Kolonne 16 die vergorene Glukose in % der vor¬

gelegten Glukosemenge aufgeführt.

Probe pH Wsdfl Sr. pro 20 ml Substrat Aeextr. Sr Diff. zw. äextr. Msr. pro 20 ml Sub. AI pro 20 ml Glukose

Ges. Sr. n. oxydb. Sr. Esr. pro 20 m; u. wsdfl. Sr. vergoren

ber. als best, im best, im best, pro pro 20 m

Msr. Aeextr. Sub. 1 ml Sub. Sub »0

mäq mäq °/o mg mäq mäq mg mg mg mäq mg mg mg

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

o-Probe 7,00 0 0 0 0 0 0 0 . 0 0 0 0 4,944 0 0

unbeimpftStamm a) 4,45 0,113 0,105 92,9 6,78 0,259 0,146 13,14 13,06 13,23 0 0 3,464 29,60 29,9Nr. 1 b) 4,40 0,113 0,110 97,3 6,78 0,259 0,146 13,14 13,25 13,22 0 0 3,380 31,28 31,6

c) 4,40 0,105 0,095 90,5 6,35 0,255 0,150 13,50 13,45"

13,31 0 0 3,548 27,92 28,2

Stamm a) 6,50 0,127 0,110 86,6 7,62 0,135 0,008 0,72 2,52 0 0 0 4,372 11,44 11,6Nr. 7 b) 6,25 0,113 0,105 92,9 6,78 0,113 0 0 1,98 0 0 0 4,068 17,52 17,7

c) 6,55 0,113 0,110 97,3 6,78 0,143 0,030 2,70 2,73 2,97 0 0 3,980 19,38 19,2

Stamm a) 4,55 0,113 0,105 92,9 6,78 0,225 0,112 10,08 11,62 10,00 0,132 6,07 3,656 25,76 26,0Nr. 9 b) 4,45 0,113 0,095 84,1 6,78 0,250 0,137 12,33 11,16 11,52 0,106 4,90 3,644 26,00 26,3

c) 4,60 0,113 0,090 79,6 6,78 0,225 0,112 10,08 9,85 10,00 0,138 6,35 3,538 28,12 28,4

Stamm a) 4,75 0,098 0,085 86,7 5,88 0,225 0,127 11,43 8,35 9,73 0,149 6,85 3,548 27,92 28,2Nr. 20 b) 4,70 0,105 0,095 90,7 6,35 0,225 0,120 10,80 11,02 10,79 0,212 7,85 3,592 27,04 27,3

c) 4,60 0,098 0,085 86,7 5,88 0,230 0,132 11,88 10,81 10,26 0,206 9,48 3,536 28,16 28,5

wurde. Die Proben wurden während 30 Tagen bei 26° C

bebrütet und täglich zweimal durchgeschüttelt. Eine un-

beimpfte Probe diente als Kontrolle.

In einem mit Stamm Nr. 1 durchgeführten Vorversuch

mit gleicher Versuchsanordnung wurde in gewissen Zeit¬

abständen 10 ml Substrat entnommen und der pH-Wert

gemessen. Es ergaben sich folgende Werte

nach: 5 Tagen pH 6.65 nach: 24 Tagen pH 4.75

0 Tage pH 7.20 10 Tagen pH 6.20 30 Tagen pH 4.50

19 Tagen pH 5.00 35 Tagen pH 4.50

Um Infektionen von Fremdorganismen zu vermeiden,

wurde im Hauptversuch nur der Anfangs- und End-pH-Wert bestimmt.

Versuchsergebnisse

Die chemische Analyse umfasste folgende Bestimmun¬

gen: wasserdampfflüchtige Säuren, ätherextrahierbare

Säuren, Alkohole und Glukose. Die Resultate sind in Ta¬

belle 13 aufgeführt. Bei den Ansätzen mit den Stämmen

Nr. 1, 9 und 20 sank der pH-Wert von 7,0 auf 4,4 bis

4,7, während Stamm Nr. 7 nur eine geringe Abnahme

des pH-Wertes bewirkte (pH 6,25 bis 6,55). Alle Stämme

bildeten nahezu gleich grosse Mengen von wasserdampf¬

flüchtigen Säuren (Durchschnitt 0,11 mäq in 20 ml Sub¬

strat), die sich bei den Stämmen Nr. 1 und 7 im Mittel zu

über 90 Prozent, bei den Stämmen Nr. 9 und 20 zu über

85 Prozent als nicht oxydierbar erwiesen. Aus den erhal¬

tenen Werten der DucLAux-Destillation in Tabelle 14

lässt sich auf Essigsäure schliessen. Bei der Berechnungdes Kohlenstoffanteils der Essigsäure in der Kohlenstoff¬

bilanz (Tabelle 16) wurde die Gesamtmenge der wasser¬

dampfflüchtigen Säuren berücksichtigt.Die erhaltenen Mengen an ätherextrahierbaren Säuren

sind mit Ausnahme der Ansätze von Stamm Nr. 7 höher

als die der wasserdampfflüchtigen Säuren. Die Differen¬

zen stimmen weitgehend mit der gefundenen Milchsäure-

Tabelle 14: Garversuch mit Nährlösung I

DucLAux-Destillation der Wasserdampfdestillate nach durch¬

geführter Oxydation nach Friedemann.

Probe Ueberdestillierte Sauremenge in °/° der vorgelegten

Menge in

20 ml 40 ml 60 ml

Destillat

80 ml 100 ml

Stamm Nr. 1 12,1 25,2 39,0 53,8 75,8Stamm Nr. 7 12,5 24,7 38,6 53,9 76,0Stamm Nr. 9 11,5 24,0 38,8 54,7 78,0Stamm Nr. 20 12,1 24,8 36,9 53,7 76,0

Essigsäure0,002 n Lösung

12,1 24,9 38,2 56,0 78,4

menge überein. Es scheint, dass neben Milch- und Essig¬säure keine anderen Säuren gebildet wurden.

Die bei der Milchsäurebestimmung der Ansätze 7 a)und 7 b) gefundenen Werte liegen innerhalb der Fehler¬

grenzen der angewandten Methode, da diese im Bereiche

von unterhalb 4 mg nicht mehr zuverlässige Ergebnisseliefert.

Die durch alkalische Destillation des Substrates erhal¬

tenen Destillate wurden mittels der Jodoformprobe auf

Alkohole und Aldehyde geprüft. Die aus den mit den

Stämmen Nr. 1 und 7 beimpften Gäransätzen stammen¬

den Proben zeigten bei der Durchführung der erwähnten

Probe keine Reaktion entsprechend dem unbeimpftenSubstrat, während die aus den übrigen Ansätzen stam¬

menden Proben deutlich positiv reagierten. In Ueberein-

stimmung mit den genannten Resultaten konnten nur in

den Versuchsserien der Stämme Nr. 9 und 20 Aethanol

gefunden werden. Die Ergebnisse der DucLAux-Destilla-

tion in Tabelle 15 schliessen das Vorhandensein von an¬

deren Alkoholen aus.

Die Differenz zwischen der in der unbebrüteten Kon¬

trollprobe gefundenen Glukosemenge und den in den be¬

impften Ansätzen bestimmten Mengen entspricht dem ver¬

gorenen Zucker. Wie aus Tabelle 13 entnommen werden

17

Tabelle 15: Duclaux-Destillation des oxydierten Alkohols aus

den Gäransätzen in Nährlösung 1

Die Werte stammen aus je 3 unabhängig voneinander durch¬

geführten Parallelversuchen

Probe Ueberdestülierte Säuremenge in °/o der vorgelegten

20 ml 40 ml

Menge in

60 ml

Destillat

80 ml 100 ml

Stamm Nr. 9 a)b)c)

11,4

10,5

11,7

25,024,123,9

38,337,9

36,5

54,7

53,7

54,2

74,8

75,9

76,5

Stamm Nr. 20 a)b)c)

11,8

11,4

11,9

24,223,3

24,2

37,3

37,3

38,2

55,4

55,054,1

75,9

77,8

76,3

Essigsäure 0,002i n Lösg. 12,1 24,9 38,2 56,0 78,4

kann, vergor Stamm Nr. 1 durchschnittlich 30 Prozent

und die Stämme Nr. 9 und 20 rund 27 Prozent des vor¬

gelegten Zuckers. Stamm Nr. 7 hingegen vermochte nur

11,6 Prozent, 16,6 Prozent und 19,2 Prozent der vorge¬

legten Glukose zu vergären.Aus den Kohlenstoffbilanzen (Tabelle 16) der durch¬

geführten Versuchsserie ist ersichtlich, dass die Stämme

Nr. 1 und 7 neben den Säuren noch andere Stoffwechsel¬

produkte bilden müssen. Im Falle von Stamm Nr. 1 er¬

scheinen rund 67 Prozent des Kohlenstoffs der vergorenen

Glukosemenge in den ermittelten Endprodukten, und zwar

entfallen etwa 45 Prozent auf Milchsäure und 22 Prozent

auf Essigsäure. In den Ansätzen mit Stamm Nr. 7 wurde

in 2 Proben (a) und (b) als Stoffwechselprodukt nur Essig¬säure und im Ansatz 7 (c) nebst Essigsäure noch eine kleine

Menge Milchsäure bestimmt. Im Mittel betrug der ge¬

fundene Kohlenstoff 51 Prozent der Kohlenstoffmenge, die

der vergorenen Glukose entspricht.Die Stämme Nr. 9 und 20 bildeten aus Glukose neben

Essigsäure grössere Mengen Aethanol. Der in den Stoff¬

wechselprodukten gefundene Kohlenstoff betrug in den

Ansätzen mit Stamm Nr. 9 im Durchschnitt 94 Prozent

und im Falle von Stamm Nr. 20 96 Prozent.

2. Gärversuch mit den Nährlösungen 2 und 3

(Glukose, Caseinhydrolysat, Mineralsalze, Hefewasser)

Wie bereits erwähnt, ist aus der Kohlenstoffbilanz (Ta¬belle 16) des mit Nährlösung 1 durchgeführten Gärver¬

suches zu entnehmen, dass die Stämme Nr. 1 und 7 aus

Glukose Milch- und Essigsäure bildeten, dass aber der

pH gemessen am n-ten Tag nach dem Impfen

0 12 3 5 10 15 20

Tabelle 17: pH-Verlauf in mit Stamm 1 beimpften Substraten

Nährlösung 1: Glukose, Ammonsulfat, Kaliumphosphat und

Magnesiumsulfat; Nährlösung 2: Glukose, Kaliumphosphat,Magnesiumsulfat, Caseinhydrolysat und Hefewasser; Nähr¬

lösung 3: Glukose, Ammoniumsulfat, Kaliumphosphat, Magne¬siumsulfat, Caseinhydrolysat und Hefewasser.

a), b) und c) bedeuten die 3 voneinander unabhängig durch¬

geführten Versuche

Probe

Nährlösung 1

unbeimpftbeimpft a)

b)c)

Nährlösung 2

unbeimpftbeimpft a)

b)

c)

Nährlösung 3

unbeimpftbeimpft a)

b)

7,00 — —

7,05 6,95 6,90

7,00 6,90 6,90

6,95 6,90 6,85

6,90 — —

6,85 6,80 6,80

6,80 6,75 6,75

6,90 6,75 6,70

6,70

6,75

6,70

6,70

6,45

6,40

6,95 —

6,55 5,50

6,50 5,356,50 5,45

7,05 — 7,00

4,85 4,50 4,40

4,65 4,30 4.25

4,60 4,35 4,30

6,856,45 5,30

6,904,80 4,40

6,95

4,50

6,20 5,15 4,70 4,50 4,45

6,85 — —

6,90 6,75 6,50

6,80 6,50 6,45

6,85 6,45 6,40

6,15

6,10

6,05

6,75

6,00

5,85

5,70

5,304,95

5,00

6,90 — 6,95

4,80 4,70 4,70

4,80 4,65 4,60

* Proben wegen Infektion durch Fremdorganismen aus der

Versuchsreihe ausgeschieden.

den gefundenen Säuremengen entsprechende Kohlenstoff

nur 67 Prozent (Stamm Nr. 1) und 51 Prozent (StammNr. 7) des Kohlenstoffes der verbrauchten Glukosemengebeträgt. Dass ausser den genannten Säuren noch andere

Stoffwechselprodukte vorhanden sein müssen, versteht

sich von selbst. Es schien jedoch auch möglich, dass bei

Verwendung eines in Bezug auf Stickstoffverbindungenkomplexer zusammengesetzten Substrates grössere Säure¬

mengen (besonders Milchsäure) erhalten werden könnten,im Hinblick darauf, dass die sogenannten «Bierkokken»

von verschiedenen Autoren (Mees 28, Shimwell 42, Peter¬

son 32, u. a.) zu den homofermcntativen Milchsäurebak¬

terien gezählt werden.

Versuchsanordnung

Aus den oben erwähnten Gründen wurde mit Stamm

Nr. 1 ein Gärversuch in den Nährlösungen 2 und 3 durch¬

geführt, die als Stickstoffquelle Caseinhydrolysat allein

(Nährlösung 2) und Caseinhydrolysat zusammen mit Am-

Tabelle 16: Kohlenstoffbilanz (berechnet auf Grund der in Tabelle 13 aufgeführten Werte; Gärversuch in Nährlösung 1)

Probe Glukoseverbr.

mgC

Essigsäure

mgC °,o

Milchsäure

mg C »/o

Aethanol

mg C 0/o mgC

rotal

o/o

Stamm Nr. 1 a)b)c)

Mittel

11,8412,51

11,17

2,712,71

2,54

22,9

21,7

22,7

22,4

5,22

5,30

5,38

44,1

42,4

48,2

44,9

0

0

0

0

0

0

0

7,938,01

6,92

67,0

64,0

71,0

67,3

Stamm Nr. 7 a)b)c)

Mittel

4,57

7,017,75

3,052,71

2,71

66,7

38,7

35,0

46,8

0

0

1,14

0

0

14,7

0

0

0

0

0

0

0

3,05

2,71

3,85

66,7

38,7

49,7

51,7

Stamm Nr. 9 a)b)c)

Mittel

10,3010,40

11,25

2,71

2,71

2,71

26,3

22,1

24,1

25,5

4,324,54

3,97

41,9

43,7

35,3

40,3

3,16

2,56

3,31

30,7

24,6

29,4

28,2

10,19

9,81

9,99

98,9

94,3

88,8

94,0

Stamm Nr. 20 a)b)c)

Mittel

11,17

10,8111,26

2,35

2,54

2,35

20,9

23,5

20,9

21,7

3.37

4,364,21

29,9

40,3

37,4

35,9

3,57

4,10

4,94

31,8

39,9

43,9

38,5

9,29

11,00

11,50

8,25

103,8

102,1

96,1

18

moniumsulfat (Nährlösung 3) enthalten. Zusatz von 20 ml

Hefewasser pro Liter Substrat diente in den beiden Gär¬

medien als Wuchsstoffquelle. Zum Vergleich wurde eine

Versuchsreihe mit Nährlösung 1 in die Untersuchungeneinbezogen.

Die Kulturgefässe, die Substratmenge, das Gewinnen

des Impfmaterials, die Impfmenge und die Bebrütungs-temperatur blieben gleich wie im vorhergehenden Ver¬

such (S. 16). Während der Versuchsdauer wurde der pH-Verlauf in allen Substraten verfolgt.

VerStichsergebnisse

Tabelle 17 und Abbildung 13 zeigen den pH-Verlaufwährend der Bebrütungszeit. Dabei wird ein mehr oder

weniger gleichmässiges Abfallen des pH-Wertes bis zum

20. Tag beobachtet. Da nach dieser Zeit keine wesent¬

lichen pH-Verschiebungen mehr eintraten, wurde der

Versuch am 25. Tag nach dem Impfen abgebrochen, und

die Proben wurden auf wasserdampfflüchtige sowie äther-

extrahierbare Säuren, Milchsäure, Aethanol und Glukose

untersucht. Die erhaltenen Resultate sind in Tabelle 18

zusammengefasst. Schon die in den verschiedenen Gär¬

ansätzen gemessenen pH-Werte Hessen vermuten, dass

Caseinhydrolysat gegenüber Ammoniumsulfat als Stick¬

stoffquelle keine Steigerung der Säurebildung bewirkt hat.

Dies bestätigen auch die erhaltenen Analysenresultate.Stamm Nr. 1 bildete in den beiden Substraten, die Casein¬

hydrolysat enthielten, aus Glukose keine wasserdampf-flüchtigen Säuren, im Gegensatz zu Nährlösung 1 (ohneCaseinhydrolysat), wo analog dem vorhergehenden Ver¬

such (Tabelle 13) zwar eine kleinere Menge der genann¬

ten Säuren ermittelt und als Essigsäure identifiziert (Ta¬belle 19) werden konnte. In allen 3 Substraten wurde

Milchsäure gefunden, wobei aber in Nährlösung 1 die

höchsten Werte bestimmt wurden. Die aus den Nähr¬

lösungen 2 und 3 durch Aetherextraktion gewonneneSäure erwies sich als Milchsäure, was zusammen mit den

Ergebnissen der Wasserdampfdestillation die Anwesen¬

heit anderer Säuren ausschliesst. Auffallend ist, dass in

Nährlösung 3, die Caseinhydrolysat und Ammonsulfat

enthält, die kleinsten Milchsäuremengen gefunden wur¬

den, was darauf hinweist, dass Ammoniumsulfat hier

hemmend wirken könnte. In keinem Falle werden Aetha¬

nol oder andere Alkohole gebildet.

Abb. 13 pH-Verlauf von Gäransätzen mit Stamm Nr. 1 inden Nährlösungen 1, 2 und 3.

1 = Nährlösung 1 (Glukose, Ammoniumsulfat, sekundäres

Kaliumphosphat und Magnesiumsulfat) — 2 = Nährlösung 2

(Glukose, Caseinhydrolysat, Hefewasser, sekundäres Kalium¬

phosphat und Magnesiumsulfat) — 3 = Nährlösung 3 (Glukose,Caseinhydrolysat, Hefewasser, Ammoniumsulfat, sekundäres Ka¬

liumphosphat und Magnesiumsulfat). (Vgl. Tabelle 17)

Tabelle 19: Duclaux-Destillation des mittels saurer Wasser¬

dampfdestillation gewonnenen Destillates aus den 3 Gäran¬sätzen mit Stamm 1 in Nährlösung 1

Probe Ueberdestillierte Säuremenge in °/o

der vorgelegten Menge in

20 ml 40 ml 60 ml 80 ml 100 ml

Destillat

Nährlösung 1 12,6 24,1 36,7 53,3 75,6Essigsäure 0,002 n Lösung 12,1 24,9 38,2 56,0 78,4

Tabelle 18: Gärversuch mit Stamm Nr. 1

Als Substrat (Kol. 1) wurden angewandt: Nährlösung 1 (Glukose, Ammonsulfat, Kaliumphosphat und Magnesiumsulfat), Nähr¬

lösung 2 (Glukose, Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Caseinhydrolysat und Hefewasser) und Nährlösung 3 (Glukose, Ammo¬

niumsulfat, Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Caseinhydrolysat und Hefewasser). Ausser der Nullprobe o wurden 3 voneinander

unabhängige Versuche a), b) und c) durchgeführt. Die wasserdampfflüchtigen Säuren pro 20 ml Substrat sind als Gesamtsäure in

mäq (Kol. 3) und als Essigsäure in mg (Kol. 4) aufgeführt. Die ätherextrahierbaren Säuren pro 20 ml Substrat (Kol. 5) und die

Differenz zwischen den ätherextrahierbaren und wasserdampfflüchtigen Säuren pro 20 ml Substrat (Kol. 6) sind in mäq und das

Differenzergebnis auch als Milchsäure in mg (Kol. 7) aufgeführt. Damit hat man den Vergleich mit der pro 20 ml Substrat im

Aetherextrakt bestimmten Milchsäure (Kol. 8). Die in 1 ml Substrat bestimmte Glukosemenge ist in Kolonne 10, und die pro20 ml vergorene Menge in Kolonne 11 wiedergegeben. In Kolonne 12 ist die vergorene Glukose in °/o in der vorgelegeten Mengeangegeben.

Substrat pH Wsdfl

Total

Sr.

Esr.

Aeextr. Sr. Diff. zw. äextr. u.wsdfl. Sr.

Msr.

Msr. im

Aeextr.

AI. Glukose

best, pro vergoren

1 ml Sub. pro 20 ml Sub. »/»

1 2

mäq

3

mg

4

mäq

5

mäq

6

mg

7

mg

8

maq

9

mg

10

mg

11 12

Nährlösung 1

0

a)b)c)

7,00

4,40

4,25

4,30

0

0,067

0,067

0,067

0

4,02

4,02

4,02

0

0,195

0,217

0,225

0

0,128

0,150

0,158

0

11,52

13,50

14,22

0

13,70

15,90

15,80

0

0

0

0

4,784

3,528

3,476

3,440

0

25,12

26,16

26,88

0

26,3

27,3

28,1

Nährlösung 2

o

a)c)

6,90

4,50

4,50

0

0

0

0

0

0

0

0,143

0,128

0

0,143

0,128

0

12,87

11,52

0

12,50

12,82

0

0

0

4,736

3,056

3,068

0

33,6033,36

0

35,5

35,2

Nährlösung 3

0

a)b)

6,754,70

4,70

0

0

0

0

0

0

0

0,113

0,105

0

0,113

0,105

0

10,17

9,45

0

9,00

8,77

0

0

0

4,688

3,376

3,768

0

26,24

18,40

0

28,0

19,6

o = unbeimpftes Substrat

19

Tabelle 20: Kohlenstoffbilanz (Gärversuch mit Stamm 1 in verschiedenen Nährlösungen, berechnet auf Grund der in Tabelle IS

aufgeführten Werte)Probe Glukoseverbr. Essigsaure Milchsäure Aethanol Tcital

mgC mgC o/o mg G °/o mgC o/o mgC o/o

Nährlösung 1 a) 10,05 1,61 16,02 5,48 54,5 0 0 7,09 70,5

b) 10,46 1,61 15,39 6,36 60,8 0 0 7,97 76,2

c) 10,75 1,61 14,97 6,32 58,8 0 0 7,93 73,8

Mittel 15,5 58,0 0 73,5

Nährlösung 2 a) 13,44 0 0 5,00 37,2 0 0 5,00 37,2

c) 13,34 0 0 5,H 38,5 0 0 5,13 38,5

Mittel 0 37,8 0 37,8

Nährlösung 3 a) 10,49 0 0 3,60 34,3 0 0 3,60 34,3

b) 7,36 0 0 3,51 47,7 0 0 3,51 47,7

Mittel 0 41,0 0 41,0

Die vergorene Menge Glukose beträgt in Nährlösung 1

im Durchschnitt rund 27 Prozent des vorgelegten Zuckers,

gegenüber rund 35 Prozent in Nährlösung 2 und rund

30 Prozent resp. 19 Prozent in Nährlösung 3. Aus den

berechneten Kohlenstoffbilanzen (Tabelle 20) ist ersicht¬

lich, dass im Falle von Nährlösung 1 im Durchschnitt mit

rund 73 Prozent nahezu doppelt so viel Kohlenstoff wie¬

dergefunden wurde wie im Falle von Nährlösung 2 und 3.

Die in diesem Versuch erhaltenen Werte aus den An¬

sätzen mit Nährlösung 1 zeigen im wesentlichen Ueber-

einstimmung mit den Resultaten aus dem vorhergehendenVersuch (Tabellen 13 und 16, Stamm Nr. 1). Milchsäure

und Essigsäure wurden in beiden Fällen gefunden, jedochbildete Stamm Nr. 1 im zweiten Versuch etwas weniger

Essigsäure, hingegen mehr Milchsäure, und der wieder¬

gefundene Kohlenstoff betrug im Durchschnitt rund 73

Prozent gegenüber rund 67 Prozent im ersten Versuch.

Aus dem Gesagten geht hervor, dass unter den genann¬

ten Bedingungen organisch gebundener Stickstoff in Form

von Caseinhydrolysat die Säurebildung aus Glukose bei

dem untersuchten Stamm Nr. 1 nicht zu steigern vermag.

3. Versuche über den Abbau von Aethanol

in synthetischen Substraten

Im Verlauf der Untersuchungen über die durch die

Kokkenstämme Nr. 1, 7, 9, 20, 31 und 60 verursachten

Veränderungen von Bier (Tabelle 9) hat sich gezeigt, dass

Stamm Nr. 7 die Fähigkeit besitzt, den Aethanolgehaltdes Bieres zu verringern. Durch die folgenden Versuche

sollte abgeklärt werden, ob der genannte Organismusauch in synthetischen Nährlösungen Aethanol abzubauen

vermag. Folgende Substrate, basierend auf der Zusam¬

mensetzung von Nährlösung 1, dienten als Kulturmedien

in diesen Versuchen.

Substrat A

5 g Maltose, 2 g Ammoniumsulfat, 2 g sekundäres Kaliumphos¬phat und 0,3 g Magnesiumsulfat mit destilliertem Wasser zum

Liter aufgefüllt.

Substrat B

Gleiche Zusammensetzung wie Substrat A, jedoch Zusatz von

5 g Aethanol (95prozentig).

Substrat C

Gleiche Zusammensetzung wie Substrat B, jedoch nur 0,5 gMaltose.

Substrat D

Gleiche Zusammensetzung wie Substrat B, jedoch ohne Maltose.

Versuchsanordnung

Je 80 ml Nährlösung wurden in etwa 100 ml fassende,trockensterilisierte Fläschchen mit Patentverschluss ge¬

geben und dreimal im Abstand von 24 Stunden im strö¬

menden Dampf während 20 Minuten erhitzt. Das Impfender Proben erfolgte mit je 1 ml Bakteriensuspension, die,

wie in den vorhergehenden Versuchen beschrieben, ge¬

wonnen wurde (24 Stunden alte, auf Hefewasseragar bei

26° C gewachsene Kulturen).Ausser Stamm Nr. 7, der in Bier Alkohol abbaute, wur¬

den Stamm Nr. 9 und die beiden Stämme Nr. 31 und 60,

die sich in Bier gut, jedoch nicht in Nährlösung 1 mit

Glukose als Kohlenstoffquelle entwickelten, in die Unter¬

suchungen miteinbezogen. Von den Substraten B, C und

D wurden je 3, von Substrat A je 2 Proben beimpft und

zusammen mit den unbeimpften Proben (von jedem Sub¬

strat 3 bzw. 2) bei 26° C während 50 Tagen bebrütet.

Versuchsergebnisse

In Tabelle 21 sind die Resultate der Aethanolbestim-

mungen zusammengestellt. Hieraus ist zu entnehmen, dass

in Substrat A (ohne Aethanolzusatz) in keinem Falle

Aethanol gebildet wurde. In den Substraten B und C, die

Aethanol und Maltose enthalten, vermochten die Stämme

Nr. 7 und 9 einen Teil des Aethanols abzubauen, wobei

Tabelle 21: Versuch über Abbau von Aethanol in synthetischemSubstiat

Bestimmung von Aethanol pro 100 ml. a), b) und c) bedeuten

3 voneinander unabhängig durchgeführte Versuche. Jeder Wert

entspricht dem Durchschnitt einer Doppelbestimmung. Für jedeVersuchsserie ist der Mittelwert errechnet und hiefür ange¬

geben wieviel Prozent (%) von der vorgelegten Menge wieder¬

gefunden wurden.

Nährlösung Kontrolle

unbeimpît

Stamm

Nr 7

Stamm

Nr 9

Stamm

Nr. 31

Stamm

Nr. 60

maq maq maq maq maq

A a)b)

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Mittel

Mittel °/o z z—

z—

B a)b)c)

10,22

9,94

9,75

7,88

7,47

7,44

8,47

9,28

7,84

9,729,75

9,09

10,09

10,37

10,28

Mittel

Mittel %>9,97

100,0

7,5976,1

8,53

85,5

9,52

95,5

10,25

102,8

C a)b)c)

10,56

10,5010,16

8,72

8,63

8,56

9,18

7,34

9,06

10,23

10,23

10,94

10,09

10,23

10,50

Mittel

Mittel %>

10,07

100,0

8,64

85,8

8,53

84,710,47

103,9

10.27

101,9

D a)b)c)

10,16

10,56

10,03

10,06

10,46

9,72

9,90

9,94

9,68

10,15

10,5610,40

10,03

10,68

9,96

Mittel

Mittel °/o10,25

100,0

10,08

98,3

9,84

96,010,57

101,1

10,22

99,7

20

Stamm Nr. 7 in Substrat B (5 g Maltose pro Liter) rund

24 Prozent und in Substrat C (0,5 g Maltose pro Liter)rund 14 Prozent, während Stamm Nr. 9 in beiden Sub¬

straten im Durchschnitt 14 Prozent der vorgelegten MengeAlkohol vergoren. In Substrat C, das als Kohlenstoff- und

Energiequelle nur Aethanol enthält, entsprach die gefun¬dene Menge Aethanol der vorgelegten Menge. Die Stämme

Nr. 31 und 60 vermochten unter diesen Versuchsbedin¬

gungen in keinem Falle Aethanol abzubauen. Es sei dar¬

auf hingewiesen, dass die beiden letztgenannten Stämme

in allen Ansätzen nur spärliche Entwicklung zeigten.Aus diesen Untersuchungen geht hervor, dass die Kok¬

kenstämme Nr. 7 und 9 in Anwesenheit von Maltose

Aethanol als Kohlenstoff- oder Energiequelle auszunützen

vermögen.In Tabelle 22 sind die Resultate der DucLAux-Destil-

lationen aufgeführt, die in allen Fällen auf Essigsäureschliessen lassen und dadurch den Beweis erbringen, dass

es sich bei der mittels der alkalischen Destillation er¬

haltenen oxydierbaren Substanz wirklich um Aethanol

handelte.

Ferner wurden alle Proben auf wasserdampfflüchtigeund ätherextrahierbare Säuren sowie auf Milchsäure

untersucht. Wasserdampfflüchtige Säuren konnten keine

ermittelt werden, während sehr kleine Mengen von äther-

extrahierbaren Säuren bestimmt wurden, die mengen-

mässig mit den für Milchsäure erhaltenen Werten weit¬

gehend übereinstimmten. Jedoch handelte es sich mei¬

stens um Mengen von unter 5 mg pro 20 ml Substrat.

Tabelle 22: Versuch über Abbau von Aethanol in synthetischemSubstrat

DucLAUx-Destillationen der durch alkalische Destillation ge¬wonnenen und nach Friedemann oxydierten Destillate

Nähr- Probe Ueberdestillierte Säuremenge in °/o der

lösung vorgelegten Menge in

20 ml 40 ml 60 ml

Destillat

80 ml 100 ml

B Kontrolle unbeimpft 11,2 23,1 37,8 54,9 77,6Stamm Nr. 7 11,6 24,9 38,9 55,5 76,6Stamm Nr. 9 11,7 24,0 38,1 54,6 76,2Stamm Nr. 31 11,9 24,3 37,7 54,1 78,0Stamm Nr. 60 11,9 23,7 36,7 54,1 75,9

C Kontrolle unbeimpft 12,5 25,3 39,2 55,4 78,7Stamm Nr. 7 11,6 24,9 38,9 55,5 76,6Stamm Nr. 9 11,6 24,1 37,8 54,3 76,0Stamm Nr. 31 11,5 23,0 36,8 54,1 76,1Stamm Nr. 60 12,3 24,8 38,2 55,3 76.2

D Kontrolle unbeimpft 11,9 24,2 37,8 54,8 76,5Stamm Nr. 7 11,8 23,8 37,8 55,5 76,5Stamm Nr. 9 11,9 24,1 38,2 54,2 75,3Stamm Nr. 31 11,5 24,0 37,8 55,3 77,6Stamm Nr. 60 11,5 24.2 37,8 54,7 77,6

Essigsäure 12,1 24,9 38,2 55,9 78,4

4. Diskussion

Die Ergebnisse der mit den Stämmen Nr. 1, 7, 9, 20, 31

und 60 in Bier und in synthetischen Substraten durchge¬führten Versuche geben einige Anhaltspunkte über die

Physiologie der untersuchten Organismen.Die Resultate der Bestimmungen der Milchsäure in be¬

impftem und unbeimpftem Bier (Tabelle 9) zeigen, dass

alle untersuchten Kokkenstämme mit Ausnahme von

Stamm Nr. 60 mehr oder weniger befähigt sind, in Bier

Milchsäure zu bilden, woraus man schliessen kann, dass

es sich bei diesen Kokkenstämmen um Milchsäurebakte¬

rien handeln könnte. Die mit Stamm Nr. 60 beimpftenProben wiesen niedrigere Milchsäuremengen auf als das

unbeimpfte Bier, dagegen war eine deutliche Erhöhungwasserdampfflüchtiger, nach Friedf.mann (15) oxydierbarerSäuren festzustellen. Ob es sich in diesem Falle auch um

einen Vertreter aus der Gruppe der Milchsäurebakterien

handelt, bleibt unklar. Dies lässt wieder deutlich erken¬

nen, dass die Organismen, die sich in Bier entwickeln

können, nicht als einheitliche physiologische Gruppe auf-

gefasst werden dürfen.

Weitere Beweise, die diese Annahme rechtfertigen,liefern die Resultate aus den mit synthetischen Nähr¬

lösungen durchgeführten Versuchen. Die beiden Stämme

Nr. 31 und 60, die sich schon in ihren morphologischenMerkmalen stark von den 4 übrigen Stämmen unter¬

scheiden, konnten in der synthetischen Nährlösung 1, die

Glukose als Kohlenstoffquelle, anorganischen Stickstoff

in Form von Ammoniumsulfat als Stickstoffquelle, ferner

sekundäres Kaliumphosphat und Magnesiumsulfat enthielt,selbst bei starker Impfung nicht zum Wachsen gebrachtwerden. Diese beiden Organismen sind nicht imstande,unter den genannten Bedingungen anorganischen Stick¬

stoff zu assimilieren. Sie zeigen also deutlich anderes Ver¬

halten als die Stämme Nr. 1, 7, 9 und 20.

Anhaltspunkte für die Vergärung von Glukose durch

die Stämme Nr. 1, 7, 9 und 20 ergeben sich aus der Er¬

mittlung der wasserdampfflüchtigen und ätherextrahier-

baren Säuren sowie den Bestimmungen von Milchsäure,Aethanol und Glukose in Gäransätzen mit dem verwen¬

deten synthetischen Substrat (Nährlösung 1). Die Stämme

Nr. 9 und 20 vergoren Glukose zu Milchsäure, Aethanol

und Essigsäure, wobei der der verbrauchten Glukose ent¬

sprechende Kohlenstoff nahezu zu 100 Prozent in den

Gärprodukten wiedergefunden wurde, wie aus Tabelle 16

ersichtlich ist. Bei Stamm Nr. 9 entfallen im Durchschnitt

40,3 Prozent des gefundenen Kohlenstoffes auf Milch¬

säure, 25,5 Prozent auf Essigsäure und 28,2 Prozent auf

Aethanol. Im Falle von Stamm Nr. 20 weicht die Ver¬

teilung des Kohlenstoffes im Vergleich zu Stamm Nr. 9

mit den Durchschnittswerten von 35,9 Prozent für Milch¬

säure, 21,7 Prozent für Essigsäure und 38,5 Prozent für

Aethanol nur wenig ab.

Die angewandten Analysen reichten zur Ermittlungsämtlicher aus Glukose durch die Kokkenstämme Nr. 1

und Nr. 7 gebildeten Abbauprodukte nicht aus. Stamm

Nr. 1 verhielt sich in Bezug auf Milch- und Essigsäure¬bildung ähnlich wie die beiden genannten Organismen(Stämme Nr. 9 und 20), jedoch fehlten Aethanol oder

andere Akohole in den entsprechenden Gäransätzen. Im

Durchschnitt erschienen 44,9 Prozent des verbrauchten

Kohlenstoffes als Milchsäure und 22,4 Prozent als Essig¬säure. Rund 33 Prozent Kohlenstoff: entfallen demnach

auf nicht ermittelte Stoffwechselprodukte. Im Falle von

Stamm Nr. 7 konnte nur Essigsäure eindeutig bestimmt

werden und der Kohlenstoffanteil entspricht im Mittel

rund 46 Prozent und schwankt von rund 35 Prozent bis

67 Prozent. Milchsäure war nicht oder nur in Spuren zu

finden.

Allgemein kann gesagt werden, dass bei den unter¬

suchten Kokkenstämmen, mit Ausnahme von Stamm Nr. 7,

Milchsäure ein Hauptstoffwechselprodukt des Glukoseab¬

baus darstellt. Die Tatsache aber, dass der Glukoseab¬

bau neben Milchsäure noch erhebliche Mengen von Essig¬säure, Aethanol oder weiteren, nichtidentifizierten Gär¬

produkten liefert, schliesst die untersuchten Kokkenstämme

aus der Gruppe der homofermentativen Milchsäurebakte¬

rien aus, berechtigt jedoch, diese Organismen als hetcro-

21

jermentative Milchsäurebakterien zu betrachten. Stamm

Nr. 7, der in Bier Milchsäure bildete, jedoch nicht in dem

verwendeten synthetischen Substrat, dürfte daher auch in

die genannte Gruppe einzuordnen sein.

Nebst Milchsäure, Aethanol und Essigsäure können in

heterofermentativen Milchsäuregärungen vor allem Gly¬cerin und CO2 gefunden werden. Nelson und Werkman

(30) haben für die Dissimilation von Glukose durch hetero-

\ermentative Milchsäurebakterien folgendes Schema vor¬

geschlagen:

C3Hi206

Glukose

CH2OH.CHOH.CHO + 2H-

Glycerinaldehyd

CsHeOä

1

CH3. CHO + CO2 + 2H

Acetaldehyd

\ +2H

CH3. CH2OH

Aethanol

->CHiOH.CHOH

.CHO

Glycerinaldehyd

^CH2OH.CHOH.CH2OH

Glycerin'

>CHsCHOH. COOH

Milchsäure

\CH3. CO

.COOH + 2H

Brenztraubensäure

\ + H.0

CH:«. COOH + C02 + 2H

Essigsäure

Als wichtigstes Intermediärprodukt wird Brenztrauben-

säure angenommen, da der Zusatz dieser Säure zu einer

solchen Gärung äquimolare Mengen von Essigsäure,Milchsäure und C02 ergibt.

Elsden (12) ist der Ansicht, dass die Entstehung der

Brenztraubensäure in Bakteriengärungen nach dem glei¬chen Mechanismus erfolgt, wie er von Meyerhof (29) für

die alkoholische Hefegärung und die Bildung von Milch¬

säure im Muskel vorgeschlagen wird, wonach das Hexose-

molekül nach vorausgegangener Phosphorylierung in zwei

Triosen gespalten wird, die dann in Brenztraubensäure

übergeführt werden.

Krebs (23) entdeckte bei Staphylococcus aureus Bildung.von Milchsäure, Essigsäure und C02 aus Brenztrauben¬

säure, gemäss der folgenden Dismutationsreaktion:

2 CH3. CO.COOH + H20 ^

CHs. CHOH.COOH + CHaCOOH + CO.

Wiken, Watt, White und Werkman (51) zeigten, dass

zellfreie Extrakte von Staphylococcus aureus Brenztrau¬

bensäure dismutieren und dass die Reaktion reversiblen

Charakter hat.

In neuerer Zeit untersuchten De Moos, Bard und Gun-

salus (11) sowie Gunsalus und Gibbs (17) den Mechanis¬

mus der heterofermentativen Milchsäuregärung bei Leu-

conostoc mesenteroides. Dieses Bakterium vergärt Glu¬

kose zu äquimolaren Mengen Milchsäure, Aethanol und

CO2. Versuche mit Glukose, die mit C14 markiert war,

ergaben, dass C-Atom 1 der Glukose im C02 erscheint

und ferner C-Atom 3 in der primären Carbinolgruppe des

Aethanols und C-Atom 4 in der Carboxylgruppe der

Milchsäure lokalisiert sind. Damit wurde bewiesen, dass

Leuconostoc mesenteroides Glukose nicht gemäss dem

Schema nach Meyerhof spaltet. Im letzteren Falle entsteht

C02 aus den C-Atomen 3 und 4 der Glukose und die

C-Atome 2 bzw. 5 erscheinen in der primären Carbinol¬

gruppe des Aethanols.

Der oxydative Abbau von Glukose über Glukonsäure

und deren Decarboxylierung, woraus C02 und Pentosen

(Ribose oder Ribulose) resultieren, sowie der weitere

Reaktionsverlauf des Pentoseabbaus, bei dem als Inter¬

mediärprodukte nebst den Triosen Sedoheptulose und

Erythrose auftreten, wurde in den letzten Jahren intensiv

untersucht. Die diesbezüglichen Arbeiten werden ein¬

gehend von Racker (33) besprochen. Dieser Autor weist

darauf hin, dass der bei Leuconostoc mesenteroides ge¬fundene Gärungsmechanismus wahrscheinlich eine Vari¬

ante des genannten oxydativen Glukoseabbaus darstellt,der jedoch unter anaeroben Bedingungen verläuft.

Die schon erwähnten, aus der Kohlenstoffbilanz erhal¬

tenen Zahlen zeigen, dass bei den untersuchten Kokken¬

stämmen Nr. 9 und 20 der Verlauf des Glukoseabbaus

nicht nach dem von Nelson und Werkman (30) oder dem

von Gunsalus und anderen (17) gefundenen Mechanis¬

mus erklärt werden kann. Dies geht schon daraus hervor,dass die Kohlenstoffanteile von Milchsäure, Essigsäureund Aethanol nahezu 100 Prozent des in Form von Glu¬

kose verbrauchten Kohlenstoffs betragen, was das Auf¬

treten von grösseren Mengen von CO2 als Stoffwechsel¬

produkt ausschliesst.

Im Falle der beiden Stämme Nr. 1 und 7 kann über die

Art des Glukosezerfalls nichts Genaues ausgesagt wer¬

den, da keine Anhaltspunkte über weitere Gärproduktevorliegen. Jedoch schliesst das Fehlen von Aethanol als

Endprodukt einen Gärverlauf, wie er bei Leuconostoc

mesenteroides beobachtet wurde, von vorneherein aus.

Während die Stämme Nr. 9 und 20 in Bezug auf Bil¬

dung von Stoffwechselprodukten aus Glukose sehr ähn¬

lich reagierten, Hessen demgegenüber die beiden Stämme

Nr. 1 und 7 in der Art des Glukoseabbaus doch wesent¬

liche Unterschiede erkennen. Die aus den Versuchen über

den Glukoseabbau erhaltenen Resultate deuten gleich wie

die aus den Untersuchungen über die Morphologie resul¬

tierenden Ergebnisse auf die Verschiedenheit der unter¬

suchten Organismen hin.

///. Untersuchungen über die Eignung verschiedener

Kohlehydrate als Kohlenstoffquellen

Die in Tabelle 23 aufgeführten Kohlehydrate wurden

in der synthetischen Nährlösung 1 auf ihre Assimilierbar¬

keit durch die Kokkenstämme Nr. 1, 7, 9 und 20 anhand

von Wachstumsbestimmungen geprüft. Die Ermittlungdes Wachstums erfolgte durch Trübungsmessung, die

direkt im Kulturgefäss in gleicher Weise wie im Falle der

Kulturen mit Bier (S. 11) durchgeführt wurde. Die ge¬mäss der Vorschrift auf S. 12 hergestellten Substrate (ge¬trenntes Sterilisieren der Zucker- und Salzlösungen) wur¬

den zu je 50 ml (von jedem Zucker 4 Proben) auf die

trockensterilisierten, zur Trübungsmessung geeignetenFläschchen verteilt und während 20 Minuten im strömen¬

den Dampf erhitzt. Von jeder C-Quelle wurden je drei

Proben mit 0,3 ml Bakteriensuspension (24 Stunden alte

Tabelle 23: Liste der auf Verwertbarkeit geprüften Kohle¬

hydrate

Präparate der Firma F. Hoffmann, La-Roche, Basel

d ( + ) Glukose* 1 (—) Sorbose 1 ( + ) Arabinose d (—) Mannit

d( + )Mannose Maltose Raffmose

d ( + ) Galactose Lactose l( + )Rhamnosed (—) Fructose d ( + ) Xylose d (—) Sorbit

Präparate der Firma Kerfoot, Vale of Bardslay (Lancashire)d ( + ) Cellobiose d ( + ) Melibiose d (—) Dulcit Saccharose

* vitaminfrei

22

auf Hefewasseragar bei 26° C gewachsenen Kulturen) be¬

impft und bei 26° C bebrütet. Die Trübungsmessung er¬

folgte in gewissen Zeitabständen im Sigrist-Nephelometer.Die durch das Impfmaterial hervorgerufene Trübungszu¬nahme betrug im Durchschnitt 7 bis 10 Prozent (Trübungdeutlich sichtbar).Die Ergebnisse der Trübungsmessungen enthalten die

Tabellen 24, 25, 26 und 27, wobei die angegebenen Zah¬

lenwerte die Trübungszunahmen (Prozent Trübung ge¬

messen am n-ten Tag minus Prozent Trübung unmittelbar

nach dem Impfen) und Durchschnittswerte von drei

Parallelansätzen darstellen.

Da es sich um Relativwerte handelt, welche von ver¬

schiedenen Faktoren abhängig sind, wie Bildung von

Zellagglomeraten, Wachstumsvermögen im vorliegendenSubstrat usw., können die bei den verschiedenen Stämmen

erhaltenen Zahlen nicht untereinander verglichen werden.

Die mitbebrüteten Kontrollproben wiesen während der

Versuchsdauer Trübungszunahmen von durchschnittlich

0,5 bis 1 Prozent auf.

Die Abb. 14, 15, 16 und 17 geben die Wachstumskurven

der untersuchten Stämme auf einigen Kohlehydraten wie¬

der. In Tabelle 28 sind die aus den Messungen sich er¬

gebenden Schlussfolgerungen zusammengefasst, wobei die

Tabelle 24: Wachstumsversuch mit Stamm 1 auf verschiedenen

Kohlehydraten

Nährlösung 1: C-Quelle, Ammoniumsulfat, sekundäres Kalium¬

phosphat und Magnesiumsulfat. (% Trübung gemessen am n-ten

Tag minus % Trübung sofort nach dem Impfen.)** Starke

Trübung, nicht mehr messbar (vgl. Abb. 14).

Tabelle 25: Wachstumsversuch mit Stamm 7 auf verschiedenen

Kohlehydraten

Nährlösung 1 : C-Quelle, Ammoniumsulfat, sekundäres Kalium¬

phosphat und Magnesiumsulfat. (% Trübung gemessen am n-ten

Tag minus % Trübung sofort nach dem Impfen.)** Starke

Trübung, nicht mehr messbar (vgl. Abb. 15).

% Trübungszunahme am n-ten TagC-Quelle C-Quelle

% Trübungszunahme am n-ten Tage12 5 7 10

d ( + ) Glukose 21 44 78¥* ** d (+) Glukose 10 35 66 80 ** ** «*

d (+) Mannose 18 31 58 75 89 d (+) Mannose 10 42 62 77 90»¥ ¥*

d ( + ) Galactose 22 39 69 86*¥ d ( +) Galactose 9 34 59 64 74 74 62

d (—) Fructose 16 31 62** ** d (—) Fructose 7 26 55 71 80

** *»

1 (—) Sorbose 2 4 6 6 10 1 (—) Sorbose 3 11 32 35 38 40 54

Maltose 26 41 73** ** Maltose 9 42 78

** ** *¥ **

Saccharose 0 0 0 0 0 Saccharose 4 7 5 5 5 5 5

Lactose 16 16 17 21 27 Lactose 8 37 69** *# ¥* **

d ( + ) Cellobiose 23 37 62 74¥* d ( + ) Cellobiose 10 41 80

*¥ »* ** **

d( + ) Melibiose 15 16 17 21 27 d ( + ) Melibiose 9 33 45 50 57 58 70

d(+) Xylose 7 10 13 16 22 d( + ) Xylose 7 22 40 48 53 60 61

1 ( + ) Arabinose 4 5 5 4 6 1 (+) Arabinose 6 23 50 57 60 63 64

Raffinose 0 1 0 1 1 Raffinose 1 1 1 1 1 1 0

1 (+) Rhamnose 6 9 10 10 11 1 (+) Rhamnose 2 10 13 13 13 13 12

d (—) Sorbit 3 3 3 3 3 d (—) Sorbit 4 4 4 4 4 4 4

d (—) Mannit 0 1 0 1 0 d (—) Mannit 1 2 1 1 1 1 1

d (—) Dulcit 0 0 0 0 0 d (—) Dulcit 0 0 0 0 0 0 0

m 4oo

2o

—>- Ttge

Abb. 14 Wachstum von Stamm Nr. 1 in Nährlösung 1 auf

verschiedenen Kohlehydraten: 1 =d(+) Glukose — 2 = d

(+) Mannose — 3 = d ( + ) Galactose — 5 = 1 (—) Sorbose

— 8 = Lactose — 9 = d ( + ) Cellobiose — 11 = d ( + ) Xylose— 12 = I ( + ) Arabinose — (vgl. Tabelle 24)

—» Tig*

Abb. 15 Wachstum von Stamm Nr. 7 in Nährlösung 1 auf

verschiedenen Kohlehydraten: 1 = d ( + ) Glukose — 3 = d

( + ) Galactose — 5 = 1 (—) Sorbose — 6 = Maltose — 7 =

Saccharose — 12 = I ( + ) Arabinose — 14 = I ( + ) Rhamnose

— (vgl. Tabelle 25)

_M

7libelle 26: Wachstumsversuih mil Stamm 9 auf verschiedenen

KohlehydratenNährlösung 1 : C-Quelle, Ammoniumsulfat, sekundäres Kalium¬

phosphat und Magnesiumsulfat. (% Trübung gemessen am n-ten

Tag minus % Trübung sofort nach dem Impfen.)" Stan

Trübung, nicht mehr messbar (vgl. Abb. 16).

% Trübungszunahme am n-ten TageC Quelle

d ( + ) Glukosed ( + ) Mannosed ( + ) Galactosed (—) Fructose

1 (—) Sorbose

Maltose

Saccharose

Lactose

d( + )Cellobiosed(+) Melibiose

d( + ) Xylose1 (+) Arabinose

Raffinose

1 ( + ) Rhamnosed (—) Sorbit

d (—) Mannit

d (—) Dulcit

14

14

14

14

2

15

2

13

13

10

4

1

9

4

2

0

0

45

40

39

50

7

40

2

21

41

24

9

4

3

9

5

0

0

85

95

68**

10

85

2

21

50

33

16

7

3

13

12

0

0

95

16**

1

23

83

33

25

9

2

14

22

0

0

18

2

24

100

33

33

12

9

17

27

0

0

24*#

2

25*

34

40

14

3

19

29

0

0

25

25

43

15

3

27

25

0

0

7 ahclle 27 : Wachslumsversiteh mit Stamm 20 auf verschiedenen

KohlehydratenNährlösung 1 : C-Quelle, Ammoniumsulfat, sekundäres Kalium¬

phosphat und Magnesiumsulfat. (% Trübung gemessen am n-ten

Tag minus % Trübung sofort nach dem Impfen.) ** Starke

Trübung, nicht mehr messbar (vgl. Abb. 17).

% Trübungszunahme am n-ten TageC-Quelle 1 3 5 10 14

d(+) Glukose

d ( + ) Mannosed ( + ) Galactosed (—) Fructose

1 (—) Sorbose

Maltose

Saccharose

Lactose

d (+) Cellobiose

d( + ) Melibiosed( + ) Xylose1 ( + ) ArabinoseRaffinose

1 ( + ) Rhamnosed (—) Sorbitd (—) Mannit

d (—) Dulcit

13

16

15

13

4

17

15

11

9

10

11

6

3

9

7

6

29

36

40

37

7

40

30

16

34

18

24

20

9

25

26

14

6

54

52

57

43

11

59

44

25

49

23

34

30

17

42

43

21

66

60

75

67

18

95

60

36

67

32

63

42

18

53

61

34

12

95

90

95

71

17

98

95

36

69

33

70

50

18

53

60

35

12

19

90

95

100

72

18

36

75

32

80

54

18

54

61

40

13

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, , , , , —, ,

a 16 2o

Tage

Abb. 16 Wachstum von Stamm Nr. 9 in Nährlösung 1 auf

verschiedenen Kohlehydraten: 1 = d ( + ) Glukose — 4 = d

(—) Fructose — 8 = Lactose — 9 = d ( + ) Cellobiose —

10 = d ( + ) Melibiose — 11 = d ( + ) Xylose — 12 = I ( + )Arabinose — 13 = Raffinose — 15 = d (—) Sorbit — (vgl.Tabelle 26)

geprüften Kohlehydrate nach ihrer Verwertbarkeit als

Kohlenstoff- und Energiequellen in sehr gut verwertbare

+ + +, massig bis gut ++, schlecht + und nicht ver¬

wertbare Verbindungen gruppiert wurden.

Allgemein erwiesen sich von den Hexosen Glukose,Mannose, Galactose und Fructose für alle untersuchten

Stämme als gute bis sehr gute Kohlenstoffquellen. Stamm

Nr. 1 greift Mannose, Stamm Nr. 7 Galactose, und Stamm

Nr. 20 Fructose schwächer an als die übrigen genanntenZucker. Sorbose wird einzig durch Stamm Nr. 7 schwach

assimiliert. Von den 5 Disacchariden Maltose, Cellobiose,Saccharose, Lactose und Melibiose werden die beiden erst¬

genannten bevorzugt und von jedem Stamm gut bis sehr

gut ausgenützt, während auf Saccharose einzig Stamm

(oo

| So

6«.

Abb. 17 Wachstum von Stamm Nr. 20 in Nährlösung 1 auf

verschiedenen Kohlehydraten: 1 = d ( + ) Glukose — 3 = d

(+) Galactose — 4 = d (—) Fructose — 5 = 1 (—) Sorbose— 7 = Saccharose — 8 = Lactose — 12 = I ( + ) Arabinose— 14 = I ( + ) Rhamnose — 17 = d {—) Dulcit — (vgl. Tab. 27)

Nr. 20 sehr schwach gedeiht. Die der Lactose entspre¬chenden Wachstumskurven der Stämme Nr. 1 (Abb. 14)und 9 (Abb. 16) sind charakterisiert durch einen sehr

steilen Anstieg im Verlaufe der ersten 2 Versuchstage,während nach dieser Zeit keine wesentliche Wachstums¬

zunahme festzustellen ist. Dies deutet darauf hin, dass das

verwendete Lactosepräparat Spuren von Substanzen ent¬

hält, die von den genannten Stämmen leicht vergoren

werden, während Lactose selbst nicht angegriffen wird.

Mel,ibiose wird von Stamm Nr. 7 massig bis gut, von den

Stämmen Nr. 9 und 20 schlecht und von Stamm Nr. 1 garnicht verwertet. Die beiden Pentosen Xylose und Ara¬

binose erwiesen sich allgemein nicht als gute Kohlenstoff¬

quellen. Auf Xylose zeigten die beiden Stämme Nr. 7 und

24

20 massiges, Stamm Nr. 9 geringes und Stamm Nr. 1 kein

Wachstum. Auf Arabinose vermochte Stamm Nr. 7 mas¬

sig bis gut, Stamm Nr. 20 schlecht zu gedeihen, während

die Entwicklung bei den Stämmen Nr. 1 und 9 vollständigausblieb. Das Trisaccharid Raffinose eignet sich für keinen

Stamm als Kohlenstoff- und Energiequelle. Die Methyl-pentose Rhamnose wurde von Stamm Nr. 20 massig an¬

gegriffen, nicht aber durch die übrigen Stämme. Die

Zuckeralkohole Sorbit, Mannit und Dulcit wurden allge¬mein nur schlecht oder gar nicht verwertet. Eine Aus¬

nahme machte Stamm Nr. 20, der auf Sorbit massiges und

auf Mannit sehr schwaches Wachstum zeigte.

Die erhaltenen Resultate stimmen im grossen und

ganzen mit den von Mees (28), Shimwell (42) und Peder-

son 32 angegebenen Daten überein. Die Disaccharide Sac¬

charose und Lactose werden bei einigen Autoren als gut,bei andern als schlecht vergärbar bezeichnet. In den vor¬

liegenden Untersuchungen haben die untersuchten Stämme

gegenüber diesen Zuckern verschiedenes Verhalten ge¬

zeigt. Völlige Uebereinstimmung mit den Resultaten der

genannten Autoren zeigte jedoch das Verhalten der unter¬

suchten Kokken gegenüber Glukose, Mannose, Galactose,

Fructose und Maltose, die allgemein als gut vergärbartaxiert werden. Die Pentosen Xylose und Arabinose er¬

wiesen sich als schlecht verwertbare Kohlehydrate.

Tabelle 28: Verwertbarkeit der verschiedenen Kohlehydrate

Kohlchydrat Nr. Stamm Stamm Stamm Stamm

Nr. 1 Nr. 7 Nr. 9 Nr 20

1. d ( + ) Glukose + + + + + + + + + .++ +

2. d ( + ) Mannose + + + + 1- + + + + + +

3. d (+) Galactose + + + ++ + + + + -I- +

4. d (—) Fructose + + + i 1 + + + - + +5. 1 (—J Sorbose — 4 --

6. Maltose + + f + + + + + + + + +7. Saccharose —

— + + +

8. Lactose — + + + — +9. d ( + ) Cellobiose + + + + + + + + + +

10. d( + ) Melibiose — + + i +

11. d( + ) Xylose — + + + + +12. 1 (+) Arabinose — + + — +13. Raffinose —

——

14. 1 ( + ) Rhamnose — — — + t

15. d (—) Sorbit — — + ++16. d (—) Mannit —

— — +17. d (—) Dulcit — - — —

+ + + = Verwertbarkeit sehr gutBei Stamm Nr. 1: Kohlehydrate, die am elften Tag 80%

bungszunahme überschritten.

Trü-

Bei den Stämmen Nr. 7 und 9: Kohlehydrate, die am siebten

Tag 70% Trübungszunahme überschütten.

Bei Stamm Nr. 20: Kohlehydrate, die am vierzehnten Tag 75%

Trübungszunahme überscKritten.

+ + = Verwertbarkeit massig bis gutBei Stamm Nr. 1: Kohlehydrate mit 74% resp. 75% Trübungs¬zunahme am siebten Tag.Bei den Stämmen Nr. 7 und 9: Kohlehydrate mit Trübungszu¬nahmen zwischen 45 und 70% am siebten Tag.Bei Stamm Nr. 20: Kohlehydrate mit Trübungszunahmen zwi¬

schen 51 und 75% am vierzehnten Tag.+ = Verwertbarkeit schlecht

Bei den Stämmen Nr. 7 und 9: Kohlehydrate mit Trübungszu¬nahmen von 20 bis 45% am siebten (Ausnahme Lactose bei

Stamm Nr. 9).Bei Stamm Nr. 20: Kohlehydrate mit Trübungszunahmen von

20 bis 51% am vierzehnten Tag.—

= nicht verwertbar

Bei Stamm Nr. 1 : Kohlehydrate mit Trübungszunahme unter

25% am elften Tag.Bei den Stämmen Nr. 7 und 9: Kohlehydrate mit Trübungszu¬nahmen unter 20% am siebten^ Tag (Ausnahme Lactose bei

Stamm Nr. 9).Bei Stamm Nr. 20: Kohlehydrate mit Trübungszunahmen unter

20% am vierzehnten Tag.

Z U SA MMENFA S S UNG

In der vorliegenden Arbeit wurden 16 aus Bier, Braue¬

reihefe, leeren Bierflaschen, Brauereibetriebswasser, Bier¬

würze und lindem Wein isolierte Kokkenstämme nach

morphologischen Gesichtspunkten beschrieben und auf

die Fähigkeit, sich in Bier zu entwickeln, geprüft.Die durch die Kokkenstämme verursachten Verände¬

rungen von Bier, die sich auf wasserdampfflüchtige und

ätherextrahierbare Säuren sowie auf Milchsäure und

Aethanol bezogen, wurden untersucht. Gärversuche mit

einer synthetischen Nährlösung geben einige Anhalts¬

punkte über die Bildung von Stoffwechselprodukten aus

Glukose. Wachstumsversuche in synthetischer Nährlösungunter Verwendung verschiedener Kohlehydrate gebenAufschluss über deren Verwertbarkeit als Kohlenstoff-

quellen. Die erhaltenen Ergebnisse lassen sich wie folgtzusammenfassen.

l.Die morphologischen Studien haben gezeigt, dass die

untersuchten Organismen in morphologischer Hinsicht,besonders in Grösse der Zellen und Bildung von Zell¬

verbänden, deutliche Unterschiede aufweisen. Ein Zu¬

sammenhang zwischen den genannten Merkmalen und

der Fähigkeit der Organismen, sich in Bier zu entwik-

keln, konnte nicht festgestellt werden. Von den 16 unter¬

suchten Stämmen konnten 6, nämlich die Stämme Nr. 1,

7, 9, 20, 31 und 60, in Bier zur Entwicklung gebrachtwerden.

2. Folgende durch Kokken verursachte Veränderungen des

Bieres wurden festgestellt.Bildung von:

Milchsäure allein,

Milchsäure bei gleichzeitigem Abbau von Aethanol,

sehr kleinen Mengen von Milchsäure und wasserdampf -

flüchtigen, nach Friedemann (15) oxydierbaren Säuren,

Abbau von Milchsäure bei gleichzeitiger Bildung von

wasserdampfflüchtigen, nach Friedemann (15) oxydier¬baren Säuren.

3. In einer synthetischen Nährlösung, die als Kohlenstoff¬

quelle Glukose, als Stickstoffquelle Ammoniumsulfat,ferner sekundäres Kaliumphosphat und Magnesiumsulfatenthielt, vermochten von den 6 Stämmen, die sich in

Bier entwickeln konnten, nur 4, nämlich Nr. 1, 7, 9 und

20, zu wachsen. Als Abbauprodukte bei der Vergärungvon Glukose im genannten synthetischen Substrat wur¬

den Milchsäure, Aethanol und Essigsäure ermittelt. Die

4 untersuchten Stämme zeigten teilweise verschiedenes

Verhalten. Bei zwei Stämmen, Nr. 9 und 20, betrug die

25

Summe der Kohlenstoffanteile der ermittelten Endpro¬dukte Milchsaure, Aethanol und Essigsaure nahezu 100

Prozent des Kohlenstoffes, der der vergorenen Glukose¬

menge entspricht Bei Stamm Nr 1 blieb die Bildungvon Aethanol aus In der Kohlenstoffbilanz fehlten im

Durchschnitt rund 30 Prozent des verbrauchten Kohlen¬

stoffes Stamm Nr 7 bildete weder Aethanol noch Milch-

saure Die gefundene Menge Essigsaure entsprach im

Durchschnitt nur rund 50 Prozent der Kohlenstoff¬

menge, die der vergorenen Glukose entspricht Der Zu¬

satz von Caseinhydrolysat und Hefewasser zum ge¬nannten synthetischen Substrat bewirkte bei Stamm

Nr 1 keine Erhöhung der Milchsaurebildung

4 In einem Versuche mit der erwähnten synthetischenNährlösung, die aber anstelle von Glukose Maltose als

Kohlenstoffquelle und ferner eine bekannte Menge von

1 Aebi, H ' Diss Eidg Techn Hochschule, Zurich 1951

2 Balke, J Wschr Brauerei, 1, 181, 257 (1884)3 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 6th Ed

,

Baltimore 1948

4 Bernhauer, K Garungschemisches Praktikum, Berlin 1939

S 34

5 Bertrand, G und Thomas, P Guide pour les manipulationsde chimie biologie, Paris 1910, S 309

6 Brown, H T und Morris, G H Zeitschr ges Brauwesen,18,215 (1895)

7 Clausen, M Schweiz Brauerei Rdsch, 64, 68 (1953)

8 Claussen, N H Zeitschr ges Brauwesen, 27, 38 (1904)9 Claussen, N H Zeitschr ges Brauwesen, 27, 117 (1904)

10 Claussen, N H Zeitschr ges Brauwesen, 27 137(1904)11 De Moos R D

, Bard, R C und Gunsalus, J C J Bact

62 499(1951)12 Elsden, S R The Enzymes (hrsg von Summer und Myr-

back), Vol II, 2 791 (1952)13 Felton, E A, Evans, J B und Niven C F J Bact 6 5

481 (1953)14 Fiechter, A Diss Eidg Techn Hochschule, Zurich 1955

15 FRiEDrMANN T E J Biol Chem 12S 161 (1938)16 Friedemann,! E, Cotonio M und Shaffer P A J Biol

Chem 73 335 (1927)17 Gunsalus J C und Gibbs M J Biol Chem 191 871

(1952)18 Hansen, E C Comp rend Trav Lab Carlsb 1 185 234

288 (1879)cit bei Windisch S Brauwiss

,1950 147

19 Heller, H Biologische Brauereibetnebskontrolle, München

1931, S 119

20 Henneblrg, W H Handbuch der Garungsbaktenologie,Berlin 1926

21 Jensen, E M und Seeley, H W J Bact, 67 484 (1951)22 Jensen, 0 The Lactic Acid Bacteria, Kopenhagen 1919

23 Krebs, H A Biochem J SI 661 (1937)24 Lindner P Wschr Brauerei 9 789(1886)

Aethanol enthielt, vermochten die Stamme Ni 7 und 9

Aethanol deutlich abzubauen

5 Die Wachstumsversuche mit den Stammen Nr 1, 7, 9

und 20, bei denen die Verwertbarkeit verschiedener

Kohlehydrate untersucht wurde, ergaben, dass die

Hexosen Glukose, Mannose, Galactose und Fructose

sowie die Disacchande Maltose und Gellobiose von allen

Stammen gut verwertet wurden Auf Saccharose und

Lactose Konnte nur vereinzelt gutes Wachstum festge¬stellt werden Die Pentosen Xylose und Arabinose er¬

wiesen sich allgemein nicht als gute KohlenstoffquellenAuf der Methylpentose, Rhamnose sowie auf dem

Zuckeralkohol Sorbit vermochte sich nur ein Stamm

massig zu entwickeln Sorbose, Raffinose, Mannit und

Dulcit wurden im allgemeinen nur sehr schwach oder

gar nicht angegriffen

25 Lindner, P Zbl Bakt, 4 427 (1888)26 Lindner, P Wschr Brauerei, 4 437 (1887)27 Lindner, P Wschr Brauerei, 6 181 (1889)28 Mees, R H Diss Techn Hochschule, Delft 1934

29 Meyerhof, O Wallerstein Lab Commun,12, 255 (1949)

30 Nelson, M E und Werkman, C H J Bact 30, 547 (1935)31 Pasteur L Oeuvres de Pasteur, 5, 11, (1876)32 Pederson, C S

,Albury, N M und Breed, R S Waller

stein Lab Commun 17 7 (1954)33 Racker, E Advances m Enzymology, 15, 141 (1954)34 Reichard, A Zeitschr ges Brauwesen, 17, 141 (1894)35 Reichard A und Riehl A Zeitschr ges Brauwesen 18

59 (1895)36 Reichard, A Zeitschr ges Brauwesen, 24 301 (1901)37 Schonefeld, F Wschr Brauerei, 15, 321 (1898)38 Schonefeld, F Wschr Brauerei 16 681 (1899)39 Schonefeld, F Wschr Brauerei, 2/, 520 (1904)40 Schimwell, J L und Kirkpatrick, W F J Inst Brewing

45 137 (1939), ref m Wallerstein Lab Commun 2 73

(1939)41 Shimwell, J L Am Brewer So 27 (1947), SO 57 (1947)42 Shimwfll J L J Inst Brewing 54, 100 (1948)43 Shimwell J L Wallerstein Lab Commun 12 71 (1949)44 Shimwell J L J Inst Brewing "A 287(1948)45 Sollied, P R Centr f Bakt II // 708 (1903)46 Stahly, G L Osburn O L und Wfrkman C H Analyst

>9 319 (1934)47 Stilfs H R Peterson W H und Fred E B J Bact 12

427 (1926)48 Strese S und Windisch, S Die Brauerei, wissenschaftl

Big 9, 141, 151 (1955)49 WiBRiAL, R Wschr f Brauerei 24 193(1907)50 Wiken, T

,Richard O und Aebi, H Expenentia 6 114

(1950)51 Wiken T Watt, D , White, A G C und Werkman, C H

Arch Biochem 14 478 (1947)52 WiuiAMS^und Mitarb Umv Texas Publ Nr 4137, 1941

LI 1 ERA 7 UR VERZEICHNIS

26

CURRICULUM VITAE

Martin Clausen von Ernen/VS, geboren am 17. Dezember 1925

Nach Besuch der Primär- und Sekundär- sowie der Kant. Landwirtschaftlichen Schule

in Visp/VS trat ich in das Kantonale Lehrerseminar von Schwyz in Rickenbach bei

Schwyz ein, wo ich im Frühjahr 1945,das Primarlehrerpatent erwarb. Im Herbst des¬

selben Jahres begann ich an der Abteilung für Landwirtschalt der Eidg. Techn.

Hochschule als Fachhörer meine Studien, die ich im Frühjahr 1946, nach bestandener

Aufnahmeprüfung, als Studierender fortsetzte und im Herbst 1950 mit dem Diplomals Jng.-Agr. (Spezialrichtun'g für Agrotechnologie) abschloss. Die hierzu vorgeschrie¬bene Praxis absolvierte ich in der Brasserie Valaisanne SA, Sion. Vom Herbst 1950

bis Herbst 1952 arbeitete ich als Biologe an der Versuchsstation Schweiz. Brauereien

in Zürich. Seither versehe ich die Stelle eines Betriebskontrolleurs in der Brauerei

Salmenbräu AG und der Vitaminhefe AG in Rheinfelden. Die Promotionsarbeit wurde

in den Laboratorien der Versuchsstation der Schweiz. Brauereien, Zürich, und der

Brauerei Salmenbräu AG, Rheinfelden, unter der Leitung von Herrn Prof. T. Wikén

durchgeführt.