DNA Damage-trigger p53-Nelson 1994

8/13/2019 DNA Damage-trigger p53-Nelson 1994

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M O L E C U L A R A N D C E L L UL A R B I OL OG Y , M a r. 1 9 9 4 , p . 1 8 1 5 - 1 8 2 3 V o l . 1 4 , N o . 30 2 7 0 - 7 3 0 6 / 9 4 / 0 4 . 0 0 + 0C o p y r i g h t © 1 9 9 4 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

DNA S t r a n d B r e a k s : t h e DNA T e m p l a t e A l t e r a t i o n s T h a tT r i g g e r p 5 3 - D e p e n d e n t DNA Damage R e s p o n s e P a t h w a y sWILLIAM G . NELSON* A N D MICHAEL B . KASTAN

T h e J o h n s H o p k i n s O n c o l o g y C e n t e r , T h e J o h n s H o p k i n s U n i v e r s i t y S c h o o l o f M e d i c i n e , B a l t i m o r e , M a r y l a n d 2 1 2 8 7R e c e i v e d 1 4 S e p t e m b e r 1 9 9 3 / R e t u r n e d f o r m o d i f i c a t i o n 5 N o v e m b e r 1 9 9 3 / A c c e p t e d 2 4 N o v e m b e r 1 9 9 3

T h e t u m o r s u p p r e s s o r p r o t e i n p 5 3 s e r v e s a s a c r i t i c a l r e g ul a t o r o f a G 1 c e l l c y c l e c h e c k p o i n t a n d o f a p o p t o s i sf o l l o w i n g e x p o s u r e o f c e l l s t o D N A - d a m a g i n g a g e n t s . T h e m e c h a n i s m b y w h i c h D N A - d a m a g i n g a g e n t s e l e v a t ep 5 3 p r o t e i n l e v e l s t o t r i g g e r G 1 / S a r r e s t o r c e l l d e a t h r e m a i n s t o b e e l u c i d a t e d . I n f a c t , w h e t h e r d a m a g e t o t h eD NA t e m p l a t e i t s e l f p a r t i c i p a t e s i n t r a n s d u c i n g t h e s i g n a l l e a d i n g t o p 5 3 i n d u c t i o n h a s n o t y e t b e e nd e m o n s t r a t e d . We e x p o s e d human c e l l l i n e s c o n t a i n i n g w i l d - t y p e p 5 3 a l l e l e s t o s e v e r a l d i f f e r e n t D N A - d a m a g i n ga g e n t s a n d f o u n d t h a t a g e n t s w h i c h r a p i d l y i n d u c e D NA s t r a n d b r e a k s , s u c h a s i o n i z i n g r a d i a t i o n , b l e o m y c i n ,a n d DNA t o p o i s o m e r a s e - t a r g e t e d d r u g s , r a p i d l y t r i g g e r e d p 5 3 p r o t e i n e l e v a t i o n s . I n a d d i t i o n , w e d e t e r m i n e dt h a t c a m p t o t h e c i n - s t i m u l a t e d t r a p p i n g o f t o p o i s o m e r a s e I-DNA c o m p l e x e s w a s n o t s u f f i c i e n t t o e l e v a t e p 5 3p r o t e i n l e v e l s ; r a t h e r , r e p l i c a t i o n - a s s o c i a t e d D NA s t r a n d b r e a k s w e r e r e q u i r e d . F u r t h e r m o r e , t r e a t m e n t o fc e l l s w i t h t h e a n t i m e t a b o l i t e N ( p h o s p h o n o a c e t y l ) - L - a s p a r t a t e ( P A L A ) d i d n o t c a u s e r ap i d p 5 3 p r o t e i ni n c r e a s e s b u t r e s u l t e d i n d e l a y e d i n c r e a s e s i n p 5 3 p r o t e i n l e v e l s t e m p o r a l l y c o r r e l a t e d w i t h t h e a p p e a r a n c e o fD NA s t r a n d b r e a k s . F i n a l l y , w e c o n c l u d e d t h a t D NA s t r a n d b r e a k s w e r e s u f f i c i e n t f o r i n i t i a t i n g p 5 3 - d e p e n d e n ts i g n a l t r a n s d u c t i o n a f t e r f i n d i n g t h a t i n t r o d u c t i o n o f n u c le a s e s i n t o c e l l s b y e l e c t r o p o r a t i o n s t i m u la t e d r a pi dp 5 3 p r o t e i n e l e v a t i o n s . W h i l e D NA s t r a n d b r e a k s a p p e a r e d t o b e c a p a b l e o f t r i g g e r i n g p 5 3 i n d u c t i o n , D NAl e s i o n s o t h e r t h a n s t r a n d b r e a k s d i d n o t . E x p o s u r e o f n o r m a l c e l l s a n d e x c i s i o n r e p a i r - d e f i c i e n t x e r o d e r m ap i g m e n t o s u m c e l l s t o l o w d o s e s o f UV l i g h t , u n d e r c o n d i t i o n s i n w h i c h t h y m i n e d i m e r s a p p e a r b u t D NAr e p l i c a t i o n - a s s o c i a t e d s t r a n d b r e a k s w e r e p r e v e n t e d , r e s u l t e d i n p 5 3 i n d u c t i o n a t t r i b u t a b l e t o D NA s t r a n db r e a k s a s s o c i a t e d w i t h e x c i s i o n r e p a i r . O u r d a t a i n d i c a t e t h a t D NA s t r a n d b r e a k s a r e s u f f i c i e n t a n d p r o b a b l yn e c e s s a r y f o r p 5 3 i n d u c t i o n i n c e l l s w i t h w i l d - t y p e p 5 3 a l l e l e s e x p o s e d t o D N A - d a m a g i n g a g e n t s .L i v i n g o r g a n i s m s p e r s i s t e n t l y e n c o u n t e r m y r i a d t h r e a t s t og e n o m e i n t e g r i t y . P e r h a p s t o p e r m i t r e p a i r o f DNA t e m p l a t ed a m a g e b e f o r e DNA r e p l i c a t i o n a n d m i t o t i c c h r o m o s o m es e g r e g a t i o n , m o s t c e l l s d e l a y t r a n s i t t h r o u g h t h e c e l l c y c l e i nr e s p o n s e t o DNA d a m a g e ( 3 6 , 3 9 , 4 9 , 5 9 , 6 2 ) . C e l l c y c l e

c h e c k p o i n t s m a n i f e s t a t t h e t r a n s i t i o n f r o m G , t o S a n d f r o mG 2 t o M may f a c i l i t a t e t h e m a i n t e n a n c e o f DNA s e q u e n c ef i d e l i t y t h r o u g h r e p a i r a n d p r e v e n t t h e a c c u m u l a t i o n o f h e r i -t a b l e DNA t e m p l a t e a l t e r a t i o n s . F o r e x a m p l e , G 2 c h e c k p o i n td e f e c t s i n m u t a n t s t r a i n s o f E s c h e r i c h i a c o l i a s w e l l a s S a c c h a -r o m y c e s c e r e v i s i a e a r e a c c o m p a n i e d b y i n c r e a s e d g e n e t i c i n s t a -b i l i t y ( 2 4 , 2 8 , 3 1 , 6 2 , 6 3 , 6 5 ) . E v i d e n c e h a s a c c u m u l a t e d t oi m p l i c a t e t h e t u m o r s u p p r e s s o r p r o t e i n p 5 3 a s a m a j o r r e g u -l a t o r o f t h e G , c e l l c y c l e c h e c k p o i n t i n m a m m a l i a n c e l l s : c e l l sw i t h w i l d - t y p e p 5 3 g e n e s e x h i b i t t r a n s i e n t i n c r e a s e s i n p 5 3p r o t e i n l e v e l s a c c o m p a n y i n g G , a r r e s t i n r e s p o n s e t o i o n i z i n gr a d i a t i o n , w h e r e a s c a n c e r c e l l s h a r b o r i n g m u t a n t p 5 3 g e n e s f a i lt o a r r e s t i n G , f o l l o w i n g - y i r r a d i a t i o n ( 3 4 , 3 8 ) . I n a d d i t i o n ,w h i l e i n t r o d u c t i o n o f cDNA e n c o d i n g w i l d - t y p e p 5 3 i n t on e o p l a s t i c c e l l s l a c k i n g p 5 3 g e n e s r e s t o r e s G , a r r e s t f o l l o w i n gDNA d a m a g e , o v e r e x p r e s s i o n o f m u t a n t p 5 3 p r o t e i n i n t u m o rc e l l s c o n t a i n i n g w i l d - t y p e p 5 3 g e n e s a b r o g a t e s t h e DNA d a m -a g e - i n d u c e d G 1 a r r e s t ( 3 8 ) . F u r t h e r m o r e , e m b r y o n i c f i b r o -b l a s t s d e r i v e d f r o m m i c e c a r r y i n g d i s r u p t e d p 5 3 g e n e s l a c k t h eG I c e l l c y c l e c h e c k p o i n t ( 3 5 ) .R e c e n t d a t a h a v e a l s o i m p l i c a t e d p 5 3 a s a c r i t i c a l d e t e r m i -n a n t o f c e l l f a t e f o l l o w i n g c e r t a i n t y p e s o f DNA d a m a g e ( 1 3 ,4 4 ) . F o r e x a m p l e , w h i l e m u r i n e t h y m o c y t e s e x p o s e d t o i o n i z i n g

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r . M a i l i n g a d d r e s s : T h e J o h n s H o p k i n s O n -c o l o g y C e n t e r , T h e J o h n s H o p k i n s U n i v e r s i t y S c h o o l o f M e d i c i n e , 6 0 0N o r t h W o l f e S t . , B a l t i m o r e , MD 2 1 2 8 7 . P h o n e : ( 4 1 0 ) 6 1 4 - 1 6 6 3 . F a x :( 4 1 0 ) 9 5 5 - 0 8 3 3 .

r a d i a t i o n u n d e r g o a p r o c e s s r e s e m b l i n g p r o g r a m m e d c e l ld e a t h ( a p o p t o s i s ) , t h y m o c y t e s c a r r y i n g d i s r u p t e d p 5 3 g e n e sa p p e a r e d i n c a p a b l e o f r a p i d l y t r i g g e r i n g t h i s c e l l d e a t h p a t h -w a y ( 1 3 , 4 4 ) . W h e t h e r DNA d a m a g e a c t i v a t e s a p 5 3 - d e p e n -d e n t s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y l e a d i n g t o G 1 a r r e s t o r t oa p o p t o s i s c o u l d d e p e n d o n t h e c e l l t y p e a n d p h y s i o l o g i c s t a t e( 5 5 ) . H o w e v e r , b o t h p a t h w a y s a r e l i k e l y t o s h a r e o n e o r moreo f t h e s t e p s i n v o l v e d i n p 5 3 i n d u c t i o n a n d p 5 3 f u n c t i o nf o l l o w i n g DNA d a m a g e .A c r i t i c a l s t e p i n t h e p 5 3 - d e p e n d e n t p a t h w a y c u l m i n a t i n g i nc e l l c y c l e a r r e s t a p p e a r s t o i n v o l v e DNA d a m a g e - i n d u c e di n c r e a s e s i n n u c l e a r w i l d - t y p e p 5 3 p r o t e i n l e v e l s b y a p o s t t r a n -s c r i p t i o n a l m e c h a n i s m ( 3 4 , 3 5 , 3 8 ) . I n d u c e d w i l d - t y p e p 5 3p r o t e i n may t h e n f u n c t i o n i n a c e l l c y c l e c h e c k p o i n t p a t h w a y o ra p o p t o s i s p a t h w a y t o r e g u l a t e t h e e x p r e s s i o n o f g e n e s a s s o c i -a t e d w i t h g r o w t h a r r e s t o r p r o g r a m m e d c e l l d e a t h . F o r e x a m -p l e , g a d d 4 5 , o n e o f s e v e r a l g r o w t h a r r e s t a n d DNA d a m a g e -i n d u c i b l e g e n e s t h u s f a r i d e n t i f i e d , i s i n d u c e d i n c o o r d i n a t i o nw i t h g r o w t h a r r e s t i n m a m m a l i a n c e l l s f o l l o w i n g s e r u m d e p r i -v a t i o n o r a s a c o n s e q u e n c e o f DNA d a m a g e ( 2 0 , 2 1 ) ; g a d d 4 5i n d u c t i o n b y i o n i z i n g r a d i a t i o n i s a p 5 3 - d e p e n d e n t p r o c e s s a n dmay b e a c o n s e q u e n c e o f d i r e c t t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n o fg a d d 4 5 mRNA s y n t h e s i s b y w i l d - t y p e p 5 3 p r o t e i n ( 3 5 ) . How-e v e r , a r e q u i r e m e n t f o r g a d d 4 5 i n e i t h e r r a d i a t i o n - i n d u c e d c e l lc y c l e a r r e s t o r c e l l d e a t h h a s n o t y e t b e e n d e m o n s t r a t e d .S e v e r a l s t u d i e s h a v e s u g g e s t e d t h a t a v a r i e t y o f DNA-d a m a g i n g a g e n t s a c t t o e l e v a t e p 5 3 p r o t e i n l e v e l s a n d / o rp 5 3 - s p e c i f i c DNA b i n d i n g a c t i v i t y i n c e l l s w i t h w i l d - t y p e p 5 3a l l e l e s ( 2 3 , 3 4 , 4 7 , 5 8 , 6 7 ) . U n f o r t u n a t e l y , t h e m e c h a n i s m o fp 5 3 i n d u c t i o n r e m a i n s u n c l e a r : i n c r e a s e s i n p 5 3 p r o t e i n l e v e l sc a u s e d b y D N A - d a m a g i n g a g e n t s c o u l d b e t r i g g e r e d b y as p e c i f i c DNA l e s i o n ( o r b y s e v e r a l s p e c i f i c DNA l e s i o n s ) , b ya n y g e n e r a l DNA h e l i x d i s t o r t i o n , o r b y some o t h e r s i g n a l

1 8 1 5


2/9

1 8 1 6 NELSON AND KASTANt r a n s d u c t i o n p r o c e s s i n d e p e n d e n t o f DNA t e m p l a t e d a m a g e .A r e q u i r e m e n t f o r a s p e c i f i c DNA l e s i o n t o e l e v a t e p 5 3 p r o t e i nl e v e l s m i g h t o f f e r a c o n s i d e r a b l e e c o n o m y t o d a m a g e d c e l l s b yl i m i t i n g t h e r e q u i r e d r e p e r t o i r e o f DNA d a m a g e r e c o g n i t i o nf u n c t i o n s n e c e s s a r y f o r i n i t i a t i o n o f t h e p 5 3 - d e p e n d e n t c e l lc y c l e c h e c k p o i n t o r a p o p t o s i s p a t h w a y . F u r t h e r m o r e , a n u n -d e r s t a n d i n g o f t h e m e c h a n i s m s o f p 5 3 i n d u c t i o n c o u l d p r o v i d ep r o f o u n d new i n s i g h t s i n t o h o w t h e p 5 3 - d e p e n d e n t G 1 c e l lc y c l e c h e c k p o i n t p a t h w a y o r p 5 3 - d e p e n d e n t a p o p t o s i s m i g h tb e m a n i p u l a t e d t h e r a p e u t i c a l l y f o r t h e p u r p o s e o f i m p r o v i n ghuman c a n c e r p r e v e n t i o n a n d c a n c e r t r e a t m e n t . T o d e t e r m i n ew h e t h e r some s p e c i f i c DNA t e m p l a t e l e s i o n ( s ) m i g h t b er e s p o n s i b l e f o r e l e v a t i n g w i l d - t y p e p 5 3 p r o t e i n l e v e l s i n c e l l sf o l l o w i n g e x p o s u r e t o D N A - d a m a g i n g a g e n t s , we a s s e s s e d p 5 3p r o t e i n l e v e l s i n h u m a n c e l l l i n e s c o n t a i n i n g w i l d - t y p e p 5 3f o l l o w i n g e x p o s u r e t o a d i v e r s e c o l l e c t i o n o f d i f f e r e n t DNA-d a m a g i n g a g e n t s . We r e p o r t h e r e t h a t DNA s t r a n d b r e a k s mayb e t h e c r i t i c a l DNA t e m p l a t e i n s u l t common t o m a n y d i f f e r e n tD N A - d a m a g i n g a g e n t s c a p a b l e o f t r i g g e r i n g p 5 3 i n d u c t i o n .

MATERIALS AND METHODSC e l l l i n e s a n d c e l l c u l t u r e . ML-1 m y e l o i d l e u k e m i a c e l l sw e r e p r o p a g a t e d i n s u s p e n s i o n i n RPMI 1 6 4 0 ( G i b c o BRL)s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0 f e t a l c a l f s e r u m . LNCaP p r o s t a t i ca d e n o c a r c i n o m a c e l l s ( 2 9 ) ( g e n e r o u s l y p r o v i d e d b y W i l l i a m B .I s a a c s , J o h n s H o p k i n s U n i v e r s i t y S c h o o l o f M e d i c i n e , B a l t i -m o r e , M d . ) w e r e a l s o c u l t i v a t e d i n RPMI 1 6 4 0 w i t h 1 0 f e t a lc a l f s e r u m . B o t h o f t h e s e h u m a n c a n c e r c e l l l i n e s c o n t a i nw i l d - t y p e p 5 3 a l l e l e s ( 3 2 , 3 4 ) . N o r m a l h u m a n l y m p h o b l a s t o i dc e l l l i n e GM 2 1 8 4 a n d x e r o d e r m a p i g m e n t o s u m ( X P ) l y m p h o -b l a s t o i d c e l l l i n e GM 2 2 5 0 w e r e o b t a i n e d f r o m t h e N a t i o n a lI n s t i t u t e o f G e n e r a l M e d i c a l S c i e n c e s Human G e n e t i c M u t a n tC e l l R e p o s i t o r y ( C a m d e n , N . J . ) . S u s p e n s i o n c u l t u r e s o f l y m -p h o b l a s t o i d c e l l s w e r e m a i n t a i n e d i n RPMI 1 6 4 0 w i th 10f e t a l c a l f s e r u m .E x p o s u r e t o D N A - d a m a g i n g a g e n t s . H y d r o x y u r e a w a s g e n -e r o u s l y p r o v i d e d b y J o h n T . I s a a c s ( J o h n s H o p k i n s U n i v e r s i t y ) ,t e n i p o s i d e ( V M 2 6 ) was s u p p l i e d b y L e r o y F . L i u ( R o b e r tWood J o h n s o n S c h o o l o f M e d i c i n e , New B r u n s w i c k , N . J . ) ,N ( p h o s p h o n o a c e t y l ) - L - a s p a r t a t e ( P A L A ) w a s p r o v i d e d b yT h e a T l s t y ( U n i v e r s i t y o f N o r t h C a r o l i n a , C h a p e l H i l l ) , a n d4 - h y d r o p e r o x y c y c l o p h o s p h a m i d e w a s s u p p l i e d b y 0 . M i c h a e lC o l v i n ( J o h n s H o p k i n s U n i v e r s i t y ) . C y t o s i n e a r a b i n o s i d e w a so b t a i n e d f r o m U p j o h n , b l e o m y c i n w a s a c q u i r e d f r o m MeadJ o h n s o n , e t o p o s i d e ( V P - 1 6 ) w a s o b t a i n e d f r o m B r i s t o l L a b o -r a t o r i e s , a n d m e t h o t r e x a t e , m e t h y l m e t h a n e s u l f o n a t e , c a m p t o -t h e c i n , d o x o r u b i c i n , d a u n o r u b i c i n , r e c o m b i n a n t h u m a n t u m o rn e c r o s i s f a c t o r , m i t o m y c i n , v i n b l a s t i n e , d i m e t h y l s u l f o x i d e ,c a f f e i n e , 2 - a m i n o p u r i n e , a p h i d i c o l i n , a c t i n o m y c i n D , a n de t h i d i u m b r o m i d e w e r e a l l o b t a i n e d f r o m t h e S i g m a C h e m i c a lC o . C u l t u r e d human c e l l s w e r e e x p o s e d t o t h e s e d i f f e r e n ta g e n t s i n c o m p l e t e g r o w t h medium a s d e s c r i b e d i n t h e f i g u r e

l e g e n d s . C e l l s w e r e e x p o s e d t o i o n i z i n g r a d i a t i o n b y t r e a t m e n ti n a 1 3 7 C s - y i r r a d i a t o r a t a d o s e r a t e o f a p p r o x i m a t e l y 1G y / m i n . F o r t r e a t m e n t s w i t h UV l i g h t , c e l l s w a s h e d w i t hp h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e w e r e e x p o s e d t o a g e r m i c i d a l l i g h ts o u r c e t o t h e d e s i r e d UV d o s e ( w i t h t h e f l u x a t 2 5 4 n mm e a s u r e d i n e a c h e x p e r i m e n t w i t h a UV m e t e r [ m o d e l J - 2 2 5 ;UV P r o d u c t s , I n c . , S a n G a b r i e l , C a l i f . ) .E l e c t r o p o r a t i o n o f n u c l e a s e s i n t o ML-1 c e l l s . N u c l e a s e swere i n t r o d u c e d i n t o ML-1 c e l l s b y e l e c t r o p o r a t i o n ( 1 2 , 4 8 ,6 4 ) . B r i e f l y , ML-1 c e l l s s u s p e n d e d i n g r o w t h medium w e r ec o l l e c t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 1 0 , 0 0 0 x g , w a s h e d i n e l e c t r o -p o r a t i o n b u f f e r ( 2 7 2 mM s u c r o s e a n d 1 mM M g C l 2 i n 7 mMp o t a s s i u m p h o s p h a t e , pH 7 . 4 ) , a n d t h e n r e s u s p e n d e d i n e l e c -

t r o p o r a t i o n b u f f e r c o n t a i n i n g n u c l e a s e s o r a p p r o p r i a t e n u c l e -a s e s t o r a g e b u f f e r s . F o u r - m i l l i m e t e r - d i a m e t e r c u v e t t e s c o n -t a i n i n g 1 0 6 c e l l s i n 0 . 8 m l w e r e t r e a t e d i n a B i o - R a de l e c t r o p o r a t o r s e t t o d e l i v e r 3 0 0 V a t 5 0 0 , u F . F o l l o w i n ge l e c t r o p o r a t i o n , t h e c e l l s w e r e i n c u b a t e d a t 3 7 ° C f o r 3 0 m i n i ne l e c t r o p o r a t i o n b u f f e r a n d t h e n a t 3 7 ° C i n g r o w t h m e d i u mb e f o r e b e i n g a s s e s s e d f o r w i l d - t y p e p 5 3 p r o t e i n l e v e l s v i ai m m u n o b l o t a n a l y s i s .I m m u n o b l o t a n a l y s i s f o r p 5 3 p r o t e i n l e v e l s . A t t a c h e d c e l l sw e r e c o l l e c t e d f o r i m m u n o b l o t a n a l y s i s f o l l o w i n g t r e a t m e n tw i t h D N A - d a m a g i n g a g e n t s b y s c r a p i n g m o n o l a y e r c u l t u r e sw i t h a r u b b e r p o l i c e m a n . D i s l o d g e d m o n o l a y e r c e l l s i n H a n k s 'b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n o r c e l l s f r o m s u s p e n s i o n c u l t u r e s w e r et h e n c o l l e c t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 1 4 , 0 0 0 x g f o r 1 0 m i n a troom t e m p e r a t u r e . C e l l p e l l e t s w e r e l y s e d i n s a m p l e b u f f e r( 2 s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e , 10 g l y c e r o l , a n d 1 0 mM d i t h i o -t h r e i t o l i n 6 2 mM T r i s - H C l , pH 6 . 8 ) b y h e a t i n g t o 9 5 ° C f o r a tl e a s t 1 0 m i n . DNA c o n t e n t o f c e l l l y s a t e s w a s e s t i m a t e d b y ad i p h e n y l a m i n e a s s a y 9 . E q u i v a l e n t c e l l e x t r a c t s w e r e e l e c t r o -p h o r e s e d o n 1 0 p o l y a c r y l a m i d e g e l s , t r a n s f e r r e d t o n i t r o c e l -l u l o s e f i l t e r s ( H y b o n d - E C L ; A m e r s h a m ) b y u s i n g a s e m i d r ye l e c t r o b l o t t e r ( M i l l i p o r e ) , a n d t h e n a s s e s s e d f o r p 5 3 p r o t e i nl e v e l s b y i m m u n o b l o t a n a l y s i s u s i n g a m i x t u r e o f a n t i - p 5 3p r o t e i n a n t i b o d i e s A b - 1 a n d A b - 2 ( O n c o g e n e S c i e n c e s ) i n am a n n e r p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 3 5 , 3 7 ) . I f n e c e s s a r y , i m m u n o -b l o t s w e r e r e p r o c e s s e d f o r e x p r e s s i o n o f DNA t o p o i s o m e r a s eI b y u s i n g human s c l e r o d e r m a a n t i s e r u m ( 5 4 ) ( s u p p l i e d b yW i l l i a m C . E a r n s h a w , J o h n s H o p k i n s U n i v e r s i t y ) o r f o r e x -p r e s s i o n o f g l u t a t h i o n e S - t r a n s f e r a s e a r b y u s i n g s p e c i f i c r a b b i ta n t i s e r u m ( O n c o r ) .

RESULTSA v a r i e t y o f a g e n t s e l e v a t e w i l d - t y p e p 5 3 l e v e l s i n humanc e l l s . To a s c e r t a i n w h a t t y p e s o f DNA d a m a g e t r i g g e r p 5 3p r o t e i n i n d u c t i o n i n c e l l s c o n t a i n i n g w i l d - t y p e p 5 3 , we s t u d i e dt h e e f f e c t s o f s e v e r a l d i f f e r e n t a g e n t s o n w i l d - t y p e p 5 3 p r o t e i ne x p r e s s i o n i n t h e human p r o s t a t i c a d e n o c a r c i n o m a c e l l l i n eLNCaP a n d t h e human m y e l o i d l e u k e m i a c e l l l i n e M L - 1 . I np r e v i o u s s t u d i e s , w i l d - t y p e p 5 3 e l e v a t i o n s w e r e d e t e c t a b l e i nl e s s t h a n 1 h a f t e r e x p o s u r e o f ML-1 c e l l s t o y i r r a d i a t i o n ( 3 4 ) .I n t h i s s t u d y , we d e t e c t e d r a p i d s i g n i f i c a n t e l e v a t i o n s i n p 5 3l e v e l s w i t h i n 2 t o 3 h a f t e r t r e a t m e n t w i t h b l e o m y c i n ( F i g . 1 B ,l a n e 2 ) , a c t i n o m y c i n D ( F i g . 1 A , l a n e 6 ) , e t o p o s i d e ( F i g . 1 B ,l a n e 5 ) , t e n i p o s i d e ( F i g . 1 A , l a n e 8 ) , d o x o r u b i c i n ( F i g . 1 A , l a n e9 ) , a n d c a m p t o t h e c i n ( F i g . 1 A , l a n e 7 , a n d F i g . 1 B , l a n e 8 ) . Nos i g n i f i c a n t p 5 3 i n d u c t i o n w a s d i s c e r n i b l e i n t h e s e c e l l s a t t h e s ee a r l y t i m e p o i n t s a f t e r t r e a t m e n t w i t h h y d r o x y u r e a ( F i g . 1 A ,l a n e 3 ) , r e c o m b i n a n t human t u m o r n e c r o s i s f a c t o r ( F i g . 1 A ,l a n e 5 ) , m i t o m y c i n ( F i g . 1 A , l a n e 4 ) , v i n b l a s t i n e ( F i g . 1 A , l a n e2 ) , e t h i d i u m b r o m i d e ( F i g . 1 A , l a n e 1 0 ) , m e t h y l m e t h a n e s u l -f o n a t e ( F i g . 1 B , l a n e 6 ) , d a u n o r u b i c i n ( F i g . 1 B , l a n e 7 ) , o r4 - h y d r o p e r o x y c y c l o p h o s p h a m i d e ( F i g . 1 B , l a n e 3 ) . T h e s e s t u d -

i e s s u g g e s t e d t h a t a g e n t s c a p ab le o f d i r e c t l y c a u s i n g DNAs t r a n d s c i s s i o n ( s u c h a s b l e o m y c i n o r y i r r a d i a t i o n ) w e r e m o r ee f f e c t i v e a t r a p i d l y e l e v a t i n g w i l d - t y p e p 5 3 l e v e l s t h a n a g e n t st h a t c r e a t e DNA s t r a n d c r o s s - l i n k s ( m i t o m y c i n a n d 4 - h y -d r o p e r o x y c y c l o p h o s p h a m i d e ) , i n d u c e DNA b a s e m o d i f i c a t i o n s( m e t h y l m e t h a n e s u l f o n a t e ) , i n t e r c a l a t e i n t o t h e DNA h e l i x( e t h i d i u m b r o m i d e ) , o r o t h e r w i s e i n t e r f e r e w i t h t h e c e l l c y c l eo r c e l l u l a r m e t a b o l i s m ( h y d r o x y u r e a , v i n b l a s t i n e , a n d t u m o rn e c r o s i s f a c t o r ) . I n a d d i t i o n , t o p o i s o m e r a s e - t a r g e t e d d r u g s( a c t i n o m y c i n D , d o x o r u b i c i n , t e n i p o s i d e , a n d c a m p t o t h e c i n )a p p e a r e d t o a c t r a p i d l y t o e l e v a t e p 5 3 l e v e l s a t t h e d o s e ss t u d i e d . Of i n t e r e s t , t h e t o p o i s o m e r a s e - t a r g e t e d d r u g d a u n o -r u b i c i n ( F i g . 1 B , l a n e 7 ) , a c o m p o u n d r e l a t e d t o d o x o r u b i c i n

M O L . C E L L . B I O L .


3/9

DNA STRAND BREAKS AND p 5 3 INDUCTION 1 8 1 7

A . LNCoP c e l l s- J0

-jL ) > I F-

A .o 0 c r

. H N x CQ X > o L< u > c j w- p 5 3

2 3 4 5 6 7 8 9 1 0B . M L - 1 c e l l s

- J0z0 -

CPT e x p o s u r e d u r a t i o n , h r so C 4 V OD c -

_ - p 5 31 2 3 4 5 6

C .J I F - C 2 z CLC ¢ M > 2 a 0

- ; - p 5 31 2 3 4 5 6 7 8

F I G . 1 . S e v e r a l d i f f e r e n t a g e n t s t r i g g e r p 5 3 e l e v a t i o n s i n humanc a n c e r c e l l s w i t h w i l d - t y p e p 5 3 a l l e l e s . P r o t e i n - c o n t a i n i n g e x t r a c t s w e r ep r e p a r e d f r o m LNCaP p r o s t a t i c a d e n o c a r c i n o m a c e l l s ( A ) a n d ML- 1m y e l o i d l e u k e m i a c e l l s ( B ) e x p o s e d t o v a r i o u s a g e n t s i n c o m p l e t eg r o w t h m e d i u m . E x t r a c t s c o n t a i n i n g 1 0 , u g o f c e l l u l a r DNA ( A ) o rp r e p a r e d f r o m 2 x 1 0 6 c e l l s ( B ) w e r e e l e c t r o p h o r e s e d o n p o l y a c r y l -a m i d e g e l s , t r a n s f e r r e d t o n i t r o c e l l u l o s e f i l t e r s , a n d t h e n e v a l u a t e d f o rp 5 3 p r o t e i n e x p r e s s i o n b y i m m u n o b l o t a n a l y s i s w i t h a n t i - p 5 3 a n t i b o d -i e s a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . ( A ) I m m u n o r e a c t i v e p 5 3l e v e l s i n LNCaP e x t r a c t s f o l l o w i n g t r e a t m e n t f o r 2 h w i t h 0 . 1 d i m e t h y l s u l f o x i d e CONTROL, l a n e 1 , , u M v i n b l a s t i n e ( V I N B L ,l a n e 2 ) , 2 mM h y d r o x y u r e a ( H U , l a n e 3 ) , 1 p L g o f m i t o m y c i n p e r m l MMC, l a n e 4 ) , 1 0 0 U n i t s o f r e c o m b i n a n t human t u m o r n e c r o s i sf a c t o r p e r m l ( T N F , l a n e 5 ) , 1 , u M a c t i n o m y c i n D ACT D , l a n e 6 ) , 1p . M c a m p t o t h e c i n ( C P T , l a n e 7 ) , 1 p . M t e n i p o s i d e ( V M 2 6 , l a n e 8 ) , 1, u M d o x o r u b i c i n DOX, l a n e 8 ) , a n d , u M e t h i d i u m b r o m i d e ( E T B R ,l a n e 1 0 ) . B p 5 3 l e v e l s d e t e c t e d i n M L - 1 c e l l s a f t e r 3 h o f t r e a t m e n tw i t h g r o w t h m e d i u m a l o n e CONTROL, l a n e 1 , 0 . 0 6 U o f b l e o m y c i np e r m l ( B L E O , l a n e 2 , 0 . 5 p . g o f 4 - h y d r o p e r o x y c y c l o p h o s p h a m i d e p e rm l ( 4 - H C , l a n e 3 ) , 1 0 nM m e t h o t r e x a t e ( M T X , l a n e 4 ) , 1 0 n g o fe t o p o s i d e p e r m l ( V P 1 6 , l a n e 5 ) , 1 0 j i g o f m e t h y l m e t h a n e s u l f o n a t e MMS, l a n e 6 ) , 1 0 n M d a u n o r u b i c i n ( D N R , l a n e 7 , a n d 1 0 p . Mc a m p t o t h e c i n ( C P T , l a n e 8 .

( F i g . I A , l a n e 9 ) , f a i l e d t o t r i g g e r s i g n i f i c a n t p 5 3 p r o t e i ni n c r e a s e s i n t h e s e c e l l s a t t h e t i m e a n d l o w ( 1 0 n M ) d o s es t u d i e d . F u r t h e r m o r e , a c t i n o m yc i n D ( F i g . I A , l a n e 6 ) t r e a t -m e n t o f LNCaP c e l l s ( w i t h 1 , . M a c t i n o m y c i n D f o r 2 h )a p p e a r e d t o r e s u l t i n a more r a p i d i n d u c t i o n o f w i l d - t y p e p 5 3l e v e l s t h a n h a d b e e n o b s e r v e d f o r ML-1 a n d RKO c e l l sp r e v i o u s l y ( t r e a t e d w i t h l e s s t h a n n M a c t i n o m y c i n D f o r u pt o 2 4 h [ 3 4 ] ) . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e d a t a s u g g e s t t h a t t o p o i -s o m e r a s e - t a r g e t e d d r u g s may h a v e d i f f e r e n t p 5 3 i n d u c t i o na c t i v i t i e s i n d i f f e r e n t c e l l s , a t d i f f e r e n t d o s e s , a n d a f t e r d i f f e r e n te x p o s u r e d u r a t i o n s .C a f f e i n e h a s b e e n f o u n d b o t h t o a b r o g a t e t h e G 1 ( 3 4 ) a n dG 2 ( 3 9 , 6 1 ) c e l l c y c l e c h e c k p o i n t s a c t i v a t e d b y D N A - d a m a g i n ga g e n t s a n d t o i n c r e a s e t h e c y t o t o x i c i t y o f many D N A - d a m a g i n ga g e n t s ( 1 0 , 3 9 , 5 5 ) . We h a v e p r e v i o u s l y s h o w n t h a t c a f f e i n eb l o c k s p 5 3 p r o t e i n i n c r e a s e s i n ML-1 c e l l s i n d u c e d b y i o n i z i n gr a d i a t i o n ( 3 4 ) . S i m i l a r l y , i n s t u d i e s o f LNCaP c e l l s t r e a t e d w i t hc a m p t o t h e c i n a n d c a f f e i n e , we f o u n d t h a t c a f f e i n e a p p e a r e db o t h t o l o w e r b a s a l p 5 3 l e v e l s i n t h e LNCaP c e l l s a n d t oa b r o g a t e c a m p t o t h e c i n - i n d u c e d p 5 3 i n c r e a s e s ( F i g . 2 C , l a n e s 1 ,2 , 5 , a n d 6 ) . B o t h t h e m e c h a n i s m b y w h i c h c a f f e i n e a f f e c t s t h es i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y c u l m i n a t i n g i n p 5 3 p r o t e i n e l e v a -

B .[ C P T ] , nM 0080

____4wW - p 5 3- - w ~ - - - - t o p o I

1 2 3 4 50

_

0 1 00 c* _ ClCPT + - + - + - +_- _--- - p 5 3

~ _ _ - d - 40 t o p o I12 3 4 5 6 7 8

F I G . 2 . R e p l i c a t i o n d e p e n d e n c e o f c a m p t o t h e c i n - i n d u c e d p S 3 e l e -v a t i o n s . E x t r a c t s p r e p a r e d f r o m LNCaP p r o s t a t i c a d e n o c a r c i n o m ac e l l s t r e a t e d w i t h c a m p t o t h e c i n ( C P T ) a n d o t h e r a g e n t s w e r e p r e p a r e da n d a n a l y z e d f o r p 5 3 p r o t e i n e x p r e s s i o n b y i m m u n o b l o t a n a l y s i s a sd e s c r i b e d f o r F i g . 1 a n d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . ( A ) p 5 3 l e v e l s f o rLNCaP c e l l s t r e a t e d w i t h 2 0 n M c a m p t o t h e c i n f o r 0 ( l a n e 1 , ( l a n e2 ) , 2 ( l a n e 3 ) , 4 ( l a n e 4 ) , 8 ( l a n e 5 ) , a n d 2 4 ( l a n e 6 ) h . ( B ) p 5 3 l e v e l sf o r LNCaP c e l l s t r e a t e d f o r 2 h w i t h n o a d d e d c a m p t o t h e c i n ( l a n e 1 )a n d f o r 2 h w i t h 8 n M ( l a n e 2 ) , 4 0 nM ( l a n e 3 ) , 2 0 0 n M ( l a n e 4 ) , a n d1 , 0 0 0 n M ( l a n e 5 ) c a m p t o t h e c i n . C E f f e c t s o f a p h i d i c o l i n , c a f f e i n e ,a n d 2 - a m i n o p u r i n e o n c a m p t o t h e c i n - i n d u c e d p 5 3 e l e v a t i o n s . LNCaPc e l l s w e r e t r e a t e d f o r 2 h w i t h ( l a n e s 2 , 4 , 6 , a n d 8 ) a n d w i t h o u t ( l a n e s1 , 3 , 5 , a n d 7 ) 1 0 n M c a m p t o t h e c i n . F o r l a n e s 3 a n d 4 , 1 0 , u Ma p h i d i c o l i n w a s p r e s e n t 1 5 m i n b e f o r e c a m p t o t h e c i n a d d i t i o n a n dt h r o u g h o u t t h e 2 - h i n c u b a t i o n . S i m i l a r l y , f o r l a n e s 5 a n d 6 , 4 mMc a f f e i n e w a s i n c l u d e d , a n d f o r l a n e s 7 a n d 8 , 1 0 mM 2 - a m i n o p u r i n e w a sp r e s e n t . As c o n t r o l s i n p a n e l s B a n d C , i m m u n o b l o t s w e r e r e pr o be dw i t h a n t i b o d i e s s p e c i f i c f o r t o p o i s o m e r a s e ( t o p o ) I

t i o n s a n d t h e m e c h a n i s m o f c a f f e i n e - m e d i a t e d e n h a n c e m e n t o fc y t o t o x i c i t y r e m a i n t o b e e l u c i d a t e d . I n t e r e s t i n g l y , 2 - a m i n o p u -r i n e , a n o t h e r a g e n t r e p o r t e d t o i n h i b i t c e l l c y c l e a r r e s t i n G ,a n d G 2 ( 2 ) , d i d n o t a p p e a r t o a f f e c t c a m p t o t h e c i n - t r i g g e r e dp 5 3 p r o t e i n i n d u c t i o n ( F i g . 2 C , l a n e s 7 a n d 8 . U n d o u b t e d l y ,2 - a m i n o p u r i n e m u s t a f f e c t G , c e l l c y c l e a r r e s t b y a m e c h a n i s md i s t i n c t f r o m t h a t u s e d b y c a f f e i n e . I t may b e t h a t t h e a g e n tu n d e r m i n e s t h e p 5 3 - d e p e n d e n t G I c e l l c y c l e c h e c k p o i n t b ya f f e c t i n g t h e c h e c k p o i n t p a t h w a y a t a s t e p d i s t a l t o p 5 3 p r o t e i ni n d u c t i o n ( 3 5 ) .W i l d - t y p e p 5 3 i n d u c t i o n b y t h e t o p o i s o m e r a s e I - t a r g e t e dd r u g c a mp t o t h e c i n r e q u i r e s r e p l i c a t i v e D NA s y n t h e s i s a n dD NA s t r a n d b r e a k s . A s t r i k i n g f i n d i n g o f o u r l i m i t e d s c r e e n o fp 5 3 i n d u c t i o n b y p o t e n t i a l D N A - d a m a g i n g a g e n t s w a s t h er e p r o d u c i b l e e l e v a t i o n o f p 5 3 p r o t e i n l e v e l s t r i g g e r e d b yt o p o i s o m e r a s e - t a r g e t e d a n t i n e o p l a s t i c d r u g s ( F i g . 1 . T h e s ed r u g s i n t e r a c t w i t h DNA t o p o i s o m e r a s e s i n s u c h a w a y a s t ot r a p t h e e n z y m e s i n c o m p l e x e s w i t h c e l l u l a r DNA t h a t r e s e m -b l e i n t e r m e d i a t e s i n e n z y m e c a t a l y s i s ( 1 1 , 4 1 , 4 2 , 5 7 ) . T r e a t -m e n t o f t h e t r a p p e d e n z y m e - D N A c o m p l e x e s ( o f t e n r e f e r r e dt o a s c l e a v a b l e c o m p l e x e s ) w i t h p r o t e i n d e n a t u r a n t s y i e l d sp r o t e i n ( e n z y m e ) - a s s o c i a t e d DNA s t r a n d b r e a k s f r o m w h i c ht h e e n z y m e s c a n b e r e c o v e r e d i n c o v a l e n t l i n k a g e w i t h b r o k e n

V O L . 1 4 , 1 9 9 4


4/9

1 8 1 8 NELSON AND KASTANDNA ( 4 2 ) . A s e r i e s o f s t u d i e s h a s s u g g e s t e d t h a t t r a p p i n g o ft o p o i s o m e r a s e - D N A c o m p l e x e s may b e n e c e s s a r y b u t n o ts u f f i c i e n t f o r c e l l k i l l i n g b y t o p o i s o m e r a s e - t a r g e t e d d r u g s ( 1 5 ,4 1 ) . F o r t h e t o p o i s o m e r a s e I - t a r g e t e d d r u g c a m p t o t h e c i n ,l e t h a l DNA d a m a g e h a s b e e n p r o p o s e d t o o c c u r a s a r e s u l t o ft h e i n t e r a c t i o n o f t h e DNA r e p l i c a t i o n a p p a r a t u s w i t h t h ed r u g - t r a p p e d e n z y m e - D N A c o m p l e x 3 , 1 5 , 3 0 , 5 1 ) . P e r h a p sr e s u l t i n g f r o m c o l l i s i o n o f t h e r e p l i c a t i o n f o r k w i t h t h e d r u g -t r a p p e d t o p o i s o m e r a s e I-DNA c o m p l e x , r e p l i c a t i o n - d e p e n -d e n t DNA d o u b l e - s t r a n d b r e a k s h a v e b e e n s h o w n t o b e ac o n s e q u e n c e o f t o p o i s o m e r a s e I - t a r g e t e d d r u g a c t i o n i n c e l le x t r a c t s i n v i t r o ( 3 0 ) a s w e l l a s i n l i v i n g c e l l s i n v i v o 3 , 5 1 ) .To d e t e r m i n e w h e t h e r t r a p p i n g o f t o p o i s o m e r a s e - D N Ac o m p l e x e s b y t o p o i s o m e r a s e - t a r g e t e d d r u g s may b e s u f f i c i e n tf o r p 5 3 i n d u c t i o n , o r w h e t h e r DNA s t r a n d b r e a k s r e s u l t i n gf r o m i n t e r a c t i o n s o f c e l l u l a r p r o c e s s e s w i t h enzyme-DNAc o m p l e x e s may b e r e q u i r e d , we s t u d i e d t h e DNA r e p l i c a t i o nd e p e n d e n c e o f p 5 3 e l e v a t i o n s t r i g g e r e d b y t h e t o p o i s o m e r a s eI - t a r g e t e d d r u g c a m p t o t h e c i n i n LNCaP c e l l s . C a m p t o t h e c i nt r e a t m e n t c a u s e d r a p i d , s u s t a i n e d i n c r e a s e s i n w i l d - t y p e p 5 3l e v e l s ( F i g . 2 A ) i n a d o s e - d e p e n d e n t m a n n e r ( F i g . 2 B ) . How-e v e r , w h e n LNCaP c e l l s w e r e c o t r e a t e d w i t h t h e DNA p o l y -m e r a s e i n h i b i t o r a p h i d i c o l i n , w h i c h p e r m i t s f o r m a t i o n o f t o -p o i s o m e r a s e I-DNA c l e a v a b l e c o m p l e x e s b u t p r e v e n t s t h eg e n e r a t i o n o f r e p l i c a t i o n - d e p e n d e n t DNA s t r a n d b r e a k s 3 ,1 5 , 3 0 , 5 1 ) , c a m p t o t h e c i n w a s u n a b le t o e l e v a t e p 5 3 p r o t e i nl e v e l s ( F i g . 2 C , l a n e s 3 a n d 4 . T h i s o b s e r v a t i o n s u g g e s t s t h a tDNA s t r a n d b r e a k s a r e c r i t i c a l f o r p 5 3 p r o t e i n i n d u c t i o n b y t h et o p o i s o m e r a s e - t a r g e t e d d r u g c a m p t o t h e c i n . W h e t h e r t h i sm e c h a n i s m i s g e n e r a l i z a b l e t o a l l t o p o i s o m e r a s e - t a r g e t e dd r u g s r e m a i n s t o b e d e t e r m i n e d .I n c r e a s e d w i l d - t y p e p 5 3 l e v e l s a c c o m p a n y D NA s t r a n db r e a k s a s s o c i a t e d w i t h c e l l d e a t h i n d u c e d b y a n t i m e t a b o l i t e s .A l t h o u g h a n t i m e t a b o l i t e s s u c h a s m e t h o t r e x a t e h a v e n o t b e e nt h o u g h t t o m o d i f y DNA d i r e c t l y , a b o d y o f e v i d e n c e h a sa c c u m u l a t e d t o s u g g e s t t h a t s u c h a g e n t s may c a u s e c e l l d e a t hb y f o s t e r i n g a n a c c u m u l a t i o n o f DNA s t r a n d b r e a k s i n t r e a t e dc e l l s t h r o u g h a m e c h a n i s m w h i c h r e m a i n s u n c l e a r ( 1 9 , 4 0 ) .DNA s t r a n d b r e a k s o c c u r r i n g a s a r e s u l t o f m e t h o t r e x a t et r e a t m e n t g e n e r a l l y a p p e a r s l o w l y a n d a c c o m p a n y l o s s o f c e l lv i a b i l i t y ( 4 0 ) . I n s t u d i e s o f p 5 3 i n d u c t i o n i n ML-1 c e l l s b ym e t h o t r e x a t e , we w e r e u n a b l e t o d e t e c t p 5 3 e l e v a t i o n s u n t i la f t e r c o n t i n u o u s e x p o s u r e t o d r u g f o r 4 8 h , a t w h i c h t i m e o n l yw e a k i n d u c t i o n w a s d e t e c t a b l e ( n o t s h o w n ) . T h i s t i m e c o u r s eo f p 5 3 i n d u c t i o n w a s r e m i n i s c e n t o f t h e t i m e c o u r s e o f DNAf r a g m e n t a t i o n r e p o r t e d a s a c o n s e q u e n c e o f m e t h o t r e x a t et r e a t m e n t ( 4 0 ) . A m p l i f i c a t i o n o f t h e CA D g e n e i n r e s p o n s e t ot r e a t m e n t w i t h t h e i n h i b i t o r PALA h a s b e e n s h o w n t o o c c u r i nc e l l s w i t h m u t a n t o r d i s r u p t e d p 5 3 a l l e l e s b u t n o t i n c e l l se x p r e s s i n g w i l d - t y p e p 5 3 ( 4 3 , 6 6 ) . To d e t e r m i n e w h e t h e rPALA m i g h t i n d u c e p 5 3 i n c o o r d i n a t i o n w i t h c a u s i n g DNAs t r a n d b r e a k s , w e e v a l u a t e d p 5 3 l e v e l s a n d g e n o m i c DNAi n t e g r i t y i n ML-1 c e l l s t r e a t e d f o r v a r i o u s p e r i o d s o f t i m e w i t hPALA ( F i g . 3 ) . We d e t e c t e d i n c r e a s e s i n p 5 3 l e v e l s i n ML-1c e l l s a c c o m p a n y i n g DNA s t r a n d b r e a k s o n l y a f t e r 2 4 t o 4 8 h o fc o n t i n u o u s e x p o s u r e t o PALA ( F i g . 3 A ) , a t i m e f r a m e c o n s i s -t e n t w i t h t h e a p p e a r a n c e o f n u m e r o u s DNA s t r a n d b r e a k s( F i g . 3 B ) . T h e s e s t u d i e s s u g g e s t t h a t a n t i m e t a b o l i t e s s u c h a sm e t h o t r e x a t e a n d PALA l e a d t o e l e v a t e d p 5 3 l e v e l s a s DNAs t r a n d b r e a k s a c c u m u l a t e w i t h i n c e l l s .DNA s t r a n d b r e a k s a r e s u f f i c i e n t f o r w i l d - t y p e p 5 3 i n d u c -t i o n . A f t e r f i n d i n g a c l o s e c o r r e l a t i o n b e t w e e n i n d u c e d DNAs t r a n d b r e a k s a n d i n c r e a s e s i n w i l d - t y p e p 5 3 p r o t e i n l e v e l sf o l l o w i n g t r e a t m e n t w i t h a v a r i e t y o f DNA-damaging a g e n t s ,we s o u g h t t o d e t e r m i n e w h e t h e r DNA s t r a n d b r e a k s a lo n ew e r e s u f f i c i e n t t o t r i g g e r p 5 3 e l e v a t i o n s . N u c l e a s e s h a v e b e e n

A. PALA e x p o s u r e d u r a t i o n , h r s1 3 2 4 48 72

PALA - - - + - + - +

_ t - p 5 3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0

B. PALA e x p o s u r e d u r a t i o n , h r s0 2 4 48 72

2 3 . 1 -n 0

9 . 4 -6 . 6 -

4 . 4 -

1 2 3 4F I G . 3 . I n c r e a s e s i n p 5 3 p r o t e i n l e v e l s a c c o m p a n y DNA s t r a n db r e a k s f o l l o w i n g p r o l o n g e d e x p o s u r e o f ML-1 c e l l s t o PALA. ( A )ML-1 c e l l s t r e a t e d b y c o n s t a n t e x p o s u r e t o 1 0 0 p . M PALA f o r 1 ( l a n e2 ) , 3 ( l a n e 4 ) , 2 4 ( l a n e 6 ) , 4 8 ( l a n e 8 ) , a n d 7 2 ( l a n e 1 0 ) h w e r e e v a l u a t e df o r p 5 3 e x p r e s s i o n b y i m m u n o b l o t a n a l y s i s . ( B ) DNA w a s e x t r a c t e df r o m ML-1 c e l l s s i m i l a r l y e x p o s e d t o 1 0 0 p . M PALA f o r 0 ( l a n e 1 ) , 2 4( l a n e 2 ) , 4 8 ( l a n e 3 ) , a n d 7 2 ( l a n e 4 ) h a n d a n a l y z e d b y a g a r o s e g e le l e c t r o p h o r e s i s f o l l o w e d b y e t h i d i u m b r o m i d e s t a i n i n g . The m i g r a t i o np o s i t i o n s o f H i n d l I l - d i g e s t e d l a m b d a DNA m o l e c u l a r s i z e m a r k e r s a r ei n d i c a t e d .

f o u n d t o c l e a v e g e n o m i c DNA w h e n i n t r o d u c e d i n t o mamma-l i a n c e l l s b y e l e c t r o p o r a t i o n ( 1 2 , 4 8 , 6 4 ) . When DNase I ( F i g .4 B ) o r t h e r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e A l u I ( F i g . 4 A ) w a s i n t r o -d u c e d i n t o ML-1 c e l l s b y e l e c t r o p o r a t i o n , i n c r e a s e s i n p 5 3p r o t e i n l e v e l s w e r e d e t e c t e d b y i m m u n o b l o t a n a l y s i s . S u c hi n c r e a s e s i n w i l d - t y p e p 5 3 l e v e l s w e r e n o t o b s e r v e d whena l b u m i n ( F i g . 4 A , l a n e 2 , h e a t - i n a c t i v a t e d A l u I ( F i g . 4 A , l a n e5 ) , o r R N a s e A ( F i g . 4 B , l a n e 2 ) w a s i n t r o d u c e d . Of i n t e r e s t ,d e p e n d i n g o n c o n d i t i o n s u s e d , e l e c t r o p o r a t i o n i t s e l f f r e q u e n t l yr e d u c e d p 5 3 l e v e l s i n ML-1 c e l l s ( F i g . 4 A , l a n e s 1 a n d 2 , a n dd a t a n o t s h o w n ) . DNase I - i n d u c e d i n c r e a s e s i n p 5 3 p r o t e i nl e v e l s b e c a m e e v i d e n t w i t h t h e i n t r o d u c t i o n o f i n c r e a s i n ga m o u n t s o f n u c l e a s e ( F i g . 4 B , s u g g e s t i n g t h a t s o m e t h r e s h o l dl e v e l o f DNA s t r a n d b r e a k s m i g h t b e r e q u i r e d f o r e l i c i t i n gr a p i d p 5 3 i n d u c t i o n . I n t e r e s t i n g l y , h i g h l e v e l s o f DNase Ie l e c t r o p o r a t e d i n t o ML-1 c e l l s c a u s e d l e s s d r a m a t i c i n c r e a s e si n p 5 3 p r o t e i n ( F i g . 4 B , l a n e 7 ) . W h e t h e r t h i s p h e n o m e n o nr e s u l t e d f r o m a c c e l e r a t e d c e l l d e s t r u c t i o n b y n u c l e a s e a c t i v i t y ,



5/9

DNA STRAND BREAKS AND p 5 3 INDUCTION 1 8 1 9

I ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ - lA . _ . 4

< : ac r wO lO > _ m U r z rn 7

A . w i t h o u t HU/ARA-CNML X P-A

- w o m . _domw --NNW - p 5 3

2 3 4 5 6

B . w i t h HU/ARA-C2 3 4 5

B . 0c rz0

4 C0)0za:

NMLu :3~~~~a

XP-A0

.) Z 0 B __ - p 5 32 5 50 1 0 0 2 0 0 4 00a t , - p 5 3

1 2 3 4 5 6 7F I G . 4 . E l e c t r o p o r a t i o n o f n u c le as e s i n t o ML-1 c e l l s causes p 5 3i n d u c t i o n . N u c l e a s e s A l u I a n d DNase I were i n t r o d u c e d i n t o ML-1c e l l s b y e l e c t r o p o r a t i o n as d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s , a n dp 5 3 p r o t e i n l e v e l s w e r e a s s e s s e d 1 h l a t e r b y i m m u n o b l o t a n a l y s i s u s i n ga n t i - p 5 3 a n t i b o d i e s . ( A ) p 5 3 e x p r e s s i o n w a s e v a l u a t e d f o l l o w i n g e l e c -t r o p o r a t i o n o f ML-1 c e l l s i n t h e presence o f b o v i n e serum a l b u m i n( B S A ; 1 2 . 5 p l i n 0 . 8 m l o f e l e c t r o p o r a t i o n b u f f e r ; l a n e 2 ) , A l u I s t o r a g eb u f f e r ( 1 2 . 5 p L I o f 1 0 mM T r i s - H C l - 1 0 0 mM N a C l - 0 . 1 mM EDTA-1mM d i t h i o t h r e i t o l - 2 0 0 p . g o f b o v i n e s e r u m a l b u m i n pe r ml-50

[ v o l / v o l ] g l y c e r o l a t pH 7 . 4 ; l a n e 3 ) , A l u I ( 1 2 . 5 p l c o n t a i n i n g 1 0 0 U o fn u c l e a s e a c t i v i t y i n A l u I s t o r a g e b u f f e r ; l a n e 4 ) , a n d h e a t - i n a c t i v a t e dA l u I ( 1 2 . 5 p l c o n t a i n i n g 1 0 0 U o f e n z y m e a c t i v i t y h e a t e d t o 9 5 ° C f o r 3 0m i n ; l a n e 5 ) . As a c o n t r o l , p 5 3 l e v e l s i n p r o t e i n e x t r a c t s f r o m ML-1c e l l s n o t t r e a t e d b y e l e c t r o p o r a t i o n ar e s h o w n i n l a n e 1 . ( B ) p 5 3 l e v e l swere a s s e s s e d f o l l o w i n g e l e c t r o p o r a t i o n o f ML-1 c e l l s w i t h no a d d e dn u c l e a s e s ( l a n e 1 ) , w i t h RNase A ( 6 . 2 5 p . g ; l a n e 2 ) , a n d w i t h DNase I( 2 5 , 5 0 , 1 0 0 , 2 0 0 , a n d 4 0 0 U o f n u c l e a s e a c t i v i t y ; l a n e s 3 t o 7 ) . E a c h o ft h e e l e c t r o p o r a t i o n e x p e r i m e n t s i n p a n e l ( B ) was p e r f o r m e d i n t h epresence o f DNase I s t o r a g e b u f f e r ( 4 0 p L o f 2 0 mM T r i s - H C l - 5 0 mMN a C l - 1 mM d i t h i o e r y t h r i t o l - 0 . 1 mg o f b o v i n e s e r u m a l b u m i n pe rml-50 [ v o l / v o l ] g l y c e r o l , pH 7 . 6 , i n 0 . 8 m l o f e l e c t r o p o r a t i o n b u f f e r ) .

f r o m d i s r u p t i o n o f m a j o r p h y s i o l o g i c c e l l processes a n d s i g n a lt r a n s d u c t i o n p a t h w a y s , o r b y some o t h e r m e c h a n i s m i s n o tc l e a r . R a p i d e l e v a t i o n o f w i l d - t y p e p 5 3 l e v e l s t r i g g e r e d b yn u c l e a s e s d e m o n s t r a t e s t h a t DNA s t r a n d b r e a k s ar e s u f f i c i e n tf o r p 5 3 i n d u c t i o n .DNA b a s e d a m a g e i n f l i c t e d b y UV l i g h t may n o t b e t h et r i g g e r f o r p 5 3 i n d u c t i o n . M a l t z m a n a n d C z y z y k f i r s t i d e n t i f i e di n c r e a s e s i n p 5 3 p r o t e i n l e v e l s i n n o n t r a n s f o r m e d r o d e n t c e l l si n response t o t r e a t m e n t w i t h UV l i g h t ( 4 7 ) . S u b s e q u e n t l y ,s e v e r a l s t u d i e s h a v e r e p o r t e d e l e v a t i o n s i n p 5 3 l e v e l s f o l l o w i n gUV i r r a d i a t i o n ( 2 3 , 2 7 , 6 7 ) . T r e a t m e n t o f l i v i n g c e l l s w i t h UVl i g h t r e s u l t s i n a v a r i e t y o f DNA l e s i o n s , i n c l u d i n g m o d i f i e dDNA b a s e s a n d DNA s t r a n d b r e a k s ( 1 4 , 2 2 , 6 0 ) . To d e t e r m i n ew h e t h e r c r e a t i o n o f DNA b a s e m o d i f i c a t i o n s , s u c h as t h y m i n ed i m e r s , b y UV i r r a d i a t i o n was s u f f i c i e n t t o r a i s e p 5 3 l e v e l s , o rw h e t h e r DNA s t r a n d b r e a k s were r e q u i r e d , we s t u d i e d UV

2 3 4 5 6F I G . 5 . P r e f e r e n t i a l i n du c ti o n o f p 5 3 b y UV l i g h t i n n o r m a l l y m -p h o b l a s t o i d c e l l s versus X P g r o u p A l y m p h o b l a s t s u n d e r c o n d i t i o n s i nw h i c h e x c i s i o n r e p a i r - a s s o c i a t e d DNA s t r a n d b r e a k s occur. Immuno-b l o t a n a l y s i s f o r p 5 3 p r o t e i n e x p r e s s i o n w a s p e r f o r m e d on p r o t e i n -c o n t a i n i n g e x t r a c t s p r e p a r e d f r o m n o r m a l NML) GM 2 1 8 4 ; l a n e s 1

t o 3 ) a n d X P c o m p l e m e n t a t i o n g r o u p A ( X P - A ) GM 2 2 5 0 ; l a n e s 4 t o6 ) l y m p h o b l a s t o i d c e l l s 3 h a f t e r t r e a t m e n t w i t h UV r a d i a t i o n ( 2 0 J / m 2f o r p a n e l A , l a n e s 2 a n d 5 , a n d 2 J / m 2 f o r p a n e l B , l a n e s 2 a n d 5 ) o ri o n i z i n g r a d i a t i o n ( I R ) ( 2 G y ; l a n e s 3 a n d 6 ) u n d e r n o r m a l g r o w t hc o n d i t i o n s ( A ) o r i n t h e presence o f 2 mM h y d r o x y u r e a HU) a n d 1 0p . M c y t o s i n e a r a b i n o s i d e ARA-C) ( B ) .

l i g h t e f f e c t s on p 5 3 l e v e l s i n n o r m a l human l y m p h o b l a s t o i dc e l l s a n d i n l y m p h o b l a s t o i d c e l l s d e r i v e d f r o m a p a t i e n ta f f l i c t e d w i t h X P . X P d e s c r i b e s a f a m i l y o f i n h e r i t e d s y n d r o m e sr e s u l t i n g f r o m d e f e c t s i n t h e e x c i s i o n r e p a i r o f UV p h o t o p r o d -u c t s s u c h as t h y m i n e d i m e r s ( 5 0 ) . We f o u n d t h a t when n o r m a lo r X P ( g r o u p A e x h i b i t i n g l e s s t h a n 3 o f n o r m a l e x c i s i o nr e p a i r a c t i v i t y [ 5 0 ] ) l y m p h o b l a s t s were t r e a t e d w i t h UV i r r a d i -a t i o n o r r y i r r a d i a t i o n u n d e r n o r m a l g r o w t h c o n d i t i o n s , i n -creases i n p 5 3 p r o t e i n l e v e l s w e r e d e t e c t e d ( F i g . 5 A ) . T h e s ei n c r e a s e s i n w i l d - t y p e p 5 3 l e v e l s d e t e c t e d a f t e r UV exposurem i g h t h a v e o c c u r r e d as a r e s u l t o f DNA p h o t o p r o d u c t s ,r e p l i c a t i o n - o r r e p a i r - i n d u c e d DNA s t r a n d b r e a k s , o r someDNA t e m p l a t e - i n d e p e n d e n t m e c h a n i s m . H o w e v e r , when b o t ht y p e s o f c e l l s w e r e t r e a t e d w i t h UV l i g h t u n d e r c o n d i t i o n s i nw h i c h U V - i n d u c e d r e p l i c a t i o n d e p e n d e n t s t r a n d b r e a k s w e r ei n h i b i t e d ( 1 8 , 2 2 ) , U V - s t i m u l a t e d p 5 3 i n d u c t i o n was d e t e c t e di n n o r m a l b u t n o t XP l y m p h o b l a s t s ( F i g . S B , l a n e s 2 a n d 5 ) . Asa c o n t r o l , i o n i z i n g r a d i a t i o n , w h i c h d i r e c t l y i n d u c e s DNAs t r a n d b r e a k s , e l e v a t e d p 5 3 l e v e l s i n b o t h t y p e s o f l y m p h o b l a s -t o i d c e l l s ( F i g . 5 B , l a n e s 3 a n d 6 ) u n d e r t h e same g r o w t h -i n h i b i t o r y c o n d i t i o n s . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t DNA s t r a n db r e a k s o c c u r r i n g as p a r t o f t h e e x c i s i o n r e p a i r process ca nt r i g g e r p 5 3 p r o t e i n i n d u c t i o n .Of i n t e r e s t , w h i l e g r o up A XP c e l l s ar e q u a n t i t a t i v e l yd e f e c t i v e i n t h e r e p a i r o f UV p h o t o p r o d u c t s , t h e c e l l s arec a p a b l e o f a l o w l e v e l o f e x c i s i o n r e p a i r o f UV p h o t o p r o d u c t s( 1 8 , 2 2 , 5 0 ) . F o l l o w i n g exposure t o UV i r r a d i a t i o n , F o r n a c ea n d S e r e s ( 2 2 ) d e t e c t e d r e p a i r - i n d u c e d s t r a n d b r e a k s i n groupA X P c e l l s a t a l e v e l o f 0 . 1 t o 0 . 2 s i n g l e s t r a n d b r e a k pe r 1 0 9 D ao f DNA f o r e a c h j o u l e o f i n c i d e n t UV l i g h t p er s qu ar e m e t e r .

- p 5 3

V O L . 1 4 , 1 9 9 4


6/9

1 8 2 0 NELSON AND KASTANA . NML l y m p h o b l a s t s

UV d o s e , J I M 20 4 8 20

_ - .wp 5 3

~ GT-GSTr

D NA BASE I O N I Z I N G DN A RECOMBINATIONDAMAGE R A D I A T I O N , REARRANGEMENTS EVENTS( e . g . U V ) 02 RADICALS |i TOPOISOMERASEDNA DN A I N H I B I T O R SR E P A I R R E P L I C A T I O N \ 0DNAREPLICATION

DNA STRAND BREAKSA - T GENE P R O D U C T ( S ) '

2 3 4 5B . XP-A l y m p h o b l o s t s

UV d o s e , J / M 20 4 8 204 _p 5 3

G S T 7 r

2 3 4 5F I G . 6 . UV l i g h t d o s e response f o r p 5 3 i n d u c t i o n i n n o r m a l a n d X P

l y m p h o b l a s t s . I m m u n o b l o t a n a l y s e s f o r p 5 3 p r o t e i n e x p r e s s i o n w e r ep e r f o r m e d on p r o t e i n - c o n t a i n i n g e x t r a c t s p r e p a r e d f r o m n o r m a l NML; A ) a n d X P g r o up A ( X P - A ; B ) l y m p h o b l a s t s 3 h a f t e rt r e a t m e n t w i t h UV l i g h t a t d o s e s o f 0 , 1 , 4 , 8 , an d 2 0 J / m 2 i n t h epresence o f 2 mM h y d r o x y u r e a a n d 1 0 p . M c y t o s i n e a r a b i n o s i d e . As ac o n t r o l , i m m u n o b l o t s w e r e r e p r o b e d w i t h a n t i b o d i e s s p e c i f i c f o rg l u t a t h i o n e S - t r a n s f e r a s e r r ( G S T r r ) .

We r e a s o n e d t h a t i f s t r a n d b r e a k s i n f l i c t e d o n UV-damagedDNA b y e x c i s i o n r e p a i r processes were c a p a b l e o f t r i g g e r i n gp 5 3 p r o t e i n e l e v a t i o n s , t r e a t m e n t o f X P c e l l s w i t h h i g h l e v e l s o fUV l i g h t u n d e r g r o w t h - i n h i b i t o r y c o n d i t i o n s m i g h t r e s u l t i np 5 3 p r o t e i n i n c r e a s e s as g r e a t e r amounts o f r e p a i r - i n d u c e ds t r a n d b r e a k s appear. I n an e f f o r t t o t e s t t h i s p r e d i c t i o n ,n o r m a l a n d X P l y m p h o b l a s t s w e r e t r e a t e d w i t h i n c r e a s i n gd o s e s o f UV i r r a d i a t i o n u n d e r c o n d i t i o n s i n w h i c h U V - i n d u c e dr e p l i c a t i o n - d e p e n d e n t DNA s t r a n d b r e a k s w e r e i n h i b i t e d ( F i g .6 ) ( 1 8 , 2 2 ) . I n c r e a s e s i n p 5 3 p r o t e i n l e v e l s w e r e r e a d i l yd e t e c t e d i n n o r m a l l y m p h o b l a s t s eve n a f t e r exposure t o l o w t om o d e s t UV d o s e s ( F i g . 6 A , l a n e s 1 t o 4 ) . I n c o n t r a s t , X Pl y m p h o b l a s t s e x p o s e d t o d i f f e r e n t amounts o f UV l i g h t d i d n o td i s p l a y d e t e c t a b l e p 5 3 p r o t e i n i n c r e a s e s u n t i l a f t e r t r e a t m e n tw i t h UV t o a d o s e o f 8 J / m 2 . F o r b o t h t y p e s o f c e l l s , exposuret o a UV l i g h t a t a d o s e o f 2 0 J / m 2 r e s u l t e d i n l i t t l e i f a n yi n c r e a s e i n p 5 3 p r o t e i n l e v e l s u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s ( F i g . 6Aa n d B , l a n e s 5 ) . T h i s a b r o g a t i o n o f p 5 3 i n d u c t i o n a t h i g h l e v e l so f exposure t o UV r a d i a t i o n may r e s u l t f r o m UV l i g h t -m e d i a t e d i n h i b i t i o n o f p r o t e i n s y n t h e s i s ( u p t o 8 0 i n h i b i t i o no f [ 3 5 S ] m e t h i o n i n e i n c o r p o r a t i o n a t t h e s e d o s e s ; d a t a n o ts h o w n ) ; p r e v i o u s s t u d i e s h a v e r e v e a l e d t h a t t h e p r o t e i n syn-t h e s i s i n h i b i t o r c y c l o h e x i m i d e p r e v e n t s p 5 3 e l e v a t i o n s t r i g -g e r e d b y i o n i z i n g r a d i a t i o n ( 3 4 ) . A l l o f o u r r e s u l t s on p 5 3i n d u c t i o n b y UV l i g h t s u g g e s t t h a t t h e presence o f UVp h o t o p r o d u c t s i n t h e DNA i s n o t s u f f i c i e n t t o e l e v a t e p 5 3l e v e l s . R a t h e r , p 5 3 i n d u c t i o n may occur as a r e s u l t o f DNAs t r a n d b r e a k s a r i s i n g b o t h f r o m r e p l i c a t i o n o f a d a m a g e d DNAt e m p l a t e a n d f r o m e x c i s i o n r e p a i r o f d a m a g e d n u c l e o t i d e s .

+ P 5 34 GADD454GENES ?

> -> APOPTOSIS

G I ARRESTF I G . 7 . S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f t h e r o l e o f DNA s t r a n d b r e a k si n p 5 3 i n d u c t i o n a f t e r DNA d a m a g e . S t ra n d b r e a ks i n g e n o m i c DNAa r i s e b y a v a r i e t y o f m e c h a n i s m s . B a s e d a m a g e , s u c h a s t h a t c a u s e d b yUV l i g h t o r a l k y l a t i n g a g e n t s , l e a d s t o s t r a n d b r e a k s t h r o u g h DNAr e p a i r p r o c e s s e s a n d t h r o u g h t h e p r o c e s s o f DNA r e p l i c a t i o n . I o n i z i n gr a d i a t i o n , p e r h a p s t h r o u g h p ro d u c t i o n o f o x y g e n r a d i c a l s , r e s u l t s i nDNA s t r a n d s c i s s i o n . E x p o s u r e t o t o p o i s o m e r a s e - t a r g e t e d a n t i n e o -p l a s t i c d r u g s r e s u l t s i n DNA s t r a n d b r e a k s . D o u b l e - s t r a nd b r e a k si n d u c e d b y t o p o i s o m e r a s e I - t a r g e t e d d r u g s o c c u r b y a DNA r e p l i c a -t i o n - d e p e n d e n t m e c h a n i s m . N o r m a l d e v e l o p m e n t a l p r o c e s s e s , s u c h a sg e n e r e a r r a n g e m e n t s i n l y m p h o i d c e l l s a n d r e c o m b i n a t i o n e v e n t s i ng e r m c e l l s , c a n a l s o g e n e r a t e DNA s t r a n d b r e a k s . B y g e n e r a t i n g DNAs t r a n d b r e a k s , a l l o f t h e s e t h r e a t s t o g e n o m e i n t e g r i t y l e a d t o p 5 3i n d u c t i o n a n d i n i t i a t i o n o f p 5 3 - d e p e n d e n t r e s p o n s e p a t h w a y s . T h ea s t e r i s k a d j a c e n t t o A - T g e n e p r o d u c t s i n d i c a t e s t h a t t h e s e f u n c t i o n smay b e i n v o l v e d i n r e s p o n s e s t o o n l y c e r t a i n t y p e s o f DNA s t r a n db r e a k s , s u c h a s t h o s e i n i t i a t e d b y i o n i z i n g r a d i a t i o n . T h e c e l l u l a rr e s p o n s e t o p 5 3 i n d u c t i o n may b e G 1 a r r e s t o r a p o p t o t i c c e l l d e a t h ,d e p e n d i n g o n c e l l t y p e a n d o t h e r u n d e f i n e d p a r a m e t e r s o f t h ep h y s i o l o g i c s t a t e o f t h e c e l l . W h e t h e r g a d d 4 5 p l a y s a c r i t i c a l r o l e i n G Ia r r e s t , a p o p t o s i s , o r b o t h f u n c t i o n s h a s n o t y e t b e e n d e m o n s t r a t e d .

T h e s e f i n d i n g s a l s o s u g g e s t t h a t t h e c e l l u l a r r e s p o n s e t od a m a g e d DNA ma y b e a c r i t i c a l d e t e r m i n a n t l e a d i n g t o p 5 3i n d u c t i o n . T h u s , t h e d i f f e r e n t p h y s i o l o g i c s t a t e s o f d i f f e r e n tc e l l s may a f f e c t t h e t i m i n g o r m a g n i t u d e o f p 5 3 i n d u c t i o nf o l l o w i n g v a r i o u s t y p e s o f DNA t e m p l a t e d a m a g e .DISCUSSION

M a j o r f u n c t i o n s o f w i l d - t y p e p 5 3 p r o t e i n a p p e a r t o i n c l u d et h e r e g u l a t i o n o f a G , / S c e l l c y c l e c h e c k p o i n t a c t i v a t e d b yDNA d a m a g e a n d t h e m e d i a t i o n o f a p o p t o s i s i n c e r t a i ns i t u a t i o n s i n r e s p o n s e t o DNA d a m a g e ( 1 3 , 3 4 , 3 5 , 3 8 , 4 4 ) .D N A - d a m a g i n g a g e n t s a c t i v a t i n g t h e p 5 3 - d e p e n d e n t c e l l c y c l ec h e c k p o i n t p a t h w a y t y p i c a l l y c a u s e w i l d - t y p e p 5 3 p r o t e i n t oa c c u m u l a t e t o h i g h l e v e l s w i t h i n d a m a g e d c e l l s . I n o u r s t u d y o fp 5 3 i n d u c t i o n b y v a r i o u s D N A - d a m a g i n g a g e n t s , we h a v ef o u n d t h a t DNA s t r a n d b r e a k s a p p e a r t o b e t h e c r i t i c a l DNAl e s i o n s r e s p o n s i b l e f o r t r i g g e r i n g e l e v a t i o n s i n p 5 3 p r o t e i nl e v e l s ( F i g . 7 ) . Of t h e a g e n t s t h a t we s t u d i e d , r a p i d s i g n i f i c a n tp 5 3 i n c r e a s e s w e r e o b s e r v e d f o l l o w i n g t r e a t m e n t w i t h i o n i z i n gr a d i a t i o n , w i t h t h e DNA s t r a n d - b r e a k i n g d r u g b l e o m y c i n , a n dw i t h DNA t o p o i s o m e r a s e - t a r g e t e d d r u g s . Of i n t e r e s t , t h et o p o i s o m e r a s e I - t a r g e t e d d r u g c a m p t o t h e c i n t r i g g e r e d p 5 3i n d u c t i o n o n l y u n d e r c o n d i t i o n s p e r m i t t i n g t h e o c c u r r e n c e o fr e p l i c a t i o n - d e p e n d e n t DNA s t r a n d b r e a k s . A g e n t s s u c h a si o n i z i n g r a d i a t i o n , w h i c h c a u s e DNA s t r a n d b r e a k s i n n o n r e p -l i c a t i n g c e l l s , g e n e r a t e d p 5 3 i n c r e a s e s i n a DNA r e p l i c a t i o n -



7/9

DNA STRAND BREAKS AND p 5 3 INDUCTION 1 8 2 1i n d e p e n d e n t m a n n e r . A n t i m e t a b o l i t e e x p o s u r e r e s u l t e d i ng r a d u al d e la y e d i n c r e a s e s i n p 5 3 l e v e l s a c c o m p a n y i n g DNAf r a g m e n t a t i o n . I n t r o d u c t i o n o f n u c l e a s e s i n t o c e l l s w i t h w i l d -t y p e p 5 3 a l l e l e s r e s u l t e d i n r a p i d a n d s p e c i f i c p 5 3 p r o t e i ne l e v a t i o n s , i m p l i c a t i n g DNA s t r a n d b r e a k s a s s u f f i c i e n t t ot r i g g e r p 5 3 i n d u c t i o n . F i n a l l y , s t u d i e s o f t h e e f f e c t s o f UVe x p o s u r e o n n o r m al a n d X P l y m p h o b la s t s s u g g e s t e d t h a t t h ep r e s e n c e o f DNA p h o t o p r o d u c t s i s n o t a d e q u a t e t o i n c r e a s ep 5 3 l e v e l s ; r a t h e r , DNA s t r a n d b r e a k s r e s u l t i n g f r o m r e p l i c a t -i n g UV-damaged DNA o r DNA s t r a n d b r e a k s r e s u l t i n g f r o me x c i s i o n r e p a i r a r e r e q u i r e d f o r p 5 3 i n d u c t i o n .DNA s t r a n d b r e a k s , e s p e c i a l l y DNA d o u b l e - s t r a n d b r e a k s ,h a v e b e e n f o u n d t o o c c u r i n m a m m a l i a n c e l l s f o l l o w i n ge x p o s u r e t o a v a r i e t y o f a g e n t s ( 1 9 ) . S u c h l e s i o n s p r e s e n t c e l l sw i t h s e v e r a l t y p e s o f p r o b l e m s . B r e a k s i n t h e DNA h e l i x w o u l dr e l a x a n y t o r s i o n a l s u p e r h e l i c a l s t r a i n i n t h e DNA t e m p l a t et h a t m i g h t b e r e q u i r e d f o r t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n , r e s u l t i n gi n a l t e r a t i o n s i n g e n e e x p r e s s i o n . D i m i n i s h e d t r a n s c r i p t i o n a la c t i v i t y i n s p e c i f i c g e n e s h a s b e e n f o u n d a f t e r t r e a t m e n t o f c e l l sw i t h i o n i z i n g r a d i a t i o n a t a d o s e c o n s i s t e n t w i t h g e n e r a t i n g o n es t r a n d b r e a k w i t h i n t h e c h r o m o s o m a l d o m a i n c o n t a i n i n g t h et r a n s c r i p t i o n a l u n i t ( 4 5 ) . I n a d d i t i o n t o e f f e c t s o n g e n e e x p r e s -s i o n , s t r a n d b r e a k s m a y p r e d i s p o s e t o g e n o m i c a l t e r a t i o n sa s s o c i a t e d w i t h n e o p l a s t i c t r a n s f o r m a t i o n a n d p r o g r e s s i o n .B r o k e n DNA e n d s m a y b e p o t e n t i a l l y r e c o m b i n o g e n i c , r e s u l t -i n g i n c h r o m o s o m e s e g m e n t t r a n s l o c a t i o n s , d e l e t i o n s , o r a m -p l i f i c a t i o n s i n c e l l s t h a t t r a v e r s e t h e c e l l c y c l e . When g e n o m i cDNA s t r a n d b r e a k s h a v e b e e n g e n e r a t e d b y t h e i n t r o d u c t i o n o fr e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e s i n t o c e l l s , a s t r i k i n g l y i n c r e a s e df r e q u e n c y o f c h r o m o s o m a l a b e r r a t i o n s h a s b e e n o b s e r v e d i nc e l l s r e a c h i n g m i t o s i s ( 6 , 7 ) . I n a d d i t i o n , r e s t r i c t i o n e n z y m e -i n d u c e d s t r a n d b r e a k s h a v e b e e n f o u n d t o i n c r e a s e n e o p l a s t i ct r a n s f o r m a t i o n ( 5 , 8 , 6 8 ) . F i n a l l y , u n r e p a i r e d o r i r r e p a r a b l eDNA s t r a n d b r e a k s m a y t r i g g e r c e l l d e a t h . A v a r i e t y o fm a m m a l i a n s t r a n d b r e a k r e p a i r - d e f i c i e n t m u t a n t c e l l l i n e sd i s p l a y i n c r e a s e d s e n s i t i v i t y t o t h e l e t h a l e f f e c t s o f c l a s t o g e n i ci n s u l t s ( 2 5 , 3 3 ) . C l e a r l y , DNA s t r a n d b r e a k s c o n s t i t u t e ac o n s i d e r a b l e t h r e a t t o c e l l v i a b i l i t y a n d c e l l g e n o m e i n t e g r i t y .T h e n e e d f o r m a m m a l i a n c e l l s t o d e a l w i t h s u c h a t h r e a t m a yb e w h y s t r a n d b r e a k s a p p e a r t o s e r v e a s t h e g e n o m i c DNAl e s i o n r e s p o n s i b l e f o r i n i t i a t i n g t h e p 5 3 - d e p e n d e n t DNA d a m -a g e r e s p o n s e p a t h w a y ( s ) .O u r o b s e r v a t i o n t h a t DNA s t r a n d b r e a k s a p p e a r f a r m o r ee f f i c i e n t a t t r i g g e r i n g p 5 3 p r o t e i n i n c r e a s e s t h a n o t h e r t y p e s o fc e l l a n d c e l l g e n o m e i n s u l t s s u g g e s t s t h a t m a m m a l i a n c e l l s m a ye x h i b i t a m e a s u r e o f e c o n o m y i n i n i t i a t i n g t h e p 5 3 - d e p e n d e n td a m a g e r e s p o n s e p a t h wa y . DNA s t r a n d b r e a k s a c c o m p a n y t h ee x p o s u r e o f m a n y d i f f e r e n t m a m m a l i a n c e l l s t o m a n y d i f f e r e n tD N A - d a m a g i n g a g e n t s . U n d o u b t e d l y , s o m e o f t h e s t r a n db r e a k s o c c u r a s a r e s u l t o f e x c i s i o n r e p a i r p r o c e s s e s . O u rs t u d i e s o f UV t r i g g e r i n g o f p 5 3 p r o t e i n i n d u c t i o n s u g g e s t t h a ts u c h a t t e m pt s a t e x c i s i o n r e p a i r m i g h t b e c o u p l e d t o t h ep 5 3 - d e p e n d e n t DNA d a m a g e r e s p o n s e p a t h w a y v i a DNAs t r a n d b r e a k s , a s n o n r e p l i c a t i n g X P c e l l s i n c a p a b l e o f g e n e r -a t i n g s t r a n d b r e a k s n e c e s s a r y f o r DNA p h o t o p r o d u c t r e p a i rf a i l t o e l e v a t e p 5 3 p r o t e i n l e v e l s f o l l o w i n g UV e x p o s u r e . Wes p e c u l a t e t h a t d e s p i t e t h e n e e d f o r a c o m p l e x a r r a y o f DNAd a m a g e r e c o g n i t i o n f u n c t i o n s f o r DNA r e p a i r , a c t i v a t i o n o ft h e p 5 3 - d e p e n d e n t c e l l c y c l e c h e c k p o i n t p a t h w a y m a y r e q u i r ea s i g n a l t r a n s d u c t i o n s y s t e m t h a t n e e d o n l y r e s p o n d t o DNAs t r a n d b r e a k s .D i f f e r e n t c e l l s a n d c e l l t y p e s a p p e a r t o b e e n d o w e d w i t hd i f f e r e n t r e p a i r c a p a c i t i e s f o r c e r t a i n DNA l e s i o n s , a s w e l l a sd i f f e r e n t d e t o x i f i c a t i o n c a p a c i t i e s f o r p o t e n t i a l D N A - d a m a g i n gs p e c i e s . S u c h c e l l s v a r y i n t h e p r o p e n s i t y t o g e n e r a t e DNAs t r a n d b r e a k s a f t e r e x p o s u r e t o c y t o t o x i c o r g e n o t o x i c a g e n t s ;

t h i s may a c c o u n t f o r t h e m a n y o f t h e a p p a r e n t d i f f e r e n c e s i nr e p o r t s o f p 5 3 p r o t e i n i n d u c t i o n b y d i f f e r e n t D N A - d a m a g i n ga g e n t s ( 2 3 , 5 8 , 6 7 ) . I n a d d i t i o n , a s i l l u s t r a t e d b y t h e b e h a v i o re x h i b i t e d b y X P l y m p h o b l a s t s i n r e s p o n s e t o UV l i g h t , d i f f e r e n tp r o l i f e r a t i v e s t a t e s o f c e r t a i n c e l l t y p e s c o u l d a l s o i n f l u e n c e p 5 3i n d u c t i o n b y s o m e D N A - d a m a g i n g a g e n t s w h i c h t r i g g e r r e p l i -c a t i o n - d e p e n d e n t DNA s t r a n d b r e a k s ( 1 9 , 5 3 ) .T h e i d e n t i f i c a t i o n o f DNA s t r a n d b r e a k s a s s e n t i n e l l e s i o n si n t h e o r c h e s t r a t i o n o f a n i m p o r t a n t c e l l i n j u r y r e s p o n s e h a sp r o f o u n d i m p l i c a t i o n s f o r f u r t h e r s t u d i e s c o n c e r n i n g s i g n a lt r a n s d u c t i o n t h r o u g h t h e p 5 3 - d e p e n d e n t G I c e l l c y c l e c h e c k -p o i n t p a t h w a y . I n a s t u d y o f c - j i n i n d u c t i o n b y UV r a d i a t i o n ,D e V a r y e t a l . ( 1 6 ) f o u n d t h a t UV l i g h t t r i g g e r e d a s i g n a lt r a n s d u c t i o n c a s c a d e t h a t a p p e a r e d t o o r i g i n a t e n e a r t h ep l a s m a m e m b r a n e , t o i n v o l v e S r c f a m i l y t y r o s i n e k i n a s e s , a n dt o c u l m i n a t e i n i n c r e a s e d p h o s p h o r y l a t i o n o f c - J u n p r o t e i n ,r e s u l t i n g i n e n h a n c e d t r a n s c r i p t i o n f a c t o r a c t i v i t y . T h i s d a m a g er e s p o n s e p a t h w a y h a s b e e n p r o p o s e d t o a c t i n d e p e n d e n t l y o fd a m a g e t o t h e DNA t e m p l a t e i t s e l f . I n c o n t r a s t , o u r d a t ad e m o n s t r a t e t h a t t h e p 5 3 - d e p e n d e n t c e l l c y c l e c h e c k p o i n tp a t h w a y a p p e a r s t o b e t r i g g e r e d b y a s p e c i f i c l e s i o n i n t h eDNA i t s e l f , a l m o s t c e r t a i n l y a DNA s t r a n d b r e a k . T h u s , t h ep 5 3 - d e p e n d e n t d a m a g e r e s p o n s e m a y c o m p l e m e n t o t h e r c e l li n j u r y r e s p o n s e p at h wa ys . T h e i d e n t i f i c a t i o n o f DNA s t r a n db r e a k s a s c r i t i c a l l e s i o n s i n t r a n s d u c i n g t h e s i g n a l l e a d i n g t op 5 3 i n d u c t i o n c o u l d f a c i l i t a t e f u t u r e s t u d i e s u n d e r t a k e n t oe l u c i d a t e t h e G , c e l l c y c l e c h e c k p o i n t p a t h w a y o r a p o p t o t i c c e l ld e a t h p a t h w a y. E n z y m e s s u c h a s p o l y ( A D P - r i b o s e ) p o l y -m e r a s e a n d t h e D N A - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e e x h i b i t g r e a t e ra c t i v i t y w i t h b r o k e n DNAs a s c o f a c t o r s t h a n w i t h c o v a l e n t l yc l o s e d DNAs a s c o f a c t o r s 4 , 2 6 ) . T h e s e e n z y m e s m i g h t b ec a n d i d a t e p a r t i c i p a n t s i n t h e p 5 3 - d e p e n d e n t c e l l c y c l e c h e c k -p o i n t o r c e l l d e a t h p a t h w a y s .F i n a l l y , DNA s t r a n d b r e a k s d o n o t a r i s e s o l e l y f r o m p a t h o -l o g i c a l i n s u l t s . P h y s i o l o g i c DNA s t r a n d b r e a k s m u s t o c c u rd u r i n g s o m a t i c g e n e r e a r r a n g e m e n t p r o c e s s e s s u c h a s d u r i n gT - a n d B - l y m p h o c y t e d e v e l o p m e n t a s w e l l a s d u r i n g g e r m l i n eg e n e r e ar r a n g e m e n t p r o c e s s e s s u c h a s m e i o s i s i n o o g e n e s i sa n d s p e r m a t o g e n e s i s . L o w e r e u c a r y o t e s s u c h a s y e a s t s c o n t a i nn o p 5 3 g e n e s a n d e x h i b i t n o o b v i o u s i o n i z i n g r a d i a t i o n - i n d u c e dG I c e l l c y c l e c h e c k p o i n t ( 6 2 ) . P e r h a p s p 5 3 - d e p e n d e n t p a t h -w a y s e v o l v e d i n h i g h e r e u c a r y o t e s t o h e l p r e g u l a t e p h y s i o l o g i cp r o c e s s e s a s s o c i a t e d w i t h DNA s t r a n d b r e a k s . F o r i n s t a n c e ,t h e G I c h e c k p o i n t m a y p r e v e n t a t t e m p t e d DNA r e p l i c a t i o n i nl y m p h o i d c e l l s c o n t a i n i n g i n a d e q u a t e l y r e j o i n e d i m m u n o g l o b -u l i n o r T - c e l l r e c e p t o r g e n e s w h i c h m i g h t r e s u l t i n t r a n s l o c a -t i o n o f s e g m e n t s o f t h e s e g e n e s t o o t h e r c h r o m o s o m a l l o c i a n da h i g h r i s k f o r n e o p l a s t i c t r a n s f o r m a t i o n . A l t e r n a t i v e l y , i n a d -e q u a t e l y r e j o i n e d s t r a n d b r e a k s m i g h t c o m m i t s u c h l y m p h o i dc e l l s t o d e a t h b y a p 5 3 - d e p e n d e n t a p o p t o s i s p a t h w a y . I na d d i t i o n , a G I c h e c k p o i n t m i g h t p r e v e n t r e p l i c a t i o n o f d a m -a g e d t e m p l a t e DNA i n g e r m c e l l s p r o g r e s s i n g t o f i r s t m e i o t i cp r o p h a s e i n o r d e r t o m i n i m i z e n o n h o m o l o g o u s m e i o t i c r e c o m -b i n a t i o n s a n d o t h e r h e r i t a b l e DNA t e m p l a t e a l t e r a t i o n s . E l e -v a t e d p 5 3 p r o t e i n l e v e l s h a v e b e e n d e t e c t e d i n d e v e l o p i n gs p e r m a t o c y t e s w h i c h u n d e r g o s u c h m e i o t i c r e c o m b i n a t i o n a le v e n t s 1 , 5 2 ) . I n s u p p o r t o f t h e s e p o s s i b i l i t i e s i s t h e i n c r e a s e di n c i d e n c e o f l y m p h o i d a n d g e r m c e l l n e o p l a s m s i n m i c eh o m o z y g o u s f o r d i s r u p t e d p 5 3 g e n e s ( 1 7 ) .C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e m o l e c u l a r c o n t r o l s o f c e l l c y c l ec h e c k p o i n t a n d a p o p t o s i s p a t h w a y s v i a e l e v a t i o n s o f p 5 3p r o t e i n l e v e l s c o u l d p r o v e u s e f u l i n t h e f o r m u l a t i o n o f news t r a t e g i e s f o r c a n c e r p r e v e n t i o n a n d t r e a t m e n t . I d e n t i f i c a t i o no f t h e DNA l e s i o n ( s ) i n i t i a t i n g t h e s e s i g n a l t r a n s d u c t i o np a t h w a y s c o u l d p r o v e c r i t i c a l i n t h i s r e g a r d . F o r e x a m p l e ,p e o p l e a f f l i c t e d w i t h i n h e r i t e d c a n c e r - p r o n e s y n d r o m e s , s u c h

V O L . 1 4 , 1 9 9 4


8/9

1 8 2 2 NELSON AND KASTANa s a t a x i a t e l a n g i e c t a s i a ( 3 5 ) o r L i - F r a u m e n i s y n d r o m e ( 4 6 , 5 6 ) ,w h i c h h a v e p o t e n t i a l G 1 c e l l c y c l e c h e c k p o i n t o r c e l l d e a t hd e f e c t s , m i g h t b e c o u n s e l e d t o a v o i d a l l e n v i r o n m e n t a l a g e n t sc a p a b l e o f DNA s t r a n d s c i s s i o n o r m i g h t b e n e f i t f r o m t r e a t -m e n t w i t h a n t i o x i d a n t s o r o t h e r p r o t e c t i v e a g e n t s t o r e d u c e t h ei n c i d e n c e o f DNA s t r a n d b r e a k s . A l s o , many a n t i n e o p l a s t i cd r u g s c l e a r l y k i l l r e p l i c a t i n g c a n c e r c e l l s more e f f e c t i v e l y t h a nn o n r e p l i c a t i n g c a n c e r c e l l s . P e r h a p s t h e p 5 3 - d e p e n d e n t c e l lc y c l e c h e c k p o i n t o r a p o p t o s i s p a t h w a y s c o u l d b e t h e r a p e u t i -c a l l y a c t i v a t e d o r i n h i b i t e d f o r t h e p u r p o s e o f p r o t e c t i n gn o r m a l c e l l s a n d s e l e c t i v e l y k i l l i n g c a n c e r c e l l s c o n t a i n i n gm u t a n t p 5 3 a l l e l e s . T h i s w i l l n o t p r o v e t r i v i a l , a s r e c e n t s t u d i e sh a v e s u g g e s t e d t h a t c u r r e n t t r e a t m e n t s t r a t e g i e s u s i n g i o n i z i n gr a d i a t i o n a n d t o p o i s o m e r a s e - t a r g e t e d d r u g s d o n o t d i r e c t l ye x p l o i t t h e p 5 3 - d e p e n d e n t c e l l c y c l e c h e c k p o i n t p a t h w a y f o rt h e r a p e u t i c a d v a n t a g e i n c a n c e r c e l l k i l l i n g i n a l l c e l l t y p e s( 5 5 ) . U n d o u b t e d l y , f u r t h e r s t u d i e s o f t h e p 5 3 - d e p e n d e n t c e l lc y c l e c h e c k p o i n t a n d p 5 3 - d e p e n d e n t a p o p t o s i s w i l l f a c i l i t a t ef u t u r e a t t e m p t s a t m a n i p u l a t i n g t h e s e p a t h w a y s t o i m p r o v ec a n c e r c a r e .

ACKNOWLEDGMENTSWe t h a n k B e v e r l y S . P l u n k e t t a n d W e n - H s i a n g L e e f o r e x c e l l e n tt e c h n i c a l a s s i s t a n c e a n d A l b e r t J . F o r n a c e , D o n a l d S . C o f f e y , a n dK a t h l e e n R . C h o f o r h e l p f u l d i s c u s s i o n s .T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y N a t i o n a l C a n c e r I n s t i t u t e P r o s t a t eC a n c e r SPORE g r a n t C A 5 8 2 3 6 , g r a n t E S 0 5 7 7 7 f r o m t h e N a t i o n a lI n s t i t u t e s o f H e a l t h , a n d g r a n t 3 1 8 7 f r o m t h e C o u n c i l f o r T o b a c c oR e s e a r c h .

REFERENCES1 . A l m o n , E . , N . G o l d f i n g e r , A . K a p o n , D . S c h w a r t z , A . J . L e v i n e , a n dV . R o t t e r . 1 9 9 3 . T e s t i c u l a r t i s s u e - s p e c i f i c e x p r e s s i o n o f t h e p 5 3s u p p r e s s o r g e n e . D e v . B i o l . 1 5 6 : 1 0 7 - 1 1 6 .2 . A n d r e a s s e n , P . R . , a n d R . L . M a r g o l i s . 1 9 9 2 . 2 - A m i n o p u r i n eo v e r r i d e s m u l t i p l e c e l l c y c l e c h e c k p o i n t s i n BHK c e l l s . P r o c . N a t i .A c a d . S c i . USA 8 9 : 2 2 7 2 - 2 2 7 6 .3 . A v e m a n n , K . , R . K n i p p e r s , T . K o l l e r , a n d J . S o g o . 1 9 8 8 . C a m p t o -

t h e c i n , a s p e c i f i c i n h i b i t o r o f t y p e I DNA t o p o i s o m e r a s e s , i n d u c e sDNA b r e a k a g e a t r e p l i c a t i o n f o r k s . M o l . C e l l . B i o l . 8 : 3 0 2 6 - 3 0 3 4 .4 . B e n j a m i n , R . C . , a n d D . M. G i l l . 1 9 8 0 . P o l y ( A D P - r i b o s e ) s y n t h e s i si n v i t r o p r o g r a m m e d b y d a m a g e d DNA. J . B i o l . C h e m . 2 5 5 : 1 0 5 0 2 -1 0 5 0 8 .5 . B o r e k , C . , A . O n g , W. F . M o r g a n , a n d J . E . C l e a v e r . 1 9 9 1 .M o r p h o l o g i c a l t r a n s f o r m a t i o n o f 1 0 T 1 / 2 mouse e m b r y o c e l l s c a nb e i n i t i a t e d b y DNA d o u b l e - s t r a n d b r e a k s a l o n e . M o l . C a r c i n o g .4 : 2 4 3 - 2 4 7 .6 . B r y a n t , P . E . 1 9 8 4 . E n z y m a t i c r e s t r i c t i o n o f m a m m a l i a n c e l l DNAu s i n g P v u I I a n d BamHl: e v i d e n c e o f t h e d o u b l e s t r a n d b r e a ko r i g i n o f c h r o m o s o m a l a b e r r a t i o n s . I n t . J . R a d i a t . B i o l . 4 6 : 5 7 - 6 5 .7 . B r y a n t , P . E . 1 9 8 8 . U s e o f r e s t r i c t i o n e n z y m e s t o s t u d y r e l a t i o n -s h i p s b e t w e e n DNA d o u b l e s t r a n d b r e a k s a n d o t h e r e n d - p o i n t s i nm a m m a l i a n c e l l s . I n t . J . R a d i a t . B i o l . 5 4 : 8 6 9 - 8 9 0 .8 . B r y a n t , P . E . , a n d A . C . R i c h e s . 1 9 8 9 . T r a n s f o r m a t i o n o f m u r i n eC3 H 1 0 T 1 / 2 c e l l s r e s u l t i n g f r o m DNA d o u b l e s t r a n d b r e a k si n d u c e d b y a r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e . B r . J . C a n c e r 6 0 : 8 5 2 - 8 5 4 .9 . B u r t o n , K . 1 9 6 8 . D e t e r m i n a t i o n o f DNA c o n c e n t r a t i o n w i t hd i p h e n y l a m i n e . M e t h o d s E n z y m o l . 1 2 B : 1 6 3 - 1 6 6 .1 0 . B u s s e , P . M . , S . K . B o s e , R . W. J o n e s , a n d L . J . T o l m a c h . 1 9 7 7 .T h e a c t i o n o f c a f f e i n e o n X - i r r a d i a t e d HeLa c e l l s . I I . S y n e r g i s t i cl e t h a l i t y . R a d i a t . R e s . 7 1 : 6 6 6 - 6 7 7 .1 1 . C h e n , G . L . , L . Y a n g , T . C . R o w e , B . D . H a l l i g a n , K . M. T e w e y , an dL . F . L i u . 1 9 8 4 . N o n i n t e r c a l a t i v e a n t i t u m o r d r u g s i n t e r f e r e w i t ht h e b r e a k a g e - r e u n i o n r e a c t i o n o f m a m m a l i a n DNA t o p o i o s o m e r -a s e I I . J . B i o l . C h e m . 2 5 9 : 1 3 5 6 0 - 1 3 5 6 6 .1 2 . C h u n g , H . W . , J . W. P h i l l i p s , R . A . W i n e g a r , R . J . P r e s t o n , a n dW. F . M o r g a n . 1 9 9 1 . M o d u l a t i o n o f r e s t r i c t i o n e n z y m e - i n d u c e dd a m a g e b y c h e m i c a l s t h a t i n t e r f e r e w i t h c e l l u l a r r e s p o n s e s t oDNA d a m a g e : a c y t o g e n e t i c a n d p u l s e d - f i e l d g e l a n a l y s i s . R a d i a t .R e s . 1 2 5 : 1 0 7 - 1 1 3 .

1 3 . C l a r k e , A . R . , C . A . P u r d i e , D . J . H a r r i s o n , R . G . M o r r i s , C . C .B i r d , M. L . H o o p e r , a n d A . H . W y l l i e . 1 9 9 3 . T h y m o c y t e a p o p t o s i si n d u c e d b y p 5 3 - d e p e n d e n t a n d i n d e p e n d e n t p a t h w a y s . N a t u r e( L o n d o n ) 3 6 2 : 8 4 9 - 8 5 2 .1 4 . C l e a v e r , J . E . DNA r e p a i r a n d i t s c o u p l i n g t o DNA r e p l i c a t i o n i ne u c a r y o t i c c e l l s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 5 1 6 : 4 8 9 - 5 1 6 .1 5 . D ' A r p a , P . , C . B e a r d m o r e , a n d L . F . L i u . 1 9 9 0 . I n v o l v e m e n t o fn u c l e i c a c i d s y n t h e s i s i n c e l l k i l l i n g m e c h a n i s m s o f t o p o i s o m e r a s ep o i s o n s . C a n c e r R e s . 5 0 : 6 9 1 9 - 6 9 2 4 .1 6 . D e V a r y , Y . , R . A . G o t t l i e b , T . S m e a l , a n d M . K a r i n . 1 9 9 2 . T h em a m m a l i a n u l t r a v i o l e t r e s p o n s e i s t r i g g e r e d b y a c t i v a t i o n o f S r ct y r o s i n e k i n a s e . C e l l 7 1 : 1 0 8 1 - 1 0 9 1 .1 7 . D o n e h o w e r , L . A . , M. H a r v e y , B . L . S l a g l e , M. J . M c A r t h u r , C . A .M o n t g o m e r y , J . S . B u t e l , a n d A . B r a d l e y . 1 9 9 2 . M i c e d e f i c i e n t f o rp 5 3 a r e d e v e l o p m e n t a l l y n o r m a l b u t s u s c e p t i b l e t o s p o n t a n e o u st u m o u r s . N a t u r e ( L o n d o n ) 3 5 6 : 2 1 5 - 2 2 1 .1 8 . D u n n , W. C . , a n d J . D . R e g a n . 1 9 7 9 . I n h i b i t i o n o f DNA e x c i s i o nr e p a i r i n human c e l l s b y a r a b i n o f u r a n o s y l c y t o s i n e : e f f e c t o nn o r m a l a n d x e r o d e r m a p i g m e n t o s u m c e l l s . M o l . P h a r m a c o l . 1 5 :3 6 7 - 3 7 4 .1 9 . E l i a , M. C . , J . G . D e L u c a , a n d M. 0 . B r a d l e y . 1 9 9 1 . S i g n i f i c a n c ea n d m e a s u r e m e n t o f DNA d o u b l e s t r a n d b r e a k s i n m a m m a l i a nc e l l s . P h a r m a c o l . T h e r . 5 1 : 2 9 1 - 3 2 7 .2 0 . F o r n a c e , A . J . , J r . 1 9 9 2 . M a m m a l i a n g e n e s i n d u c e d b y r a d i a t i o n ;a c t i v a t i o n o f g e n e s a s s o c i a t e d w i t h g r o w t h c o n t r o l . A n n u . R e v .G e n e t . 2 6 : 5 0 7 - 5 2 6 .2 1 . F o r n a c e , A . J . , J r . , D . W. N e b e r t , M. C . H o l l a n d e r , J . D . L e u t h y ,M. A . P a p a t h a n a s i o u , J . F a r g n o l i , a n d N . J . H o l b r o o k . 1 9 8 9 .Mammalian g e n e s c o o r d i n a t e l y r e g u l a t e d b y g r o w t h a r r e s t s i g n a l sa n d D N A - d a m a g i n g a g e n t s . M o l . C e l l . B i o l . 9 : 4 1 9 6 - 4 2 0 3 .2 2 . F o r n a c e , A . J . , J r . , a n d D . S . S e r e s . 1 9 8 3 . D e t e c t i o n o f DNAs i n g l e - s t r a n d b r e a k s d u r i n g r e p a i r o f UV d a m a g e i n x e r o d e r m ap i g m e n t o s u m c e l l s . R a d i a t . R e s . 9 3 : 1 0 7 - 1 1 1 .2 3 . F r i t s c h e , M . , C . H a e s s l e r , a n d G . B r a n d n e r . 1 9 9 3 . I n du c t i o n o fn u c l e a r a c c u m u l a t i o n o f t h e t u m o r - s u p p r e s s o r p r o t e i n p 5 3 b yD N A - d a m a g i n g a g e n t s . O n c o g e n e 8 : 3 0 7 - 3 1 8 .2 4 . G e o r g e , J . , M. C a s t e l l a z z i , a n d G . B u t t i n . 1 9 7 5 . P r o p h a g e i n d u c -t i o n a n d c e l l d i v i s i o n i n E . c o l i . I I I . M u t a t i o n s s f i A a n d s f i B r e s t o r ed i v i s i o n i n t i f a n d I o n s t r a i n s a n d p e r m i t e x p r e s s i o n o f m u t a t o rp r o p e r t i e s o f t i f . M o l . G e n . G e n e t . 1 4 0 : 3 0 9 - 3 3 2 .2 5 . G i a c c a , A . J . , R . A . M a c L a r e n , N . D e n k o , D . N i c o l a o u , a n d T .S t a m a t o . 1 9 9 0 . I n c r e a s e d s e n s i t i v i t y t o k i l l i n g b y r e s t r i c t i o n e n -z y m e s i n t h e x r - 1 DNA d o u b l e - s t r a n d b r e a k r e p a i r - d e f i c i e n tm u t a n t . M u t a t . R e s . 2 3 6 : 6 7 - 7 6 .2 6 . G o t t l i e b , T . M . , a n d S . P . J a c k s o n . 1 9 9 3 . T h e D N A - d e p e n d e n tp r o t e i n k i n a s e : r e q u i r e m e n t f o r DNA e n d s a n d a s s o c i a t i o n w i t hKu a n t i g e n . C e l l 7 2 : 1 3 1 - 1 4 2 .2 7 . H a l l , P . A . , P . H . M c K e e , H . D . M e n a g e , R . D o v e r , a n d D . P . L a n e .1 9 9 3 . H i g h l e v e l s o f p 5 3 p r o t e i n i n U V - i r r a d i a t e d n o r m a l humans k i n . O n c o g e n e 8 : 2 0 3 - 2 0 7 .2 8 . H a r t w e l l , L . H . , a n d T . A . W e i n e r t . 1 9 8 9 . C h e c k p o i n t s : c o n t r o l st h a t e n s u r e o r d e r o f c e l l c y c l e e v e n t s . S c i e n c e 2 4 6 : 6 2 9 - 6 3 4 .2 9 . H o r o s z e w i c z , J . S . , S . S . L e o n g , E . D a w i n s k i , J . P . K e r r , H .R o s e n t h a l , T . M. C h u , E . A . M i r a n d , a n d G . P . M u r p h y . 1 9 8 3 .LNCaP m o d e l o f h u m a n p r o s t a t i c c a r c i n o m a . C a n c e r R e s . 4 3 :1 8 0 9 - 1 8 1 8 .3 0 . H s i a n g , Y . - H . , M. G . L i h o u , a n d L . F . L i u . 1 9 8 9 . A r r e s t o fr e p l i c a t i o n f o r k s b y d r u g - s t a b i l i z e d t o p o i s o m e r a s e I-DNA c l e a v -a b l e c o m p l e x e s a s a m e c h a n i s m o f c e l l k i l l i n g b y c a m p t o t h e c i n .C a n c e r R e s . 4 9 : 5 0 7 7 - 5 0 8 2 .3 1 . H u i s m a n , O . , a n d R . D ' A r i . 1 9 8 1 . An i n d u c i b l e DNA r e p l i c a t i o n -c e l l d i v i s i o n c o u p l i n g m e c h a n i s m i n E . c o l i . N a t u r e ( L o n d o n )2 9 0 : 7 9 7 - 7 9 9 .3 2 . I s a a c s , W. B . , B . S . C a r t e r , a n d C . M. E w i n g . 1 9 9 1 . W i l d - t y p e p 5 3s u p p r e s s e s g r o w t h o f human p r o s t a t e c a n c e r c e l l s c o n t a i n i n gm u t a n t p 5 3 a l l e l e s . C a n c e r R e s . 5 1 : 4 7 1 6 - 4 7 2 0 .3 3 . J e g g o , A . L . 1 9 9 0 . S t u d i e s o n m a m m a l i a n m u t a n t s d e f e c t i v e i nr e j o i n i n g d o u b l e - s t r a n d b r e a k s i n DNA. M u t a t . R e s . 2 3 9 : 1 - 1 6 .3 4 . K a s t a n , M. B . , 0 . O n y e k w e r e , D . S i d r a n s k y , B . V o g e l s t e i n , a n dR . W. C r a i g . 1 9 9 1 . P a r t i c i p a t i o n o f p 5 3 p r o t e i n i n t h e c e l l u l a rr e s p o n s e t o DNA d a m a g e . C a n c e r R e s. 5 1 : 6 3 0 4 - 6 3 1 1 .3 5 . K a s t a n , M. B . , Q . Z h a n , W. S . E l - D e i r y , F . C a r r i e r , T . J a c k s , W. V .W a l s h , B . S . P l u n k e t t , B . V o g e l s t e i n , a n d A . J . F o r n a c e , J r . 1 9 9 2 .

M O L . C E L t - . B I O L .


9/9

DNA STRAND BREAKS AND p 5 3 INDUCTION 1 8 2 3A m a m m a l i a n c e l l c y c l e c h e c k p o i n t p a t h w a y u t i l i z i n g p 5 3 a n dGADD45 i s d e f e c t i v e i n a t a x i a - t e l a n g i e c t a s i a . C e l l 7 1 : 5 8 7 - 5 9 7 .3 6 . K a u f m a n n , W. K . , J . C . B o ye r , L . L . E s t a b r o o k s , a n d S . J . W i l s o n .1 9 9 1 . I n h i b i t i o n o f r e p l i c o n i n i t i a t i o n i n human c e l l s f o l l o w i n gs t a b i l i z a t i o n o f t o p o i s o m e r a s e - D N A c l e a v a b l e c o m p l e x e s . M o l .C e l l . B i o l . 1 1 : 3 7 1 1 - 3 7 1 8 .3 7 . K e s s i s , T . D . , R . J . S l e b o s , W. G . N e l s o n , M. B . K a s t a n , B . S .P l u n k e t t , S . M. H a n , A . T . L o r i n c z , L . H e d r i c k , a n d K . R . C h o .1 9 9 3 . Human p a p i l l o m a v i r u s 1 6 E6 e x p r e s s i o n d i s r u p t s t h e p 5 3 -m e d i a t e d c e l l u l a r r e s p o n s e t o DNA d a m a g e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i .USA 9 0 : 3 9 8 8 - 3 9 9 2 .3 8 . K u e r b i t z , S . J . , B . S . P l u n k e t t , W. V . W a l s h , a n d M. B . K a s t a n .1 9 9 2 . W i l d - t y p e p 5 3 i s a c e l l c y c l e c h e ck p o i n t d e t e r m i n a n t f o l l o w -i n g i r r a d i a t i o n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 9 : 7 4 9 1 - 7 4 9 5 .3 9 . L a u , C . C . , a n d A . B . P a r d e e . 1 9 8 2 . A m e c h a n i s m b y w h i c h c a f f e i n ep o t e n t i a t e s l e t h a l i t y o f n i t r o g e n m u s t a r d . P r o c . N a t ] . A c a d . S c i .US A 7 9 : 2 9 4 2 - 2 9 4 6 .4 0 . L i , J . , a n d E . K a m i n s k a s . 1 9 8 4 . A c c u m u l a t i o n o f DNA s t r a n db r e a k s a n d m e t h o t r e x a t e c y t o t o x i c i t y . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA8 1 : 5 6 9 4 - 5 6 9 8 .4 1 . L i u , L . F . 1 9 8 9 . DNA t o p o i s o m e r a s e p o i s o n s a s a n t i t u m o r d r u g s .A n n u . R e v . B i o c h e m . 5 8 : 3 5 1 - 3 7 5 .4 2 . L i u , L . F . , T . C . R o w e , L . Y a n g , K . M. T e w e y , a n d G . L . C h e n . 1 9 8 3 .C l e a v a g e o f DNA b y m a m m a l i a n DNA t o p o i s o m e r a s e I I . J . B i o l .C h e m . 2 5 8 : 1 5 3 6 5 - 1 5 3 7 0 .4 3 . L i v i n g s t o n e , L . R . , A . W h i t e , J . S p r o u s e , E . L i v a n o s , T . J a c k s , a n dT . D . T l s t y . 1 9 9 2 . A l t e r e d c e l l c y c l e a r r e s t a n d g e n e a m p l i f i c a t i o np o t e n t i a l a c c o m p a n y l o s s o f w i l d - t y p e p 5 3 . C e l l 7 0 : 9 2 3 - 9 3 5 .4 4 . L o w e , S . W . , E . M. S c h m i t t , S . W. S m i t h , B . A . O s b o r n e , a n d T .J a c k s . 1 9 9 3 . p 5 3 i s r e q u i r e d f o r r a d i a t i o n - i n d u c e d a p o p t o s i s i nm o u s e t h y m o c y t e s . N a t u r e ( L o n d o n ) 3 6 2 : 8 4 7 - 8 4 9 .4 5 . L u c h n i k , A . N . , T . A . H i s a m u t d i n o v , a n d G . P . G e o r g i e v . 1 9 8 8 .I n h i b i t i o n o f t r a n s c r i p t i o n i n e u k a r y o t i c c e l l s b y x - i r r a d i a t i o n :r e l a t i o n t o t h e l o s s o f t o p o l o g i c a l c o n s t r a i n t i n c l o s e d DNA l o o p s .N u c l e i c A c i d s R e s . 1 6 : 5 1 7 5 - 5 1 9 0 .4 6 . M a l k i n , D . , F . P . L i , L . C . S t r o n g , J . F . F r a u m e n i , J r . , C . E . N e l s o n ,D . H . K i m , J . K a s s e l , M. A . G r y k a , F . Z . B i s c h o f , M. A . T a i n s k y ,a n d S . H . F r i e n d . 1 9 9 0 . Germ l i n e p 5 3 m u t a t i o n s i n a f a m i l i a ls y n d r o m e o f b r e a s t c a n c e r , s a r c o m a s , a n d o t h e r n e o p l a s m s . S c i -e n c e 2 5 0 : 1 2 3 3 - 1 2 3 8 .4 7 . M a l t z m a n , W . , a n d L . C z y z y k 1 9 8 4 . UV i r r a d i a t i o n s t i m u l a t e sl e v e l s o f p 5 3 c e l l u l a r t u m o r a n t i g e n i n n o n t r a n s f o r m e d mousec e l l s . M o l . C e l l . B i o l . 4 : 1 6 8 9 - 1 6 9 4 .4 8 . M o r g a n , W. F . , B . L . Y a t e s , J . T . R u f e r , E . A

DNA Damage-trigger p53-Nelson 1994

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