DNA revolution DNA revolution I marcatori molecolari e il ...
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26/03/2019
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DNA Profiling e Genetica Forense
DNA revolutionI marcatori molecolari e il
loro contributo alle scienze forensi (II parte)
DNA
revolution
Sequenziamento massivo
(Next Generation
Sequencing – NGS)
Microsatellites
SNPs
DNA Barcoding
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Il passato, il presente e il futuro
del sequenziamento∗ del DNA
∗ Sequenziamento del DNA:
Determinare il N° e l’ordine dei nucleotidi che
costituiscono una molecola di DNA.
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SEQUENZIAMENTO DEL DNA
1977 – Il DNA è sequenziato per la prima volta da Fred Sanger, Walter Gilbert e Allan
Maxam in maniera indipendente.
1977 1982: lambda virus
DNA stretches up to 30-40Kbp
(Sanger et al.)
1994: H. Influenzae
1.8 Mbp (Fleischmann et al.)
2001: Homo Sapiens
Metodi di sequenziamento
• Maxam e Gilbert (chimico)
• Sanger (enzimatico)
• Sequenziamento automatico del DNA in
fluorescenza
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Questo metodo prevede la marcatura del ssDNA alle estremità 3’
con 32P, il taglio del DNA e la separazione dei due filamenti identici
marcati ad un’estremità.
Si suddivide la miscela in 4 parti, ciascuna delle quali viene
sottoposta ad un diverso trattamento chimico per metilare o
rimuovere specificamente 1 o 2 basi.
Si producono in questo modo frammenti marcati di dimensione
specifica e tramite una elettroforesi è possibile determinare
l’ordine dei nucleotidi �la sequenza.
Utilizzato in passato:
1) non adatto al sequenziamento automatico;
2) composti chimici dannosi alla salute
Maxam-Gilbert Sequencing (CHIMICO)
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DMS
G
GG
G
FA
GA
GG
AG
AA
H
CTT
C
TC
CT
H+S
CC
CC
Maxam-Gilbert Sequencing(metodo chimico)
Es. metilazione delle Gcon dimetilsolfato (DMS)
ssDNA marcato ad una estremità: poi 4 reazioni di modificazi one base-specifiche come segue….
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Sequencing gels are read from bottom to top (5′ to 3′).
G G+A T+C C
3′AAGCAACGTGCAG5′
Longer fragments
Shortest fragmentsG
A
Maxam-Gilbert Sequencing
Gel di poliacrilammide
Metodi di sequenziamento
•Sanger (enzimatico)
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Nobel Prize Chemistry (1958) amino acid sequence (insulin)
Nobel Prize Chemistry (1980) dideoxy method of DNA
sequencing
Frederick Sanger (13. 8. 1918 – 19. 11. 2013)
Sanger F, Nicklen S, Coulson AR (December 1977). "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (12): 5463–7.
DEOSSI-NUCLEOTIDE e DIDESOSSI-NUCLEOTIDE
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The Chain Terminator
Adapted From Berg et al: Biochemistry 5th ed. Freeman+Co, 2002
dideoxyH3’
5’
base base base
PO3
5’3’
base base base base
• Dideoxy nucleotides cannot be further extended, and so terminate the sequence chain
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Analisi di sequenza e PCR
1) DNA polimerasi;
2) Miscela di deossi-nucleotidi (dNTPs marcati con 32P o 35S = dATP, dCTP, dGTP,
dTTP); ddNTP a concentarzione più bassa
3) filamento DNA a singolo filamento (stDNA)
DNA stampo a singolo filamento (stDNA)
Filamento copiaPrimer marcato
Sequenziamento: metodo Sanger
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Expose gel to x-ray film (to make an “auto-radiogram”)
Original Sanger Sequencing with Radioactive Signal
Template (stDNA)
A nested series of DNA fragments ending in the base specified by the terminator-ddNTP
very lowconcentration ofddNTPs vs dNTPs
Cycle sequencing (PCR)
94°C: DNA denatures�ssDNA(stDNA )
45°C: 1 primer (marcatocon 32P o 35S) anneals +dNTPs + ddNTP)
60-72°C: Taq DNA pol extendsprimer
Repeat: 25-35 times
Advantages: don’t need a lotof template DNA
Disadvantages: DNA pol mayincorporate ddNTPs poorly
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https://www.youtube.com/watch?v=qr6A4eXZOWs
Run each reaction mixture on electrophoresis gel
Short fragments go to bottom, long fragments on
top
Read the "sequence" from bottom of gel to top
Convert this "sequence" to the complementary
sequence
Now read from the other end and you have the
sequence you wanted - read 5' to 3'
Sequenziamento: metodo Sanger
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SEQUENZIAMENTO DEL DNA – Sanger sequencing (MANUALE-
autoradiografia)SEQUENZIAMENTO DEL DNA – Sanger sequencing
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Analisi di sequenza e PCR
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Each of the 4 ddNTPs is labeled with a different fluorescent dye (instead of
radioactivity)
Fluorescent Sanger Sequencing: “Dye-terminators” Fluorescent Sanger Sequencing: “Dye-terminators”
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Le molecole ottenute da ogni reazione vengono caricate su gel in 4
corsie parallele; la corsa viene letta per autoradiografia grazie alla
presenza del primer marcato in ogni frammento
SEQUENZIAMENTO DEL DNA (Sanger) (SEMI-AUTOMATIZZATO) SEQUENZIAMENTO DEL DNA (Sanger) (SEMI-AUTOMATIZZATO)
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Sequenziamento automatico del DNA in
fluorescenza
Fluorescent Sanger Sequencing: “Dye-terminators”
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Fluorescent Sanger Sequencing (automatizzato)
1-tube sequencing reaction(cycle sequencing with modified Taq Polymerase)
dGTP
dATP
dTTP
dCTP
+
Direction of electro-phoresis
Load on gel(modern machines use
capillaries, not slab gels)
�Il fluorocromo viene
eccitato dal laser
emette luce nel visibile,
in un determinato
intervallo di λ
�La luce emessa viene
filtrata per determinati
range di λ e convertita
in un segnale elettrico
che viene misurato in
RFUs
(RelativeFluorescence
Units).
Argon ion LASER (488
nm)
Color SeparationFluorescence
ABI Prism spectrograph
Processing with GeneScan/Genotyper software
Sample Interpretation
CCD Panel (with virtual filters)
Sample Detection
Capillary (filled with
polymer solution)
tradotto nei
tipici picchi
colorati
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Recombinant DNA: Genes and Genomes. 3rd Edition (Dec06). WH Freeman Press.
Fluorescent Sanger Sequencing Trace
Lane signal
Trace
(Real fluorescent signals from a lane/capillary are much uglier than this).
A bunch of magic to boost signal/noise, correct for dye-effects, mobility differences, etc, generates the ‘final’ trace (for each capillary of the run)
�Minor quantità di DNA stampo
� Ridotta introduzione di impurità nella miscela di reazione
Fluorescent sequencing
288,000 bp/day
Progress of Sanger Sequencing Technology
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AB capillary sequencers
1-2 million bp/day
Progress of Sanger Sequencing TechnologyConfronto metodi di sequenziamento
� Sanger
� rapida e semplice
attuazione
� disponibilità di kit
� necessità di primer
� sensibile a strutture
secondarie
� Maxam e Gilbert
� lunga preparazione del DNA
� reazioni da mettere a punto
� relativamente economico
� strutture non influenti
� utilizzabile per oligonucleotidi
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Sequenziamento
Vantaggi:
Svantaggi:
Sequenziamento
Vantaggi:
• Alta riproducibilità e affidabilità
• Utile negli screening genomici e per isolamento e
caratterizzazione di microsatelliti e SNPs
• Strumento base per il DNA barcoding
Svantaggi:
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Sequenziamento
Vantaggi:
• Alta riproducibilità e affidabilità
• Utile negli screening genomici e per isolamento e
caratterizzazione di microsatelliti e SNPs
• Strumento base per il DNA barcoding
Svantaggi:
• Time-consuming and expensive
• Richiede informazioni a priori (primer)
• possibilità di sequenziare 1 sequenza per volta
• Difficoltà nell’interpretazione di alcuni risultati ambigui
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Probe 1
D1S7
Probe 2
D2S44
Probe 3
D4S139
Single-Locus
ProbeMulti-Locus
Probe
Joh
n M
. B
utl
er
(20
09
) Fu
nd
am
en
tals
of
Fore
nsi
c D
NA
Ty
pin
g, F
igu
re 3
.3
(Originally developed
by Alec Jeffreys)
Better for forensic samples containing mixturesComplex patterns
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Microsatelliti (STR)
• Durante gli anni il numero di loci STR selezionati è >>>
• Attualmente il CODIS USA: 13 microsatelliti selezionati a
partire da 17 loci candidati sulla base della loro
variabilità e facilità di interpretazione.
• UK e alcuni altri stati Europei: 10 STR, 8 dei quali in
comune con il CODIS
Microsatelliti (STRs–Short tandem repeat o SSR
Simple sequence repeat)
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Il microsatellite 'ideale' (scienze forensi)
1) Con elevata eterozigosità (>> discriminazione)
2) Amplificabile in corti prodotti PCR (x DNA degradato)
3) I cui alleli siano ben separabili
4) Che presenti un ridotto fenomeno di stuttering
5) Con tasso di mutazione contenuto (x paternità)
6) Situato su autosomi (�indipendenza statistica dei loci)
La comunità forense si è orientata principalmente su
microsatelliti del tipo tetranucleotide repeats autosomici
Microsatelliti (STRs o SSR –Short tandem repeat o
Simple sequence repeat)
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7 repeats
8 repeats
AATG
AATG= (tetranucleotide) core/repeats;
7 repeats= allele 7
8 repeats= allele 8
Eterozigote (7-8)= gli alleli aquel locusSTRsonodiversi
Microsatelliti (STR)
15 repeats
19 repeats
CA
Microsatelliti (STR)
CA= (dinucleotide) core/repeats;
15 repeats= allele 15
19 repeats= allele 19
Eterozigote (15-19)= gli alleli aquel locusSTRsonodiversi
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15 repeats
19 repeats
CA
Microsatelliti (STR) e PCR
Si determinano le sequenze UNICHE che fiancheggiano il microsatellite per
disegnare i PRIMERS per la PCR
Si amplifica il gDNA da saggiare con i primers selezionati e si analizza su gel di
agarosio
1 2Genotipizzazione: l’allele
15 è distinguibile
dall’allele 19
CODOMINANTI!
Distribuzione dei
microsatelliti nei
cromosomi umani
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Distribuzione dei microsatelliti nel genoma umano
STR: LENGTH OF REPEAT UNIT
Dinucleotides:
Trinucleotides:
Tetranucleotides:
Pentanucleotides:
Exanucleotide:
CACA
AATAAT
AGATAGAT
2
3
4
5
6
AATGTAATGT
AATGTT
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Distribuzione dei microsatelliti nel genoma umano
• Dinucleotide
• Trinucleotide
• Tetranucleotide
• Pentanucleotide
• Hexanucleotide
(CA)(CA)(CA)(CA)
(GCC)(GCC)(GCC)
(AATG)(AATG)(AATG)
(AGAAA)(AGAAA)
(AGTACA)(AGTACA)
Requires size based DNA separation to
resolve different alleles from one another
High stutter
Low stutter
YCAII
DYS448
~45%
<2%
Categories for STR Markers
Category Example Repeat Structure
13 CODIS Loci
Simple repeats – contain units of identical length and sequence
(GATA)(GATA)(GATA) TPOX, CSF1PO, D5S818, D13S317, D16S539
Simple repeats with non-consensus alleles(e.g., TH01 9.3)
(GATA)(GAT-)(GATA) TH01, D18S51, D7S820
Compound repeats –comprise two or more adjacent simple repeats
(GATA)(GATA)( GACA) VWA, FGA, D3S1358, D8S1179
Complex repeats –contain several repeat blocks of variable unit length
(GATA)(GACA)(CA)(CATA) D21S11
These categories were first described by Urquhart et al. (1994) Int. J. Legal Med. 107:13-20
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GENERAL CRITERIA FOR SELECTING STR LOCI
4 Tetranucleotide repeats:
PD > 0.85
Allele range < 60 bps
Low stutter
Microsatelliti
Ancor oggi i marcatori molecolari più
utilizzati nelle scienze forensi!
Vantaggi:
• Elevata riproducibilità
• Marcatori frequenti nel genoma
• Loci molto polimorfici (elevato numero di alleli)
• CO-DOMINANTI
• EREDITA’ MENDELIANA
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1. Estrazione e quantificazione del DNA
2.Amplifcazione PCR multiplex
3. Separazione dei prodotti di PCR mediante elettroforesi capillare
4. Interpretazione del dato grezzo
Come si genera un profilo STR???
Piccola parentesi (PCR e MULTIPLEX PCR)
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Make copies (extend primers )
Starting DNA Template
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
Add primers (anneal ) 5’3’
3’5’
Forward primer
Reverse primer
Separate strands (denature )
5’
5’3’
3’
DNA Amplification with PCR (1 Locus)
Original DNA target region
Thermal cycleThermal cycleThermal cycle
http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/
DNA Amplification with PCR (1 Locus)
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DNA Amplification with PCR (1 Locus)
• Primer with fluorescent tagattaches to DNA and targetsregion of interest
• Individual is assigned adesignation for each of CODIS13 loci tested
• SAMPLE 1 (7,8)
• SAMPLE 2 (8,10)
MATERNAL
PATERNAL
LOCUS 1
Jelena A. Myers
MATERNAL
PATERNAL
LOCUS 1
8 repeats
10 repeats
SAMPLE 1
SAMPLE 2
DNA Amplification with PCR (1 Locus)
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• Possono essere amplificati nellastessa reazione fino a 24 marcatorigenetici (24 Loci)
• A partire da 1 ng di DNA.
• Si usano fluorocromi diversiper distinguere gli alleli degli STR icui range di peso molecolare sisovrappongono
Multiplex PCR (+ Loci contemporaneamente)
Detection Methods
Fluorescence
Label one of the primers for each locus
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Fluorescence results when a fluorophore or
fluorescent dye absorbs incident light and in
response emits light at a different wavelength
excitation emission
excitation emission
excitation emission
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Le temperature di Tm dei vari primers devono essere simili
1. Software online per primer selection: “Primer3Plus” http://primer3plus.com/
2. Una valutazione sperimentale della concentrazione ottimale dei singoli
primers è sempre necessaria
Multiplex PCR (+ Loci contemporaneamente)
� PRESENZA DI INIBITORI:
I reperti biologici possono essere
mescolati con inibitori della PCR di
che non sempre vengono eliminati
efficacemente negli step di
purificazione del DNA.
• CONTAMINAZIONE IN LABORATORIO O
IN FASE DI REPERTAZIONE:
a causa della sua elevata sensibilità, la
PCR presenta un forte problema
legato contaminazione
Multiplex PCR (+ Loci contemporaneamente)
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Multiplexing PCR con più coppie di primer con fluorofori differenti
Gel con un pattern di
bande non più
riconducibili al singolo
locus
Elettroferogramma
I kit commerciali (Applied Biosystems e Promega) permettono di coamplificare
(PCR multiplex) i 13 marcatori molecolari (STR) del CODIS
I kit commerciali sono in continua «evoluzione»: >> numero di loci (multiplex PCR):
STR, mini STR, Y-STR ecc.
Kit commerciali
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Fluorescent
dye-labeled
primer
GATA
3′5′
3′5′
(Maternal)
(Paternal)
1 2 3 4 5 6
1 2 3 4 5 6 7 8
STR Repeat Region
forward primer
hybridization regionreverse primer
hybridization region
75….80….100….120….140….160….180….200….220….240.…260…..
(size in bp)
RFUs
1000
500
6
139bp
8
147bp
DNA Separation and Detection
Short Tandem Repeat (STR) Typing
Locus Dye Promega PP16 Primer SequencesD3S1358-F ACTGCAGTCCAATCTGGGTD3S1358-R FL ATGAAATCAACAGAGGCTTGCTH01-F FL GTGATTCCCATTGGCCTGTTCTH01-R ATTCCTGTGGGCTGAAAAGCTCD21S11-F ATATGTGAGTCAATTCCCCAAGD21S11-R FL TGTATTAGTCAATGTTCTCCAGAGACD18S51-F FL TTCTTGAGCCCAGAAGGTTAD18S51-R ATTCTACCAGCAACAACACAAATAAACPentaE-F ATTACCAACATGAAAGGGTACCAATAPentaE-R FL TGGGTTATTAATTGAGAAAACTCCTTACAATTTD5S818-F GGTGATTTTCCTCTTTGGTATCCD5S818-R JOE AGCCACAGTTTACAACATTTGTATCTD13S317-F ATTACAGAAGTCTGGGATGTGGAGGAD13S317-R JOE GGCAGCCCAAAAAGACAGAD7S820-F JOE ATGTTGGTCAGGCTGACTATGD7S820-R GATTCCACATTTATCCTCATTGACD16S539-F GGGGGTCTAAGAGCTTGTAAAAAGD16S539-R JOE GTTTGTGTGTGCATCTGTAAGCATGTATCCSF1PO-F JOE CCGGAGGTAAAGGTGTCTTAAAGTCSF1PO-R ATTTCCTGTGTCAGACCCTGTTPentaD-F JOE GAAGGTCGAAGCTGAAGTGPentaD-R ATTAGAATTCTTTAATCTGGACACAAGAMEL-F TMR CCCTGGGCTCTGTAAAGAAAMEL-R ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTGvWA-F GCCCTAGTGGATGATAAGAATAATCAGTATGTGvWA-R TMR GGACAGATGATAAATACATAGGATGGATGGD8S1179-F TMR ATTGCAACTTATATGTATTTTTGTATTTCATGD8S1179-R ACCAAATTGTGTTCATGAGTATAGTTTCTPOX-F GCACAGAACAGGCACTTAGGTPOX-R TMR CGCTCAAACGTGAGGTTGFGA-F TMR GGCTGCAGGGCATAACATTAFGA-R ATTCTATGACTTTGCGCTTCAGGA
DNA Profile
Multiplex PCR (+ Loci contemporaneamente) primer set
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ABI Prism 310 Genetic Analyzer
capillare
Siringa contenente il polimero
Tray di caricamento dei
campioni
Tampone di uscita
Elettrodo di iniezione
Tampone di
iniezione
3. Separazione dei prodotti di PCR mediante elettroforesi capillare
520 540 560 580 600 620 640
WAVELENGTH (nm)
100
80
60
40
20
0
310 Filter Set F with color contributions
5-FAM JOE NED ROX
Laser excitation(488 nm, 514.5 nm)
Norm
aliz
ed F
luore
scent In
tensi
ty
Spettri di emissione dei fluorocromi Applied B. in uso nel kit AmpFlSTR.
I filtri virtuali sono rappresentati dalle quattro colonne nere centrate sul picco dello spettro di ciascuno dei 4 fluorocromi.
A causa della sovrapposizione degli spettri, una matrice di deconvoluzione (4 x 4) deve essere utilizzata per una corretta interpretazione dei dati.
4. Interpretazione del dato grezzo
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Raw data
•Il software GENESCAN divide I
dati grezzi in un
elettroferogramma separato per
ciascun colore
•Blue
•Green
•Yellow
•Red
•Il software GENOTYPER
identifica i differenti loci e per
ciascuno di essi riconosce gli alleli
facendo riferimento ad uno
standard di peso molecolare e ad
un ladder allelico
4. Interpretazione del dato grezzo
D3S13
58VWA FGA
8S1179D
21S11DD18S51
D5S818D13S317
D7S820
Ameloge nin
RAW DATA
PROCESSED DATA
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Microsatelliti
Dimensioni dei frammenti in paia di basi
• Grazie all’utilizzo di primers marcati con fluorofori la tecnica
del GENOTYPING (elettroforesi capillare e lettura della
fluorescenza) permette la genotipizzazione e l’analisi di loci
microsatellite
Conversione dei picchi in GENOTIPI
(utilizzo di SOFTWARE specifici)
Heterozygote Homozygote
GENOTYPING
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La tipizzazione degli alleli degli STR viene effettuata comparando il campione ad un ladder allelico ALLELIC LADDER
Il Ladder è l’insieme degli
alleli di un locus rilevati
nella popolazione
generale. Assegna ad un
determinato allele un
nome univoco.
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STR Analysis
13 loci STRs comunemente indagati
(PROFILO COMPLETO DI UN SOGGETTO) STR Profilo
D8S1179 9-14
D21S11 28-30
D7S820 12-12
CSF1PO 12-12
D3S1358 15-17
TH01 6-7
D13S317 9-12
D16S539 12-12
D2S1338 23-24
D19S433 14-14
VWA 17-19
TPOX 8-8
D18S51 16-16
ame XY
D5S818 11-12
FGA 20-22
PROFILO STR COMPLETO DI UN SOGGETTO
che si traduce in una coppia di numeri per ciascun m arcatore
rappresentativi del numero delle ripetizioni per ogn i allele
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Problemi interpretativi del
sequenziamento
No rumore di fondo
Tutti i picchi sono stati correttamente letti dal software
NORMAL STUTTER BANDS
LOW HETEROZYGOTE
PEAK HEIGHT RATIO
Come leggere l’elettroferogramma??
SPLIT PEAKS
Parziale adenilazione
dell’amplicone
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1. “pull up”:
2. “Dye blobs”:
3. Cristalli di urea e bolle d’aria:
4. Spikes:
5. Contaminanti
Problemi «tecnici»
Problemi nell’interpretazione di profili microsatellite Problemi interpretativi del sequenziamento
Pill-up peaksPresenza di picchi di altri colori sotto il
picco principale dovuti al
sequenziamento di un quantitativo
eccessivo di DNA
Dye blobsArtefatto dato da picchi ampi di
un colore sovrastanti il picco
corretto.
Dovuti a una non corretta
purificazione (residui di dNTPs)
SpikesArtefatti dati da picchi
multicolore alti e stretti che
mascherano il nucleotide
sottostante.
Dovuti a presenza di bolle d’aria nel
capillare di sequenziamento.
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Problemi nell’interpretazione di profili microsatellite
Problemi «biologici»
�Prodotti stutterScivolamento della polimerasi durante l’amplificazione di ripetizioni in tandem
(VNTR, STR)
In genere, il prodotto dello stuttering ha un’altezza < 15% del picco «reale»
-Differenze tra loci e tra alleli dellostesso locus-Differenze per lo stesso locus in esperimenti diversi e kit diversi-Negative and positive stutter-Possibili probleminell’interpretazione di traccemiste.
Alcuni prodotti di PCR più corti di un’unità
rispetto al numero di ripetizioni dell’allele
amplificato.
HOW STUTTER OCCURS
1 2 3 4 5 6
1 2
Template
Amplicon
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46
4
1 2 3 5 6Template
Amplicon
1 2 3 4 5
HOW STUTTER OCCURS
1 2 3 4 5 6
1 2 3 4 5
HOW STUTTER OCCURS
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Problemi nell’interpretazione di profili microsatellite
Problemi «biologici»
�Alleli nulli (Allele drop-out)
Mutazione nel sito di annealing di un primer (3’) che determina il suo mancato
attacco e la non amplificazione di uno dei due alleli in un eterozigote
*
*
8
Allele 6 amplicon has ‘dropped out’
Imbalance in allele peak heights
68
Mutation at 3’-end of primer binding site (allele dropout )
Mutation in middle of primer
binding site
(a)
(b)
Problemi nell’interpretazione di profili microsatellite
Problemi dovuti a “campioni difficili”
A) DNA degradato
C) Campioni misti
Possibilità di n. di alleli per individuo > 2
Progressiva diminuzione dell’amplificato
B) DNA scarso (low concentration DNA)
Alternativa basarsi anche su mtDNACampioni di riferimentoReplicati
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0.5 ng
-A
+A
Troppo DNA• Picchi fuori scala• Picchi divisi• Difficile interpretazione
quantità di DNA
(log scale)
100 ng
10 ng
1 ng
0.1 ng
0.01 ng
2.0 ng
Troppo poco DNA• Sbilanciamento tra alleli
eterozigoti• Allele drop-out• Aumenta la possibilità di
errori di interpretazione
STR lavorano bene in questo Range
STR ben bilanciate
Quanto è importante la quantità di DNA che si può ricavare da u nreperto? MOLTO
Esempio di analisi di replicati
Replicate
#1
High stutter
14,19 7,9.3 12,13 11,13 24
14,19 7,9.3 12,13 11,13 18,24
Replicate
#2
Replicate
#3
Consensus Profile:
Correct Profile:
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Stretch omopolimerico e presenza di regioni ripetute
Caduta del segnale dopo lo stretch
Sequenze confuse dopo lo stretch
Slittamento della polimerasi (presenza di prodotti diversi di sequenziamento)
Sequenza microsatellite
Problemi interpretativi del sequenziamento
Contaminazione da DNA esogeno
Presenza di picchi sovrapposti e disordinati
Sequenza non interpretabile
Oppure…?
Problemi interpretativi del
sequenziamento
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Problemi interpretativi del
sequenziamentoPresenza di varianti alleliche
CLONAGGIO dei prodotti di PCR
SUMMARY
• STRs used today in forensics generally are characterized by tandem repeats of 4(or 5)bp units
• STR polymorphism is due to variation in the number of repeated units
• There are different repeat unit sequences (AATG, TCTA, CTTT, etc.)
• STR loci are either simple, compound or complex
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• Alleles are designated by comparison with an allelic ladder
• Offladder variants of tetramers usually have 1, 2, or 3 extra bases within the repeat array
• Offladder variants also can occur above and below the extremities of the ladder
SUMMARY
• STR loci “associated with” genes are typically in noncoding regions (i.e., introns or flanking regions)
• Many STR loci are “anonymous,” or not currently known to reside within a known gene
SUMMARY
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• STRs are amplified by the PCR. PCR primers bind to unique sequences that flank the repeat region
• Alleles that align with the allelic ladder have “plus A”
• “Minus A” may occur at some loci but is easily addressed
SUMMARY
• Stutter is inherent to STR (tetramers) amplification of some loci
• Loci with a simple repeat structure tend to stutter more
• Loci vary in the extent to which they exhibit stutter
• Small alleles show less stutter than larger alleles
• Stutter is generally predictable and general guidelines can be used for profile interpretation
SUMMARY
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• Interpreting electropherograms is faciltated, especially with software
SUMMARY
DNA revolution
Sequenziamento massivo
(Next Generation
Sequencing – NGS)
Microsatellites
SNPs
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2007 Scietific Brea�thr�ugh �f the YearS�Ps & IDe�s i HuRef Aut�s��es
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dbS�P at �CBIhttp$%%www'cbi'��'ih'g�v%S�P%
Single (Simple) Nucleotide Polymorphisms (SNPs)
• S�Ps are used f�r idetificati� ad f�resics
• S�Ps are used f�r �appig ad ge��e)wide ass�ciati� studies �f c��p�ex diseases
• S�Ps are used f�r esti�atig predisp�siti� t� disease
• S�Ps are used f�r i��igrati� & citi+eship i the U-
• S�Ps are used t� predict specific geetic traits
• S�Ps are used f�r c�assifyig patiets i c�iica� tria�s
GCTGTATGACTAGAAGATCGATGCTGTATGACGAGAAGATCGAT
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Types �f S�Pshttp$%%www'cbi'��'ih'g�v%sites%etre+0db1sp
• ��c�dig S�Ps• 5’ UTR
• 3’ UTR
• Itr�s
• Itergeic Regi�s
• Regu�at�ry• Sp�icig
• Trascripti�a� regu�ati� (pr���ter & TF bidig sites)
• Tras�ati�a� regu�ati� (iitiati� �r ter�iati�)
• C�dig S�Ps• Sy�y��us S�Ps (third p�siti� variati�)
• Rep�ace�et S�Ps (chage A�i� acid)
SNPs
Ciclo vitale di uno SNP:
• Comparsa
• Sopravvivenza
• Aumento di frequenza
• FISSAZIONE
284 mila anni
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SNPs = Single Nucleotide Polymorphisms
• Silenti o Sinonime =
•
•
Sostituzione che NON altera la codifica di un aa
Non-sinonime o missenso = Sostituzione che altera la codifica di un aa
• Non-senso = Sostituzione che trasforma un codone per un aa in uno diSTOP
Frameshift = Indel nella regione codificante che causa lo slittamento della
lettura del codice genetico (le più dannose)
� GCTGTATGACTAGAAGATCGAT� GCTGTATGACGAGAAGATCGAT
SNPs = Single Nucleotide Polymorphisms
• Polimorfismo più abbondante
Basso tasso di mutazione: prevalentemente loci biallelici
• Sono meno variabili se comparati ai microsatelliti ma questo
limite è compensato dalla loro frequenza e dalla
facilità di isolamento.
� GCTGTATGACTAGAAGATCGAT� GCTGTATGACGAGAAGATCGAT
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SNPs = Single Nucleotide Polymorphisms
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Genotyping Technologies
1. RFLP
2. PCR (allele specific primers)
3. Oligonucleotide ligation
4. Primer extension (incorporate labeled nucleotides)
5. Hybridization (microarray)
6. Taqman (RT-PCR)
7. Sequencing (whole genome or targeted)
8. Genotyping by sequencing
……and many other ones !!!
SNPs SNP: PCR e Restriction Fragment Length Polymorphisms
The presence of RFLP is inferred from changes in fragment sizes.
1 2
A B C
+ -AGATCT A TATCTTCTAGA TATAGA
1 2 Size Number+ + A,B,C 3+ - A, (B+C) 2- + (A+B), C 2- - (A+B+C) 1
+/+ +/- -/+ -/-
Polymorphism
Restriction site
Gel band
pattern
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SNP: PCR and
sequencing
N
Sito di
eterozigosi
C/G
individuo
omozigote CC
individuo
eterozigote
SNP: PCR and sequencing
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5′ AGTCTG 5′ AG(T/A)CTG 5′ AGACTG
T/T T/A A/A
SNP Detection by Sequencing1. Elevata riproducibilità
2. CO-DOMINANTI
3. EREDITA’ MENDELIANA
4. Molto frequente nel genoma e presenti in tutte le
regioni
5. Elevate potenzialità con NGS
1. Svantaggi: problemi si sequenziamento
1. Richiede informazioni a priori (seq.fiancheggianti)
2. Poco variabili
Vantaggi:SNPs
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Types of Polymorphic DNA Sequences
•RFLP: restriction fragment length polymorphisms
•VNTR: variable number tandem repeats (8 to >50 base pairs)
•STR: short tandem repeats (1–8 base pairs)
•SNP: single-nucleotide polymorphisms
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Identificazione delle persone disperse nel World trade
center (NYC) in seguito all’attacco terroristico del 11/9
• Sono stati generati
– 52,000 profili STR
– 44,000 profili mtDNA
– 17,000 profili SNPs
• 850/1594
• vittime identificate
grazie all’analisi del
DNA
Test di parentelaMini STR: MiniFiler PCR
AmpFℓSTR® MiniFiler ™ PCR Amplification
The primers amplify the STR
loci:
1. D13S317,
2. D7S820,
3. D2S1338,
4. D21S11,
5. D16S539,
6. D18S51,
7. CSF1PO,
8. FGA,
9. Amelogenin
Convalidato secondo le norme FBI