Dr.a. Juliana Lopes AlmeidaMédica veterinária

Mestrado em ciências agrárias, reprodução equina (Universidade de Brasília - UNB)Doutorado em patologia comparativa, reprodução equina (University of California, Davis, EUA, UCDAVIS)

Pós doutorado em Biotecnologia da reprodução (Universidade de Fortaleza, UNIFOR)Diretora do Hospital Veterinário Metropolitano - HVM

Biotecnologia da reprodução compreende todas as técnicas utilizadas como ferramentas para aumentar a eficiência reprodutiva dos animais.

Viabilidade da criação de cavalos = sucesso na reprodução

Indústria do cavalo -movimenta cerca de R$ 7,5 bilhões anuais

3,2 milhões de empregos diretos e indiretos

Investimento no melhoramento genético

Caracterização da Reprodução da égua: Poliéstricas estacionais:▪ Foto-período dependentes;▪ Duração variável (Hafez, 1995, Romano et al. 1998);

Puberdade - 12 a 18 meses; Maturidade sexual - 24 meses:▪ Variabilidades (McKinnon, 1993);

Melatonina:▪ ↑ foto-período = ↓ melatonina;▪ Manejo visando a atividade ovariana (Hafez, 1995);

HIPOTÁLAMO

HIPÓFISE

OVÁRIO

ÚTERO(Placenta)

GNRH +

LH/FSH +

ESTRÓGENOFSH - / LH +

INIBINAFSH -

PGF2 alfa

PINEAL

AUMENTO

MELATONINA -

PMSGProgesterona Estrógeno

Gestação 315 360 dias; Reconhecimento materno:▪ Previne regressão do CL (Stanbenfeld & Edqvist, 1996);

Fixação Embrionária:▪ 16o dia pós ovulação;▪ Cálices endometriais a partir de 35 dias:▪ Gonadotropina Coriônica Eqüina ou PMSG: Função:

Corpos Lúteos Acessórios;▪ Função;▪ Geralmente são formados 3 a 5 por ovário;▪ Formados pela ação da PMSG;▪ Persistem até 180 dias;

Hormônio Ação Indicação Produtos Dosagem ObservaçãoGNRH Ovulação - Indireta Indução de Ovulação em

36 horasDeslorelina

1,0 mg IV ou 1,5 mg IM

Folículo maior ou igual a 35 mm e edema de útero

Luteinização de CL

Ocitocina contratilidade uterina - miométrio

Limpeza do útero Ocitocina 10UI/ml

20UI Im ou IV Pré sensibilizado por estrógenos

Retenção de placenta Expulsão da placenta e lóquios

20UI Im ou IV

Indução de parto Parto 40 a 100 UI IM

Estrógenos - Benzoato ou cioponato de estradiol

Indução de cio coleta de sêmen ou cio silencioso

ECP, Sincrodiol, Gonadiol, estrogin

1 a 5 mg Verficar ausência de CL e Progesterona

Relaxamento de cérvice ou cio sem edema uterino

Presença de folículos mas sem edema uterino ou aberuta de cérvice

Indução de edema Indução de edema em éguas em anestro

10 a 15 mg divididos em 3 dias ou dose única

Protocolo de anestro uso com Progesterona

Progesterona Preparo do útero para receber o embrião

Éguas em anestro Progesterona 300 mg IM semanal, Altrenogest

1500 mg Protocolo de anestro uso com Progesterona

Complemento de progesterona endógena

Éguas gestantes com sinais de pouca progesterona endógena ou receptoras para receber embrião

Sinais de edema, Cl hipoecogênico, útero flácido

Supressão de cio Éguas em prova

Hormônio Ação Indicação Produtos Dosagem ObservaçãohCG Ovulação - direta Indução de ovulação em

36 horasVetecor, chorulon

1500UI

Luterinização de CL

Prostaglandina F 2 alfa

Regressão de Cl Indução de cio Lutalyse, Sincrocio, Preloban, Sincrosin

dinoprost 7,5 mg

5 dias após ovulação

Sincronização receptoras intervalo de 0 a 2 diasCL persistenteAborto ou Absorção Até 60 dias de gestaçãoIndução de parto

EPE Gonadotropina Superovulação EPE 8 mg IM BID Trata um ciclo pós PGF por 6 dias

Anestro persistenteOvulação - direta Indução de Ovulação em

36 horas6 mg IV

Entende-se por inseminação artificial o depósito mecânico de sêmen no aparelho reprodutivo da fêmea

Vantagens da utilização de um programa de I.A. na espécie equina.

Melhor aproveitamento do Garanhão

Evita doenças transmissíveis através da cobertura

Evita ferimentos durante a cobertura do garanhão e da égua

Manipulação de glândulas acessórias; Farmacológica; Vagina artificial;

Deletérios: centrifugação rápida, mudanças de temperatura; luz; químicos; água

Volume de 020 a 100 mL

Aparência: leitosa, cremosa, opalescente ou aquosa

Cor: branco opalescente a leitoso

Odor: “sui-generis”

Motilidade: proporção de sptz móveis em umaamostra de semen

Vigor: velocidade do movimento de sptz com motilidade progressiva (0-5)

Concentração espermática;

Patologia espermática;

Fresco,

Refrigerado,

Congelado.

Porque é desejável refrigerar o sêmen?

o metabolismo do sptz a temperatura corporal e ambiente é máximo.

produtos do catabolismo do sptz (ác. lático e/ou CO2) aumentam a acidez do meio causando danos as células espermáticas.

peroxidação das membranas lipídicas causam danos as células espermáticas.

Limitações

Choque térmico: alterações no espermatozóidesquando eles são rapidamente resfriados da temperatura corporal até próximo a 0°C

Choque osmótico

SPTZ para cada 15° C de redução, o metabolismo é reduzido em 45%.

SPTZ armazenados a 5°C: requerimentos metabólicos serão apenas de 10%

Faixa crítica = 19 a 8°C

SPTZ são insensíveis a velocidade de resfriamento até atingir 19°C

A partir de 19ºC; veloc. 0,05°C/min.

Diluição 1:1 –Utilização 24-48 h

Diluidor mais utilizado: diluidor de Kenney (1975) Glicose -49g Leite desnatado -24g Bicarbonato de sódio a 10% -7,5ml Gentamicina -200mg Água bidestilada -1000ml

Doses inseminates: 109, 10 a 30 mL

Refrigeração computadorizada

Unidades de refrigeração e conservação (contêiner):

Equitainer I, II e III

ExpectaFoal

Equine Express

Salsbro Box (contêiner sueco)

Celle container (container alemão)

Botutainer, Botubox (containers brasileiros)

Grande vantagem de conservação de sêmen por tempo indeterminado

Forma de seguro reprodutivo do animal

Causa graves lesões ao espermatozóide

Apenas 24% dos garanhões apresentam boas taxas de concepção

Não existe um protocolo ideal

Diluidores

Tampão, antibióticos, gema ou leite, açucares e crioprotetor

Avanços na composição dos diluidores

▪ Açucares: lactose, rafinose e trealose

▪ AA: glicina

Lipoproteínas de baixa densidade da gema, lecitina de soja

Redução do glicerol em combinação com as amidas nos meios comerciais

A centrifugação amortecida: Composto iodado não iônico, chamado = iodixanol, é utilizado como

gradiente de densidade ou como amortecedor na centrifugação do sêmen.

Ausência de lesões causadas pelo processo de centrifugação.

Centrifugação com solução de partículas de sílica silanizada

Utilização de um filtro específico feito de membrana hidrofílica sintética

Onde congelar

Pallhetas de 0,5 mL

Palhetas de 0,25 mL

Macrotubos

Máquinas para congelamento-TK3000® -TK

Máquina Sousa (Patente) -tecnologia em congelação

Descongelamento

Rápido x lento ?

▪ 37º C / 30 seg.

▪ 46ºC / 20 seg.

▪ 75°C / 7 seg.

▪ 98ºC/ 4 seg.

Preparo para I.A.

24 hs antes da ovulação

Folículo pré-ovulatório (35 mm ou maior)

Uso de 2500 a 3300 UI de hCG

Ovulação em 24-48 h

Dose ideal: 500 milhões de espermatozóidesviáveis.

Pipetas flexíveis.

800 x 106 até 6 horas depois da indução de ovulação

400 x 106 24h e 48h após ovulação

Inseminação histeroscópica

o sêmen depositado próximo ao oviduto, sobre a junção útero-tubárica (papila), através de um aparelho de endoscopia via lumen uterino

Fibroendoscópio

Redução da quantidade de espermatozóides: 5 a 40 x 106

Deposição ipsilateral da ovulação

Sêmen sexado

Definição: recuperação de embrião de umadoadora e transferência para uma receptora;

Éguas em competição; Éguas novas (2 anos); Éguas com méritos genéticos; Vários potros ou éguas; Éguas com problemas reprodutivos; Éguas com problemas não-reprodutivos; Pesquisa Espécies em extinção

Éguas jovens, reprodutivamente saudáveis 3-10 anos de idade, 1-2 potros Ciclo estral normal, livre de fluido uterino Qualidade do endométrio

Boa mãe Tamanho da égua capacidade lactante bom temperamento

Três tipos de receptoras: Éguas intactas (mais comum) Ovariectomizadas, éguas tratadas com progesterona Não cíclicas, éguas tratadas com progesterona

ovulação da doadora

ovulação da receptora

Quando: D6: vitrificação, criopreservação, bissecção; D7-8: maioria das lavagens; D9: maior índice de recuperação, embrião

facilmente degenerado;

Dia 6 58%

Dia 7 61%

Dia 8 65%

Dia 9 71%

70% éguas jovens, éguas férteis, sêmenfresco;

30-50% éguas velhas, sêmen congelado

Contenção;

Cateter inserido na sonda e preenchido com ar (selamento de os interno);

Lavagem (1 a 2 L por égua);

Fluido passado por filtro de 75μm;

Repetir 2 a 3 vezes.

Volume de efluente: >90% recuperação Ocitocina Massagem transretal

Qualidade do efluente Turvo: endometrite Hemorrágico: massagem muito vigorosa e

manipulação de cateter

Égua: Idade > 14 anos: redução RE Patologia de oviduto, útero Morte embrionária precoce

Número de ovulações ovulações múltiplas

Histórico reprodutivo Aborto, Morte embrionária precoce, subfertilidade

Garanhão:

Qualidade do sêmen;

Tipo de sêmen (fresco, resfriado, congelado);

Momento da inseminação.

Manejo

Exercício: reduzida taxa de recuperação embrionária

Dia da tentativa de recuperação ▪ embrião entra no útero D 5.5-6 ▪ As taxas de recuperação D6 menor ▪ Falha de entrar no útero

Procura: Lupa (7 a 15 x magn); Embriões maiores visíveis a

olho nu;

manipulação:

Lavagem: Passagem por 3 gotas de

solução de manutenção

Avaliação: Tamanho Qualidade Estágio de desenvolvimento

(mórula, blastocisto inicial, blastocisto expandido)

Maior índice de recuperados( grau 1 e 2)

grau categoria aparência caracteristicas

1 excelente esférico embrião ideal, célulasuniformes, cor e

textura uniforme

2 bom Imperfeiçõespequenas

Poucos blastômerosextrusados, forma

irregular, separação de trofoblasto

3 razoável Problemas visíveis Blastômerosextrusados, células

degeneradas, blastocele degenerada

4 ruim Problemas severos, irregular

Blastocele colapsada, muitos balstômerosextrusados, célulasdegeneradas, com

massa celular

Cirúrgica: Linha ventral; Laparotomia de flanco;

Não cirúrgica: Transcervical Espéculo Pipeta de inseminação Bainha e inovulador

Injeção intra-uterina guiadapor ultra-som

Historicamente, técnicacirúrgica resultava em maioresíndices 70-75% (Squires et al.) >90% (Wilsher et al.)

Recentemente, semelhantes ou melhores resultados com técnica nao-cirúrgica 81% (Losinno et al.) 85% (Wilsher et al.)

Embrião Idade das doadoras Qualidade Maturidade

Receptoras Tônus do utero e cervix antes da transferência Idade da receptora

Manejo técnicas de transferência sincronização

Vantagens: Sem necessidade de manejo de receptoras Transporte a longas distâncias criopreservação de embriões

Meios Ham’s F-10 Vitrocell Botuembryo

Dispositivo de refrigeração passiva para armazenar embriões em 5° C por até 24 horas;

Taxas de prenhez similares a embriões 'frescos’;

Não houve diferenças significativas em viabilidade entre embriões D7 e D8

Maiores embriões D7 mais resistentes do que o menores embriões D7

Porque? Preservar material genético Importação/exportação Receptoras não disponíveis Armazenamento até a doadora

provar seu valor em competicões

Como? técnicas convencionais de

congelamento índices de gestação: 50-60% embriões < 250 μm

vitrificação criopreservação

Altas conc de crioprotetores Baixa conc de crioprotetores

< 15 min para terminar 1.5 horas para completar

Sem material especial Material especial

Descongelamento: transferência direta Descongelamento: diluição antes de transferência

< 300 μm < 250 - 300 μm

índices de gestação: 60% índices de gestação: 50 - 60%

Razões para o fracasso da superovulação: Anatomia do ovário Insensibilidade do receptor de FSH

equino Indisponibilidade de produtos

confiáves que induzam múltipla ovulações;

Benefícios: Aumentar a eficiência TRA Aumento a progênie Avanço da primeira ovulação

eCG, GnRH, pFSH, Hormônio de crescimento Não eficiente

Imunização contra inibina Efeitos colaterais

EPE (extrato de pituitaria equina) índices de ovulação (2-4 ovulações por ciclo) recuperação embrionária: 2 (50%)

eFSH semelhante a EPE

ReFSH

eFSH (BID) quando o maior folículo for 20-23 mm

PGF2α segundo dia Parar quando folículo atingir 33-35 mm Aguardar 24-36 hrs hCG Inseminação

Indicações:

Fêmeas acometidas por afecções ovarianas, uterinas e cervicais;

Éguas que não apresentam bons resultados na Monta Natural (MN), Inseminação Artificial (IA) e/ou Transferência de Embriões (TE), sem causa definida ; ou

Animais com anormalidades adquiridas durante a vida reprodutiva: oclusões de oviduto, Infecções uterinas e lacerações cervicais

Coleta de ovócito: Éguas eutanaziadas Aspiração transvaginal

• Aspiração e lavagem dos folículos via transvaginal, guiada por ultrassonografia (TVA)

• Punções pelo flanco

• Laparotomia com exposição dos ovários e aspiração dos folículos

Ovocito maduro em estágio de Metafase-II

Unidade de reprodução assistida Hospital Quiron de Barcelona

Revista Brasileira de Ginecologia e ObstetríciaOn-line version ISSN 1806-9339Rev. Bras. Ginecol. Obstet. vol.30 no.7 Rio de Janeiro July 2008

GIFT clássica caracteriza-se pela deposição de ovócitos maduros e espermatozóidescapacitados diretamente no oviduto

Índices de coleta: 70-80% (24 h após hCG ouGnRH)

Transferência imediata

MIV por 12 h a 16 h

Transferência cirúrgica de ovócito de doadora ao oviduto de receptoras Receptoras inseminadas normalmente Sptz colocado no oviduto no mesmo

momento do ovócito

índices de gestação: 32-40% (éguasvelhas)

índices de gestação: 20-92% (éguasjovens)

A qualidade e o tipo de conservação do sêmen interferem nos resultados,

Pouco sucesso

2 embriões produzidos de FIV (ambos os casos os ovócitos foram coletados de folículos pré-ovulatórios conseqüentemente maturados in vivo)

Maiores obstáculos: a capacitação in vitro e pouco conhecimento sobre sistema de maturação e cultivo embrionário in vitro

Efluxo de cholesterol não foi obtido!!!

Tx prenhez de 60% (Choi et al., 2002)

Ovócitos são obtidos, maturados, desnudos e em seguida aqueles com o primeiro corpúsculo polar aparente são utilizados

Amostra de sêmen fresco ou descongelado é lavada e colocada em meio com polivinilpirrolidona.

A cauda do espermatozóide é seccionada e a cabeça injetada dentro do oócito, sendo este ativado ou não quimicamente e cultivado in vitro ou transferido para o oviduto de uma receptora (Squires et al., 1996)

Precisa capacitação espermática

Qualidade do sêmen é insuficiente

Garanhões subférteis

Requer um oócito maduro

Cultivo in vitro de embriões (para o estágio de blastocisto)

No Brasil, a empresa In Vitro Clonagem, por meio da Dra. Perla Fleury, noticiou o primeiro nascimento de um equino (fêmea) por esta técnica no ano de 2012. Os ovócitos foram obtidos do ovário de uma égua quarto de milha, após sua morte

Porque? Um sexo mais desejado Expansão genética mais rápida Superovulação ICSI

Como? índices de separação 40% (20%

de em X e 20% emY) Sucesso:80-90%

O primeiro potro produzido a partir de sêmen sexado originou-se da inseminação cirúrgica diretamente no oviduto de 150.000 espermatozoides (LINDSEY et al., 2001).

60 a 70 dias (tubérculo genital)

110 a 120 dias (gônadas)

PCR (polimerase chain reaction)

Inicialmente, foram encontradas grandes dificuldades no desenvolvimento da técnica de transferência nuclear tanto na taxa de fusão entre oócitos e células dos doadores, quanto na taxa de clivagem, que eram menores que 15% (Hinrichs, 2006)

0.7% a 2.7% de embriões reconstruídos resultam em nascimento

A partir de 2006 houve o nascimento de vários potros clonados.

A empresa líder mundial na produção de clones equinos é a ViaGen, com sede no estado do Texas, e com um laboratório em Alberta, no Canadá.

No Brasil, os primeiros clones equinos nasceram em 2012, e são da raça Mangalarga. Foram desenvolvidos pela empresa In Vitro Clonagem Animal, de Mogi Mirim, SP. Um dos clones é do lendário reprodutor Turbante JO, que renasce aos 43 anos.

Banco de células

Os potros nascidos não apresentaram os problemas relatados nas demais espécies domésticas

O potro clonado não seráa cópia idêntica do cavalooriginal

Vários fatores causamdiferentes fenótipos e comportamentos

Avanços;

Vários aspectos ainda necessitam de esclarecimento;