Dr.a. Juliana Lopes Almeida Médica...

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Dr.a. Juliana Lopes Almeida Médica veterinária Mestrado em ciências agrárias, reprodução equina (Universidade de Brasília - UNB) Doutorado em patologia comparativa, reprodução equina (University of California, Davis, EUA, UCDAVIS) Pós doutorado em Biotecnologia da reprodução (Universidade de Fortaleza, UNIFOR) Diretora do Hospital Veterinário Metropolitano - HVM
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    29-Sep-2018
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  • Dr.a. Juliana Lopes AlmeidaMdica veterinria

    Mestrado em cincias agrrias, reproduo equina (Universidade de Braslia - UNB)Doutorado em patologia comparativa, reproduo equina (University of California, Davis, EUA, UCDAVIS)

    Ps doutorado em Biotecnologia da reproduo (Universidade de Fortaleza, UNIFOR)Diretora do Hospital Veterinrio Metropolitano - HVM

  • Biotecnologia da reproduo compreende todas as tcnicas utilizadas como ferramentas para aumentar a eficincia reprodutiva dos animais.

  • Viabilidade da criao de cavalos = sucesso na reproduo

    Indstria do cavalo -movimenta cerca de R$ 7,5 bilhes anuais

    3,2 milhes de empregos diretos e indiretos

    Investimento no melhoramento gentico

  • Caracterizao da Reproduo da gua: Polistricas estacionais: Foto-perodo dependentes; Durao varivel (Hafez, 1995, Romano et al. 1998);

    Puberdade - 12 a 18 meses; Maturidade sexual - 24 meses: Variabilidades (McKinnon, 1993);

  • Melatonina: foto-perodo = melatonina; Manejo visando a atividade ovariana (Hafez, 1995);

  • HIPOTLAMO

    HIPFISE

    OVRIO

    TERO(Placenta)

    GNRH +

    LH/FSH +

    ESTRGENOFSH - / LH +

    INIBINAFSH -

    PGF2 alfa

    PINEAL

    AUMENTO

    MELATONINA -

    PMSGProgesterona Estrgeno

  • Gestao 315 360 dias; Reconhecimento materno: Previne regresso do CL (Stanbenfeld & Edqvist, 1996);

  • Fixao Embrionria: 16o dia ps ovulao; Clices endometriais a partir de 35 dias: Gonadotropina Corinica Eqina ou PMSG: Funo:

  • Corpos Lteos Acessrios; Funo; Geralmente so formados 3 a 5 por ovrio; Formados pela ao da PMSG; Persistem at 180 dias;

  • Hormnio Ao Indicao Produtos Dosagem ObservaoGNRH Ovulao - Indireta Induo de Ovulao em

    36 horasDeslorelina

    1,0 mg IV ou 1,5 mg IM

    Folculo maior ou igual a 35 mm e edema de tero

    Luteinizao de CL

    Ocitocina contratilidade uterina - miomtrio

    Limpeza do tero Ocitocina 10UI/ml

    20UI Im ou IV Pr sensibilizado por estrgenos

    Reteno de placenta Expulso da placenta e lquios

    20UI Im ou IV

    Induo de parto Parto 40 a 100 UI IM

    Estrgenos - Benzoato ou cioponato de estradiol

    Induo de cio coleta de smen ou cio silencioso

    ECP, Sincrodiol, Gonadiol, estrogin

    1 a 5 mg Verficar ausncia de CL e Progesterona

    Relaxamento de crvice ou cio sem edema uterino

    Presena de folculos mas sem edema uterino ou aberuta de crvice

    Induo de edema Induo de edema em guas em anestro

    10 a 15 mg divididos em 3 dias ou dose nica

    Protocolo de anestro uso com Progesterona

    Progesterona Preparo do tero para receber o embrio

    guas em anestro Progesterona 300 mg IM semanal, Altrenogest

    1500 mg Protocolo de anestro uso com Progesterona

    Complemento de progesterona endgena

    guas gestantes com sinais de pouca progesterona endgena ou receptoras para receber embrio

    Sinais de edema, Cl hipoecognico, tero flcido

    Supresso de cio guas em prova

  • Hormnio Ao Indicao Produtos Dosagem ObservaohCG Ovulao - direta Induo de ovulao em

    36 horasVetecor, chorulon

    1500UI

    Luterinizao de CL

    Prostaglandina F 2 alfa

    Regresso de Cl Induo de cio Lutalyse, Sincrocio, Preloban, Sincrosin

    dinoprost 7,5 mg

    5 dias aps ovulao

    Sincronizao receptoras intervalo de 0 a 2 diasCL persistenteAborto ou Absoro At 60 dias de gestaoInduo de parto

    EPE Gonadotropina Superovulao EPE 8 mg IM BID Trata um ciclo ps PGF por 6 dias

    Anestro persistenteOvulao - direta Induo de Ovulao em

    36 horas6 mg IV

  • Entende-se por inseminao artificial o depsito mecnico de smen no aparelho reprodutivo da fmea

    Vantagens da utilizao de um programa de I.A. na espcie equina.

    Melhor aproveitamento do Garanho

    Evita doenas transmissveis atravs da cobertura

    Evita ferimentos durante a cobertura do garanho e da gua

  • Manipulao de glndulas acessrias; Farmacolgica; Vagina artificial;

  • Deletrios: centrifugao rpida, mudanas de temperatura; luz; qumicos; gua

  • Volume de 020 a 100 mL

    Aparncia: leitosa, cremosa, opalescente ou aquosa

    Cor: branco opalescente a leitoso

    Odor: sui-generis

    Motilidade: proporo de sptz mveis em umaamostra de semen

    Vigor: velocidade do movimento de sptz com motilidade progressiva (0-5)

  • Concentrao espermtica;

    Patologia espermtica;

  • Fresco,

    Refrigerado,

    Congelado.

  • Porque desejvel refrigerar o smen?

    o metabolismo do sptz a temperatura corporal e ambiente mximo.

    produtos do catabolismo do sptz (c. ltico e/ou CO2) aumentam a acidez do meio causando danos as clulas espermticas.

    peroxidao das membranas lipdicas causam danos as clulas espermticas.

  • Limitaes

    Choque trmico: alteraes no espermatozidesquando eles so rapidamente resfriados da temperatura corporal at prximo a 0C

    Choque osmtico

  • SPTZ para cada 15 C de reduo, o metabolismo reduzido em 45%.

    SPTZ armazenados a 5C: requerimentos metablicos sero apenas de 10%

    Faixa crtica = 19 a 8C

    SPTZ so insensveis a velocidade de resfriamento at atingir 19C

    A partir de 19C; veloc. 0,05C/min.

  • Diluio 1:1 Utilizao 24-48 h

    Diluidor mais utilizado: diluidor de Kenney (1975) Glicose -49g Leite desnatado -24g Bicarbonato de sdio a 10% -7,5ml Gentamicina -200mg gua bidestilada -1000ml

    Doses inseminates: 109, 10 a 30 mL

  • Refrigerao computadorizada

    Unidades de refrigerao e conservao (continer):

    Equitainer I, II e III

    ExpectaFoal

    Equine Express

    Salsbro Box (continer sueco)

    Celle container (container alemo)

    Botutainer, Botubox (containers brasileiros)

  • Grande vantagem de conservao de smen por tempo indeterminado

    Forma de seguro reprodutivo do animal

    Causa graves leses ao espermatozide

    Apenas 24% dos garanhes apresentam boas taxas de concepo

    No existe um protocolo ideal

  • Diluidores

    Tampo, antibiticos, gema ou leite, aucares e crioprotetor

    Avanos na composio dos diluidores

    Aucares: lactose, rafinose e trealose

    AA: glicina

    Lipoprotenas de baixa densidade da gema, lecitina de soja

  • Reduo do glicerol em combinao com as amidas nos meios comerciais

    A centrifugao amortecida: Composto iodado no inico, chamado = iodixanol, utilizado como

    gradiente de densidade ou como amortecedor na centrifugao do smen.

    Ausncia de leses causadas pelo processo de centrifugao.

    Centrifugao com soluo de partculas de slica silanizada

    Utilizao de um filtro especfico feito de membrana hidroflica sinttica

  • Onde congelar

    Pallhetas de 0,5 mL

    Palhetas de 0,25 mL

    Macrotubos

  • Mquinas para congelamento-TK3000 -TK

    Mquina Sousa (Patente) -tecnologia em congelao

  • Descongelamento

    Rpido x lento ?

    37 C / 30 seg.

    46C / 20 seg.

    75C / 7 seg.

    98C/ 4 seg.

  • Preparo para I.A.

    24 hs antes da ovulao

    Folculo pr-ovulatrio (35 mm ou maior)

    Uso de 2500 a 3300 UI de hCG

    Ovulao em 24-48 h

  • Dose ideal: 500 milhes de espermatozidesviveis.

    Pipetas flexveis.

  • 800 x 106 at 6 horas depois da induo de ovulao

    400 x 106 24h e 48h aps ovulao

  • Inseminao histeroscpica

    o smen depositado prximo ao oviduto, sobre a juno tero-tubrica (papila), atravs de um aparelho de endoscopia via lumen uterino

  • Fibroendoscpio

    Reduo da quantidade de espermatozides: 5 a 40 x 106

    Deposio ipsilateral da ovulao

    Smen sexado

  • Definio: recuperao de embrio de umadoadora e transferncia para uma receptora;

  • guas em competio; guas novas (2 anos); guas com mritos genticos; Vrios potros ou guas; guas com problemas reprodutivos; guas com problemas no-reprodutivos; Pesquisa Espcies em extino

  • guas jovens, reprodutivamente saudveis 3-10 anos de idade, 1-2 potros Ciclo estral normal, livre de fluido uterino Qualidade do endomtrio

    Boa me Tamanho da gua capacidade lactante bom temperamento

    Trs tipos de receptoras: guas intactas (mais comum) Ovariectomizadas, guas tratadas com progesterona No cclicas, guas tratadas com progesterona

  • ovulao da doadora

    ovulao da receptora

  • Quando: D6: vitrificao, criopreservao, bisseco; D7-8: maioria das lavagens; D9: maior ndice de recuperao, embrio

    facilmente degenerado;

  • Dia 6 58%

    Dia 7 61%

    Dia 8 65%

    Dia 9 71%

  • 70% guas jovens, guas frteis, smenfresco;

    30-50% guas velhas, smen congelado

  • Conteno;

    Cateter inserido na sonda e preenchido com ar (selamento de os interno);

    Lavagem (1 a 2 L por gua);

    Fluido passado por filtro de 75m;

    Repetir 2 a 3 vezes.

  • Volume de efluente: >90% recuperao Ocitocina Massagem transretal

    Qualidade do efluente Turvo: endometrite Hemorrgico: massagem muito vigorosa e

    manipulao de cateter

  • gua: Idade > 14 anos: reduo RE Patologia de oviduto, tero Morte embrionria precoce

    Nmero de ovulaes ovulaes mltiplas

    Histrico reprodutivo Aborto, Morte embrionria precoce, subfertilidade

  • Garanho:

    Qualidade do smen;

    Tipo de smen (fresco, resfriado, congelado);

    Momento da inseminao.

  • Manejo

    Exerccio: reduzida taxa de recuperao embrionria

    Dia da tentativa de recuperao embrio entra no tero D 5.5-6 As taxas de recuperao D6 menor Falha de entrar no tero

  • Procura: Lupa (7 a 15 x magn); Embries maiores visveis a

    olho nu;

    manipulao:

  • Lavagem: Passagem por 3 gotas de

    soluo de manuteno

    Avaliao: Tamanho Qualidade Estgio de desenvolvimento

    (mrula, blastocisto inicial, blastocisto expandido)

    Maior ndice de recuperados( grau 1 e 2)

  • grau categoria aparncia caracteristicas

    1 excelente esfrico embrio ideal, clulasuniformes, cor e

    textura uniforme

    2 bom Imperfeiespequenas

    Poucos blastmerosextrusados, forma

    irregular, separao de trofoblasto

    3 razovel Problemas visveis Blastmerosextrusados, clulas

    degeneradas, blastocele degenerada

    4 ruim Problemas severos, irregular

    Blastocele colapsada, muitos balstmerosextrusados, clulasdegeneradas, com

    massa celular

  • Cirrgica: Linha ventral; Laparotomia de flanco;

    No cirrgica: Transcervical Espculo Pipeta de inseminao Bainha e inovulador

    Injeo intra-uterina guiadapor ultra-som

  • Historicamente, tcnicacirrgica resultava em maioresndices 70-75% (Squires et al.) >90% (Wilsher et al.)

    Recentemente, semelhantes ou melhores resultados com tcnica nao-cirrgica 81% (Losinno et al.) 85% (Wilsher et al.)

  • Embrio Idade das doadoras Qualidade Maturidade

    Receptoras Tnus do utero e cervix antes da transferncia Idade da receptora

    Manejo tcnicas de transferncia sincronizao

  • Vantagens: Sem necessidade de manejo de receptoras Transporte a longas distncias criopreservao de embries

    Meios Hams F-10 Vitrocell Botuembryo

  • Dispositivo de refrigerao passiva para armazenar embries em 5 C por at 24 horas;

    Taxas de prenhez similares a embries 'frescos;

    No houve diferenas significativas em viabilidade entre embries D7 e D8

    Maiores embries D7 mais resistentes do que o menores embries D7

  • Porque? Preservar material gentico Importao/exportao Receptoras no disponveis Armazenamento at a doadora

    provar seu valor em competices

    Como? tcnicas convencionais de

    congelamento ndices de gestao: 50-60% embries < 250 m

  • vitrificao criopreservao

    Altas conc de crioprotetores Baixa conc de crioprotetores

    < 15 min para terminar 1.5 horas para completar

    Sem material especial Material especial

    Descongelamento: transferncia direta Descongelamento: diluio antes de transferncia

    < 300 m < 250 - 300 m

    ndices de gestao: 60% ndices de gestao: 50 - 60%

  • Razes para o fracasso da superovulao: Anatomia do ovrio Insensibilidade do receptor de FSH

    equino Indisponibilidade de produtos

    confives que induzam mltipla ovulaes;

    Benefcios: Aumentar a eficincia TRA Aumento a prognie Avano da primeira ovulao

  • eCG, GnRH, pFSH, Hormnio de crescimento No eficiente

    Imunizao contra inibina Efeitos colaterais

    EPE (extrato de pituitaria equina) ndices de ovulao (2-4 ovulaes por ciclo) recuperao embrionria: 2 (50%)

    eFSH semelhante a EPE

    ReFSH

  • eFSH (BID) quando o maior folculo for 20-23 mm

    PGF2 segundo dia Parar quando folculo atingir 33-35 mm Aguardar 24-36 hrs hCG Inseminao

  • Indicaes:

    Fmeas acometidas por afeces ovarianas, uterinas e cervicais;

    guas que no apresentam bons resultados na Monta Natural (MN), Inseminao Artificial (IA) e/ou Transferncia de Embries (TE), sem causa definida ; ou

    Animais com anormalidades adquiridas durante a vida reprodutiva: ocluses de oviduto, Infeces uterinas e laceraes cervicais

    Coleta de ovcito: guas eutanaziadas Aspirao transvaginal

  • Aspirao e lavagem dos folculos via transvaginal, guiada por ultrassonografia (TVA)

    Punes pelo flanco

    Laparotomia com exposio dos ovrios e aspirao dos folculos

  • Ovocito maduro em estgio de Metafase-II

    Unidade de reproduo assistida Hospital Quiron de Barcelona

  • Revista Brasileira de Ginecologia e ObstetrciaOn-line version ISSN 1806-9339Rev. Bras. Ginecol. Obstet. vol.30 no.7 Rio de Janeiro July 2008

    http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_serial&pid=0100-7203&lng=en&nrm=iso
  • GIFT clssica caracteriza-se pela deposio de ovcitos maduros e espermatozidescapacitados diretamente no oviduto

    ndices de coleta: 70-80% (24 h aps hCG ouGnRH)

    Transferncia imediata

    MIV por 12 h a 16 h

  • Transferncia cirrgica de ovcito de doadora ao oviduto de receptoras Receptoras inseminadas normalmente Sptz colocado no oviduto no mesmo

    momento do ovcito

    ndices de gestao: 32-40% (guasvelhas)

    ndices de gestao: 20-92% (guasjovens)

    A qualidade e o tipo de conservao do smen interferem nos resultados,

  • Pouco sucesso

    2 embries produzidos de FIV (ambos os casos os ovcitos foram coletados de folculos pr-ovulatrios conseqentemente maturados in vivo)

    Maiores obstculos: a capacitao in vitro e pouco conhecimento sobre sistema de maturao e cultivo embrionrio in vitro

  • Efluxo de cholesterol no foi obtido!!!

  • Tx prenhez de 60% (Choi et al., 2002)

    Ovcitos so obtidos, maturados, desnudos e em seguida aqueles com o primeiro corpsculo polar aparente so utilizados

    Amostra de smen fresco ou descongelado lavada e colocada em meio com polivinilpirrolidona.

    A cauda do espermatozide seccionada e a cabea injetada dentro do ocito, sendo este ativado ou no quimicamente e cultivado in vitro ou transferido para o oviduto de uma receptora (Squires et al., 1996)

  • Precisa capacitao espermtica

    Qualidade do smen insuficiente

    Garanhes subfrteis

    Requer um ocito maduro

    Cultivo in vitro de embries (para o estgio de blastocisto)

  • No Brasil, a empresa In Vitro Clonagem, por meio da Dra. Perla Fleury, noticiou o primeiro nascimento de um equino (fmea) por esta tcnica no ano de 2012. Os ovcitos foram obtidos do ovrio de uma gua quarto de milha, aps sua morte

  • Porque? Um sexo mais desejado Expanso gentica mais rpida Superovulao ICSI

    Como? ndices de separao 40% (20%

    de em X e 20% emY) Sucesso:80-90%

  • O primeiro potro produzido a partir de smen sexado originou-se da inseminao cirrgica diretamente no oviduto de 150.000 espermatozoides (LINDSEY et al., 2001).

  • 60 a 70 dias (tubrculo genital)

    110 a 120 dias (gnadas)

    PCR (polimerase chain reaction)

  • Inicialmente, foram encontradas grandes dificuldades no desenvolvimento da tcnica de transferncia nuclear tanto na taxa de fuso entre ocitos e clulas dos doadores, quanto na taxa de clivagem, que eram menores que 15% (Hinrichs, 2006)

    0.7% a 2.7% de embries reconstrudos resultam em nascimento

  • A partir de 2006 houve o nascimento de vrios potros clonados.

    A empresa lder mundial na produo de clones equinos a ViaGen, com sede no estado do Texas, e com um laboratrio em Alberta, no Canad.

    No Brasil, os primeiros clones equinos nasceram em 2012, e so da raa Mangalarga. Foram desenvolvidos pela empresa In Vitro Clonagem Animal, de Mogi Mirim, SP. Um dos clones do lendrio reprodutor Turbante JO, que renasce aos 43 anos.

    Banco de clulas

  • Os potros nascidos no apresentaram os problemas relatados nas demais espcies domsticas

    O potro clonado no sera cpia idntica do cavalooriginal

    Vrios fatores causamdiferentes fentipos e comportamentos

  • Avanos;

    Vrios aspectos ainda necessitam de esclarecimento;

  • Atualizaes em biotecnologia da reproduo em equinosIntroduoIntroduoFisiologia e Endocrinologia da Reproduo da guaReproduo da Fmea EquinaNmero do slide 6Nmero do slide 7Nmero do slide 8Reproduo da Fmea EqinaNmero do slide 10Reproduo da Fmea EqinaReproduo da Fmea EqinaNmero do slide 13Reproduo da Fmea EqinaNmero do slide 15Nmero do slide 16Inseminao artificialInseminao artificialNmero do slide 19Colheita de smenNmero do slide 21Inseminao artificialNmero do slide 23Nmero do slide 24Nmero do slide 25Nmero do slide 26Nmero do slide 27Nmero do slide 28Nmero do slide 29Nmero do slide 30Nmero do slide 31Nmero do slide 32Processamento do smenExames imediatosExames mediatosComo utilizarSmen refrigeradoSmen refrigeradoSmen refrigeradoSmen refrigeradoSmen refrigeradoSmen CongeladoNmero do slide 43Smen congeladoEstudos recentesSmen congeladoSmen congeladoSmen congeladoInseminao artificialInseminao artificialIA em tempo fixoInseminao artificialInseminao artificialNmero do slide 54Transferncia de embrioIndicaesSeleo de receptorasNmero do slide 58Recuperao de embriondice de recuperao (Vanderwall, 2000)ndices de recuperaoMaterial utilizadoNmero do slide 63Recuperao de embriesNmero do slide 65Recuperao de embrioFatores que afetam a recuperaoFatores que afetam a recuperaoFatores que afetam a recuperaoEstudos recentesProcura de embrio e manipulaoLavagem e avaliaoNmero do slide 73Nmero do slide 74Transferncia de embrio: tcnicandices de sucessoFatores que afetam ndices de gestaoResfriamento e transporte de embriesEmbries refrigeradosCriopreservao de embriesvitrificao Vs criopreservaoVitrificaoVitrificaoSuperovulaoHormniosProtocolo de superovulaoColeta e transferncia de ovcitos Coleta e transferncia de ovcitos Coleta transvaginal de ovcitoNmero do slide 90Nmero do slide 91GIFT (transferncia intrafalopiana de gametas)Transferncia de ovcitoFertilizao in vitro (FIV)Fertilizao in vitro (FIV)ICSI (intracytoplasmic sperm injection - injeo intracitoplasmtica de espermatozide) ICSI (intracytoplasmic sperm injection - injeo intracitoplasmtica de espermatozide) ICSI (intracytoplasmic sperm injection - injeo intracitoplasmtica de espermatozide) ICSI (intracytoplasmic sperm injection - injeo intracitoplasmtica de espermatozide) Sexagem de smenSexagem de smenSexagem fetalClonagem (transferncia nuclear)BipartioClonagemClonagemClonagem: o que se esperar?Novos estudosNovos estudosConsideraes finaisNmero do slide 111Nmero do slide 112Nmero do slide 113