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Doctoral Thesis

Structural variations of epibatidine led to new ligands forstudying the neuronal nAChRs via positron emission tomographyand electrophysiology

Author(s): Spang, Jörg Ernst

Publication Date: 1999

Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-003824524

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Diss. ETHNo.: 13286

StructuralVariations of EpibatidineLed to NewLigands for Studying the NeuronalnAChRsvia

Positron Emission TomographyandElectrophysiology

A thesis submitted to theSwiss Federal Instituteof TechnologyZürich

for the degreeofDoctor ofNatural Sciences

presented by

Jörg Ernst SpangDipl. Chem. UniversitätFreiburg i. Br.

born April 4*, 1968Citizen of Germany

accepted on the recommendationof

Prof. Dr. G. Folkers,examinerProf. Dr. P. A. Schubiger, co-examiner

1999

V

ZusammenfassungDie vorliegende Dissertation beschreibt in vivo und in vitro Studien an den neuronalen.

nikotineigenAcethylcholin Rezeptoren (neuronalenAChR)mit Hilfe von Liganden, die

von der Struktur des Alkaloids Epibatidin abgeleitet wurden (EPB, exo-2-(2-chloro-5-

pyridyl)-7-azabicyclo[2.2.1]heptane).Die vorgenommenenVeränderungenan dem Pyridinring von EPB führten zu exo-2-(3-Pyridyl)-7-azabicyclo[2.2.1]heptan (DC1EPB). ßvo-2-(2-Pyridyl)-7-azabicyclo[2.2.1]-heptan (2PABH), evo-2-(4-Pyridyl.)-7-azabicyclo[2.2.1]heptan (4PABH) sowie exo-2-

Phenyl-7-azabicyclo-[2.2.1]heptan(PABH). Eine Modifikation der Bicyclo-Einhe.it von

EPB ergab exo-6-(2-ChIoro-5-pyridyl)-8-azabicyclo[3.2.1]octan(HEPB). Alle

Verbindungen, mit Ausnahme von PABH und 4PABH, wurden mittels duraler

Hochleistungs-flüssigkeitschromatographie(HPLC) in ihre Enantiomereaufgetrennt. In

Hinblick auf in vivo Studien - speziell Experimente mittels Positronen Emissions

Tomografie (PET) - wurden die VerbindungenEPB, DC1EPB, 2PABHund HEPB mit

Kohlenstoff-11markiert. Durch selektive Methylierung mitttels [uC]Methyliodid an der

7-aza beziehungsweise 8-aza Position wurde das [' JC]Nuklid in die Struktur eingeführt.In Maus, Ratte und Schwein zeigten die intravenös injizierten N-[HC]Methyl-EPBEnatiomereeine ausgeprägte Enantioselektivität. So demonstrierteeine Bioverteilung,dass das (-)-Isomer sehr viel stärker im Gehirn von Mäusen akkumulierte als das ('+)-Isomer. Ein ähnlich unterschiedliches Verhalten konnte in PET Studien mit Ratten

festgestellt werden. In dem Zielorgan, dem Gehirn, wurden keine Metaboliten des

Radioliganden nachgewiesen. Eine an einem Schwein durchgeführtePET Studie zeigte,dass die regionale Verteilungvon N-[1JC]Methyl-(-)-EPB (hohe spezifische Aufnahmein Thalamus und Cortex) die Verteilung der zentralen nAChRs im Säugetiergehirnwiderspiegelte. ledoch war aufgrund der hohen Toxizität, die N-Methylepibatidin in

Maus und Ratte (LD50: circa 5 ug/kg) zeigte, für einen weiteren klinischen Nutzen ein

weniger toxischer Ligand zu suchen.

Zu diesem Zwecke wurden die Kohlenstoff-11 methylierten Derivate von DC1EPB,HEPB sowie 2PABH in vivo getestet. PET Untersuchungenmit Ratten wiesen die

besten Resultate für N-[HC]Methyl-(-)-DClEPBund N-[l,C]Methyl-(-)-HEPB auf. Sie

VI Zusammenfassung

zeigten ähnlichhohe Aufnahmenim Gehirn wie N-[nC]Methyl-(-)-EPB. Da von HEPB

eine weit geringereToxizität (LD50: circa 1 mg/kg) als von EPB bekannt war, wurde mit

N-[uClMethyl-HEPBeine PET Studiemit einem Schwein durchgeführt. Hierbei wurde

zur Beschreibung der in vivo Bindung eine tracer-kinctisches Modell von beiden N-

luC]Methyl-HEPBEnantiomerenberechnet. N-[11C]Methyl-(-)-HEPB erwies sich als

überaus geeigneter Radioligand zur Visualisierung und Quantifizierungder nAChR

mittels PET. Allerdings zeigte Methyl-HEPBimmer noch eine sehr hohe Toxizität, sodass der geringe Sicherheitsbereich eine klinische Anwendungeinschränkte.

Zur Untersuchungder Struktur-Wirkung Beziehungzwischen EPB und den neuronalen

nAChRs wurden EPB und verschiedene seiner Analoga und Derivate an nAChR-

Sübtypen elektrophysiologisch getestet. Unter den heute bekannten Agonistenrepräsentierten die beiden EPB Enantiomeredie stärksten Agonisten für die cx4ß2-,a3ß4- und mit die stärksten für die c.7-nAChR-Subtypen.Die Einführung einer

Methylgruppe an der 7-aza Position (N-Methyl-EPB) reduzierte die Aktivität des (+)-Enantiomers und erzeugte somit eine ausgeprägte Enantioselektivität. Ebenfalls

erzeugte die Erweiterung des Azabicyclo-Einheit(HEPB) sehr starke enantioselektive

Effekte; die Aktiviät des (-)-Enantiomerswurde drastisch reduziert. Die Eliminierungdes Chloratoms(DC1EPB)verringerte die Aktivität von beiden Isomerenhauptsächlichgegenüber den «4ß2- und a3ß4-Subtypen. Eine veränderte Position des

Pyridinstickstoffs (2PABH) resultierte in einem vollkommen veränderten

elektrophysiologischenProfil, welches sich durch eine starke Stereospezifität an dem

a7-Rezeptorauszeichnete; das (+)-Isomer verhält sich wie ein Antagonist und das (-)-Isomer wie ein Agonist. Die Entfernung des Pyrdinstickstoffs (PABH) resultierte in

einer selektiven Aktivierung der a3ß4-Rezeptorensowie in dem Verlust der Aktivität

gegenüber den a4ß2- und a7-Subtypen. Die para Position des Stickstoffs (4PABH)zeigte im Vergleich zu PABH keinen Einfluss auf das elektrophysiologischenVerhalten. Zusammenfassend beschreibt dieser elektrophysiologischeDatensatz die

Ligandbindungsstelle von verschiedenen nAChRs-Subtypen in unterschiedlichen

Rezeptorkonformationen.

VII

SummaryThe present thesis describes how the neuronal nicotinic acethylcholine receptors(neuronal nAChRs) were investigated in vivo and in vivo by fhe use of a variety of

Compounds which were strueturally derived from the alkaloid and 11ACI1R ligandepibatidine (EPB, exo-2-(2-cliloro-5-pyridyl)-7-azabicyclo[2.2.1]heptane).Variations about the pyridine ring of EPB led to exo-2-(3-pyridyl)-7-azabicyclo-[2.2.1]heptane (DC1EPB), exö-2-(2-pyridyl)-7-azabicyclo[2.2.1]hepfane (2PABH), exo-

2-(4-pyridyl)-7-azabicyclo[2.2.1]heptane (4PABH) and cwo-2-phenyl-7-azabicyclo-[2.2.1]heptane (PABH). Modification of bicyclo-moietyresulted in _xo-6-(2-chloro-5-pyridyl)-8-azabicyclo[3.2.1]octane. Except PABH and 4PABH all Compounds were

separated into their enantiomers via chiral high Performance liquid chromatography(HPLC). For in vivo studies and further investigations with position emission

tomography (PET) EPB, DC1EPB, 2PABH and HEPB were radiolabelled with carbon-

11. The [uC]nuclide was introduced by selective methyiation of the 7-aza or 8-aza

position using [''Clmethyliodide.The intravenouslyapplied N-[nC]methyl-EPB enantiomers displayed in mice, rat and

pig strong enantioselective effects. A biodistribution performed in mice showed a very

strong brain uptake of the (-)-isomer whereas the uptake of the (+)-enantiomer wasmarkedlyless. Similarresults were also observed in PET studies with rats. A metabolite

analysis (performed in mice) unveiled polar metabolites however not penetrating the

target organ, the brain. A PET scan of a pig brain showed an uptake of N-[HC]methyl -

(-)-EPB in the thalamus. This regional radioligand distribution reflected the

concentrationdensity of the central nAChRs in a mammalianbrain. However, the hightoxicity found for N-methyl-EPB (LD50: circa 5 ug/kg in mice and rats) limited a further

clinical use and a less toxic nAChRradioligand was highly preferable.Therefore carbon-11 methylated derivatives of DCLEPB,HEPB and 2PABH were tested

in vivo. Rat PET scans displayedhigh brain uptake for N-[11C]methyl-(-)-DCl.EPB andN-["C]methyl-(-)-HEPB similar to that of N-[liC]methyl-(-)-EPB. As HEPB was

reported to be dramaticallyless toxic (LD50 about 1 mg/kg) as EPB, a pig PET studywas performedwith its methylated derivative. To describe the in vivo bindine of the

VIII Summary

radioligands quantitative kinetic modelling was performed for both enantiomers. N-

[nC]methyl-(-)-HEPBrevealed a high and specific uptake in the thalamus and cortex.

The results demonstrated the feasibility of imagingand quantifying nAChR in vivo with

N-[!lClmethyl-(-)-HEPB. Toxicity studies with methyl-HEPB displayed still a strongtoxicity, thus the relativelysmall safety marginlimited fürtheruse in humans.

To investigate the structure funetion relationship between EPB and the neuronal

nAChRs, clectrophysiological studies with EPB and some of its analogues were

performed at differentnAChR Subtypes. Both enantiomers of EPB were the strängest

agonists for a4ß2- and a3ß4- and one of the strengest for the a7-nAChR-subtypesknown to day. The introduction of a methyl group at the 7-aza position (N-methyl-EPB)reduced the activity of the (+)-enantiomerand thus induced a strong enantioselectivity.Similar effects were caused by the enlargement of the azabicyclo moiety, however in

this case the activity of the (-)-enantiomer was dramatically reduced. Removing the

chlorine atom caused a none enantioselective loss in activity of DC1.EPB which is

mainly exhibited at the «4ß2- and oc3ß4-subtypes. The changed pyridine nitrogenposition in 2PABH produced a totally changed electrophysiological profilecharacterised by a strong stereospeeifity at the oc7-receptor; the (+)-isomer is an

antagonist and the (-)-isomer an agonist.The removal of the pyridinenitrogen effected a

selective activation of the a3ß4 receptors and a total loss of activity towards the a4ß2and a7 Subtypes. As 4PABH displayed an electrophysiological profile analogous to

PABH the nitrogen at the para position did not influence the agonism. Taken togetherthis electrophysiological data set described the ligand binding pockets of different

neuronal nAChRSubtypes in differentconformationalstates.